专利名称：一种含有原料药材丹参的注射剂及其质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种含有原料药材丹参的注射剂及其质量控制方法，属中药领域。
背景技术：
香丹注射液和丹参注射液均为含丹参的中药注射剂，原料药材中均含有丹参，都具有扩张血管、增进冠状动脉血流量的功能，用于治疗心绞痛、心肌梗塞等心血管疾病，在临床上应用非常广泛。丹参的有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分两大类，水溶性成分主要为丹酚酸类成分，如丹酚酸A、B、C、D、E，紫草酸，迷迭香酸等，此外还有丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸等。研究结果表明，丹酚酸类成分是丹参活血化瘀作用的主要有效成分，其抗心肌缺血缺氧的活性比丹参素和原儿茶醛更强，其中丹酚酸A是目前已知的最强的抗氧化的化合物之一，并且有改善记忆，降低抗癌药物阿霉素毒性等作用。
关于丹酚酸A和丹酚酸B对照品的制备曾有报道，如周长新等曾报道采用Sephadex LH-20凝胶柱进行分离，但凝胶的价格昂贵，不利于大量地制备(中国药科大学学报，1999，30(6))。还有报道采用制备薄层色谱法分离，此法一次制备的量较小，且组分在薄板上受空气中氧的影响，不够稳定。(中国医学科学院药物研究所，中草药现代研究(第二卷)，北京北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，481)。
目前报道的含有原料丹参的注射剂的过敏反应较多，如谭静、谭孝杰、普英杰、谢怀龙，香丹注射液致呼吸困难1例，药学实践杂志，2003年02期；刘勤珍、王莉、付承桦，香丹注射液过敏反应1例，河北医学，2004年09期；王德奎、杨君、王迪，复方丹参注射液致药疹2例报告，哈尔滨医药，1994年02期；肖宜瑞、言敏能，复方丹参注射液不良反应7例分析，湖南中医药导报，1997年05期；汤启勋，四川中药注射剂不良反应观察，中药新药与临床药理，1998年03期；钟艳萍、程学仁，丹参及其制剂的不良反应，中药新药与临床研究，1999年04期；由于中药成分复杂，难以找到中药过敏反应的致敏源，因此，如何有效的控制中药注射剂的毒副作用，保证制剂的安全性一直是中药制剂解决的问题。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种含有原料药材丹参的注射剂，本发明还提供了该注射剂的质量控制方法。
本发明提供了一种含有原料药材丹参的注射剂，每制剂单位中含有丹酚酸A0.5～7.5mg、丹酚酸B 0.5～7.5mg。
其中，所述的每制剂单位是指粉针剂的每克，注射液的每毫升。
进一步，所述的所述的注射液每毫升含丹酚酸A 0.5～1.0mg、丹酚酸B0.5～1.0mg。
其中，所述的丹酚酸A和丹酚酸B的对照品是由下述方法制备丹参药材经水煮醇沉法提取，挥去乙醇后用氯仿提取，弃去氯仿液，水层酸化后，用醋酸乙酯提取丹酚酸。
采用硅胶柱层析分离丹酚酸A和丹酚酸B，以氯仿-醋酸乙酯-甲酸系统为洗脱剂。
对照品的制备方法采用硅胶柱层析法分离，分离效果好，制备的对照品量大，组分稳定，具有明显的优越性。
具体制备方法如下取丹参药材，粉碎后，加四倍量的水煎煮1小时，放冷，滤过，同法再煎煮两次，合并滤液，浓缩，加乙醇至含醇量为75％，放置过夜，滤过，取续滤液，挥去乙醇，用氯仿萃取3次，弃去氯仿液。水层用盐酸调至pH3，用醋酸乙酯提取3次，合并醋酸乙酯液，挥去溶剂，得黄色结晶性粉末，即为粗品。
用硅胶柱层析法对粗品进行分离，流动相为氯仿-醋酸乙酯-甲酸(体积比3∶2∶0.4)，分段收集，薄层色谱法监测，合并相同组分的段，同法再进行分离，分别收集含不同组分的带，至纯度达到要求后，挥去溶剂，得到结晶性粉末I和II。
分别采用液相色谱-质谱(LC-MS)联用方法测定了结晶I和II的分子量，分别测定了他们的紫外吸收光谱、红外吸收光谱、1H核磁共振光谱、13C核磁共振光谱等，并与文献报道进行比较，确定结晶I和II分别为丹酚酸A和丹酚酸B。
本发明还提供了一种含有原料药材丹参的注射剂的质量控制方法，它是由丹酚酸A和丹酚酸B为指标性成分进行定性和定量控制，每制剂单位中含有丹酚酸A 0.5～7.5mg、丹酚酸B 0.5～7.5mg。
其中，所述的定量控制方法为采用高效液相色谱法，使用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-甲酸系统为流动相；柱温25℃；UV280nm检测，供试品溶液和对照品溶液采用流动相配制，供试品溶液用流动相稀释至12.5倍的体积，使用外标法测定含量。
进一步地，所述的乙腈-水-甲酸的体积比为24∶76∶0.8。
本发明优选的实施方案如下1、色谱条件和系统适用性试验 以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-水-甲酸(24∶76∶0.8)，流速1.0ml/min，检测波长280nm。理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于2500。
2、对照品溶液的制备 分别精密称取丹酚酸A对照品和丹酚酸B对照品各约5mg，置同一50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。
3、供试品溶液的制备 精密量取香丹注射液或丹参注射液2ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。
4、测定方法 分别准确吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，用峰面积按外标法计算，即得。
该注射剂的HPLC图谱如图1所示，由两个特征峰组成。所述的两个特征峰的保留时间tR为丹酚酸A tR＝29.1min，丹酚酸B tR＝22.70min。其中两个特征峰的平均相对保留时间tR为丹酚酸A tR＝1.00，丹酚酸B tR＝0.8，由于操作精度和重现性的影响，丹酚酸B tR值的范围为0.7～0.9。
本发明方法可一次同时测定本品中的多个有效成分。除可用于测定注射液中两个最重要的有效成分丹酚酸A和丹酚酸B的含量外。在本法的色谱条件下，注射液中的其他有效成分如丹参素、原儿茶醛以及多个其他丹酚酸类成分分离良好，为同时测定这些成分提供了可能，具有很明显的优越性。
本发明建立了高效液相色谱法测定香丹注射液和丹参注射液中丹酚酸A和丹酚酸B两种成分的含量，通过对两个成份的定量控制，可保证注射剂用药的安全性和有效性，使制剂质量稳定、可控性强，且检测方法先进、准确、简便，适用于常规分析，对控制含有原料药材丹参的注射剂诸如香丹注射液和丹参注射液等的质量具有重要的作用。
图1.对照品溶液的色谱图其中两个特征峰的保留时间tR为丹酚酸AtR＝29.1min，丹酚酸B tR＝22.70min；图2.香丹注射液阴性对照的色谱3.香丹注射液的色谱图其中特征峰的保留时间tR为丹酚酸AtR＝28.9min，丹酚酸B tR＝22.6min，丹参素tR＝3.7min，原儿茶醛tR＝6.3min；图4.丹参注射液阴性对照的色谱5.丹参注射液的色谱图其中特征峰的保留时间tR为丹酚酸AtR＝29.0min，丹酚酸B tR＝22.70min，丹参素tR＝3.7min，原儿茶醛tR＝6.3min；具体实施方式
本发明为一种同时测定香丹注射液、丹参注射液中丹酚酸A和丹酚酸B含量的方法。本发明通过以下技术路线予以实施。
本发明的实施例如下，其中所用的仪器与试药为日本岛津LC-10AT VP高效液相色谱仪，岛津LC-10AT VP输液泵，SPD-10AVP紫外检测器、Class-VP色谱工作站。
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，超纯水(西南物理研究所)，其它试药均为分析纯。
实施例1 丹酚酸A和丹酚酸B对照品的制备取丹参药材5公斤，粉碎，加四倍量的水煎煮1小时，放冷，滤过，同法再煎煮两次，合并滤液，浓缩至约为5升，加乙醇至含醇量为75％，放置过夜，滤过，取滤液，挥去乙醇，用氯仿萃取3次，弃去氯仿液。水层用盐酸调至pH3，用醋酸乙酯提取3次，合并醋酸乙酯液，蒸去溶剂，得黄色结晶性粉末，即为粗品。
用硅胶柱层析法对粗品进行分离，流动相为氯仿-醋酸乙酯-甲酸(体积比3∶2∶0.4)，分段收集，薄层色谱法监测，合并相同组分的段，同法再进行分离，分别收集含不同组分的带，至纯度达到要求后，挥去溶剂，得到结晶性粉末I和II。
1、结晶I的结构鉴定结晶I为黄色结晶性粉末。
紫外光谱文献报道丹酚酸A的紫外光谱数据为(EtOH)λmax(lgε)205(4.27)，218(4.18)，287(4.08)，305(4.05)，335(4.00)；试验测得结晶I的紫外光谱数据为(EtOH)λmax(lgε)206(4.77)，218(4.55)，288(4.51)，304(4.46)，335(4.39)。
红外光谱波数在1446～1604cm-1(m→s)的一系列碳-碳伸缩振动吸收表明分子中有苯环；波数在3300cm-1的宽峰表明缔合羟基的存在。
1H-NMR(丙酮-d6)文献报道丹酚酸A的1H-NMR数据为δ3.01(2H，m)，5.16(1H，dd，J＝5.0/7.9)，6.25(1H，d，J＝15.8)，8.02(1H，d，J＝15.8)，6.20～7.25(10H，m)；试验测得结晶I的1H-NMR数据为δ3.01(2H，m)，5.19(1H，dd，J＝4.4/7.5)，6.30(1H，d，J＝15.6)，8.05(1H，d，J＝15.6)，6.50～7.30(10H，m)。
13C-NMR所得的全去偶碳谱总共出现了26个碳信号，丹酚酸A的分子式中有26个碳，两者相符。
LC-MS用LC-MS测得结晶I的分子离子峰为494。丹酚酸A的分子式为C26H22O10，分子量为494，结晶I和丹酚酸A的分子量相同。
经上述比较，确证所制得的化合物为丹酚酸A。用高效液相色谱方法测定，采用峰面积归一化法计算，其相对含量为98.7％。
2、结晶II的结构鉴定结晶II为白色结晶性粉末。
紫外光谱文献报道丹酚酸B的紫外光谱数据为(EtOH)λmax(lgε)203(4.95)，253(4.13)，288(4.16)，308(4.09)，330(4.05)；试验测得结晶II的紫外光谱数据为(EtOH)λmax(lgε)206(4.89)，254(4.16)，288(4.21)，301(4.11)，327(4.03)。
红外光谱波数在1448～1611cm-1(m→s)的一系列碳-碳伸缩振动吸收，表明分子中有苯环；波数在1718cm-1的碳-氧伸缩振动吸收表明分子中有羰基；波数在～3400cm-1的宽峰表明缔合羟基的存在。
1H-NMR(丙酮-d6)文献报道丹酚酸B的1H-NMR数据为δ3.05(4H，m)，5.19(2H，dd，J＝4.7)，4.42(1H，d，J＝4.6)，5.79(1H，d，J＝4.7)，6.32(1H，d，J＝15.6)，7.53(1H，d，J＝15.9)，7.71(1H，d，J＝8.5)，6.88(1H，d，J＝8.5)，6.67(1H，d，J＝1.8)，6.40(1H，dd，J＝1.8/8.06)，6.63(1H，d，J＝8.0)，6.71(1H，d，J＝8.03)；试验测得结晶II的1H-NMR数据为δ3.05(4H，m)，5.2(2H，dd，J＝5.2)，4.40(1H，d，J＝5.2)，5.80(1H，d，J＝5.2)，6.32(1H，d，J＝16)，7.53(1H，d，J＝16)，7.71(1H，d，J＝8.4)，6.88(1H，d，J＝8.4)，6.67(1H，d，J＝1.6)，6.44(1H，dd，J＝1.6/8.0)，6.63(1H，d，J＝8.0)，6.71(1H，d，J＝8.0)。
13C-NMR所得的全去偶碳谱总共出现了36个碳信号，丹酚酸B的分子式中有36个碳，两者相符。
LC-MS用LC-MS测得质谱图中的分子离子峰为718，丹酚酸B的分子式为C36H30O16，分子量为718，结晶II和丹酚酸B的分子量相同。
经上述比较，确证所制得的结晶II为丹酚酸B。用高效液相色谱方法测定，采用峰面积归一化法计算其相对含量为93.7％。
实施例2 丹酚酸A和丹酚酸B的测定方法色谱条件使用Inertsil C8-3柱5um(250×4.6mm)；乙腈-水-甲酸(体积比24∶76∶0.8)为流动相；柱温25℃；流速1.0ml/min；检测波长280nm。
对照品溶液的制备分别精密称取丹酚酸A对照品和丹酚酸B对照品各约5mg，置同一50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度。
供试品溶液的制备精密量取香丹注射液或丹参注射液2ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。
测定方法分别准确吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，用峰面积按外标法计算，即得。
按以上方法，对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液的色谱图见附图。
色谱系统适用性试验按丹酚酸A计算，测得色谱柱的理论板数为6.0×103，丹酚酸A与前、后相邻的组分可以完全分离，丹酚酸B与其前色谱峰可以完全分离，与其后色谱峰的分离度为1.5，丹酚酸B与前、后相邻的色谱峰也可以完全分离。丹酚酸A和丹酚酸B色谱峰的脱尾因子分别为1.1和1.2，峰形基本对称。
方法的验证
专属性从附图可以看出，制剂的阴性对照对测定无干扰。
线性与范围经测定，丹酚酸A进样量在0.25～2.5μg之间，以峰面积对进样量(μg)回归，回归方程为A＝1.251×106X+3.229×104，r＝0.9998，丹酚酸B进样量在0.25～2.5μg之间，以峰面积对进样量(μg)回归，回归方程为A＝7.946×105X+2.085×103，r＝0.9993，峰面积与进样量呈良好的线性关系。
精密度测得对照品溶液中，丹酚酸A和丹酚酸B日内精密度的RSD分别为0.6％和0.9％，日间精密度的RSD分别为1.2％和1.8％。
准确度测得香丹注射液中丹酚酸A的平均回收率为99.2％，RSD为1.6％，丹酚酸B的平均回收率为98.5％，RSD为2.0％。测得丹参注射液中丹酚酸A的平均回收率为100.8％，RSD为2.0％，丹酚酸B的平均回收率为98.8％，RSD为2.2％三、测定结果按以上方法测得几批香丹注射液和丹参注射液的含量如下
以下通过药效学试验说明本发明药物采用上述质量控制方法的安全性。
试验例1注射剂中丹酚酸类成份进行了过敏性试验。
采用丹参总酚酸为指标成分，其用量大小可间接反应药物的药效和毒副作用；用英国种豚鼠为实验动物，按《新药临床前研究指导原则》进行试验，结果豚鼠按0.33ml 5％总丹酚酸溶液/kg给药时，未出现过敏反应，但给药量增至上述剂量的5倍和10倍时，均出现过敏反应。根据人和动物剂量的折算方法，计算出人的安全剂量为20.7mg丹酚酸/次，按注射10ml计算，注射液中丹酚酸浓度的限度应为2.1mg/ml，考虑到丹酚酸类成分为有效成分，且用药的个体差异不同，结合对多批样品的测定结果，确定注射液中丹酚酸的浓度控制范围为每毫升含丹酚酸A 0.5～1.0mg、丹酚酸B 0.5～1.0mg。
上述实验说明，用丹酚酸A、丹酚酸B为指标成分，进行质量控制，稳定性强，可控性高，虽然不能证明丹酚酸A、丹酚酸B是直接过敏源，但通过控制其含量，间接达到控制注射剂过敏性的目的，因此，使含有原料丹参的注射制剂更安全、可控、稳定，临床提供了安全用药的保证。
权利要求
1.一种含有原料药材丹参的注射剂，其特征在于每制剂单位中含有丹酚酸A0.5～7.5mg、丹酚酸B0.5～7.5mg。
2.根据权利要求1所述的含有原料药材丹参的注射剂，其特征在于所述的每制剂单位是指粉针剂的每克，注射液的每毫升。
3.根据权利要求2所述的含有原料药材丹参的注射剂，其特征在于所述的注射液每毫升含丹酚酸A 0.5～1.0mg、丹酚酸B 0.5～1.0mg。
4.根据权利要求1、2或3所述的含有原料药材丹参的注射剂，其特征在于所述的丹酚酸A和丹酚酸B的对照品是由下述方法制备丹参药材经水煮醇沉法提取，挥去乙醇后用氯仿提取，弃去氯仿液，水层酸化后，用醋酸乙酯提取丹酚酸；采用硅胶柱层析分离丹酚酸中的丹酚酸A和丹酚酸B，以氯仿-醋酸乙酯-甲酸系统为洗脱剂。
5.一种控制权利要求1所述的含有原料药材丹参的注射剂的质量的方法，其特征在于它是由丹酚酸A和丹酚酸B为指标性成分进行定性、定量控制，每制剂单位中含有丹酚酸A 0.5～7.5mg、丹酚酸B 0.5～7.5mg。
6.根据权利要求5所述的含有原料药材丹参的注射剂的质量控制方法，其特征在于所述的定量控制方法为采用高效液相色谱法，该注射剂的HPLC图谱如图1所示，由两个特征峰组成；使用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-甲酸系统为流动相；柱温25℃；流速1.0ml/mim UV 280nm检测；供试品溶液和对照品溶液采用流动相配制，供试品溶液用流动相稀释至12.5倍的体积，使用外标法测定含量。
7.根据权利要求6所述的含有原料药材丹参的注射剂的质量控制方法，其特征在于所述的两个特征峰的平均相对保留时间tR为丹酚酸A tR＝1.00，丹酚酸B tR＝0.7～0.9。
8.根据权利要求6所述的含有原料药材丹参的注射剂的质量控制方法，其特征在于所述的乙腈-水-甲酸的体积比为24∶76∶0.8。
全文摘要
本发明提供了一种含有原料药材丹参的注射剂，每制剂单位中含有丹酚酸A0.5～7.5mg、丹酚酸B 0.5～7.5mg。本发明还提供了含有原料药材丹参的注射剂的质量控制方法，通过对丹酚酸A、丹酚酸B的定量控制，保证注射剂用药的安全性和有效性，使制剂质量稳定、可控性强，且检测方法先进、准确、简便，适用于常规分析，对控制含有原料药材丹参的注射剂诸如香丹注射液和丹参注射液等的质量具有重要的作用。
文档编号A61P9/10GK1788748SQ20041008152
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者曾晓春 申请人:雅安三九药业有限公司