专利名称：一种抗血吸虫病的童虫细胞型疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于免疫预防血吸虫病发生的疫苗制品，特别是一种童虫细胞型疫苗。
背景技术：
血吸虫病是世界主要热带病，6亿人受威胁。其中在我国严重流行的是日本血吸虫病，属人畜共患寄生虫病。由于该病在人畜中流行传播属于自然环境造成，目前的防治措施尚不能达到控制其流行与传播的要求。
迄今为止，国内对(日本/曼氏)血吸虫病疫苗类型的研究涉及面包括1.减毒活疫苗用血吸虫活尾蚴经射线照射后用于接种/免疫动物，可对攻击感染虫体产生60％到90％的(减虫率)保护性免疫力，但很不实用；2.虫体死疫苗包括用血吸虫成虫或童虫的组织或可溶性复合成分免疫动物，几乎不能诱导宿主产生抗攻击感染免疫力；3.天然分子疫苗从血吸虫虫体或虫卵中分离出有效天然成分，添加佐剂后用于免疫动物，仅可诱导部分保护性免疫力，其中用未成熟虫卵分子抗原具有抗血吸虫生殖或卵胚发育作用，但对抗攻击感染虫体作用差；4.重组疫苗将经筛选鉴定出来有效的抗原分子或照射尾蚴免疫动物后获取抗血清，对血吸虫cDNA文库进行筛选，用基因重组技术，表达出重组/融合蛋白免疫动物，其保护性免疫效果均在40％(减虫率)范围内；5.基因疫苗又称DNA疫苗，经文库(含多肽库)筛选鉴定出来的片段，构建成真核表达载体，直接免疫动物，其保护性免疫效果均不理想；6.多肽疫苗根据有效分子的表位序列，设计合成分子抗原肽，一般将多个多肽分子用于免疫动物，获得较好的保护性，但未达到理想结果；7.多表位疫苗采用有效疫苗分子的B细胞和T细胞表位合成cDNA片段，构建成重组或基因疫苗后用于免疫动物的研究，其效果不理想；8.复合疫苗又可称“鸡尾酒”疫苗，将多种疫苗侯选分子对动物作联合免疫，观察抗攻击感染的作用，目前报道的效果也都不理想；9.异源疫苗用肝片虫或旋毛虫抗原免疫宿主观察抗血吸虫攻击感染的作用，其效果均为超出上述同源疫苗所达到的要求；10.抗独特型疫苗以抗病原生物的抗体免疫动物，作为抗原的模拟物Ab2免疫动物后产生抗Ab2独特型抗体，发挥保护作用，正处在探索中。
上述疫苗，存在照射尾蚴活疫苗有不安全性和消材量大等不实用的问题，除照射疫苗外，均需加佐剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效抗血吸虫病的童虫细胞型疫苗。
本发明所述童虫细胞型疫苗的制备方法是以日本血吸虫尾蚴经腹部重感染健康家兔，经14～24天后灌注冲虫，收集虫体洗涤后，在无菌条件下将虫体经快速切碎，加入含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化30分钟，吸上清，加入含Ca2+，Mg2+的D-Hank’s液终止消化得活细胞；或将收集洗涤后的虫体作物理处理经300目过筛获取活细胞；或经体外培养获取活细胞。将所获得的细胞，经离心2000rpm×5min，用D-Hank’s，反复洗涤3次，弃上清非细胞成分，获日本血吸虫肝期童虫活细胞疫苗，在活细胞中加少量PBS或D-Hank’s液作细胞计数，并定容为1.6×107/ml，用作免疫接种剂量浓度。
将上述肝期童虫活细胞经冰冻处理后，获得肝期童虫死细胞，用于免疫接种。
一种抗血吸虫病的童虫细胞型疫苗，利用该疫苗进行免疫接种，其使用方法如下免疫接种对象小鼠；免疫接种部位与剂量腹股沟皮下和背颈部皮下注射，注射体积量为0.1ml，细胞量为1.6×105/ml～1.0×108/ml，共免疫接种1～4次，每隔2周1次。
本发明所制得的细胞疫苗是一种实用型疫苗，易于生产和制备，且安全有效，克服了照射尾蚴活疫苗不安全性和消材量大等不实用的问题，见效快。使用该童虫细胞免疫接种小鼠，不须加佐剂均可诱导宿主产生显著的抗日本血吸虫攻击感染和致病的免疫力，超出了目前已有其他类型疫苗的效果；该疫苗的发现将会对蠕虫病疫苗研究与应用产生积极影响。
图1用日本血吸虫肝期童虫制备的活细胞照片；图2用体外培养法对日本血吸虫18d童虫作原代培养出来的生长细胞照片；图3用体外培养法对日本血吸虫18天童虫作传代培养出来的生长细胞照片；其中A、B、C为染色细胞，A和B25X，C40X；D和E为HE染色，D100X，E40X；F为Brdu染色阴性对照；H为美兰染色阳性细胞；图4实验动物(小鼠)肝表面病变程度比较图(照片)，A对照组，B童虫碎片组，C童虫细胞组；图5第一批实验的对照组和实验组获取雄虫的大小及数目的比较(照片)，其中A活细胞组，B虫体组，C对照组。
具体实施例方式
1.童虫细胞疫苗的制备采用日本血吸虫尾蚴，经腹部重感染健康家兔后第14～24天灌注冲虫，收集虫体洗涤后，在无菌条件下将虫体经快速切碎，加入10倍含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化30min，吸上清，加入含Ca2+，Mg2+的D-Hank’s液终止消化；将所获得的细胞，经离心2000rpm×5min，用D-Hank’s，反复洗涤3次，弃上清非细胞成分，继后加少量PBS或D-Hank’s液作细胞计数，并定容为1.6×107/ml，用作免疫接种剂量浓度。获日本血吸虫肝期童虫活细胞，按上述方法获取虫体细胞后，经冰冻处理后用于免疫接种动物。
童虫细胞疫苗的免疫接种a.接种对象用日本血吸虫肝期童虫活细胞和活组织碎片分别接种小鼠各1组及不作免疫对照1组，共3组，每组10只鼠；接种方法与攻击感染在不加佐剂条件下分别(经腹股沟皮下)免疫接种小鼠4次，末次免疫后1周攻击感染。感染血吸虫尾蚴30条/鼠，感后42天，比较观察了二者抗攻击感染的保护性免疫力及其机制。
观察结果细胞接种组和虫体萃片接种组分别与PBS注射组比，虫体发育数分别下降67.6％％和46.3％，其中细胞接种组比虫体接种组的虫体下降为39.66％；肝组织中虫卵数(LEPG)在细胞接种组和虫体接种组中分别减少95.4％和64.8％，细胞接种组比虫体接种组的LEPG下降为87.1％；在细胞组鼠肝表面虫卵结节、肝组织中虫卵肉芽肿大小和雄虫长度均显著小于其他两组的；特异性IgG2a/IgG1比值≥2，但总抗体水平低于虫体碎片接种组。
结论本研究在国内外首次建立了一种血吸虫细胞型疫苗研究模型，结果表明，在不加佐剂条件用血吸虫童虫活细胞可诱导小鼠产生显著的抗攻击感染和抗致病的保护性免疫力，其机制可能为Th1介导的细胞免疫应答。
b.用日本血吸虫肝期重虫活细胞和死细胞(作第二批实验，3组小鼠，每组10只)在不加佐剂条件下分别(经颈背部皮下)免疫接种小鼠3次，末次免疫后2周攻击感染血吸虫尾蚴30条/鼠，感染后42天，比较观察了二者抗攻击感染的保护性免疫力和机制，结果见表1。在细胞免疫两组小鼠肝表面卵结节明显少于对照组的。
表1第二批实验的保护性效果(减虫率和减卵率)
c.用血吸虫童虫活细胞在不用佐剂条件下作不同免疫次数的保护性效果观察(结果见表2)。
表2 第三批实验的保护性效果(减虫率及虫体发育程度)
结论在不加佐剂条件下用血吸虫童虫活/死细胞均可诱导小鼠产生显著的抗攻击感染保护性免疫力，2～4次免疫的保护力差异无显著。此类疫苗属天然材料、制备简单、成本不高、接种宿主由于不用佐剂而不会产生毒副作用，故具很强的实用价值。
权利要求
1.一种抗血吸虫病的童虫细胞型疫苗，其特征在于利用该疫苗进行免疫接种，其使用方法为腹股沟皮下和背颈部皮下注射，注射体积量为0.1ml，细胞量为1.6×105/ml～1.0×108/ml，共免疫接种1～4次，每隔2周1次。
2.一种权利要求1所述童虫细胞型疫苗的制备方法，其特征在于以日本血吸虫尾蚴经腹部重感染健康家兔，用感染后14～24天的血吸虫童虫，经洗涤后，在无菌条件下将虫体经快速切碎，加入10倍含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化30分钟，吸上清，加入含Ca2+，Mg2+的D-Hank’s液终止消化得活细胞，将所获得的细胞，经离心2000rpm×5min，用D-Hank’s，反复洗涤3次，弃上清非细胞成分，获日本血吸虫肝期童虫活细胞疫苗，在活细胞中加少量PBS或D-Hank’s液作细胞计数，并定容为1.6×107/ml，用作免疫接种剂量浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于还可以将收集洗涤后的虫体作物理处理经300目过筛获取活细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于还可以经体外培养获取活细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述童虫活细胞经冰冻处理后，得肝期童虫死细胞，用于免疫接种。
全文摘要
一种抗血吸虫病童虫细胞型疫苗。其制备方法是收集日本血吸虫重感染家兔第14～24天童虫，经无菌快速切碎，用胰酶消化30分钟，吸上清，加含Ca
文档编号A61P33/00GK1778388SQ20041004698
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者曾庆仁, 林雪迟, 蔡立汀, 龚燕飞, 张祖萍 申请人:中南大学