专利名称：治疗眼新生血管化疾病的RNAi治疗药物的制作方法
本申请要求2004年2月5日提交的美国临时申请系列号60/541,775的优先权，该临时申请的内容通过引用整体结合到本文。
背景技术：
许多不同的眼病是过度新生血管化(NV)——眼内部血管的异常增殖和生长的结果。眼NV本身的发展不但对视力产生不利后果，而且还是许多严重眼病中的早期病理步骤；尽管已引入新的治疗药物，但它在美国和欧洲仍是造成永久失明的最普遍原因。有几种主要的眼病会促进异常的新生血管形成，导致引起失明的进一步损害。遗憾的是，对于患有任一这类眼NV疾病的患者，只存在很少几种治疗选择。最常用的认可疗法是维速达尔(Visudyne)光动力疗法，该法使用光线来激活新生血管化附近的光敏剂，以破坏不需要的血管。它对许多试验对象是无效的，即使有效也不能防止复发。最近批准的药物Macugen有些益处，但对大多数试验对象仍无效。另外，Macugen的眼内给药会导致发生刺激和感染风险，这两方面都是不利的因为会加重新生血管化的病状。因此，存在对有效治疗法极大和增长的未满足的临床需求，这种治疗要么是抑制疾病的进展，因为疾病进展往往迁延过久，要么是逆转不需要的血管发生。
美国国家卫生研究院(NIH)的国家眼科学院(National Eye Institute)估计有400,000名美国人患有某种形式的眼疱疹，而且美国每年诊断出将近50,000个新病例和复发病例，其中较为严重的基质角膜炎约占25％。从更大规模的研究发现，眼疱疹复发率一年内为10％，两年内为23％，二十年内为63％。尽管应用现有的抗病毒药物能在一定程度上控制HSV感染，但仍没有能治疗HSV引起的基质角膜炎和保护试验对象免于失明的有效药物。
眼新生血管化疾病可分为影响眼前部或眼睛前部和影响眼后部或视网膜的疾病。这些不同区域的NV的发生可能有不同的起源，但不论是眼睛的哪个区域，NV过程的生化和生理特征本质上近乎相同。因此，用以干预眼NV生化特征的有效方法展示的前景，是给以眼NV为主要病理症状或潜在病理症状的任何眼病提供有效治疗法，而不论这些眼病作用于眼前部还是眼后部。尽管如此，眼前部和眼后部的组织差别是相当大的，这些差别可显著影响便于治疗剂到达组织和细胞的给药治疗法的这种最有效方法。
眼后部NV疾病当为视网膜供氧的微小血管受到损害时会发生眼糖尿病性视网膜病(DR)。这种损害会让血液和分泌液逸出到视网膜中，而且还导致新血管生长。这些新血管较脆，往往会出血到眼睛的玻璃体区域，干扰视力。患有最严重型DR的试验对象不加治疗将有导致严重视力丧失的重大风险。在这些疾病中，新生血管化是主要的疾病病理。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是60岁以上人群的最主要失明原因，且这个问题每年都变得更严重。在AMD中，中央视觉的丧失使得清晰识别成为不可能。就个人和社会负担的AMD数量整体而言，造成这种疾病的原因及其如何发展没有被更多地认识到或许令人奇怪。不过人们还是清楚，视网膜色素上皮细胞(RPE)起着关键的作用。异常废物在RPE底下和内部积累，致使RPE细胞最终死亡。视网膜的视杆细胞和视锥细胞的存活依赖于正常执行功能的RPE，因此RPE功能的失效会导致逐渐失明。这种疾病引起眼睛后部发生结疤过程，导致新生血管的形成(新血管化)。在一大部分患有“湿性AMD”的试验对象中，视网膜前部的渗漏新血管系统持续过度增殖，这也会使视力模糊和扭曲。在这种疾病中，试验对象群体的大部分人在疾病稍后的严重阶段有破坏性新生血管持续增生。
眼色素层炎是起源于眼睛内部组织过度或持续发炎的一种眼病。随着时间推移色素层炎会导致新生血管化，从而损害视力。这种疾病可在眼睛的几个不同区域发展，如局限于眼后部，或者弥散于包括眼后部区域的众多区域各处。这种疾病起源于炎症，而炎症可由包括病毒感染的多种原因引起。共通性是过度和持续的炎症，导致破坏性病理过程(包括新生血管化)和最终失明。
眼前部NV疾病虹膜红变是描述虹膜和眼前部结构上异常血管生长的术语。通常该区域的血管不可见。当视网膜缺氧或局部缺血如糖尿病性视网膜病或静脉阻塞的情况时，会有异常血管形成，以给眼睛供氧。遗憾的是，这些血管的形成阻碍房水从眼前部排出，使眼压升高。这通常会导致新生血管性青光眼。
眼色素层炎是起源于眼睛内部组织发炎的一大类疾病。这种疾病在解剖学上最常分成前色素层炎、中色素层炎、后色素层炎或弥漫性色素层炎。眼色素层炎的眼并发症会引起深度的和不可逆的失明，尤其是未被识出或未得到适当治疗时。最常见的并发症包括白内障、青光眼、视网膜脱离，及视网膜、视神经或虹膜的新生血管化等。
脉络膜新生血管化(CNV)是一大类眼病的潜在病理，该眼睛区域具有新生血管化的特征。相关的一类眼病是眼睛感染的结果，包括结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿和虹膜炎，而且这些全是眼新生血管化的主要原因并导致失明。在美国，复发性HSV感染是角膜失明的最常见感染原因。这种病毒感染造成称之为基质角膜炎(SK)的致盲性损伤。角膜NV是疱疹性SK引起的视力丧失过程中的早期步骤。
眼NV生物化学和生理学如同其他组织一样，眼组织常处于需要新生血管化的连续维护状态。这个必需过程由促进因子和抑制因子之间的平衡来维持平衡。遗憾的是，在许多眼新生血管化疾病中没有恰当的维持这种平衡，结果造成破坏性新血管过度生长。不管是什么眼睛区域和疾病，尽管病理的起因及其在视力丧失中的作用差别很大，但这种过度新生血管化的过程几乎完全相同。病理过程的共同特征为这些不同眼部疾病的有效治疗干预提供了方法。
正常角膜是无血管的，HSV本身并不表达任何血管生成蛋白质，但被感染的眼组织表达诱导角膜NV的血管生成因子。血管生成因子的产生最初出现在被病毒感染的角膜上皮非炎性细胞，然后在临床阶段由基质中的炎性细胞(PMN和巨噬细胞)表达。通过移植纯化的HSV病毒DNA片段(HSV DNA，富含CpG基序)或合成的CpG寡核苷酸(CpG ODN)建立了HSV诱导角膜NV的小鼠模型。这个模型被认为能提供角膜NV和疱疹性SK疾病的临床相关模型，且可用于测试抑制眼NV疾病的治疗方式的有效性。
一种引人注意的治疗干预方法是抑制这些疾病的共同病理条件。从许多研究中已确定，VEGF介导的新生血管化和血管发生是许多眼新生血管化疾病的共同病理途径之一。VEGF介导的血管发生途径在所有这些NV相关眼病的血管发生中起主要作用。VEGF家族由五种结构上相关的生长因子组成VEGF-A、胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。已知的受体包括三种结构上同源的酪氨酸激酶受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，它们与不同VEGF成员具有不同亲和性或相关功能。虽然对四种VEGF成员的功能和调节知之甚少，但已知VEGF-A能结合VEGFR-1和VEGFR-2，诱导新生血管化和血管发生以及增加血管通透性。VEGFR-1和VEGFR-2在增生的内皮中均被上调，这可能是对VEGF-A或低氧的直接响应。VEGFR-1对VEGF-A的亲和性比VEGFR-2高。VEGFR-2据认为负责血管生长的血管生成信号，而对VEGFR-1的功能却知之甚少。一些研究提示其在转导血管生成信号中的直接作用及在能动性和通透性方面的作用。对血管发生的VEGF途径中的关键参与者的这种认识，促使了对以VEGF-A抑制剂作为候选治疗药物(包括macugen，一种抑制VEGF与其受体结合的适体寡核苷酸)的研究。虽然在眼血管发生以及在其他血管发生疾病如肿瘤生长方面的研究已证实VEGF途径对临床疗效的价值，但实验药物对许多试验对象远未能奏效。显然，如果我们要为这些主要的眼病开发出治疗法，则需要有更好的VEGF途径抑制剂。
发明概述本发明提供使用RNAi药物，包括小干扰RNA或siRNA(双链RNA寡核苷酸)及给药系统来抑制促血管生成因子的表达从而抑制眼NV疾病的组合物和方法。
因此本发明的一个目标是提供包含至少一种dsRNA寡核苷酸和药物载体的组合物，其中当对患有新生血管化或血管发生有关的眼病的试验对象给药时，所述dsRNA抑制与眼病中新生血管化或血管发生有关的基因的表达。
本发明的又一个目标是提供用以治疗试验对象眼病的方法，其中所述疾病特征至少部分是新生血管化，该方法包括给予所述试验对象包含dsRNA寡核苷酸和药学上可接受载体的组合物，其中所述dsRNA寡核苷酸抑制能促进所述试验对象眼新生血管化的基因的表达。
在一个实施方案中，药物载体选自聚合物、脂质或胶束。载体可选自例如聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物和配体官能化亲水聚合物接枝聚合物。
眼病可选自基质角膜炎、色素层炎、发红、结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、黄斑变性和视网膜病。眼病可至少发生在眼前部。可在眼远端部位给予组合物，例如可结膜下、静脉内和皮下给药，和/或可在眼睛局部给予组合物。
在另一个实施方案中，dsRNA抑制选自以下的基因的表达促炎途径基因、促血管发生途径基因、促细胞增殖途径基因及病毒感染介质基因组RNA和病毒感染介质基因。组合物可包含至少两种dsRNA分子，其中每种dsRNA分子均抑制选自以下的基因的表达促炎途径基因、促血管发生途径基因、促细胞增殖途径基因及病毒感染介质基因组RNA和病毒感染介质基因。组合物可包含至少三种dsRNA分子，其中至少一种dsRNA分子抑制VEGF的表达，至少一种dsRNA分子抑制VEGF R1的表达，至少一种dsRNA分子抑制VEGF R2的表达。组合物可包含至少两种dsRNA分子，其中至少一种dsRNA分子抑制碱性FGF的表达，至少一种dsRNA分子抑制FGF R的表达。
dsRNA分子可抑制一种或多种VEGF途径基因、FGF途径基因或它们的组合的表达。dsRNA分子可抑制一种或多种促血管发生基因、促炎基因或它们的组合的表达。dsRNA分子可抑制一种或多种促血管发生基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。dsRNA分子可抑制一种或多种促血管发生基因、内皮细胞增殖基因或它们的组合的表达。dsRNA分子可抑制一种或多种促炎基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
组合物可包含至少三种能抑制至少两种或多种基因的表达的dsRNA分子。所述基因可编码VEGF、VEGF R1和VEGF R2、碱性FGF、FGF R和/或它们的组合。所述基因可为促血管发生基因、内皮细胞增殖基因、单纯疱疹病毒基因、促炎基因或它们的组合。
在这些组合物中，dsRNA分子可为dsRNA寡核苷酸。
附图简述
图1显示含三个功能域阳离子核心、立体聚合物和肽配体的TargeTranTM(TT)的结构示意图。TT与核酸发生电相互作用，引发自组装形成纳米颗粒，纳米颗粒将有效载荷选择性递送到具有配体受体的细胞。
图2显示siRNA介导的对VEGF途径基因的体外敲减。35mm孔中的RAW264.7 gamma NO(-)细胞(A)和SVR细胞(B)分别用靶向mVEGFA和mVEGFR1的siRNA以指示量转染。293细胞(C)用靶向mVEGFR2的siRNA和表达mVEGFR2的质粒以指示量共转染。转染48小时后，分离细胞RNA，通过mVEGFA的RT-PCR或mVEGFR1和mVEGFR2)的RS-PCR判断内源表达的mVEGFA或mVEGFR1的敲减情况，或mVEGFR2的外源表达敲减情况。
图3显示FITC标记的siRNA的眼部给药。CpG植入后六小时，分别通过局部途径(左)或全身途径(右)将FITC标记的siRNALuc与PT或TT一起给予小鼠。采用每眼10μg siRNA(局部给药)或每尾40μg(全身给药)一次的剂量。siRNA给药24小时后在荧光显微镜下检查眼球、肝脏和肺的冷冻切片。只显示了眼切片的结果。
图4显示在被感染并用siVEGFmix通过局部或全身给药治疗的角膜中VEGF mRNA水平下降。用1×105pfu HSV-1 RE感染小鼠，并在感染后第1天和第3天用靶向VEGF途径基因的siRNA通过局部(10μg/眼)或全身(40μg/尾)给药治疗后，在感染后第4天和第7天收集角膜，然后通过RT-PCR(A)或实时定量PCR(B)测量VEGF mRNA水平。
图5显示在被感染并用siVEGFmix通过局部或全身给药治疗的角膜中VEGF蛋白质水平下降。在感染后第7天处理两张角膜/小鼠，以测量VEGF蛋白质水平。如在材料和方法中所述，小鼠用HSV-1感染并用靶向VEGF途径基因的siRNA治疗，通过抗体捕捉ELISA估测其角膜裂解液上清的VEGF水平。结果以四只单独小鼠(每鼠2张角膜)的平均值±SD表示。在各组之间观察到VEGF蛋白质水平有统计学显著性差异(p＜0.05)。
图6显示靶向VEGF途径基因的siRNA的局部给药能抑制CpGODN诱导的血管发生。将CpG ODN(1μg)植入到小鼠角膜中的微袋24小时后，通过结膜下注射将10μg/眼的siLacZ、siVEGFA、siVEGFR1、siVEGFR2或siVEGFmix(靶向VEGF途径基因的总siRNA的等摩尔混合物)随PT一起给予小鼠。在CpG微球(pellet)植入(每组四只小鼠)后第4天和第7天测量血管发生面积。在各组之间观察到血管发生面积有统计学显著性差异(*p＜0.05，**p＜0.01)(A)。NV由第7天摄取的照片显示(40x)(B)。
图7显示针对VEGF途径基因的siRNA的全身给药能抑制CpGDNA诱导的血管发生。在CpG ODN诱导后6小时和24小时，将针对VEGF途径基因的单个siRNA或总siRNA混合物通过尾静脉注射给药。在CpG微球植入(每组四只小鼠)后第4天和第7天测量血管发生面积。在各组之间观察到血管发生面积有统计学显著性差异(*p＜0.05，**p＜0.01)(A)。NV由第7天摄取的照片显示(40x)(B)。
图8显示TargeTranTM介导的全身给药增强了siRNA的功效，并在CpG ODN诱导后6小时和24小时显示剂量反应。将被测抗生血管siRNA的混合物或非相关siLuc对照分别随TT一起全身给药。siVEGFmix还随PBS一起给药。在CpG微球植入后第4天和第7天测量血管发生面积；在各组(每组四只小鼠)之间观察到统计学显著性差异(*p＜0.05)(A)。以每鼠10、20、40和80μg总siRNA的剂量全身给药靶向EGF途径基因的混合siRNA，进行剂量反应实验。在CpG微球植入后第4天和第7天测量血管发生面积，比较不同剂量之间的抗生血管效率(B)。
图9显示siRNA介导的HSK和血管发生严重程度的降低。以每眼1×105pfu HSV-1 RE感染小鼠，在感染后第1天和第3天分别用siVEGF mix或siLuc局部和全身治疗。在感染后第10天计算HSK临床评分的平均值(A)或临床生血管评分的平均值(B)。每个点代表每只眼睛的临床评分。横棒和括号内的数字表示每组的平均值。数据收集两组平行实验，每组6只眼睛。在各组之间观察到HSK或血管发生评分有统计学显著性差异(p＜0.05)。感染后第14天，在siLuc治疗的小鼠受感染角膜中可见血管过度生长和溃疡形成，而siVEGF mix治疗的小鼠在接近角膜缘的区域显示较少的NV。局部和全身给药均显示NV面积明显减少。全身给药结果见照片(C)。
图10显示绿色荧光标记的siRNA在荷瘤小鼠中的组织分布。小鼠通过静脉注射以P-nanoplex(左列)或RPP-nanoplex(中列)或水溶液(右列)形式接受40mg荧光标记的siRNA。注射后一小时，解剖组织并在荧光显微镜上检查。每个组织均以相等的曝光时间拍照。P-nanoplex在所有器官中均显示点状荧光，在肺和肝脏中尤其强烈。RPP-nanoplex在肺中显示较弱的荧光水平，为点状分布，而在肝脏中则是较弱的非点状荧光。相比于P-nanoplex，在肿瘤中观察到较高的荧光水平。与两种nanoplex制剂的任一种相比，给予游离siRNA后所有器官中荧光水平都非常低。
图11显示静脉给予复合于纳米颗粒中的导向VEGFR2的siRNA对肿瘤新生血管化和VEGFR2蛋白质水平的抑制作用。(B-D)用siRNARPP-nanoplex治疗的肿瘤中的新生血管化。对肿瘤生长抑制实验结束时切除的代表性肿瘤进行低倍光学显微镜检。对肿瘤和周围皮肤组织的透照显示，在不进行治疗的小鼠(B)和用带siRNA-LacZ的RPP-nanoplex治疗的小鼠(C)中有强烈的新生血管化。相反，用带VEGFR2siRNA的RPP-nanoplex治疗的小鼠显示较低的新生血管化和杂乱的血管分支(D)。星号表示肿瘤组织。标尺＝2mm。(E)siRNA RPP-nanoplex治疗后肿瘤组织中的VEGFR2表达。将肿瘤生长抑制实验结束时切除的代表性肿瘤(A)均浆，通过蛋白质印迹法测量VEGFR2表达水平。左泳道是未进行治疗的肿瘤，中间泳道是用LacZ siRNA治疗的肿瘤，右泳道是用VEGF R2 siRNA治疗的肿瘤。
图12显示阴性对照siRNA(siLuc)治疗的眼睛视网膜中渗漏新生血管化抑制情况的绿色荧光测量结果与VEGF途径活性siRNA(siMix)治疗的眼睛视网膜中渗漏新生血管化抑制情况的绿色荧光测量结果的对比。铺片揭示给予靶向VEGF、VEGF R1和VEGF R2的活性siRNA抑制剂对NV有抑制作用，但对荧光素酶表达有特异性的阴性siRNA却没有抑制作用。绿色荧光染料在渗漏新生血管化部位的渗入由铺片镜检方法获得的图像中的绿色观察到。左边图像获自阴性对照siRNA寡核苷酸即siLuc治疗的眼睛，显示由于渗漏新生血管化造成的绿色荧光。右边图像获自活性siRNA寡核苷酸即siMix治疗的眼睛，显示与阴性对照相比，由于渗漏新生血管化减少造成的绿色荧光减少。
发明详述本发明提供用以治疗眼新生血管化疾病如糖尿病性视网膜病(DR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、色素层炎、基质角膜炎(SK)和癌症的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明采用RNAi介导的对细胞和生化途径的抑制来实现对眼病的抑制。本发明提供包括siRNA寡核苷酸在内的RNAi药物来抑制1)病毒感染的基因表达，2)炎性细胞和生化途径，3)促血管发生细胞和生化途径，包括VEGF、VEGF受体、FGF、FGF受体、PDGF和PDGF受体，4)介导眼新生血管化的细胞增殖，和5)它们的组合。在一个实施方案中，本发明采用全身给药的化学合成载体来递送合成的siRNA寡核苷酸。本发明提供siRNA介导的局限于眼组织和发生新生血管化疾病的组织的抗血管发生效应。本发明为核酸药物、蛋白质或肽和为小分子抑制眼病的过度新生血管化提供方法。本发明还对诱导不需要的眼新生血管化的多个因子和多个生化途径的抑制提供药物组合。本发明还提供将治疗药物给予眼组织的临床手段。本发明的方法和组合物可用以治疗由眼睛感染、糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和眼癌症引起的眼新生血管化。
VEGF是负责正常血管生成和血管再塑的必需生长因子。在某些疾病条件下，例如在肿瘤状况下(其中形成新生血管以向快速生长的异常组织传送足够的氧和营养物)，VEGF生血管途径将被激活。在美国，大多数严重视力丧失由局部缺血性眼病如糖尿病性视网膜病、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病试验对象中联合视网膜新生血管化的并发症引起。生血管蛋白质VEGF的眼内表达与这些人类病症中的新生血管化和与小鼠中局部缺血诱导的视网膜新生血管化密切相关。因此，由VEGF和VEGF受体组成的的VEGF途径是抑制视网膜血管发生的合理靶标。
可获得公布的临床相关动物模型，以便评估抗生血管药物，开发出针对眼NV疾病的新型治疗药物。一种视网膜血管发生临床相关动物模型采用低氧来诱导过度血管发生。另一种视网膜血管发生模型采用激光烧伤来造成出现血管发生的视网膜损伤。一种角膜NV临床相关动物模型采用通过预先植入到小鼠角膜基质的微袋中的CpG或通过HSV感染进行的疾病诱导，这样可容易地测量对血管发生的抑制作用。可首先在细胞培养物中测试候选治疗药物的效果，然后在疾病的临床相关动物模型中有选择的进行研究。
RNAi治疗方法RNAi，双链RNA(dsRNA)诱导序列特异性的信使RNA(mRNA)的降解，常称为基因沉默，它已被证明是发现基因或验证基因的一种强有力工具，且在开发新型基因特异性药物中拥有极大的潜力。在我们为抑制眼NV而进行的抗生血管RNAi设计中，选择了VEGF生血管途径的关键参与者mVEGF-A、mVEGF-R1和mVEGF-R2作为靶基因。小干扰RNA(siRNA)根据Tuschl的研究小组建议的一般指导方针进行设计。该siRNA是21核苷酸长的双链RNA，在任一3′末端均带2-nt突出端，负链与靶mRNA序列互补。单独或组合敲减这些基因，具有阻断生血管途径、导致NV被抑制，从而减轻SK症状的效果。相同的方法适用于其他NV相关眼病。
迄今为止，尚没有给予RNAi药物至靶向眼新生血管化的合适技术报道。因此，针对眼新生血管化疾病的RNAi药物的专利核酸给药系统存在极大的需求。RNA干扰(RNAi)的应用在细胞培养和模式生物如果蝇、线虫、纹斑鱼中已取得飞速的发展。对RNAi的研究已发现，长dsRNA由切酶(一种细胞核糖核酸酶III)加工，产生带3′-突出端的约21nt双链体，称为短干扰RNA(siRNA)，其介导序列特异性的mRNA降解(4，5，6)。对RNAi的机制及其快速扩大的应用的认识，代表了生物医学领域近十年来的重大突破。应用siRNA双链体来干扰特定基因的表达需要靶标可接近性的知识，但还受阻于缺乏给予siRNA到眼NV疾病的靶细胞的有效手段。随着有关siRNA作为功能基因组工具的文献的飞速增多，人们对将siRNA用作新型治疗药物的兴趣不断涌现。治疗应用显然要依赖于有效的局部和全身给药方法。使用siRNA作为治疗药物的优点显然应归于其特异性、稳定性、效力、自然作用机制，以及靶向不同基因靶标的药物的一致化学特性，因为这些药物只在核苷酸序列上有所不同。
我们已用siRNA使肿瘤模型中的促血管生成因子沉默，并已证实了强烈的基因沉默效应(10)。这个进展证实了RNAi在体外和体内使促血管生成因子沉默的可行性和有效性，并证明我们的分子设计和专利给药系统适用于siRNA介导的基因沉默来治疗眼新生血管化。已将称之为TargeTranTM的全身给药系统用于siRNA的给药(11)。siRNA给药载体是基于Woodle等(WO 01/49324，其内容通过引用整体结合到本文中)描述技术的阳离子聚合物。本文所用的“合成载体”指多功能合成载体，其最少含有核酸结合结构域和配体结合(即组织靶向)结构域，并与核酸序列复合。合成载体还可含有其他结构域，例如亲水聚合物结构域、内体破坏或解离结构域、核靶向结构域和核酸凝缩结构域。用于本发明的合成载体优选能使非特异性相互作用减少，但仍能有效地参与配体介导的(即特异性的)细胞结合。另外，用于本发明的合成载体能够与一种或多种治疗核酸形成复合物，并随后可给予试验对象。我们已用这种全身方法通过尾静脉注射在啮齿类动物中给予这些siRNA。对VEGF A、VEGF R1和VEGF R2的敲减作用导致眼新生血管化明显被抑制(13)。
我们还使用了另一种称之为PolyTranTM的基于聚合物的载体来在体外和体内给予siRNA。这种技术(参见WO 0147496，其内容通过引用整体结合到本文中)能够极大地减少由CpG在本应无血管的小鼠眼角膜中诱导的新血管系统形成。我们在siRNA设计和实验中取得的成功显示了开发RNAi治疗药物以治疗疱疹性SK和其他生血管眼病的巨大可能性(图1-3)。
RNAi和治疗药物本发明提供能抑制基因表达和干预眼新生血管化的干扰RNA药物。本发明提供许多形式的干扰RNA分子作为治疗药物，包括双链RNA(dsRNA)寡核苷酸、小发夹RNA(shRNA)和DNA衍生的RNA(ddRNA)。本发明还提供因其序列而有活性，但未必被认为是“RNA干扰”的核酸药物，包括诱杀性寡核苷酸、反义、核酶、基因表达和适体。这些核酸和其他治疗药物具有净负电荷或其他物理特性，这样本发明的制剂和组合物可被眼组织和细胞接触并在需要时吸收。
RNAi是可用来敲减基因表达，从而以序列特异性方式破坏mRNA的有效方法。可操纵RNAi，以快速和持续的方式提供生物功能。本发明提供对基因进行选择性干预的RNAi药物来治疗眼NV或其他NV相关眼病，以此作为控制人类眼病的手段。
干扰RNA的设计RNAi药物设计成具有与靶向基因的一段序列匹配的核苷酸序列。选定的靶向基因的RNAi序列可在由该基因表达所产生的mRNA的任何部分。RNAi包含能与来自靶基因的mRNA杂交的序列，即RNAi序列的“反义链”。RNAi序列包含能与反义链杂交的序列，即RNAi序列的“有义链”。所选靶向序列的RNAi序列不应与细胞所产生的任何其他mRNA同源，也不应与不被转录成mRNA的靶向基因的任何序列同源。已知有多种设计规则，包括市售的方法，是从靶mRNA序列选择20-27碱基的序列。这些设计方法不断发展，可采用当前最流行的方法。可从至少三个方法获得设计方案，然后从这些方法构建和装配最高优先的单一共有序列表。本发明发明人发现制备至少6个最高优先的候选序列，然后进行细胞培养以测试其基因抑制能力，几乎都能够揭示出至少两个活性RNAi序列。如果不是这样，则可进行第二轮的获取6个最高优先的候选序列并用于试验。
设计工作除需要鉴定活性RNAi序列外，还必须确保只与所需的mRNA序列有同源性。RNAi序列与靶基因mRNA的基因组序列之外的基因组序列同源性差，能在mRNA水平或基因水平减少脱靶反应(off-target effect)。同样，RNAi序列的“有义链”同源性差，也能减少脱靶反应。通过用Clone Manager Suite(SciEd Software，Cary NC)进行DNA比较和通过在线Blast检索，可确认选定基因的靶向序列是独特的，且缺乏与其他基因(包括人类对等基因)的序列同源性。例如，与mVEGF-A的mRNA匹配的序列经确认对mVEGF-A是独特的，与mVEGF-B mRNA、mVEGF-C mRNA、mVEGF-D mRNA或人类对等基因(包括hVEGF165-a(AF486837))没有同源性。但是，匹配的序列会靶向mVEGF-A的多个同种型，例如分别编码190氨基酸(aa)、141aa、146aa和148aa mVEGF-A蛋白质的mVEGF(M95200)、mVEGF115(U502791)、mVEGF-2(S38100)、mVEGF-A(NM_192823)。所有这些公开的mVEGF-A同种型的cDNA序列，除mVEGF-A(NM_192823，蛋白质的成熟形式)之外，其N端均包含26aa信号肽。mVEGF的靶向序列不是选择在信号肽部分，而是选择在所有这些mVEGF-A同种型共有的成熟蛋白质部分。mVEGF-R1和mVEGF-R2的靶向序列也被证实分别对这两个基因是独特的。本发明包括不同形式的干扰RNA。例如，小干扰RNA(siRNA)采用已知的指导方针按上述靶序列进行设计。这些siRNA是21nt双链RNA寡核苷酸，3′突出端为2nt(TT)。靶向序列(mRNA序列)和siRNA的序列在表1中列举。
RNAi药物对靶基因序列具有特异性，这取决于基因的物种。大多数哺乳动物基因具有很高的同源性，这样可选择RNAi药物，以对所有带有基因mRNA的该同源区段的物种中的基因产生活性。本发明的优选RNAi药物设计与人基因mRNA序列有完全的同源性，与至少一种用于毒性试验的动物物种的基因mRNA有足够同源性，以对该动物物种基因产生活性。
RNAi药物对靶基因序列具有特异性，这可包括对单核苷酸多态性(SNP)的特异性。本发明优选的RNAi药物设计是与疾病病理相关的全部多态性的靶基因的所有人基因mRNA序列有完全的同源性，与疾病病理无关的全部多态性的靶基因的所有人基因mRNA序列有较少的同源性。
表1.基因及部分靶向mRNA序列(显示反义链)
临床相关动物模型最近的小鼠眼模型提供了可行的角膜NV临床相关模型。在这个模型中，用纯化的HSV DNA(富含CpG)和/或合成的CpG基序-寡核苷酸(CpG ODN)，而不是用HSV干扰或VEGF蛋白质，来诱导角膜中的VEGF表达，从而诱导NV和角膜SK。在这个模型中，易于诱导新生血管化并加以测量。本发明采用这个模型来测试干扰RNA并收集有关CpG诱导SK的RNAi疗法的数据，以提供定量数据，产生接近于HSV感染相关的人眼SK的环境。
对病毒感染的抑制眼新生血管化的一种已确立的原因是疱疹和其他病毒感染。一种干预病毒感染衍生的眼新生血管化的手段是抑制病毒感染的起源。RNAi药物利用的是对dsRNA病毒感染有活性的内源过程，但事实上可用来具有高度选择性的抑制几乎任何mRNA的表达。本发明提供用以抑制眼病毒感染的RNAi药物作为干预眼新生血管化的手段。本发明的RNAi药物包括短dsRNA寡核苷酸——siRNA，其具有与病毒基因序列匹配的序列，缺乏对人类基因的序列特异性。本发明的RNAi药物能抑制由DNA或RNA病毒感染所表达的mRNA，能降解dsRNA病毒感染的基因组。本发明的RNAi药物所抑制的一种DNA病毒感染是引起疱疹性基质角膜炎的HSV。这种病毒具有相对较大的保持游离的基因组，病毒mRNA的表达水平随时间推移有升有降。连续低水平的HSV病毒mRNA表达导致持续的(尽管是潜伏的)感染，这种感染不时会发作。本发明的RNAi药物可用来抑制感染复发引起的HSVmRNA表达升高。通过降低感染出现发作的能力，RNAi药物能防止眼新生血管化疾病被诱发。RNAi药物还可用于将连续的低水平HSVmRNA表达减少至更低的水平，这能降低HSV感染出现发作的能力。RNAi药物能有效地抑制导致眼新生血管化的眼组织DNA和RNA病毒感染。
对促进眼NV的炎性细胞和途径的抑制炎症是涉及许多细胞和生化因子的过程，这个过程尽管复杂，但在各种组织中却是高度保守的。炎症中的一个早期事件是组织低氧、损伤或其他伤害所引起的激活因子分泌。这些因子能激活细胞，诱导炎性细胞募集到组织中，炎性细胞再分泌出另外的激活因子。炎症的诱导的一个共同生化途径是TNF和IL-1的分泌。这些因子主要以并行的方式起作用，因此要强烈抑制它们对炎症级联的激活作用需要同时干预它们两者。在此点下游，炎症级联导致诱导新生血管化的因子的分泌，炎症过程提供了许多可供干预的点引发级联的分泌性因子的上游；和负责激活级联中的特定细胞的因子的下游，如内皮细胞从血液募集嗜中性粒细胞和内皮细胞诱导新生血管化。本发明提供能有效抑制因子上调的RNAi药物，所述因子在炎症中的作用取决于其基因的表达。虽然许多分泌性因子存在于细胞中并被释放出来引发炎症，但对于炎症的不断发展和对于炎症的持续存在来说，对上述这些因子的表达进行上调是重要的。本发明的RNAi药物提供了对持续性炎症的抑制，而持续性炎症是造成眼新生血管化疾病的更强因素。有多种因子参与到炎症途径中，特别是导致眼新生血管化疾病的持续性眼炎症，重要的是包括内皮细胞激活。
对介导眼NV的生血管途径的抑制血管发生过程和炎症一样，虽然复杂但在各种组织中却高度保守。另一个相似性是几种分泌性因子所起的主要作用。有一个早期步骤由涉及VEGF生长因子的分泌的VEGF途径驱动，所述VEGF生长因子结合并激活携带VEGF家族不同成员的受体的细胞。这些生长因子还与其他受体(例如NP-1)发生相互作用，从而刺激携带这些受体的细胞，包括肿瘤细胞。另一种主要的分泌性生血管生长因子是bFGF，其激活单独一套受体。这两种途径均激活邻近血管系统中的内皮细胞，刺激它们发生增殖和迁移，从而在分泌生长因子刺激物的区域形成新的血管系统。但是，VEGF诱导的胞内激酶信号转导途径和bFGF途径在与c-RAF或其下游靶转录因子如NFkB有关的公共点合并。因此，VEGF途径和bFGF途径在它们合并前以略为并行的方式起作用。新生血管化的这些分泌性生长因子途径代表了供进行本发明所提供的治疗干预的非常有用的点，所述治疗干预可通过抑制生长因子或其受体或两者来进行。本发明还提供同时抑制两种途径，以及抑制这些途径所诱导的胞内信号，如诱导的信号转导激酶，或者在优选的实施方案中为转录因子。转录因子已被确立为有用的治疗干预点，但常规治疗方式对其却难以对付。本发明提供抑制蛋白质(包括转录因子)的表达的RNAi药物，这使得现在能够在新生血管化的这些关键胞内步骤进行治疗干预。
VEGF家族由五个结构上相关的成员组成VEGF-A、胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。VEGF受体家族中存在三种结构上同源的酪氨酸激酶受体VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR或Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)，它们与不同VEGF成员具有不同亲和性或相关的功能。虽然对其他四种VEGF成员的功能和调节知之甚少，但已知VEGF-A能结合VEGFR-1和VEGFR-2，诱导新生血管化、血管发生和血管通透性。为在功能上与其特异性受体发生相互作用，VEGF自然形成同型二聚体。VEGFR-1和VEGFR-2在肿瘤和增生的内皮中均被上调，这可能是对VEGF-A或部分上对低氧的直接响应。普遍认为VEGFR-2介导血管生长的血管生成信号，且为增殖所必需。但是，VEGFR-1的功能却不甚明确。VEGFR-1对VEGF-A的亲和性比VEGFR-2高，且能介导运动性和通透性，因此在转导血管生成信号中发挥作用。对VEGF和VEGF受体的基本生物学性质的认识，为设计靶向VEGF信号传导途径的方法提供了坚实的基础。本发明提供能特异性抑制鼠和人形式的VEGF、VEGF受体和胞内信号转导途径的RNAi药物。
bFGF途径是几种FGF途径之一。bFGF因子是血管发生的强刺激物，因此，它和它的受体是治疗干预的重点。本发明提供能特异性抑制bFGF及其受体和胞内信号转导途径的RNAi药物。
对眼NV内皮细胞增殖的抑制新血管系统形成的一个关键步骤是邻近血管系统中激活的内皮细胞的增殖。这个步骤是治疗干预的重点。已知许多胞内因子对于内皮细胞存活和/或增殖是必不可少的。本发明提供的两个实施方案是1)阻断内皮细胞增殖和2)诱导激活内皮细胞的凋亡。这两个实施方案任一个或两者导致因内皮细胞增殖和迁移被抑制造成的新血管系统减少。本发明提供抑制细胞周期从而抑制增殖的RNAi药物。本发明还提供引发激活内皮细胞凋亡的RNAi药物。本发明提供能通过与新血管系统激活有关的ανβ3/ανβ5整联蛋白上调选择性结合激活内皮细胞的配体靶向纳米颗粒。本发明提供的纳米颗粒能将RNAi药物给予到内皮细胞的胞内区室，以诱导凋亡或抑制增殖，或者这两方面同时发生。
抑制眼NV疾病的组合方式导致过度和不需要的眼新生血管化的过程是复杂的，通常涉及并行的生化途径。因此，在一个靶标乃至一个途径上进行治疗干预不能完全控制疾病病理(新生血管化)。本发明提供组合干预在生化途径的多个靶标上干预，或者在多个途径上干预，或者两方面同时进行。例如，本发明提供对VEGF途径的多个靶标的干预，包括针对VEGF-A、VEGF-R1和VEGF-R2的siRNA组合。本发明进一步提供在多个途径上的干预，包括siRNA VEGF途径靶标和bFGF途径靶标的组合。本发明还提供这些组合的组合，例如针对VEGF途径和bFGF途径的siRNA组合。本发明还提供在疾病病理的多个方面上进行组合干预，如引发包括病毒感染介质在内的各种因子，引发炎症途径、生血管途径和内皮细胞增殖途径。
治疗药物的给药，包括定位、局部和全身给药本发明提供用以给予治疗药物以治疗眼新生血管化疾病特别是治疗眼前部的疾病的组合物和方法。本发明还提供用以给予治疗药物以治疗眼睛任何部位(包括眼后部)的眼新生血管化疾病的组合物和方法。眼睛任何部位的组织，可根据本发明用新血管系统靶向给药的治疗药物通过局部给予到眼睛和通过在远侧部位静脉内给予来治疗。眼前部的组织，可根据本发明通过局部给予到结膜下组织、通过局部给予到眼睛、通过眼周注射、通过眼内注射和通过在远侧部位静脉内给予来治疗。本发明提供的组合物包含1)通过静电相互作用结合核酸的阳离子剂(cationic agent)，包括非天然合成聚合物、接枝聚合物、嵌段共聚物、肽、脂质和胶束，2)降低与组织和细胞的非特异性结合的亲水剂(hydrophilic agent)，包括非天然合成聚合物、肽和碳水化合物，3)组织和细胞穿透剂(penetrating agent)，包括表面活性剂、肽、非天然合成聚合物和碳酸化合物。
优选的一类肽是组氨酸-赖氨酸共聚物，其为一大类碱性阳离子肽，在一些情况下称为PolyTranTM。优选的另一类肽是线型聚赖氨酸，其中组氨酸或咪唑单体偶联到赖氨酸单体的ε氨基部分。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与阳离子肽的自组装复合物，其中阳离子电荷过量2倍至10倍，更优选阳离子电荷过量2倍至6倍。优选的一类与组氨酸或咪唑单体偶联的聚赖氨酸，其赖氨酸单体的伯胺偶联度达30-70％。优选的另一类肽是其单体由组氨酸-组氨酸-赖氨酸三肽或组氨酸-组氨酸-赖氨酸-赖氨酸四肽组成的聚合物，其中所述聚合物为线型聚合物或支链聚合物，支链聚合物中的一个单体偶联到另一个单体的α或ε氨基或均偶联。聚赖氨酸类聚合物的优选分子量范围为5,000-100,000，更优选分子量为10,000-30,000。
优选的一类接枝聚合物是与亲水聚合物接枝的肽，其中所述亲水聚合物包括PEG、聚唑啉(polyoxazoline)、聚缩醛(在一些情况下称为Fleximer)、HPMA和聚甘油。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与阳离子接枝聚合物的自组装复合物，其中阳离子电荷过量2倍至10倍，更优选阳离子电荷过量2倍至6倍。亲水聚合物的优选分子量范围为2,000-10,000。优选的另一类接枝聚合物是与亲水聚合物接枝的肽，其进一步包含接枝到亲水聚合物的配体，其中所述配体包括肽、碳水化合物、维生素、营养物和抗体或它们的片段。
优选的一类非天然合成阳离子聚合物是具有乙基-氮(-C-C-N-)主链重复单元的聚合物，包括聚唑啉和聚乙烯亚胺(PEI)。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与阳离子聚合物的自组装复合物，其中阳离子电荷过量2倍至10倍，更优选阳离子电荷过量2倍至6倍。在一个实施方案中，本发明提供用组氨酸或咪唑单体衍生化的线型聚唑啉或PEI。优选的另一类聚合物是用组氨酸或咪唑单体衍生化的支链聚唑啉或PEI。优选的一类与组氨酸或咪唑单体偶联的聚合物其30-70％的碱性部分是咪唑。所述聚合物的优选分子量在5,000-100,000的范围，更优选分子量为10,000-30,000。
优选的一类接枝聚合物是与亲水聚合物接枝的聚合物，其中所述亲水聚合物包括PEG、聚唑啉、聚缩醛(在一些情况下称为Fleximer)、HPMA和聚甘油。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与阳离子接枝聚合物的自组装复合物，其中阳离子电荷过量2倍至10倍，更优选阳离子电荷过量2倍至6倍。优选的另一类接枝聚合物是与亲水聚合物接枝的聚合物，其进一步包含接枝到亲水聚合物的配体，其中所述配体包括肽、碳水化合物、维生素、营养物和抗体或它们的片段。
优选的另一类阳离子聚合物是具有聚缩醛主链的聚合物。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与阳离子聚缩醛聚合物的自组装复合物，其中阳离子电荷过量2倍至10倍，更优选阳离子电荷过量2倍至6倍。在一个实施方案中，本发明提供用碱性部分衍生化的线型聚缩醛，其中所述碱性部分类别包括赖氨酸、伯胺、组氨酸和咪唑单体的混合物。优选的另一类聚合物是用碱性部分(同样包括赖氨酸、胺、组氨酸和咪唑单体类别)衍生化的支链聚缩醛。优选的一类与赖氨酸、胺、组氨酸和咪唑单体偶联的聚缩醛聚合物其30-70％的碱性部分是咪唑。所述聚合物的优选分子量在5,000-100,000的范围，更优选分子量为10,000-30,000。优选的一类接枝聚合物是用亲水聚合物接枝的聚合物，其中所述亲水聚合物包括PEG、聚唑啉、聚缩醛(在一些情况下称为Fleximer)、HPMA和聚甘油。优选的另一类接枝聚合物是用亲水聚合物接枝的聚缩醛聚合物，其进一步包含接枝到亲水聚合物的配体，其中所述配体包括肽、碳水化合物、维生素、营养物和抗体或它们的片段。
优选的一类脂质是Woodle等(WO 01/49324，其内容通过引用整体结合到本文中)所公开的取代的乙醇胺。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与阳离子脂质的自组装复合物，其中阳离子电荷过量2倍至10倍，更优选阳离子电荷过量2倍至6倍。优选的另一类脂质是用亲水聚合物接枝的脂质，优选的又一类脂质是聚合物接枝的脂质，其进一步包含接枝到亲水聚合物的配体，其中所述配体包括肽、碳水化合物、维生素、营养物和抗体或它们的片段。
优选的一类胶束是其中一种嵌段包含亲水聚合物、另一种嵌段包含疏水聚合物的嵌段共聚物，包括聚环氧丙烷、疏水聚唑啉、用伯胺或咪唑或两者衍生化的疏水聚合物、用能与治疗药物形成可裂解的键的部分衍生化的疏水聚合物，所述部分包括形成二硫化物的巯基、形成席夫碱的醛以及形成酯的酸或醇。优选的组合物具有带负电荷的治疗药物如核酸与胶束的自组装复合物，其中胶束质量比治疗药物质量过量2倍至50倍，更优选质量过量4倍至20倍。优选的另一类胶束是进一步包含接枝到亲水聚合物的配体的嵌段共聚物，其中所述配体包括肽、碳水化合物、维生素、营养物和抗体或它们的片段。
本发明的一个实施方案包括由以下三个功能域组成的共轭聚合物阳离子聚合物如25kD PEI、亲水聚合物如3.4kD聚乙二醇(PEG)和配体如二硫化物稳定化的折叠RGD-肽。阳离子聚合物域能缩合培养哺乳动物细胞的常规转染中所采用的核酸(DNA或RNA)。亲水聚合物功能域保护被给药的核酸免受降解，而且屏蔽表面电荷，从而防止核酸与细胞表面上或血液中存在的蛋白质之间发生非特异性电荷介导相互作用。这些非特异性相互作用往往诱导治疗药物分布不利或者有害的生物活性。第三种域即RGD-肽配体提供对在有新生血管化的组织中被上调的细胞表面整联蛋白(如ανβ3和ανβ5整联蛋白)的组织和细胞特异性寻靶作用。这个实施方案可用来进行siRNA全身给药，以靶向新血管系统和抑制不需要的血管发生(包括在眼部)。
本发明提供配制成制剂的治疗药物(包括siRNA)以给予细胞中组织中。制剂能保护核酸免受降解，促进治疗药物的组织和细胞吸收。通过用本发明的制剂组合物给予RNAi或其他带负电荷的治疗药物，本发明实现了治疗药物的细胞吸收和对内源靶基因表达的抑制。通过使用制剂进行局部给药，本发明提供将siRNA和其治疗药物局部给予眼睛以治疗眼病，包括基质内感染、角膜新生血管化、基质角膜炎、色素层炎等。尽管局部给药可能比远处全身给药侵入性更强，而且招致会导致炎症的感染或刺激风险，但在许多临床情况下，例如在严重NV病情或在快速生长的肿瘤的情况下，还是优选局部给予siRNA。本发明还提供掺入能提高对组织的黏附力和对角膜内皮的通透性的药物。这种组合提供滴眼剂形式的局部应用。
通过使用本发明的组合物和方法，可将siRNA和其他治疗药物通过局部注射或静脉注射给药用于治疗眼新生血管化。
实施例实施例1.局部和全身给予VEGF途径抑制剂以治疗眼前部NV疾病小鼠SK模型、病毒和组织培养眼基质角膜炎(SK)BALB/c小鼠模型已被报道，其角膜NV通过微袋方法将CpG DNA寡核苷酸(CpG ODN，含有HSV DNA基因组的NV诱导基序等价物)植入到基质中来诱导，或者通过角膜划痕法进行HSV-1病毒感染来诱导。本研究中所用刺激性ODN的序列是1466，TCAACGTTGA和1555，GCTAGA CGTTAGCGT(由美国FDA生物制品评价和研究中心的Dr.Dennis M.Klinman博士提供)。用于植入到角膜微袋的微球含有ODN 1466和1555的等摩尔混合物以及先前所报道的hydron聚合物。用HSV-1 RE株(由Uni.Alabama，Mobile的RobertLausch博士提供)以每眼2-μl 1×105蚀斑形成单位的剂量诱导HSK。为测试体外RNAi效果，使用了以下三种细胞系RAW264.7 gamma NO(-)，ATCC CRL-2278，为表达内源mVEGF-A的小鼠巨噬细胞系。SVR，ATCC CRL-2280，为荷mVEGF受体(mVEGFR1和mVEGFR2)的小鼠内皮细胞系。293细胞系，用于由cmv启动子驱动的表达mVEGFR2的pCImVEGFR2质粒转染，以检测外源mVEGFR2的敲减。
小干扰RNA(siRNA)设计双链siRNA，以靶向VEGF途径因子mVEGF-A(XM_192823)、mVEGFR1(D88689)和mVEGFR-2(MN010612)。从每个基因选取两个靶序列。这些序列是(从5′到3′)mVEGF-A1)AAGCCGTCCTGTGTGCCGCTG；mVEGF-A 2)AACGATGAAGCCCTGGAGTGC；mVEGFR1 1)AAGTTAAAAGTGCCTGAACTG；mVEGFR1 2)AAGCAGGCCAGACTCTCTTTC；mVEGFR2 1)AAGCTCAGCACACAGAAAGAC；mVEGFR2 2)AATGCGGCGGTGGTGACAGTA。为合成非相关siRNA对照，还选择了LacZ(E00696)和萤火虫荧光素酶(Luc，AF434924)各自的两个靶序列。它们是LacZ1)AACAGTTGCGCAGCCTGAATG；LacZ 2)AACTTAATCGCCTTGCAGCAC；Luc 1)AAGCTATGAAACGATATGGGC；2)AACCGCTGGAGAGCAACTGCA。Blast序列检索确认这些siRNA对它们的靶向序列的特异性，mVEGF-A靶标设计成由不同mVEGF-A异构体所共有。所有siRNA均按Tuschl的研究小组建议的公认指导方针委托设计成21-nt双链RNA寡核苷酸，其任一RNA链的中间为19-nt双链体，3’-末端为dTdT突出端；并由Qiagen合成。为获得更好的RNAi效果，我们例行使用靶向单个mRNA分子上的不同序列的两个双链21-核苷酸RNA双链体的混合物。
RNA模板特异性PCR(RS-PCR & RT-PCR)进行RS-PCR，以检测siRNA体外对mRNA的敲减作用。细胞质RNA通过RNAwiz(Ambion，#9736)按厂商说明书进行分离，另进行DNA酶处理，然后用专门设计的引物进行RS-PCR。RT反应的mRNA特异性反向引物均为47-mer寡核苷酸，其5′-末端30-mer的独特序列(称为“TS1”序列，以下用大写字母表示)与对每个mRNA分子独特的17-mer序列(以下用小写字母表示)连接。它们是(从5′到3′)1)mVEGFA DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg；2)mVEGFR1 DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAtagattgaagattccgc；3)mVEGFR2 DnGAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAggtcactgacagaggcg。
RT试验后对所有被测基因进行的PCR试验使用相同的反向引物，TS 1GAACATC GATGACAAGCTTAGGTATCGATA。PCR的正向引物是30-mer寡核苷酸，均对每个基因独特1)mVEGFA UpGATGTCTACCAGCGAA GCTACTGCCGTCCG；2)mVEGFR1 UpGTCAGCTGC TGGGACACCGCGGTCTTGCCT；3)mVEGFR2 UpGGCGCTGCTAGCTGTCGCTCTGTGGT TCTG。
持家基因GAPDH的RT-PCR用作RS-PCR中所用RNA量的对照。寡脱氧胸苷(dT)引物(19-mer)用于GAPDH的RT试验。用于PCR的引物是20-mer寡核苷酸1)GAPDH UpCCTGGTCACCA GGGCTGCTT；2)GAPDH DnCCAGCCTTCTCCATGGTGGT。
还根据前述方案使用RT-PCR。为检测mVEGF-A表达，所用引物是5′-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3′(有义链)和5′-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3′(反义链)。
定量实时PCR用DNA Engme Opticon(MJ Research Inc.)进行QRT-PCR。用SYBR Green I试剂(Qiagen，CA)按照厂商方案进行PCR。在引物的优选程序中，1％琼脂糖凝胶分析证实了一个预测大小的产物的扩增，无引物二聚体带。通过建立解链曲线图形也确认每个寡核苷酸组无引物二聚体形成。如下进行计算，以作样品之间的半定量比较对于每个样品，通过扣除目的基因的CT(循环阈值)与“持家”基因GAPDH的CT之差(目的基因CT-GAPDH CT＝ΔCT)使数据归一化。然后将此ΔCT与载体对照样品的表达水平比较(样品ΔCT-载体ΔCT)。为确定目的基因的相对增强表达，进行以下计算改变倍数＝2(样品ΔCT-载体ΔCT)。所用的引物是mGAPDH有义链5′-CATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，GAPDH反义链5′-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATG-3′，mVEGF164有义链GCCAGCACATAGAGAGAATGAGC和mVEGGF165反义链CAAGGCTCACAGTGATTTTCTGG。
siRNA的体内给药用PolyTranTM(PT)和TargeTranTM(TT)分别通过结膜下和尾静脉注射局部和全身给药siRNA。PT是一类能通过其带正电荷的颗粒表面高效率地转化细胞的阳离子多肽。TT属于配体靶向的nanoplex，其与不需要的生物分子和细胞的非特异性相互作用大为减少。TT由以下三个功能层组成结构上与先前报道的含RGD肽类似的H-ACRGDMFGCA-OH肽的RGD配体、PEG立体层和聚集siRNA或其他大分子的阳离子PEI核心(图1)。通过设计，TT-siRNA制剂能靶向RGD特异性整联蛋白被上调的生血管组织。先前研究已在异种移植乳腺癌小鼠肿瘤模型中证明了TT-siRNA制剂的功效，在所述小鼠肿瘤模型中给予靶向人VEGF和小鼠VEGFR2的siRNA获得了相当大的肿瘤生长抑制作用。
siRNA体内抗生血管功效的评估siRNA抑制角膜NV和HSK的功效通过三种方式进行评估。
1)测量生血管区域在CpG ODN微球植入后第4天和第7天，用测径器在立体显微镜下测量NV区域的长度和宽度。起源于角膜缘血管环并长向角膜中央的新血管以角膜圆周钟点数描述，每个钟点数等于圆周的1/12。NV面积按椭圆的公式计算。A＝[(钟点数)×0.4(血管长度mm)]/2。
2)HSK严重程度的临床评分在HSV感染后不同日子用裂隙灯检查眼睛临床损伤的发展。角膜炎损伤的临床严重程度按以下体系评分0，正常角膜；+1，轻度角膜混浊；+2，中度角膜不透明或结疤；+3，炎症角膜不透明但虹膜可见；+4，不透明角膜和角膜溃疡；+5，角膜破裂和坏死性基质角膜炎。
3)NV严重程度的临床评分血管发生的严重程度如前所述进行记录。简单的说，眼睛的特定四分之一圆周评分为4代表1.5mm朝向角膜中央的向心生长。将眼睛的四个四分之一圆周的分数加和，得到每只眼特定时间点的新生血管化指数(范围0-16)。
xx.RNA模板特异性RT-PCR针对三个鼠VEGF途径基因的siRNA序列的体外测量为评估候选siRNA序列的基因抑制作用，在细胞培养物中进行了一系列的转染，siRNA对mRNA水平的作用确定为siRNA活性的量度。用上述RS-PCR和RT-PCR进行测量。如图2所示，获得了siRNA序列敲减所有三个VEGF途径基因的证据。抑制作用在一些情况下是针对内源表达，在另一些情况下则是针对内源表达。
mVEGF-A的体外抑制如图2A所示，在RAW264.7 NO(-)细胞——内源表达VEGF-A的小鼠巨噬细胞系中评估siRNA序列抑制VEGF-A的能力。如RT-PCR所测出，mVEGF-A的120和164同种型的表达均按剂量依赖性方式降低，而对照siRNA的转染没有作用。
mVEGF-R1的体外抑制siRNA序列抑制VEGF R1的活性在内源表达此种VEGF受体的SVR细胞中评估。如图2B所示，由RS-PCR测出，转染48小时后mVEGFR1表达按剂量依赖性方式降低，而对照siRNA的转染对mVEGFR1水平没有作用。
mVEGF-R2的体外抑制最后，siRNA序列抑制VEGF R2的活性在293细胞中用供质粒pCImEGFR2进行外源表达的共转染方法来评估。图2C显示mVEGFR2表达降低，而对照siRNA的转染没有作用。
这些体外研究结果表明，所有三种被研究的鼠VEGF途径基因均能被通过生物信息学方法鉴定的siRNA序列所抑制。现适合根据此研究成果评估siRNA在眼组织中的体内给药和活性。
荧光siRNA向鼠眼组织的给药进行了这样的研究将FITC标记siRNA给予眼组织，然后摘除组织，观察siRNA的分布。局部给药的结果在图3A(左图)中显示。这些结果证明将siRNA掺入到PolyTran阳离子肽聚合物促进其向角膜组织的吸收(左上图)，而siRNA水溶液(非配成制剂)的荧光快速消失(左下图)。
鼠眼新血管组织中的VEGF siRNA基因抑制进行了有关研究，以确定局部给予VEGF siRNA是否能抑制VEGFmRNA的表达水平。用HSV感染小鼠角膜诱导眼新生血管化，并用针对mVEGF-A基因的siRNA通过局部给药进行治疗，以此作为检查RNA或蛋白质水平上的可能变化的实例。用1×105pfu HSV-1感染小鼠，并在第1天和第3天用siRNA治疗后，在第4天和第7天收集角膜。通过RT-PCR或QRT-PCR测量mVEGF-A mRNA水平。由RT-PCR所测出(图4A)，与非相关siLuc对照相比，用siVEGFmix治疗的角膜在第4天和第7天mVEGF-A mRNA的表达下降。同样，如QRT-PCR所测出(图4B)，与用对照siRNA序列治疗的角膜相比，用VEGF siRNA治疗的角膜在第7天显示显著的mVEGF-A mRNA表达下降。在这里，全身给药比局部给药显示出更强的功效。
与用对照siRNA治疗相比，用siRNA治疗HSV感染小鼠，在第7天p.i.经ELISA监测蛋白质水平也显示mVEGF-A被抑制(p＜0.05)(图5)。在RNA或蛋白质水平上所观察到的mVEGF-A表达下降，证实siRNA对HSV诱导的NV和HSK的抗生血管作用(待在下文描述)与siRNA介导的对靶向VEGF途径因子的敲减作用有关。
用siRNA局部治疗CpG诱导的角膜新生血管化将hydron微球中含CpG的ODN植入到鼠眼组织(角膜微袋)中，犹如HSV感染介导的HSK一样会诱导VEGF介导的血管发生。这个模型系统避免要处理HSV。采用这个系统来测量局部给予由聚合物载体PolyTranTM携带的siRNA的抑制作用。对所有三对分别靶向mVEGF-A、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA的体外活性(图2)进行了研究。在将CpG ODN插入到微袋中24小时后，通过结膜下注射给予10μg/10μl/眼的siRNA单剂量。每对siRNA双链体(分别靶向VEGF-A、VEGF R1和VEGF R2)以相同的总RNA剂量(即10μg/10μl/眼)单独或组合(以等摩尔比)进行检测。起源于角膜缘的新生血管化(角膜NV)在微球植入后第4天和第7天进行监测。如图6所示，与非相关siRNA对照(LacZ)相比，在微球植入后第4天和第7天在所有三个被测siRNA对上均观察到角膜NV被显著抑制(p＜0.05)。靶向所有三个被测基因的siRNA双链体组合显示最有效的抑制作用，在第4天测出NV减少大约60％(p＜0.01)。在第7天抑制作用最有效。这些体内研究结果证明了被测siRNA的体内功效；提示了PolyTranTM是作为将siRNA局部给予动物眼睛的给药运载体的合理选择；而且表明了组合使用靶向不同基因的siRNA以实现对病理的协同抑制作用的潜力。
对CpG ODN诱导的血管发生HSK模型的全身治疗通过全身治疗证明siRNA在眼NV部位的定位，研究了全身给药siRNA的治疗潜力。在微球植入后24小时通过尾静脉注射给予小鼠40μg/100μl单剂量的分别靶向mVEGF-A、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA。按上述局部给药研究相同的方式以相同的siRNA总剂量单独或组合给予siRNA。在微球植入后第4天和第7天，按方法中所述对血管发生面积进行测量。如图7所示，与siLacZ治疗组相比，所有被测siRNA双链体单独使用时在微球植入后第4天，均显示对NV的显著抑制作用(p＜0.05)。与在局部给药中所观察到的相似，相比于单独使用只靶向一个靶基因的siRNA，给予靶向所有三个靶基因的siRNA混合液提供最有效的抑制作用(大约60％抑制，p＜0.01)。再且，尽管第7天的抑制效率通常低于第4天，但相比于单独应用的抗生血管siRNA，混合siRNA是最有效的。为证实所观察到的TargeTranTM介导给药的功效是由于给药制剂引起的，我们比较了siRNA在相同的小鼠模型中用TargeTranTM或只用PBS全身给药时的抗生血管功效。显然，在植入后第4天或第7天，TargeTranTM介导的iRNA给药比只用PBS运载体给药实现更有效的抗血管发生作用(p＜0.05)(图8A)。为进一步证实所观察到的TargeTranTM-siRNA制剂的功效，还在相同的CpG-SK小鼠模型进行了抗生血管功效的剂量反应研究。带有含CpG ODN微袋的小鼠，在微球植入后6小时和24小时以10、20、40和80μg的剂量尾静脉注射组合siRNA双链体两剂进行治疗。在第4天和第7天评估出的抗生血管作用均显示明显的剂量依赖性模式(图8B)。
用siRNA治疗HSV感染诱导的角膜新生血管化已知了VEGF siRNA在CpG-ODN HSK模型中抑制角膜NV的功效，再用更有临床相关性的HSV感染介导的HSK模型进行研究。在这个研究中，用这个模型系统再次进行siRNA的局部给予。每对siRNA双链体(分别靶向VEGF-A、VEGF R1和VEGF R2)以相同的总RNA剂量单独或组合(以等摩尔比)进行试验。在HSV感染后14天中监测到基质角膜炎和新生血管化。如图9所示，与用Luc siRNA对照处理的动物相比，所有三个局部或全身给予的被测siRNA对中均观察到对两个测量项(SK和角膜NV)的显著抑制作用(p＜0.05)。Luc siRNA对照治疗的眼睛有80％发展临床上明显损伤(在感染后第10天评分为2或更高)，而用靶向VEGF途径基因的siRNA治疗的眼睛只有42％(局部给药)或50％(全身给药)发展这种损伤，在这当中局部给药比全身给药显示更强的抗生血管功效。这些结果汇总在一起表明，给予针对VEGF途径基因的siRNA，可通过抑制血管发生来减少HSK的发展。如在CpG微袋模型中所观察到(图7)，靶向所有三个VEGF途径基因的siRNA双链体组合提供最有效的抑制作用。
FITC-siRNA向生血管眼睛的定向给药为测试用RGD肽靶向纳米颗粒全身给药siRNA是否能提供对眼新生血管化的定位，在CpG-ODN HSK模型中用TargeTranTM给予FITC标记的siRNA进行研究。图3(右图)所示结果证明局部方法和全身方法产生相似的吸收效果。再且，用纳米颗粒全身给予FITC标记的siRNA结果是荧光主要分布在生血管眼中，在肝脏、肾脏或肺中水平很低(数据未显示)。全身给予siRNA盐水溶液没有显示siRNA分布到生血管眼中(图3右图)，这并不意外。结膜下注射PolyTranTM所观察到的FITC-siRNA向生血管眼中的分布很可能归因于在接近新生血管化的地方(角膜缘)局部给药。不过，在PolyTranTM所观察到向眼新血管的给药，正是RGD配体靶向的nanoplex靶向在新生血管化部位被上调的整联蛋白表达的预期特征(图1)。
鸡尾酒式siRNA应用我们反复试验了“鸡尾酒方法”来组合应用siRNA双链体。当靶向相同mRNA的不同序列(组织培养物中，数据未显示)或靶向所有三个被测VEGF途径基因(体内，图4-8)的混合siRNA同时使用时，获得比使用靶向单个基因的siRNA要高的效价。
在小鼠SK模型中通过局部或全身给药siRNA实现了靶向mVEGFA、mVEGFR1和mVEGFR2的siRNA对角膜NV和SK的极大抑制作用。这种siRNA介导的抑制作用在被测小鼠HSK模型中以剂量依赖性方式(图8)在CpG诱导的角膜NV和SK(图6、7、8)或HSV感染引起的角膜NV和SK(图4、5和9)中实现。这种抑制作用与由RS-PCR、RT-PCR和QRT-PCR测出的siRNA介导的体外和体内对靶向mRNA的敲减作用(图2、4)相一致，与ELISA测出的体内对靶向基因的蛋白质表达的敲减作用(图5)也相一致。还观察到同时给予靶向所有三个被测VEGF途径基因的siRNA所显示的抗生血管作用比单独使用siRNA时更强(图4-8)。这些体外或体内实验在非相关Luc siRNA或LacZ siRNA对照和盐水对照上得到的观察结果证实，靶向VEGF途径的siRNA和给药试剂造成所观察到的角膜NV抑制。
在角膜给药试验中，PolyTranTM和TargeTranTM似乎都能有效给予FITC标记的siRNA到CpG处理的眼睛。PolyTranTM相关的眼给药似乎可归因于给药的位置，但TargeTranTM相关的眼给药可能要归因于nanoplex的RGD配体靶向作用。虽然不清楚所检测出的荧光是否来自完整或降解的siRNA分子，且所给予的RNA双链体的半寿期不能由荧光检测揭示，但还是可以适当地得出如下结论，即siRNA向生血管眼睛的选择性给药是通过TargeTranTM介导的全身途径实现的。
上述多重靶向方法使siRNA介导的基因敲减作用得以改进。当靶向所有三个被测VEGF途径基因的混合siRNA在组织培养物或小鼠中同时使用时，结果显示的效价总是比使用靶向单一基因的siRNA时要强(图4-8)。这种我们称之为“鸡尾酒方法”的方法可用来敲减单一基因的多个靶序列、多个靶向某个途径的不同基因(或序列)的siRNA、多个感染介质基因和宿主基因(例如病毒蛋白质和宿主受体蛋白质基因)等。这种方法适用于角膜SK、其他生血管疾病(包括肿瘤)，其原理还适用于其他疾病和生物过程。
本实施例证明，VEGF途径特异性siRNA与临床给药系统一起使用，是治疗眼NV疾病，包括HSV诱导的角膜SK、糖尿病性视网膜病(DR)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、色素层炎和发红的新方法。配体靶向性非病毒给药试剂在安全性、无损伤性以及siRNA治疗给药和眼NV疾病治疗的组织特异性方面具有优势。
实施例2.局部给予VEGF途径抑制剂治疗眼后部NV疾病材料和方法将同一代孕母亲的幼鼠在P7至P12进行低氧(75％)处理，在P12至P16转换到正常空气(正常氧)。(P数指天数)。采用结膜下给药与阳离子聚合物试剂PolyTran PT73复合的siRNA。siRNA与PT73之比为1∶8(重量)。用5mM HEPES溶液将混合物稀释至所需体积。siRNA剂量为每眼4μg siRNA(PT73复合物中)分散于5μl体积中。在P12和P13各进行一次注射。每只小鼠左眼用阴性对照siRNA即siLuc处理，右眼用活性siRNA即siMix处理。阴性对照siLuc为两种寡核苷酸(siLuc-a和b)的等量混合物。siMix为simVEGFA、simVEGFR1和simVEGFR2的等量混合物，它们各自为两种寡核苷酸(例如simVEGF-a和b、simVEGFR1-a和b、simVEGFR2-a和b)的混合物。在P16处死小鼠，进行荧光灌注/铺片和冷冻切片分析，以鉴定新生血管化。
结果双眼的铺片在图5中显示。一个铺片结果显示强烈荧光，荧光由出现过度新生血管化时灌注染料而产生，这是用siLuc处理的眼睛。另一个铺片结果显示相当弱的荧光，这是用siMix处理的眼睛中新生血管化被抑制的标志。
实施例3.远侧全身给予VEGF途径抑制剂治疗肿瘤模型系统的新生血管化材料和方法核酸基于Elbashir等(2)的研究，设计siRNA标记siLuc、siLacZ、siGFP和siVEGFR2的短双链RNA寡核苷酸，经BLAST分析证实缺乏显著的干扰同源性，并由Dharmacon(Lafayette，CO)合成和纯化。每个靶标合成两个序列，以1∶1摩尔比合并。所用的靶序列为，siLucaaccgctggagagcaactgca和aagctatgaaacgatatgggc，siLacZaacagttgcgcagcctgaatg和aacttaatcgccttgcagcac，siGFPaagctgaccctgaagttcatc和aagcagcacgacttcttcaag，siVEGFR2aatgcggcggtggtgacagta和aagctcagcacacagaaagac(已描述了此siRNA对VEGF R2的抑制作用(28))。靶向荧光素酶的siRNA在有义链的3′位置用荧光素通过标准键化学缀合作用标记(FITC-siRNA)，以作FACS分析和组织分布实验。编码荧光素酶的pCI-Luc质粒(pLuc)获自LofstrandLabs(Gaithersburg，MD)。
RGD-PEG-PEI(RPP)和PEG-PEI(PP)的合成制备了两种聚乙二醇化形式的支链PEI(P)，一种是其中的PEG在其远侧末端带RGD肽(RPP)，另一种是其中的PEG没有肽(PP)。这三种化合物在本文所用的缩写为，P代表支链PEI，PP代表聚乙二醇化PEI，RPP代表RGD-PEG-PEI。
合成了序列为H-ACRGDMFGCA-OH的环化10-mer RGD-肽，经氧化形成分子内二硫键，由Advanced ChemTech(Louisville，KY，USA)纯化至＞95％纯度。这个序列衍生自经噬菌体展示鉴定结合RGD肽的整联蛋白，且发现对细胞结合和内化有效(23，29)。
RPP的合成如下分两步进行。在第一步，在氮气下向搅拌中的RGD(60mg)的DMSO(600μL)溶液加入TEA(8.54μL于20μL THF中)。搅拌1分钟后，一次加入NHS-PEG-VS(212mg于THF∶DMSO；300μL∶100μL中)溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时，用TFA(用量相当于TEA)猝灭，然后将混合物冻干。中间体RGD-PEG-VS通过反相HPLC或对水透析进行纯化，然后将混合物冻干，得率为50-90％。缀合作用通过质谱分析(MALDI)确认。
在合成的第二步，将100mg(21.7μmole)纯化的RGD-PEG-VS中间体溶于1ml纯DMSO中。向此溶液中加入6当量TEA(溶于0.5mlTHF中)并混合。将9.4mg(218μmole，以胺计)溶于DMF(0.5ml)中的PEI加入到以上溶液中，在室温下搅拌12小时。缀合作用的完成通过TLC上RGD-PEG-VS的消失来确认。反应通过加入过量的TFA终止并冻干。产物通过HPLC纯化为TFA盐。在500MHz分光计(Varian)上通过质子NMR光谱测定法，由对应于PEI(2.8-3.1ppm)和PEG(3.3-3.6ppm)的-CH2-质子的峰面积比，确定RGD-PEG与PEI的缀合度。根据这一估计，有约7％的PEI胺与RGD-PEG缀合，或者说每25KD PEI分子有大约40个RGD-PEG分子连接于其上，使得每个PEI分子的胺平均数从580降低至540。不同合成的百分缀合度在7-9之间。
Nanoplex的制备如下制备nanoplex混合等体积的阳离子聚合物水溶液和核酸水溶液，使可电离氮(聚合物)相对于磷酸盐(核酸)的净摩尔过量在2-6的范围。阳离子聚合物与核酸之间的静电相互作用导致形成平均颗粒大小分布约为100nm的多聚物(polyplex)，本文称nanoplex。
根据以下三种形式的PEI制备了三种形式的nanoplex支链PEI(P)、聚乙二醇化PEI(PP)和RGD-PEG-PEI(RPP)。较早的研究揭示，用于DNA缩聚的聚阳离子与其他大分子的缀合作用会导致不完全缩聚和形成非球形结构(30，31)。虽然我们在本研究所用的缀合物中没有观察到任何这些问题，但为避免出现这种潜在问题，将一部分缩聚所需的聚阳离子用非缀合PEI代替。因此所有的RPP和PP nanoplex均含有摩尔数(以胺浓度表示)与缀合物相当的PEI。因此如下制备这些nanoplex首先用5mM Hepes缓冲液(pH 7)制备含1∶1摩尔比的RGD-PEG-PEI(RPP)或PEI-PEG(PP)与PEI(P)的阳离子聚合物水溶液。在单独的管中，将核酸(质粒DNA和/或siRNA)以与阳离子聚合物相同的总体积溶于相同的缓冲液中。然后将两个溶液合并在一起，旋涡搅拌30秒钟，制成nanoplex。平均颗粒大小分布用Coulter N4plus颗粒大小测定仪(Beckman Coulter)测定，ζ-电势在Coulter Delsa 440 SX测定仪上进行测量。两种仪器均用确定大小和迁移率的胶乳珠(Beckman Coulter，Miami，FL)作为标准进行校准。
小鼠肿瘤新生血管化模型雌性裸鼠(6-8周龄)获自Taconic(Germantown，NY)，关在顶部有滤膜的笼中(filter-topped)，不限制标准的啮齿动物食物(rodent chow)和水，并接受12小时的光/暗周期。实验按照国际法规和地方动物实验伦理委员会(local animal experiments ethical committee)的批准进行。通过在小鼠胁腹接种1×106N2A细胞诱导皮下N2A肿瘤。肿瘤在体积约0.5-1cm3时开始显示新生血管化，此时小鼠通过尾静脉注射0.2ml溶液接受nanoplex或游离siRNA。在组织分布实验中，注射40μg游离形式或者P-nanoplex或RPP-nanoplex形式的荧光标记siRNA。注射后一小时，解剖组织并用适合荧光的解剖显微镜检查。组织的镜检用Olympus SZX12荧光显微镜进行，该显微镜装备有数码相机并与运行MagnaFire 2.0相机软件(Optronics，Goleta，CA)的PC连接。每个组织均以相等的曝光时间拍照。
在肿瘤新生血管化表型研究中，当接种肿瘤细胞后第7天可触知肿瘤时开始实验。每鼠每3天通过尾静脉注射用40μg siRNA(RPP-nanoplex中)进行处理。每隔一定时间由对处理分配不知情的观测者用数字测径器测量肿瘤生长。每个测量包括相隔大约90度的两个方向上的肿瘤直径。肿瘤体积如下计算0.52×最长直径×最短直径2(32)。在实验结束时，处死动物，切除肿瘤组织和周围皮肤，置显微镜载玻片上，测定新生血管化。用以上对荧光组织测量所述的Olympus显微镜和相机设备，通过显微镜检术进行新生血管化和血管发生的组织检查。透照组织以显示皮肤中的血管，摄取数字图像并如上所述进行保存。然后立即将组织速冻，待进行蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹分析肿瘤样品中的鼠VEGF受体2表达通过蛋白质印迹法检测。将肿瘤组织与M-Per哺乳动物蛋白质提取试剂(Pierce)一起放入lysingMatrix D(Bio-Rad，Cambridge，MA)中。将组织均浆，离心，收集上清。将相当含量的提取蛋白质(50μg)与含5％2-巯基乙醇(Bio-Rad)的样品缓冲液混合，煮沸，冷却后加样到6％聚丙烯酰胺凝聚的各泳道上。在30mA下进行电泳，随后将蛋白质转移到Immunblot PVDF膜(Bio-Rad)。用3％明胶(于Tris缓冲盐水(TBS)中)将膜封闭过夜。随后将膜转移到1％明胶(于TTBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％吐温20)中)，与1μg单克隆抗mVEGFR2抗体(R&D Systems)温育过夜。在TTBS中洗涤两次后，将山羊抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物加入到1％明胶中保持1小时，用TTBS洗涤膜两次，然后用TBS洗涤一次。抗体用Bio-Rad颜色试剂盒染色30分钟。
结果siRNA Nanoplex胶体特性用定型设计法开发siRNA nanoplex，以设计出结合以下三个功能要求的分子缀合物自组装、形成立体聚合物保护性表面层和暴露配体。为设计siRNA nanoplex，我们重新研究了原先质粒DNA所用的材料，包括聚阳离子络合剂用聚乙烯亚胺(PEI)、立体稳定用聚乙二醇(PEG)和含Arg-Gly-Asp(RGD)基序的肽配体，所述肽配体因其靶向在肿瘤血管系统中的激活内皮细胞上表达的整联蛋白的能力而提供肿瘤选择性。虽然含有RGD基序的肽能结合几种整联蛋白，但它们的特异性是由侧翼氨基酸序列以及结合结构域的构象决定的。在本研究中，我们使用了“环状”RGD肽，其整联蛋白结合结构域在构象上受到二硫键的约束。这个肽具有被证明当在丝状噬菌体上表达时通过受体介导途径造成细胞结合和内化的肽的环状区域当中的完全相同氨基酸序列。这个肽被证明以序列特异性方式抑制细胞附着于纤连蛋白和玻连蛋白包被的板。此外，当偶联到寡赖氨酸时，这个肽在多种细胞(包括内皮细胞)中显示受体介导的DNA给药。在这些研究中，为促进与PEG的化学缀合，将丙氨酸残基添加到这个肽的环状区域外部的每个末端。靶向性siRNA nanoplex如下制备化学合成带阳离子聚合物、立体聚合物和肽配体(RPP)的三联聚合物缀合物，然后在水溶液中与核酸混合进行纳米颗粒自组装。这个RPP缀合物允许对每个功能域进行个别优化或化学置换。
当将纯化RPP与核酸水溶液混合时，缀合物的阳离子结构域结合带负电荷的核酸，驱动自组装形成那么颗粒分散液。研究发现，胺(PEI)与磷酸盐(核酸)之比(N/P)为2∶1时可形成稳定的nanoplex。此比例下的颗粒大小和ζ-电势结果在表I中给出。RPP-nanoplex或PP-nanoplex的平均大小都比较小，在0.07-0.10μm之间。在监测颗粒大小的9天时间内，颗粒大小基本保持不变。相反，P-nanoplex的平均颗粒大小较大，在0.12-0.17μm之间，且在24小时内发生聚集。发现带siRNA的P-nanoplex的ζ-电势如同质粒DNA通常所见的那样为高正电势，达35±4mV，但PEI的PEG缀合物的掺入导致PP-nanoplex和RPP-nanoplex的ζ-电势分别下降至5±6mV和6±1mV。表面电荷极性和数量取决于两种成分的比例，但在相同的比例下，当存在PEG时表面电荷数量(数据未显示)下降，表明在nanoplex表面上形成了立体聚合物层。
这些颗粒大小和ζ-电势测量结果表明，与siRNA形成的RPPnanoplex显示胶体表面特性，这种胶体表面特性表示了立体聚合物外层和潜在暴露的介导细胞结合特异性的RGD配体。只需简单地将RPP缀合物水溶液与siRNA混合，就可发生这种nanoplex自组装(RPP-nanoplex)。它们的胶体特性和生物特性比得上不含RGD肽的前体缀合物的制剂(PP-nanoplex)，或者比得上非缀合PEI(P-nanoplex)。
肿瘤吸收、靶向基因抑制、表型作用选择RPP-nanoplex，在荷瘤小鼠中进行有关新生血管化的抑制的体内研究。进行研究是为了确定通过静脉注射给予荷瘤动物的siRNAnanoplex造成siRNA在肿瘤新生血管化水平的提高。通过对FITC标记的siRNA向裸鼠中的确立成神经细胞瘤N2A肿瘤的吸收进行成像，观察肿瘤新生血管化积累情况。被给予siRNA、P-nanoplex和RPP-nanoplex水溶液的动物中肿瘤、肺和肝脏FITC荧光的荧光显微镜检结果在图中显示。静脉给予siRNA水溶液并没有在肿瘤中产生可观的FITC-siRNA荧光。同样，对于这个样品，在肝脏中只观察到极少的FITC荧光，在肺中还更少。这些结果极可能是FITC-siRNA被快速降解到尿中、组织积累不足(肝脏除外)和导致FITC被快速排泄或被肝脏代谢的潜在代谢不稳定性的反映。肿瘤中缺乏来自FITC-siRNA水溶液的荧光表明，会导致FITC从nanoplex制剂中损失的任何FITC键不稳定性都将不产生肿瘤荧光。这个结论由给予P-nanoplex时缺乏肿瘤FITC荧光得到证实。这种肿瘤FITC荧光缺乏证明，P-nanoplex在肿瘤中没有积累到任何可检测程度，siRNA nanoplex中也没有任何FITC键稳定性使人为肿瘤荧光得以产生。另一方面，P-nanoplex中的FITC-siRNA的确在肝脏中特别是在肺中产生可观的点状FITC-siRNA荧光。相反，RPP-nanoplex在肿瘤新血管系统中产生可观的FITC-siRNA荧光，但其在肝脏和肺中积累不足，表现为点状荧光较弱。这提供了强有力的证据，即RPP-nanoplex显示出非特异性组织相互作用减少，从而减少肝脏和肺的吸收，同时显示出由于靶向作用造成的在肿瘤新血管系统中的积累。由于FITC荧光标记通过寡核苷酸所常规使用的具有已知体内稳定性的键共价连接到siRNA，在这些组织中观察到的荧光分布对应于siRNA的分布，而不是对应于FITC不稳定性。此外，即使以水溶液形式给予对血清降解更为敏感的FITC缀合siRNA，也不在任何被测量的组织中造成任何显著积累。这些结果表明RPP siRNA nanoplex造成siRNA分子在肿瘤新血管系统中水平提高，这导致下文描述的在肿瘤中进行的siRNA生物活性研究。
用靶向内源治疗基因的siRNA，确定siRNA是否通过RPP介导的向肿瘤中的给药来抑制新生血管化。在这些研究中，选择了靶向鼠血管内皮生长因子受体-2(VEGF R2)的siRNA，并将其与RPP nanoplex一起使用，因为该受体是血管发生中的关键因素。不过，为对此基因产生治疗作用，需要将siRNA给予至肿瘤中的宿主(鼠)内皮细胞中，以引起对肿瘤生长的表型作用。用抑制鼠VEGF R2表达的siRNA通过在细胞培养物鉴定进行了功效研究(数据未显示)。用这种治疗性基因siRNA，每3天以RPP-nanoplex形式静脉给予进行研究。在图中显示的结果表明了对肿瘤VEGF R2水平、新生血管化和生长速率的抑制作用，并且这种抑制作用是序列特异性的。肿瘤血管发生与VEGF R2表达水平一起作了鉴定。肿瘤生长速率下降与紧靠肿瘤周围的血管减少并行发生。另外，在用mVEGF R2 siRNA治疗的肿瘤中可见血管很少，这是使VEGFR2表达沉默所预期出现的无规律分支的证据。VEGFR2在受治疗肿瘤中的表达也是以序列特异性方式减少(图6E)。这些结果汇总一起支持了这样的说法，即RPP-nanoplex中的siVEGFR2对肿瘤的抑制作用是因为siRNA被有效给予至肿瘤血管系统中，产生对VEGFR2表达、肿瘤血管发生和生长的序列特异性抑制而发生的。这些结果证明siRNA nanoplex通过新血管靶向和抑制机制起作用。
实施例4.远侧全身给予VEGF途径抑制剂治疗眼后部NV疾病材料和方法将同一代孕母亲的幼鼠在P7至P12进行低氧(75％)处理，然后在P12至P16转换到正常空气(正常氧)。采用静脉给药递送与阳离子聚合物试剂PolyTran RPP复合的siRNA。siRNA与RPP之比为1∶2-1∶8(重量)。用5mM HEPES溶液将混合物稀释至所需体积。siRNA剂量为每鼠10μg-100μg siRNA(RPP复合物中)分散于100μl体积中。在一些情况下在P12开始给药，在另一些情况下早些给药，而在又一些情况下晚些给药。按不同时间表从连续一周每天给药到每周一次给药，反复进行给药。对于每个研究，一组小鼠用阴性对照siRNA即siLuc治疗，另一组小鼠用活性siRNA即siMix治疗。阴性对照siLuc为两种寡核苷酸(siLuc-a和b)的等量混合物。siMix为simVEGFA、simVEGFR1和simVEGFR2的等量混合物，它们各自为两种寡核苷酸(例如simVEGF-a和b、simVEGFR1-a和b、simVEGFR2-a和b)的混合物。从P16起在不同时间处死小鼠，进行荧光灌注/铺片和冷冻切片分析，以鉴定新生血管化。
结果当小鼠用siLuc处理时，双眼的铺片显示强烈荧光，荧光由过度新生血管化出现时灌注染料而产生。当小鼠用siMix处理时，新生血管化被抑制，双眼的铺片结果显示相当弱的荧光。
RNAi药物siRNA药物按照本发明的方法和实施例1的说明设计和制备siRNA药物。合适的siRNA药物的序列在以下附录II中显示。
1)RNA特异性PCR(RS-PCR)用RS-PCR来检测靶向基因的mRNA合成的减少。RS-PCR包括两个连续反应RNA特异性反转录(RT)和PCR。从被测哺乳动物中摘除被转染细胞或组织，用RNAwiz(Ambion)从中分离总细胞RNA转录物，并按Promega的T7RiboMAX手册所述的方式用DNA酶处理。无DNA的RNA用作RT反应的模板，以合成mRNA特异性cDNA分子的第一链。为RT设计的mRNA特异性引物从5′到3′方向包含特殊30nt序列，其与靶向基因编码序列不互补，接着是与AUG密码子下游约400nt的部分编码序列互补的14nt序列。RT反应用MuLv反转录酶(retrotranscriptase)(Applied Biosystems)在20μl体积中进行。反应在37℃进行30秒，接着42℃进行15秒，然后94℃加热5秒。PCR反应用GeneAmp试剂盒(PE Biosystems)进行。PCR所用的每对引物包括正向引物和反向引物，前者与从AUG密码子下游约10nt开始的编码序列互补，后者只具有上述特殊30nt序列。50μl反应中含有每对引物的1μl 20μm原液、5μl 10x PCRII缓冲液、3μl 25mM MgCl2、1μl10mM dNTPs和0.5μl(5u/μl)TaqDNA聚合物酶。如下进行PCR反应94℃2秒，然后94℃1秒-72℃2秒两步反应35个循环，接着72℃10秒后，在4℃下浸泡。反应样品随DNA大小标准一起通过琼脂糖凝胶电泳检测。合理大小(约400bp)的DNA片段的密度反映了靶基因特异性mRNA在被感染细胞中的起始水平。siRNA由Dharmacon合成，引物由Elim Biopharmaceuticals合成。
2)RS-PCR引物的设计对于mVEGF-A(参考序列XM 192823)引物1mVEGF-A Up(30-mer，mVEGF-A编码序列的4-33nt或克隆序列的64-93nt)。
5′---GAT GTC TAC CAG CGA AGC TAC TGC CGT CCG---3′引物2mVEGF-A Dn(47-mer，前面30-mer同“TS1引物”，后面17-mer与mVEGF-A编码序列的403-387nt或克隆序列的463-447nt互补)。
5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA caa gct gcctog cct tg---3′对于mVEGFR-1(参考序列D88689)引物3mVEGFR-1 Up(30-mer，mVEGFR-1编码序列的4-33bp或克隆序列的255-284)5′---GTC AGC TGC TGG GAC ACC GCG GTC TTG CCT---3′引物4mVEGFR-1 Dn(47-mer，前面30-mer同“TS1引物”，后面17-mer与mVEGFR-1编码序列的377-361nt或克隆序列的628-612nt互补)。
5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA tag att gaa gattcc gc---3′
对于mVEGFR-2(参考序列D88689)引物5mVEGFR2/400Dn(47-mer，3′17-mer与mVEGFR2 400-384nt互补)5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA ggt cac tgacag agg cg---3′引物6mVEGFR2/12up(30-mer，mVEGFR2的12-41)5′---GGC GCT GCT AGC TGT CGC TCT GTG GTT CTG---3′表2.RS-PCR靶向基因和产物大小
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附录II.眼病的siRNA靶向序列和抗血管发生活性SS1.VEGF途径SS1.1.VEGF-AVEGF基因人VEGF，检索号XM_052681，基因ID14781453，小鼠VEGF，检索号M95200，基因ID202350。
选择了以下20个候选siRNA
位置 序列VEGF-A-1 64-84AAGTGGTCCCAGGCTGCACCCVEGF-A-2 467-487 AAGATCCGCAGACGTGTAAATVEGF-A-3 498-518 AAACACAGACTCGCGTTGCAAVEGF-A-4 499-519 AACACAGACTCGCGTTGCAAGVEGF-A-5 517-537 AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAVEGF-A-6 537-557 AAACGAACGTACTTGCAGATGVEGF-A-7 538-558 AACGAACGTACTTGCAGATGTVEGF-A-8 542-564 AACGTACTTGCAGATGTGACAVEGF-A-9 162-182 AATCGAGACCCTGGTGGACATVEGF-A-10338-358 AAGGCCAGCACATAGGAGAGAVEGF-A-1192-112 AAGGAGGAGGGCAGAATCATCVEGF-A-12386-406 AATGCAGACCAAAGAAAGATAVEGF-A-13380-400 AATGTGAATGCAGACCAAAGAVEGF-A-14301-321 AACATCACCATGCAGATTATGVEGF-A-15451-471 AAGCATTTGTTTGTACAAGATVEGF-A-16116-136 AAGTGGTGAAGTTCATGGATGVEGF-A-17401-421 AAGATAGAGCAAGACAAGAAAVEGF-A-18421-441 AATCCCTGTGGGCCTTGCTCAVEGF-A-19379-499 AAATGTGAATGCAGACCAAAGVEGF-A-20262-282 AATGACGAGGGCCTGGAGTGTSS1.2.VEGF-BVEGF-B基因人VEGF-B，检索号NM_003377.3，基因ID39725673选择了以下10个候选siRNA位置 序列VEGF-B-1 140-160 AAAGTGGTGTCATGGATAGATVEGF-B-2 141-163 AAGTGGTGTCATGGATAGATGVEGF-B-3 236-258 AAACAGCTGGTGCCCAGCTGCVEGF-B-4 327-349 AAGTCCGGATGCAGATCCTCAVEGF-B-5 390-412 AAGAACACAGCCAGTGTGAATVEGF-B-6 393-415 AACACAGCCAGTGTGAATGCAVEGF-B-7 424-446 AAAGGACAGTGCTGTGAAGCCVEGF-B-8 425-447 AAGGACAGTGCTGTGAAGCCAVEGF-B-9 440-462 AAGCCAGACAGGGCTGCCACTVEGF-B-10670-692 AACCCAGACACCTGCAGGTGCSS1.3.
VEGF R-1基因人VEGF-R1，(hFLT-1)，检索号AF063657，基因ID3132830，小鼠VEGF-R1，(mFLT-1)，检索号D88689，基因ID2809068)，选择了以下20个候选siRNA
位置 序列VEGFR1-1 1706-1728AAGGAGAGGACCTGAAACTGTVEGFR1-2 2698-2720AAGCAAGGAGGGCCTCTGATGVEGFR1-3 2702-2724AAGGAGGGCCTCTGATGGTGAVEGFR1-4 2755-2777AACTACCTCAAGAGCAAACGTVEGFR1-5 3014-3036AAGTGGCCAGAGGCATGGAGTVEGFR1-6 3048-3070AAAGTGCATTCATCGGGACCTVEGFR1-7 3049-3071AAGTGCATTCATCGGGACCTGVEGFR1-8 2140-2160AGCACGCTGTTTATTGAAAGAVEGFR1-9 568-588 AAGGGCTTCATCATATCAAATVEGFR1-10215-235 AAAGGCTGAGCATAACTAAATVEGFR1-112352-2372AAGGTCTTCTTCTGAAATAAAVEGFR1-123517-3537AATGCCATACTGACAGGAAATVEGFR1-131190-1210AAGAGGATGCAGGGAATTATAVEGFR1-14834-854 AAGGCGACGAATTGACCAAAGVEGFR1-1589-109 AAGATCCTGAACTGAGTTTAAVEGFR1-16216-236 AAGGCTGAGCATAACTAAATCVEGFR1-173429-3449AAGGCCAAGATTTGCAGAACTVEGFR1-18967-987 AACACCTCAGTGCATATATATVEGFR1-19567-587 AAAGGGCTTCATCATATCAAAVEGFR1-201938-1958AATCCTCCAGAAGAAAGAAATSS1.4.
VEGF R-2基因人VEGF-R2，(hKDR)，检索号AF063658，基因ID3132832，小鼠VEGF-R2，(mFLK-1)，检索号X70842，基因ID57923)，选择了以下20个候选siRNA位置 序列VEGFR2-1 523-545 AACAGAATTTCCTGGGACAGCVEGFR2-2 2387-2409AACTGAAGACAGGCTACTTGTVEGFR2-3 2989-3011AAGGACTTCCTGACCTTGGAGVEGFR2-4 3032-3054AAGTGGCTAAGGGCATGGAGTVEGFR2-5 3040-3062AAGGGCATGGAGTTCTTGGCAVEGFR2-6 3401-3423AAATGTACCAGACCATGCTGGVEGFR2-7 3632-3654AATTCCATTATGACAACACAGVEGFR2-8 3676-3698AACAGTAAGCGAAAGAGCCGGVEGFR2-9 3641-3661ATGACAACACAGCAGGAATCAVEGFR2-10357-377 AAGCTCAGCACACAGAAAGACVEGFR2-11493-513 AATGCGGCGGTGGTGACAGTASS2.EGF途径SS2.1.
EGF基因人EGF，检索号NM_001963，基因ID6031163。
选择了以下20个候选siRNA位置 序列EGF-12042-2062AAGTGGATAGAGAGAGCTAATEGF-23873-3893AAGGCTGCTGGATTCCAGTATEGF-32426-2446AAGCAGTCTGTGATTGAAATGEGF-42621-2641AAGCCCTCATCACTGGTTGTGEGF-51273-1293AAAGGACATGGTTAGAATTAAEGF-62328-2348AAGGCCTTGGCCGTCTGGTTAEGF-7174-194 AAGGGTGTCAGGTATTTCTTAEGF-83922-3942AATGGAGCGAAGCTTTCATATEGF-91496-1516AAGTACTGTGAAGATGTTAATEGF-10 1274-1294AAGGACATGGTTAGAATTAACEGF-11 531-551 AAGGTACTCTCGCAGGAAATGEGF-12 2686-2706AAACGGAGGCTGTGAACATATEGF-13 2263-2283AATGGCCAAGAGATTATTCTGEGF-14 1292-1312AACCTCCATTCATCATTTGTAEGF-15 261-281 AAGGTCTCTCAGTTGAAGAAAEGF-16 3218-3238AATGCCAGCTGCACAAATACAEGF-17 1019-1039AAGGCTCTGTTGGAGACATCAEGF-18 2576-2596AAGAGGACTGGCAAAGATAGAEGF-19 760-780 AAGGCAAGAGAGAGTATGTAAEGF-20 765-785 AAGAGAGAGTATGTAATATAGSS2.2.
EGF R基因人EGF-R，检索号NM_005228，基因ID41327737)，小鼠EGF-R，检索号NM_207655，基因ID46560581，选择了以下5个候选siRNA位置 序列EGFR-1 483-505 AAAGACCATCCAGGAGGTGGCEGFR-2 2869-2889AAAGTGCCTATCAAGTGGATGEGFR-3 2870-2890AAGTGCCTATCAAGTGGATGGEGFR-4 3751-3771AACCCTGACTACCAGCAGGACEGFR-5 3755-3775CTGACTACCAGCAGGACTTCTSS2.3.
HER-2基因人HER-2，检索号M11730，基因ID183986，小鼠HER-2，检索号BC053078，基因ID31419374，选择了以下5个候选siRNA位置 序列
HER2-1 1255-1275AAGATCTTTGGGAGCCTGGCAHER2-2 1253-1273AAGAAGATCTTTGGGAGCCTGHER2-3 2797-2817AAGGTGCCCATCAAGTGGATGHER2-4 3019-3039AAATGTTGGATGATTGACTCTHER2-5 3805-3825AACCTCTATTACTGGGACCAGSS2.4.
HER-3基因人HER-3，检索号M34309，基因ID183990，小鼠HER-3，检索号XM125954，基因ID38091004，选择了以下13个候选siRNA位置 序列HER3-1 678-698 AATTGACTGGAGGGACATCGTHER3-2 1264-1284AAGATCCTGGGCAACCTGGACHER3-3 1537-1557AAGGAAATTAGTGCTGGGCGTHER3-4 2404-2424AAGATTCCAGTCTGCATTAAAHER3-5 2857-2877AAATACACACACCAGAGTGATHER3-6 2858-2878AATACACACACCAGAGTGATGHER3-7 3770-3790AAGATGAAGATGAGGAGTATGHER3-8 3776-3796AACCTCTATTACTGGGACCAGHER3-9 1118-1138CTGACAAGATGGAAGTAGATAHER3-10 1119-1139TGACAAGATGGAAGTAGATAAHER3-11 2402-2422TCAAGATTCCAGTCTGCATTAHER3-12 2403-2423CAAGATTCCAGTCTGCATTAAHER3-13 2805-2825TGAGGCCAAGACTCCAATTAASS2.5.
HER-4基因人HER-4，检索号NM_005235，基因ID4885214，小鼠HER-4，检索号XM_136682，基因ID38049556。
选择了以下7个候选siRNA位置 序列HER4-1 462-482 AAATGGTGGAGTCTATGTAGAHER4-2 463-483 AATGGTGGAGTCTATGTAGACHER4-3 731-751 AATGTGCTGGAGGCTGCTCAGHER4-4 838-860 AATCCAACCACCTTTCAACTGHER4-5 1227-1247AACAGGTTTCCTGAACATACAHER4-6 1450-1470AACTGGACAACACTCTTCAGCHER4-7 1909-1929AACGGTCCCACTAGTCATGACSS3.FGF途径SS3.1.
FGF-2基因人FGF-2(碱性FGF)，检索号NM_002006，基因ID41352694。
选择了以下20个候选siRNA位置 序列FGF-2-1 630-650 AAGAGCGACCCTCACATCAAGFGF-2-2 661-681 AAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGFGF-2-3 849-869 AAACGAACTGGGCAGTATAAAFGF-2-4 880-900 AAACAGGACCTGGGCAGAAAGFGF-2-5 854-874 AACTGGGCAGTATAAACTTGGFGF-2-6 648-668 AAGCTACAACTTCAAGCAGAAFGF-2-7 850-870 AACGAACTGGGCAGTATAAACFGF-2-8 881-901 AACAGGACCTGGGCAGAAAGCFGF-2-9 667-687 AAGAGAGAGGAGTTGTGTCTAFGF-2-10 723-743 AAGGAAGATGGAAGATTACTGFGF-2-11 734-754 AAGATTACTGGCTTCTAAATGFGF-2-12 781-801 AACGATTGGAATCTAATAACTFGF-2-13 690-710 AAAGGAGTGTGTGCTAACCGTFGF-2-14 818-838 AAGGAAATACACCAGTTGGTAFGF-2-15 804-824 AATACTTACCGGTCAAGGAAAFGF-2-16 750-770 AAATGTGTTACGGATGAGTGTFGF-2-17 822-842 AAATACACCAGTTGGTATGTGFGF-2-18 655-675 AACTTCAAGCAGAAGAGAGAGFGF-2-19 823-843 AATACACCAGTTGGTATGTGGFGF-2-20 798-818 AACTACAATACTTACCGGTCASS3.2.
FGF-1基因人FGF-1(酸性FGF)，转录物变体1，检索号NM_000800，基因ID15055546；转录物变体2，检索号NM_033136，基因ID15055540；转录物变体3，检索号NM_033137，基因ID15055544。
选择了以下20个候选siRNA位置 序列
FGF-1-1 447-467 AAGGCTGGAGGAGAACCATTAFGF-1-2 214-234 AAGCCCAAACTCCTCTACTGTFGF-1-3 190-210 AATCTGCCTCCAGGGAATTACFGF-1-4 114-134 AAGCGCCACAAGCAGCAGCTGFGF-1-5 484-504 AAGAAGCATGCAGAGAAGAATFGF-1-6 539-559 AACGCGGTCCTCGGACTCACTFGF-1-7 460-480 AACCATTACAACACCTATATAFGF-1-8 97-117 AAGCTCTTTAGTCTTGAAAGCFGF-1-9 469-489 AACACCTATATATCCAAGAAGFGF-1-10221-241 AACTCCTCTACTGTAGCAACGFGF-1-11288-308 AAGGGACAGGAGCGACCAGCAFGF-1-12487-507 AAGCATGCAGAGAAGAATTGGFGF-1-13113-133 AAAGCGCCACAAGCAGCAGCTFGF-1-14502-522 AATTGGTTTGTTGGCCTCAAGFGF-1-15520-540 AAGAAGAATGGGAGCTGCAAAFGF-1-16211-231 AAGAAGCCCAAACTCCTCTACFGF-1-17538-558 AAACGCGGTCCTCGGACTCACFGF-1-18526-546 AATGGGAGCTGCAAACGCGGTFGF-1-19220-240 AAACTCCTCTACTGTAGCAACFGF-1-20424-444 AATGAGGAATGTTTGTTCCTGSS3.3.
FGFR2基因人FGFR2，转录物变体1，检索号NM_000141，基因ID13186239；转录物变体2，检索号NM_022969，基因ID13186252；转录物变体3，检索号NM_022970，基因ID13186254；转录物变体4，检索号NM_022971，基因ID13186256；转录物变体5，检索号NM_022972，基因ID13186258；转录物变体6，检索号NM_022973，基因ID13186260；转录物变体7，检索号NM_022974，基因ID13186262；转录物变体8，检索号NM_022975，基因ID27754768；转录物变体9，检索号NM_022976，基因ID13186266；转录物变体10，检索号NM_023028，基因ID13186268；转录物变体11，检索号NM_023029，基因ID13186242；转录物变体12，检索号NM_023030，基因ID13186270；转录物变体13，检索号NM_023031，基因ID13186272；选择了以下20个候选siRNA
位置 序列FGFR2-1 1368-1388AAGCCGGACTGCCGGCAAATGFGFR2-2 2610-2630AAGCCCTGTTTGATAGAGTATFGFR2-3 2088-2108AAGCAGTGGGAATTGACAAAGFGFR2-4 2297-2317AAAGGCAACCFCCGAGAATACFGFR2-5 1753-1773AATCGCCTGTATGGTGGTAACFGFR2-6 2010-2030AATGGGAGTTTCCAAGAGATAFGFR2-7 699-719 AAGAGCCACCAACCAAATACCFGFR2-8 2843-2863AAGCAGTTGGTAGAAGACTTGFGFR2-9 1187-1207AAGCAGGAGCATCGCATTGGAFGFR2-10 1082-1102AAGCGGCTCCATGCTGTGCCTFGFR2-11 1557-1577AAGAGATTGAGGTTCTCTATAFGFR2-12 1771-1791AACAGTCATCCTGTGCCGAATFGFR2-13 2762-2782AAGCCAGCCAACTGCACCAACFGFR2-14 1178-1198AAGGAGTTTAAGCAGGAGCATFGFR2-15 2151-2171AAGATGATGCCACAGAGAAAGFGFR2-16 2745-2765AAGGACACAGAATGGATAAGCFGFR2-17 1171-1191AAACGGGAAGGAGTTTAAGCAFGFR2-18 1222-1242AAACCAGCACTGGAGCCTCATFGFR2-19 2732-2752AAGCTGCTGAAGGAAGGACACFGFR2-20 1556-1576AAAGAGATTGAGGTTCTCTATSS3.4.
FGFR1基因人FGFR1转录物变体1，检索号NM_000604，基因ID13186232；转录物变体2，检索号NM_015850，基因ID13186250；转录物变体3，检索号NM_023105，基因ID13186233；转录物变体4，检索号NM_023106，基因ID13186235；转录物变体5，检索号NM_023107，基因ID13186237；转录物变体6，检索号NM_023108，基因ID13186240；转录物变体7，检索号NM_023109，基因ID13186244；转录物变体8，检索号NM_023110，基因ID13186246；转录物变体9，检索号NM_023111，基因ID13186248；选择了以下20个候选siRNA位置 序列
FGFR1-1 2701-2721AACGGCCGACTGCCTGTGAAGFGFR1-2 2275-2295AAGTCGGACGCAACAGAGAAAFGFR1-3 2422-2442AAGGGCAACCTGCGGGAGTACFGFR1-4 2255-2275AAGTGGCTGTGAAGATGTTGAFGFR1-5 2319-2339AATGGAGATGATGAAGATGATFGFR1-6 2237-2257AACCCAACCGTGTGACCAAAGFGFR1-7 2887-2907AAGCCCAGTAACTGCACCAACFGFR1-8 1540-1560AACGTGGAGTTCATGTGTAAGFGFR1-9 2236-2256AAACCCAACCGTGTGACCAAAFGFR1-10 2332-2352AAGATGATCGGGAAGCATAAGFGFR1-11 1153-1173AACACCAAACCAAACCGTATGFGFR1-12 1303-1323AATGGCAAAGAATTCAAACCTFGFR1-13 2905-2925AACGAGCTGTACATGATGATGFGFR1-14 1636-1656AACCTGCCTTATGTCCAGATCFGFR1-15 2857-2877AAGCTGCTGAAGGAGGGTCACFGFR1-16 1596-1616AAAGCACATCGAGGTGAATGGFGFR1-17 2230-2250AAGGACAAACCCAACCGTGTGFGFR1-18 2968-2988AAGCAGCTGGTGGAAGACCTGFGFR1-19 2254-2274AAAGTGGCTGTGAAGATGTTGFGFR1-20 1444-1464AACCACACATACCAGCTGGATSS3.5.
FGFR3基因人FGFR3，检索号M58051，基因ID182568转录物变体1，检索号NM_000142，基因ID13112046；转录物变体2，检索号NM_022965，基因ID13112047；选择了以下20个候选siRNA位置 序列
FGFR3-1 1969-1989AACCTCGACTACTACAAGAAGFGFR3-2 1627-1647AAGATGATCGGGAAACACAAAFGFR3-3 1588-1608AAGGACCTGTCGGACCTGGTGFGFR3-4 865-885 AAGGTGTACAGTGACGCACAGFGFR3-5 2263-2283AAGCAGCTGGTGGAGGACCTGFGFR3-6 652-672 AAGCTGCGGCATCAGCAGTGGFGFR3-7 1540-1560AAGCCTGTCACCGTAGCCGTGFGFR3-8 1571-1591AAGACGATGCCACTGACAAGGFGFR3-9 1321-1341AACGCGTCCATGAGCTCCAACFGFR3-10 1297-1317AAGCGACAGGTGTCCCTGGAGFGFR3-11 2191-2211AACTGCACACACGACCTGTACFGFR3-12 994-1014 AAGGAGCTAGAGGTTCTCTCCFGFR3-13 1570-1590AAAGACGATGCCACTGACAAGFGFR3-14 982-1002 AACACCACCGACAAGGAGCTAFGFR3-15 1873-1893AAGTGCATCCACAGGGACCTGFGFR3-16 331-351 AATGCCTCCCACGAGGACTCCFGFR3-17 1813-1833AAGGACCTGGTGTCCTGTGCCFGFR3-18 2152-2172AAGCTGCTGAAGGAGGGCCACFGFR3-19 1723-1743AACCTGCGGGAGTTTCTGCGGFGFR3-20 265-285 AAGGATGGCACAGGGCTGGTGSS3.6.
FGFR4基因人FGFR4，检索号L03840，基因ID182570转录物变体1，检索号NM_002011，基因ID47524172；转录物变体2，检索号NM_022963，基因ID47524176；转录物变体3，检索号NM213647，基因ID47524174；选择了以下20个候选siRNA位置 序列
FGFR4-1 726-746 AAGGATGGACAGGCCTTTCATFGFR4-2 2403-2423AAGGTCCTGCTGGCCGTCTCTFGFR4-3 1743-1763AAGCTGATCGGCCGACACAAGFGFR4-4 1085-1105AAAGACTGCAGACATCAATAGFGFR4-5 292-312 AAGAGCAGGAGCTGACAGTAGFGFR4-6 1657-1677AAGCCAGCACTGTGGCCGTCAFGFR4-7 753-773 AACCGCATTGGAGGCATTCGGFGFR4-8 1833-1853AAGGGAAACCTGCGGGAGTTCFGFR4-9 1392-1412AAGCTCTCCCGCTTCCCTCTGFGFR4-10 1078-1098AAGTCCTAAAGACTGCAGACAFGFR4-11 1692-1712AACGCCTCTGACAAGGACCTGFGFR4-12 604-624 AAGCACCCTACTGGACACACCFGFR4-13 1086-1106AAGACTGCAGACATCAATAGCFGFR4-14 1686-1706AAAGACAACGCCTCTGACAAGFGFR4-15 666-686 AACACCGTCAAGTTCCGCTGTFGFR4-16 1454-1474AAGCTCATCCCTGGTACGAGGFGFR4-17 984-1004 AAGGTGTACAGCGATGCCCAGFGFR4-18 1687-1707AAGACAACGCCTCTGACAAGGFGFR4-19 1764-1784AACATCATCAACCTGCTTGGTFGFR4-20 504-524 AATCTCACCTTGATTACAGGTSS4.1.其他途径I
HP BRCA2-AAAGTCAACCACAGAGTCGTAT247-268HP BRCA2-BAAGTAACGAGTGAGCCACGCT215-235NOXA-AAAGTCGAGTGTGCTACTCAAC238-258NOX AACTGAACTTCCGGCAGAAAC277-297新型ZF蛋白AATGCGGAGAACACTAATTAT345-365新型ZF蛋白AACTTCCATAAATGTGAAATC381-401NFAT4 AAGTGATACTCCCGCCTCAGC726-746NFAT4 AAGTAGCTGGCACTACGGGCA752-772SP1的辅因子 AATCAGGTTCCAATGTGATGA200-221SP1的辅因子 AAGGCTTAGCTCCCAAGCCTC145-165Ets2抑制蛋白 AAGGCAGATCCAGCTGTGGCA194-214Ets2抑制蛋白 AAGCCAGAGTCGTCCCCTGGC171-191PKC相关 AAGTCTTCCGTTTTCTGAGAA69-89PKC相关 AATGGTGCAGCAGAAATTGGA126-136PKC eta AAGAAGGGCCACCAGCTGCTG269-289PKC eta AACGTCACCGACGGCGGCCAC389-409线粒体F0 AACCTCGGGCAGAAGAGGAGA164-184线粒体F0 AACTGAAACGGATTGCCAGAG211-231Bcl-2 TF AAGAAGCGATACAGGTCTCGT91-111Bcl-2 TF AAGGTCTCGTAGTAGAGATCG126-146Bcl-2 A1 AACCTGGATCAGGTCCAAGCA257-277Bcl-2 A1 AATCTGAAGTCATGCTTGGAC334-354RAP1 AACAGAGGAGGACTACATTCC267-287RAP1 AACCACGAAATCACCAGCATC379-399SS5.1.其他途径II
EGFR-RP-A AK026010AAGCTGGACATTCCCTCTGCGEGFR-RP-B AAGAGCCCAGCTTCCTGCAGC内质蛋白94-AAK025862AACTGTTGAGGAGCCCATGGA内质蛋白94-BAATCTGATGATGAAGCTGCAG叶酸BP-AAF000381AACCGCGGTCCTATTCCATTA叶酸BP-BAACACTCCAATTFTTCAAAGTA-RAF-A U33821 AAGAGTTACCTTCCTAATGCAA-RAF-B AAGATTGGGTTGGTATATTCANOVEL-1-A NM_017873 AATCCTTGTTCTCACTGAGCTNOVEL-1-B AAGATGGCTGAGCTGGGGCTGEGF因子8-A NM_005928 AACCCCTGCCACAACGGTGGTEGF因子8-B AACCACTGTGAGACGAAATGTAPRIL-A AK090698AACTGCCCCAGCGATCTCTGCAPRIL-B AACCTAATTCTCCTGAGGCTGPGF前体-A AK023843AAGAGTGACACTGTGGCTTCCPGF前体-B AATGGGCTGAGCTGCTGCTCCSS6，TNF途径TNF途径SS6.1.
TNF基因人TNF(同义词DIF，TNFA，TNFSF2，TNF-α)，检索号NM 000594，基因ID 25952110选择了以下10个候选siRNA位置 序列hTNF-1 428-448 AAGCCTGTAGCCCATGTTGTAhTNF-2 512-532 AATGGCGTGGAGCTGAGAGAThTNF-3 671-691 AACCTCCTCTCTGCCATCAAGhTNF-4 533-553 AACCAGCTGGTGGTGCCATCAhTNF-5 731-751 AAGCCCTGGTATGAGCCCATChTNF-6 497-517 AATGCCCTCCTGGCCAATGGChTNF-7 779-899 AAGGGTGACCGACTCAGCGCThTNF-8 181-201 AAGCATGATCCGGGACGTGGAhTNF-9 665-685 AAGGTCAACCTCCTCTCTGCChTNF-10 180-200 AAAGCATGATCCGGGACGTGGSS6.2.
hTNFR1基因人TNF受体，1A(同义词TNFRSF1A，FPF，p55，p60，TBP1，TNF-R，TNFAR，TNFR1，p55-R，CD120a，TNFR55，TNFR60，TNF-R-I，TNF-R55，MGC19588)，检索号NM_001065，
基因ID23312372选择了以下20个候选siRNA位置 序列hTNFR1-1 666-686 AAGAACCAGTACCGGCATTAThTNFR1-2 1005-1025AAGCTCTACTCCATTGTTTGThTNFR1-3 1320-1340AAGCCACAGAGCCTAGACACThTNFR1-4 841-861 AAAGCCTGGAGTGCACGAAGThTNFR1-5 472-492 AAGGAACCTACTTGTACAATGhTNFR1-6 714-734 AATTGCAGCCTCTGCCTCAAThTNFR1-7 605-625 AATGGGTCAGGTGGAGATCTChTNFR1-8 669-689 AACCAGTACCGGCATTATTGGhTNFR1-9 471-491 AAAGGAACCTACTTGTACAAThTNFR1-10462-482 AAGTGCCACAAAGGAACCTAChTNFR1-11604-624 AAATGGGTCAGGTGGAGATCThTNFR1-12810-830 AACGAGTGTGTCTCCTGTAGThTNFR1-13888-908 AAGGGCACTGAGGACTCAGGChTNFR1-14809-829 AAACGAGTGTGTCTCCTGTAGhTNFR1-15991-1011 AACGGTGGAAGTCCAAGCTCThTNFR1-16768-788 AACACCGTGTGCACCTGCCAThTNFR1-17732-752 AATGGGACCGTGCACCTCTCChTNFR1-181089-1109AACCCAAGCTTCAGTCCCACThTNFR1-19476-496 AACCTACTTGTACAATGACTGhTNFR1-20444-464 AATTCGATTTGCTGTACCAAGSS6.3.
hTNFR2基因人TNF受体，1B(同义词TNFRSF1B，p75，TBPII，TNFBR，TNFR2，CD120b，TNFR80，TNF-R75，p75TNFR，TNF-R11)，检索号Nom001066，基因ID23312365。
选择了以下20个候选siRNA位置 序列
hTNFR2-1 844-864 AAGGGAGCACTGGCGACTTCGhTNFR2-2 957-977 AAGCCCTTGTGCCTGCAGAGAhTNFR2-3 412-432 AAGCCTGCACTCGGGAACAGAhTNFR2-4 1362-1382AAGGAGGAATGTGCCTTTCGGhTNFR2-5 294-314 AAGACCTCGGACACCGTGTGThTNFR2-6 351-371 AACTGGGTTCCCGAGTGCTTGhTNFR2-7 784-804 AACCCAGCACTGCTCCAAGCAhTNFR2-8 1301-1321AATGGGAGACACAGATTCCAGhTNFR2-9 979-1099 AAGCCAAGGTGCCTCACTTGChTNFR2-10914-934 AATAGGAGTGGTGAACTGTGThTNFR2-111227-1247AATGTCACCTGCATCGTGAAChTNFR2-12600-620 AACACGACTTCATCCACGGAThTNFR2-131288-1308AAGCCAGCTCCACAATGGGAGhTNFR2-14432-452 AACCGCATCTGCACCTGCAGGhTNFR2-15984-1004 AAGGTGCCTCACTTGCCTGCChTNFR2-16800-820 AAGCACCTCCTTCCTGCTCCChTNFR2-17954-974 AAGAAGCCCTTGTGCCTGCAGhTNFR2-181245-1265AACGTCTGTAGCAGCTCTGAChTNFR2-191369-1389AATGTGCCTTTCGGTCACAGChTNFR2-20776-796 AACTCCAGAACCCAGCACTGCSS6.4.
小鼠IL-1b AGGCTCCGAGATGAACAACAA小鼠IL-1b TACCTGTCCTGTGTAATGAAA小鼠IL-1r ACCATCGAGGTTACTAATGAA小鼠IL-1r TCGGAATATCTCCCATCATAA小鼠IL-1a TCGGGAGGAGACGACTCTAAA小鼠IL-1a CCAGAGTGATTTGAGATACAA小鼠IL-1r2 CACGTTTATCTCGGCTGCTTA小鼠IL-1r2 AAGACTGATAGTCCCGTGCAA小鼠TNF受体aAAGGAAAGTATGTCCATTCTA小鼠TNF受体aCCGCAACGTCCTGACAATGCA小鼠TNF受体bCCAGGTTGTCTTGACACCCTA小鼠TNF受体bCTGGCTATTCCCGGAAATGCA小鼠TNF CACGTCGTAGCAAACCACCAA小鼠TNF CAGCCGATTTGCTATCTCATA
权利要求
1.一种包含至少一种dsRNA寡核苷酸和药物载体的组合物，其中当给予患有与新生血管化或血管发生有关的眼病的受试者时，所述dsRNA抑制与眼病中的新生血管化或血管发生有关的基因的表达。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述药物载体选自聚合物、脂质或胶束。
3.根据权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述眼病选自基质角膜炎、色素层炎、发红、结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、黄斑变性和视网膜病。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述dsRNA抑制选自促炎途径基因、促血管发生途径基因、促细胞增殖途径基因以及病毒感染介质基因组RNA和病毒感染介质基因的基因的表达。
5.根据权利要求4的组合物，所述组合物包含至少两种dsRNA分子，其中每种dsRNA分子能抑制选自促炎途径基因、促血管发生途径基因、促细胞增殖途径基因以及病毒感染介质基因组RNA和病毒感染介质基因的基因的表达。
6.根据权利要求5的组合物，所述组合物包含至少三种dsRNA分子，其中至少一种dsRNA分子能抑制VEGF的表达，至少一种dsRNA分子能抑制VEGF R1的表达，至少一种dsRNA分子能抑制VEGF R2的表达。
7.根据权利要求5的组合物，所述组合物包含至少两种dsRNA分子，其中至少一种dsRNA分子能抑制碱性FGF的表达，至少一种dsRNA分子能抑制FGF R的表达。
8.根据权利要求5的组合物，其中所述dsRNA分子能抑制一个或多个VEGF途径基因、FGF途径基因或它们的组合的表达。
9.根据权利要求5的组合物，其中所述dsRNA分子能抑制一个或多个促血管发生基因、促炎基因或它们的组合的表达。
10.根据权利要求5的组合物，其中所述dsRNA分子能抑制一个或多个促血管发生基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
11.根据权利要求5的组合物，其中所述dsRNA分子能抑制一个或多个促血管发生基因、内皮细胞增殖基因或它们的组合的表达。
12.根据权利要求5的组合物，其中所述dsRNA分子能抑制一个或多个促炎基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
13.根据权利要求5的组合物，所述组合物包含至少三种能抑制至少两个或多个基因的表达的dsRNA分子。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述基因编码VEGF、VEGFR1和VEGF R2。
15.根据权利要求13的组合物，其中所述基因编码碱性FGF和FGF R的表达。
16.根据权利要求13的组合物，其中所述基因编码VEGF途径基因、FGF途径基因或它们的组合。
17.根据权利要求13的组合物，其中所述基因是促血管发生基因、促炎基因或它们的组合。
18.根据权利要求13的组合物，其中所述基因是促血管发生基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合。
19.根据权利要求13的组合物，其中所述基因是促血管发生基因、内皮细胞增殖基因或它们的组合。
20.根据权利要求13的组合物，其中所述基因是促炎基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合。
21.根据权利要求2的组合物，其中所述载体选自聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物和配体官能化亲水聚合物接枝聚合物。
22.根据任一前述权利要求的组合物，其中所述dsRNA分子是dsRNA寡核苷酸。
23.一种治疗受试者的眼病的方法，其中所述疾病至少部分特征是新生血管化，所述方法包括给予所述受试者包含dsRNA寡核苷酸和药学可接受载体的组合物，其中所述dsRNA寡核苷酸能抑制促使所述受试者发生眼新生血管化的基因的表达。
24.根据权利要求23的方法，其中所述眼病至少位于眼前部。
25.根据权利要求23的方法，其中所述组合物在选自结膜下、静脉和皮下的眼睛远侧部位给予。
26.根据权利要求23的方法，其中所述组合物局部给予眼睛。
27.根据权利要求23的方法，其中所述药物载体选自聚合物、脂质或胶束。
28.根据权利要求23的方法，其中所述眼病选自基质角膜炎、色素层炎、发红、结膜炎、角膜炎、睑炎、睑腺炎、睑板腺囊肿、虹膜炎、黄斑变性和视网膜病。
29.根据权利要求23的方法，其中所述dsRNA能抑制至少一个选自促炎途径基因、促血管发生途径基因、促细胞增殖途径基因以及病毒感染介质基因组RNA和病毒感染介质基因的基因的表达。
30.根据权利要求23的方法，其中所述dsRNA能抑制不只一个基因的表达。
31.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF、VEGF R1和VEGF R2的表达。
32.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制碱性FGF和FGF R的表达。
33.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF途径基因、FGF途径基因或它们的组合的表达。
34.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管发生基因、促炎基因或它们的组合的表达。
35.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管发生基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
36.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管发生基因、内皮细胞增殖基因或它们的组合的表达。
37.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制促炎基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
38.根据权利要求30的方法，其中所述dsRNA能抑制不只两个基因的表达。
39.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF、VEGF R1和VEGF R2的表达。
40.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制碱性FGF和FGF R的表达。
41.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制VEGF途径基因、FGF途径基因或它们的组合的表达。
42.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管发生基因、促炎基因或它们的组合的表达。
43.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管发生基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
44.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促血管发生基因、内皮细胞增殖基因或它们的组合的表达。
45.根据权利要求38的方法，其中所述dsRNA能抑制促炎基因、单纯疱疹病毒基因或它们的组合的表达。
46.根据权利要求2的方法，其中所述载体选自聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水聚合物接枝聚缩醛、配体官能化阳离子聚合物和配体官能化亲水聚合物接枝聚合物。
47.根据权利要求23-46中任一项的方法，其中所述受试者是人。
全文摘要
提供了治疗眼病的组合物和方法。具体的说，提供了能抑制眼睛血管发生和/或新生血管化的siRNA分子和siRNA分子的混合物。所述组合物和方法适合用于治疗与血管发生和/或新生血管化有关的眼病。
文档编号A61K48/00GK101052644SQ200580011952
公开日2007年10月10日 申请日期2005年2月7日 优先权日2004年2月5日
发明者Q·唐, P·Y·卢, F·Y·谢, M·C·伍德尔 申请人:因特拉迪格姆公司