原生动物感染病的预防或治疗用药物组合物的制作方法

专利名称：原生动物感染病的预防或治疗用药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在寄生性的原生动物感染病的预防或治疗中有用的药物组合物。
背景技术：
已知，至今为止，尤其是在以热带和亚热带地域为中心的地区有许多寄生性的原生动物感染病，例如，有疟疾、利什曼病、非洲锥虫病(非洲睡眠病)、美洲锥虫病(恰加斯(氏)病(Chagas))、淋巴丝虫病、巴贝西虫病等。这其中，可分为只感染人的感染病、也感染家畜和小动物的人畜共通感染病，不论哪一种感染病都会带来重大的经济和社会的损害。现在，在这些疾病中，存在着充分治疗效果的药物还没有出现、对治疗药具有抗性的原生动物的出现和扩散、以及治疗药的副作用等问题，因此迫切希望获得有效的药物。
例如，由于现在可以使用的利什曼病治疗剂-葡萄糖酸锑(Pentostam)在分子内具有锑原子，因此不可避免治疗的副作用-锑中毒。非洲锥虫病(非洲睡眠病)的初期治疗中可以使用的美拉胂醇(Melarsoprol)在分子内含有砷原子，因此存在着引起作为副作用的砷中毒这样的问题。而且，这些疾病中，有些是会影响到正常的社会生活的重症疾病，甚至是需要护理的卧床不起的疾病、以及会发展成致死性症状的疾病，因此必须要开发即时的化学疗法制剂。
已知本发明的药物组合物中含有的通式(1)表示的化合物是对癌细胞具有高选择性的抗肿瘤剂(例如，参照欧洲专利第527494号公报，特开平5-117148号公报，和美国专利第5861424号公报。)，但是并不知道其作为寄生虫性的原生动物感染病的预防药或治疗药的用途。另一方面，本发明人弄清出了下述通式(3)表示的若丹菁(Rhodacyanine)化合物对疟疾和利什曼病显示出治疗效果(例如，参照专利文献特开2000-191531号公报，特开2003-034640号公报，特开2003-034641号公报和特开2003-034642号公报。)，但是几乎没有了解寄生虫感染症与药物的效果之间的因果关系，在这种现状下，要发现对原生动物感染病有效的化合物的结构极为困难。也就是说、本发明的通式(1)表示的化合物是否显示出对原生动物感染病的效果完全不清楚，绝不是可以预想得到的。
化1
(式中、R7和R9分别独立地表示烷基，R8表示烷基、芳基、或杂环基，C和D分别独立地表示用于形成5元或6元杂环的原子团，P表示生理学上可允许的阴离子，a表示使分子整体的电荷为零所必需的0～2的整数、b表示0或1。)专利文献1欧洲专利第527494号公报专利文献2特开平5-117148号公报专利文献3美国专利第5861424号公报专利文献4特开2000-191531号公报专利文献5特开2003-034640号公报专利文献6特开2003-034641号公报专利文献7特开2003-034642号公报发明内容发明要解决的问题本发明的问题在于提供对寄生性的原生动物感染病具有高选择毒性并且具有高预防或治疗效果的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物。
用于解决问题的方法本申请发明人为了解决上述问题，就各种各样的化合物，鉴定了成为病因的原生动物的增殖效果，而且，反复进行了鉴定作为副作用的指标的哺乳类细胞的细胞毒性的研究，结果是，发现本发明的通式(1)表示的化合物对寄生性的原生动物感染病非常有效，从而完成本发明。
也就是说，本发明涉及[1]原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于含有下述通式(1)表示的化合物作为有效成分；化2
(式中、R表示烷基、芳基或杂环基，A和B，各自独立地表示含有至少1个不同原子的5元环或6元环、或其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环，Y表示S，O，Se，或-NR1-(R1表示烷基、芳基或杂环基)，L1，L2，L3，L4和L5各自独立地表示次甲基，Q表示生理学上可允许的阴离子，k表示使分子整体的电荷为零所必需的0～2的整数，p和q分别表示在0～3范围内且p和q之和为1以上6以下的整数。)；和[2]上述[1]中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于L1和/或L5为取代次甲基，构成L1和A的原子和/或构成L5和B的原子结合形成5或6元环，和[3]上述[1]或[2]中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于通式(1)表示的化合物是下述通式(2)表示的化合物；化3
(式中、R2和R3各自独立地表示烷基，X1和X2各自独立地表示S，O，Se，-CH＝CH-、-CR4R5-(R4和R5各自独立地表示烷基。)、或-NR6-(R6表示烷基、芳基、或杂环基。)，Z1和Z2各自独立地表示5元环或6元环、或为了形成在其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环所必需的原子团，m和n分别表示0或1。)。
此外，本发明还涉及上述[3]中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物y，其特征在于[4]L1和/或L5为取代次甲基，L1和R2和/或L5和R3结合从而形成5或6元环；和[5]上述[1]～[4]中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于Q是卤素离子、磺酸离子、或羧酸离子；和[6]上述[1]～[5]任一项中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于原生动物寄生感染病是疟疾、利什曼病、非洲锥虫病、或美洲锥虫病。
发明的效果根据本发明，可以提供一种原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其对寄生性的原生动物感染病具有高选择毒性且具有高预防或治疗效果。
具体实施例方式
作为本发明的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物(以下、单独称为本发明的药物组成)，如果是含有下述通式(1)表示的化合物作为有效成分的药物组合物，没有特别的限定，可以含有1种，也可以含有2种以上通式(1)表示的化合物，通常，还可以同时含有药物上可允许的载体或稀释剂。
化4
通式(1)中，R表示烷基、芳基或杂环基。作为通式(1)的R表示的烷基，优选碳数为1～15的烷基，更优选碳数为1～7的烷基，可以是直链状，分支状，也可以是环状。这种烷基可以被取代，作为优选的取代基，可以例举有碳数为1～15的烷基、碳数为2～15的烯基、碳数为2～15的炔基、碳数为1～15的烷氧基、碳数为6～15的芳氧基、卤素原子(氯、溴、氟、碘等)、碳数为6～15的芳基、羟基、氨基、烷基或用芳基取代的氨基、酰氨基、磺酰氨基、氨基甲酰基、氨磺酰基、羧基、碳数为2～15的烷氧羰基、碳数为2～15的酰氧基、5元或6元的杂环(吡咯环、呋喃环、哌啶环、吗啉环、吡啶环等)、氰基、硝基等，但是它们也可以再互相取代。作为R表示的具体的烷基，可以例举有甲基、乙基、羟乙基、2-丙烯基、苄基、丙基、丁基等。
作为通式(1)的R表示的芳基、优选是碳数为5～15的芳基，更优选是碳数为6～10的芳基。这种芳基可以是被取代的，作为取代基，可以例举有与上述烷基中相同的取代基。作为R表示的具体的芳基，可以例举有苯基、甲苯基、p-氯苯基、1-萘基、2-萘基等。
作为通式(1)的R表示的杂环基，可以是饱和环，也可以是不饱和环，优选5～8元环，更优选5元环或6元环。作为不同原子，可以例举有氮原子、氧原子、硫原子、硒原子、碲原子、磷原子，但是优选氮原子、氧原子、硫原子、硒原子。这种杂环基可以是被取代的杂环基，作为取代基，与上述烷基中相同的取代基。作为R表示的具体的杂环基，可以例举有吡咯基、呋喃基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡啶基、吡咯烷基等。
通式(1)中，A和B各自独立地表示含有至少1个不同原子的5元环或6元环，或其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环。作为通式(1)的A和B表示的含有至少1个不同原子的5元环或6元环可以是饱和环，也可以是不饱和环，作为包含于这种5元环或6元环中的不同原子，可以例举有氮原子、氧原子、硫原子、硒原子、碲原子、硅原子、磷原子等，优选含有至少一个氮原子。此外，作为A和B表示的上述5元环或6元环中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环中的3～8元环可以是饱和环，也可以是不饱和环，例如，可以例举有环丙烷环、环丙烯环、环丁烷环、环丁烯环、环戊烷环、环戊烯环、环己烷环、环己烯环、环庚烷环、环庚烯环、环辛烷环、环辛烯环、苯环、萘环、蒽环、菲环、噻吩环、吡啶环等，这其中尤为优选5元环或6元环。此外，A和B可具有1个或2个以上的取代基，作为这种取代基，可以例举有与通式(1)的R表示的烷基的取代基相同的取代基。
通式(1)中，Y表示S，O，Se或-NR1-，其中，优选S或O。并且，R1表示烷基、芳基或杂环基，分别与通式(1)的R表示的烷基、芳基或杂环基意义相同。
通式(1)中，L1，L2，L3，L4和L5各自独立地表示表示次甲基，可具有取代基。作为取代基，优选可以例举有碳数为1～15的烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基等)、碳数为6～15的芳基(例如，苯基、甲苯基、萘基等)、卤素原子(氯、溴、氟和碘)、碳数为2～15的烯基(例如乙烯基、1-丙烯基等)、碳数为2～15的炔基(例如，乙炔基等)、碳数为1～15的烷氧基(例如，甲氧、乙氧基等)。而且，L1为取代次甲基时，可以通过构成L1和A的原子结合形成5元环或6元环，同样，L5为取代次甲基时，可以通过构成L5和B的原子结合形成5元环或6元环，作为这种5元环或6元环，可以例举有5元杂环(例如，吡咯啉环等)和6元杂环(例如，四氢化吡咯烷环、恶嗪环等)。
通式(1)中，Q表示生理学上可允许的阴离子。所谓这种生理学上可允许的阴离子，是指在给接受者施用通式(1)表示的化合物时无毒，并且使通式(1)表示的化合物溶解于水性系统的离子。作为Q表示的生理学上可允许的阴离子，可以例举有，例如，氯离子、溴离子和碘离子等卤素离子；甲磺酸离子、三氟甲磺酸离子、p-甲苯磺酸离子、萘磺酸离子、2-羟乙烷磺酸离子等脂肪族和芳香族磺酸离子等磺酸离子；环己烷氨基磺酸离子等氨基磺酸离子；甲基硫酸离子和乙基硫酸离子等硫酸离子；硫酸氢离子；硼酸离子；二乙基磷酸离子和甲基氢磷酸离子等烃基和二烃基磷酸离子；三甲基吡咯啉酸离子等吡咯啉酸离子；羧酸离子(可以合适使用取代了羧基和羟基的羧酸离子的)；碳酸离子；碳酸氢离子和氢氧化物离子；醋酸离子；丙酸离子；戊酸离子；柠檬酸离子；马来酸离子；富马酸离子；乳酸离子；琥珀酸离子；酒石酸离子；安息香酸离子，并且优选卤素离子、磺酸离子、或羧酸离子。
通式(1)中，k表示使分子整体的电荷为零所必需的0～2的整数、p和q分别表示在0～3范围内且p和q之和为1以上6以下的整数。
并且，上述通式(1)表示的化合物优选下述通式(2)表示的化合物。
化5
通式(2)中、R2和R3各自独立地表示烷基，与通式(1)的R表示的烷基意义相同。并且，可以通过构成L1和R2的原子结合形成5元环或6元环，同样，L5为取代次甲基时，可以通过构成L5和R3的原子结合形成5元环或6元环。作为通过L1和R2，L5和R3的结合形成的环，优选，可以例举有5元杂环(例如，吡咯啉环等)和6元杂环(例如，四氢化吡咯烷环、恶嗪环等)。
通式(2)中、X1和X2各自独立地表示S，O，Se，-CH＝CH-、-CR4R5、或-NR6，R4和R5各自独立地表示烷基，R6表示烷基、芳基或杂环基。R4～R6表示的烷基，R6表示的芳基杂环基，与通式(1)的R表示的意义相同。
通式(2)中、Z1和Z2各自独立地表示5元环或6元环、或为了形成其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环所必需的原子团。所谓由Z1和Z2表示的原子团形成的5元环或6元环是指在通式(2)表示的化合物的含有N，X1，Z2或N+，含有X2，Z2的各个环状部上形成的环，作为Z1和Z2、具体可以例举有，亚甲基、乙烯基、亚乙烯基等。
作为由Z1和Z2表示的原子团形成的5元环或6元环为杂环的具体实例，可以例举有噻唑类环(例如，噻唑、4-甲基噻唑、4-苯基噻唑、4，5-二苯基噻唑、4，5-二甲基噻唑等)、苯并噻唑类环(例如，苯并噻唑、5-甲基苯并噻唑、5-苯基苯并噻唑、5-甲氧苯并噻唑、4-氟代苯并噻唑、5，6-二氧亚基苯并噻唑、5-硝基苯并噻唑、5-三氟甲基苯并噻唑、5-甲氧羰基苯并噻唑、6-羟基苯并噻唑、5-氰基苯并噻唑、5-碘苯并噻唑等)、萘并恶二噻戊噻唑类环(例如，α-萘并恶二噻戊噻唑、β-萘并恶二噻戊噻唑、γ-萘并恶二噻戊噻唑、5-甲氧-β-萘并恶二噻戊噻唑、8-甲氧-α-萘并恶二噻戊噻唑、6-甲氧-8-醋酸基-β-萘并恶二噻戊噻唑、8，9-二羟基-β-萘并恶二噻戊噻唑等)、恶唑类环(例如，4-甲基恶唑、4-苯基恶唑、4，5-二苯基恶唑、4-苯氧基恶唑等)、苯并恶唑类环(例如，苯并恶唑、5-氯苯并恶唑、5，6-二甲基苯并恶唑、6-羟基苯并恶唑、5-苯基苯并恶唑等)、萘并恶唑类环(例如，α-萘并恶唑、β-萘并恶唑、γ-萘并恶唑等)、硒唑类环(例如，4-甲基硒唑、4-苯基硒唑等)、苯硒唑类环(例如，苯硒唑、5-氯苯硒唑、5，6-二甲基苯硒唑、6-羟基苯硒唑、5-苯基苯硒唑等)、噻唑啉类环(例如，噻唑啉、4，4-二甲基噻唑啉等)、2-吡啶类环(例如，2-吡啶、5-甲基-2-吡啶、5-甲氧-2-吡啶、4-氯-2-吡啶、5-氨基甲酰-2-吡啶、5-甲氧羰基-2-吡啶、4-乙酰氨基-2-吡啶、6-甲硫基-2-吡啶、6-甲基-2-吡啶等)、4-吡啶类环(例如，4-吡啶、3-甲氧-4-吡啶、3，5-二甲基-4-吡啶、3-氯-4-吡啶、3-甲基-4-吡啶等)、2-喹啉类环(例如，2-喹啉、6-甲基-3-喹啉、6-氯-2-喹啉、6-乙氧-2-喹啉、6-羟基-2-喹啉、6-硝基-2-喹啉、6-乙酰氨基-2-喹啉、8-氟代-2-喹啉等)、4-喹啉类环(例如，4-喹啉、6-甲氧-4-喹啉、6-乙酰氨基-4-喹啉、8-氯-4-喹啉、8-三氟甲基-4-喹啉等)、1-异喹啉类环(例如，1-异喹啉、6-甲氧-1-异喹啉、6-乙酰氨基-1-异喹啉、6-氯-1-异喹啉等)、3，3-二烷基假吲哚(ジアルキルインドレニン)类环(例如，3，3-二甲基假吲哚、3，3，7-三甲基假吲哚、5-氯-3，3-二甲基假吲哚、5-乙氧羰基-3，3-二甲基假吲哚、5-硝基-3，3-二甲基假吲哚、3，3-二甲基4，5-苯撑假吲哚、3，3-二甲基-6，7-苯撑假吲哚、5-乙酰氨基-3，3，-二乙基假吲哚、5-二乙基氨基-3，3-二丙基假吲哚、5-苯甲酰氨基-3-乙基-3-甲基假吲哚等)、咪唑类环(例如，咪唑、1-甲基-4-苯基咪唑、1-苄基-4，5-二甲基咪唑等)、苯并咪唑类环(例如，苯并咪唑、1-甲基苯并咪唑、1-甲基-5-三氟甲基苯并咪唑、1-乙基-5-氯苯并咪唑、1-苯基-5-甲氧羰基苯并咪唑、1-乙基-5-二甲基氨基苯并咪唑等)、萘并咪唑类环(例如，1-甲基-α-萘并咪唑、1-甲基-5-甲氧-β-萘并咪唑等)等。
并且，Z1和Z2也可以是上述5元环或6元环中缩合了1个或2个以上的3～8元环、优选缩合了5或6元环的缩合环，作为这种1个或2个以上的3～8元环、可以是饱和环，也可以是不饱和环，可以例举有，例如，环丙烷环、环丙烯环、环丁烷环、环丁烯环、环戊烷环、环戊烯环、环己烷环、环己烯环、环庚烷环、环庚烯环、环辛烷环、环辛烯环、苯环、萘环、蒽环、菲环、噻吩环、吡啶环等。而且，上述5元环、6元环和缩合环可以具有1个或2个以上的取代基，作为这种取代基，可以例举有与通式(1)的R表示的烷基的取代基同样的取代基。
通式(2)中，m和n分别表示0或1。
上述本发明的通式(1)和通式(2)表示的化合物，可以按照欧洲专利第527,494号、特开平5-117148号、美国专利公开号692,347号；Knott(E.B.Knott)等人的非专利文献J.CHEm.SOC.，4762页(1952年)、同949页(1955年)、和川上等人所著的非专利文献J.MED.C hEM.，3151页(1997年)中公开的，从公知的起始原料，容易地制备，该公开内容全部记载于本说明书中。
作为本发明的通式(1)和通式(2)表示的化合物的典型的例子，可以例举有以下的化合物，但是这些化合物不限于此。
化6

化7

化8
本发明的药物组合物可以有效用于疟疾、利什曼病、非洲锥虫病(非洲睡眠病)、美洲锥虫病(恰加斯(氏)病(Chagas))、淋巴丝虫病、巴贝西虫病、其它病因为因寄生性的原生动物的感染的各种类型的疾病的预防或治疗。本发明的药物组合物，根据需要，可以含有以往一直使用的抗原生动物感染病剂。作为这种以往一直使用的抗原生动物感染病剂的最佳实例，可以例举有氯喹、甲氟喹、蒿属素、阿托伐醌、乙嘧啶(息疟定)(以上为疟疾的治疗药)；苏拉明、喷他脒(pentamidine)(以上为非洲锥虫病的治疗药)苄硝唑(Benznidazol)、伯氨喹(以上、为美洲锥虫病的治疗药)、葡萄糖酸锑(Pentostam)、两性霉素B、灭特复星(Miltefosine)(以上、为利什曼病的治疗药)等。
并且，作为可以与本发明的通式(1)和通式(2)表示的化合物一起使用的药物载体或稀释剂，可以使用以往可一般使用的药物载体或稀释剂，可以例举有，例如，葡萄糖；蔗糖；乳糖；乙醇；甘油；甘露糖醇；山梨糖醇；季戊四醇；二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、聚乙二醇400、多种聚乙二醇；三月桂酸甘油酯、和二硬脂酸甘油酯等脂肪酸的单、二和三甘油酯；果胶；淀粉；精氨酸；木糖；滑石；石松子；橄榄油、花生油、蓖麻油、玉米油、红花油、小麦麦芽油、芝麻油、棉籽油、葵花油和鱼肝油等油和油脂；明胶；卵磷脂；二氧化硅；纤维素；甲羟基丙基纤维素、甲基纤维素、羟基乙基纤维素等纤维素衍生物；硬脂酸钙、月桂酸钙、油酸镁、棕榈酸钙、二十二酸钙和硬脂酸镁等具有12～22个碳原子脂肪酸盐；环糊精类(例如，α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟基乙基-β-环糊精、羟基丙基-β-环糊精、二羟基丙基-β-环糊精、羧甲基乙基-β-环糊精、环舞低聚糖<シクロアワオドリン，cycloawaodorin>、和二甲基-β-环糊精等)；乳化剂(例如，具有2～22，尤其是10～18个碳原子的饱和和不饱和脂肪酸和与甘醇、甘油、二乙二醇、季戊四醇、乙醇、丁醇、十八烷醇等具有1～20个碳原子的单价的脂肪醇或多价醇的酯；和二甲聚硅氧烷等硅酮等。
并且，本发明的通式(1)和通式(2)表示的化合物的药学的有效量和给药方法或给药方法，依赖于感染病的成因的寄生原生动物的种类、原生动物的寄生部位、病状的重量、治疗方法、患者的年龄、体重、性别、全面的健康状态、和患者的(遗传的)人种的背景。然而，一般，本发明的给药量为1～2000mg，更一般为50～500mg/日/体重70kg，作为合适的给药方法、可以例举有，例如，以溶于5％葡萄糖水溶液的形式或伴随上述的载体或稀释剂的形式，在静脉内、腹腔内、皮下注射、口服、或涂布在皮肤上等方法。
以下，为了阐明本发明的通式(1)和通式(2)表示的化合物及其药物组合物的有效性，公开了实施例，但本发明的技术的范围不限于这些实施例。
实施例11-1.药物感受性热带热疟疾原生动物的培养本实施例中，采用了恶性疟原虫(Plasmodium Falciparum)F CR-3株的原生动物。实验中使用的培养基为在经过滤灭菌的RPMI-1640培养基中，将pH调整成7.4，以终浓度为10％添加人血清制成的培养基。疟疾原生动物的培养在O2浓度5％、CO2浓度5％、N2浓度90％、温度36.5℃下进行。
1-2.药物感受性热带热疟疾原生动物增殖抑制筛选试验通过离心分离收集经培养的疟疾原生动物感染红血球，用含有血清的培养基进行清洗后、加入非感染红血球，初期感染率为0.3％。此时的血球比容值为3％。试验中使用的本发明化合物、阳性对象药(氯喹、奎宁)溶解于二甲亚砜(DMSO)，作为预定浓度的试验液。在24孔培养板中以平均5～10μL加入试验液。对照，以10μL/孔加入DMSO。将试验液分成两份。接着，加入预先调整成预定浓度的热带热疟疾原生动物培养液，平静地进行移液，使之均一地悬浮于培养基中。培养板在CO2-O2-N2(5％，5％，90％)培养箱中培养72小时后，对各孔制成薄层涂抹标本，进行Diff-Quik染色后，在显微镜(油浸、1,000×)下测量，计算试验液添加组和对照地疟疾原生动物感染率。根据按上述求得的疟疾原生动物感染率用下式计算出增殖抑制率，求出50％增殖抑制浓度(EC50)。
增殖抑制率(％)＝{1-(b-a)/(C-a)}×100a初期感染率b试验液添加时的感染率c对照的感染率1-3.小鼠FM3A细胞增殖抑制试验使用小鼠乳癌来源的FM3A细胞的野生株-F28-7株。培养基为在ES培养基中以2％的终浓度添加除去了补体的胎儿牛血清而成的培养基，在CO2浓度5％、37℃下进行培养。
这种条件下的FM3A细胞的倍增时间为约12小时。进行前述培养，用培养基将进入对数增殖期的细胞稀释成5×104cells/ML。试样使用疟疾活性测定时调制的试样。在24孔培养板中以平均5～10μL加入试样溶液(如果加入培养基等，最终浓度成为1×10-4～1×10-5M。)。化合物分成两份，作为对照，同时制备加入了10μLDMSO的孔。接着，加入平均990～995μL预先制备的培养细胞悬浮液，平静地进行移液培养基，使之均一地悬浮。48小时培养后，用细胞控制器(cell controller)(CC-108，Toa.Medical Electrics公司制)计算各孔的细胞数，用下式计算出增殖率，算出50％增殖抑制率(EC50)。
增殖率(％)＝{(C-A)/(B-A)}×100A初期细胞数B2天后的对照的细胞数C添加试样2天后的细胞数根据添加了试样的孔的细胞数和对照的细胞数计算出细胞增殖抑制活性。由此评价试样的细胞毒性。
1-4.对药物感受性疟疾的药效判定根据试样对于药物感受性热带热疟疾原生动物和小鼠FM3A细胞的EC50值评价试样的抗疟疾作用。用下式计算可以作为对药物感受性疟疾原生动物的选择毒性的指标使用的化学疗法系数，进行了药效判定。
化学疗法系数＝(试样对于小鼠FM3A细胞的EC50值)÷(试样对于药物感受性热带热疟疾原生动物的EC50值)试样对于本发明化合物和阳性对象药的药物感受性热带热疟疾原生动物和小鼠FM3A细胞的各EC50值、以及选择毒性系数示于表1。
表1

本发明的化合物显示出与已知药物奎宁和氯喹同等或其以上的增殖抑制效果。而且，并没有显示出对正常细胞的强毒性。
实施例22-1.氯喹抗性热带热疟疾原生动物的培养本实施例中使用了恶性疟原虫(Plasmodium Falciparum)K1株的原生动物。实验中使用的培养基是在经过滤灭菌地RPMI-1640培养基中以5％的终浓度添加人血清而形成的培养基。疟疾原生动物的培养在O2浓度3％、CO2浓度4％、N2浓度93％、温度为37℃下进行。
2-2.氯喹抗性热带热疟疾原生动物增殖抑制筛选试验试验中使用的本发明化合物-阳性对象药(氯喹)溶解于DMSO中，制成预定浓度的试验液。通过离心分离收集培养的疟疾原生动物感染红血球，用非感染红血球稀释，初期感染率为0.15％。此时的血球比容值为2.5％。在96孔培养板的孔中添加200μL的疟疾感染培养液，加入含有预定浓度的药物的试验液或不含药物的DMSO进行调整。试验液制成双份。于37℃培养48小时后，在各孔中加入0.5μCi的放射性的锂(3H)表征的次黄嘌呤。进而，在24小时同条件下培养后，玻璃纤维过滤器上收集，用蒸留水清洗。用β平板液体闪烁计数器(Wallac公司制)测量放射线强度，计算试验液添加组和对照的疟疾原生动物感染率。根据按上述求得的疟疾原生动物感染率用下式计算出增殖抑制率，求出50％增殖抑制浓度(EC50)。
增殖抑制率(％)＝{1-(b-A)/(C-A)}×100a初期感染率b试验液添加时的感染率c对照的感染率2-3.大鼠L6细胞增殖抑制试验使用大鼠来源的L6细胞(大鼠骨骼成肌细胞)。培养基为在RPMI1640培养基中以1％的终浓度添加L-谷氨酰胺(200mM)，以10％的终浓度添加胎儿牛血清制成的培养基，在CO2浓度5％、37℃下培养。将试验中使用的本发明化合物或对象药溶解于DMSO中，制成预定浓度的试验液。进行前述培养，将含有进入对数增殖期的细胞的培养基分在96孔培养板的孔中，接着加入含有预定浓度的药物的试验液或不合药物的DMSO。试验液分成两份。在培养箱中培养培养板72小时后，检测增殖抑制活性。检测按下述方式进行。
在各孔中加入10μL的Alamar Blue水溶液，再培养2小时。接着，在荧光微板读数器(SpectramaxGemeni XS；美国molecular device公司制)中装备培养板，用536nM的激发波长照射，测定588nM的荧光强度，计算试验液添加组和对照的L6细胞的残存率。根据按上述求出的细胞残存率用下式计算对L6细胞的增殖抑制率，求出50％增殖抑制浓度(EC50)。
增殖抑制率(％)＝{(C-A)/(B-A)}×100A初期细胞数B3天后的对照的细胞数C添加试样3天后的细胞数2-4.对氯喹抗性疟疾的药效判定根据试样对于氯喹抗性热带热疟疾原生动物和大鼠L6细胞的EC50值评价试样的抗疟疾作用。用下式计算可以作为对氯喹抗性疟疾原生动物的选择毒性的指标使用的化学疗法系数，进行了药效判定。
化学疗法系数＝(试样对于大鼠L6细胞的EC50值)÷(试样对于氯喹抗性热带热疟疾原生动物的EC50值)试样对于本发明化合物和阳性对象药的氯喹感受性热带热疟疾原生动物和大鼠L5细胞的各EC50值、以及选择毒性系数示于表2。
表2


本发明的化合物显示出与已知药物氯喹同等或其以上的增殖抑制效果。而且，并没有显示出对正常细胞的强毒性。也就是说，可以评定为作为抗药物抗性疟疾药是有效的。
实施例33-1.非洲锥虫病原生动物的培养本实施例中使用了罗德西亚布氏锥虫(Trypanosoma brucei rhodensiense)(STIB900株)的原生动物的血流栖息型锥鞭毛体。实验中使用的培养基采用在经过滤灭菌的MEM培养基中添加25mM的N-2-羟基乙基哌嗪-2-乙磺酸(HEPES)、1g/L的葡萄糖、1％的MEM非必需氨基酸、0.2mM的2-巯基乙醇、2mM的丙酮酸钠炎、0.1mM的次黄嘌呤和15％热处理马血清制成的培养基。原生动物的培养在CO2浓度为5％的空气中，在温度为37度下进行。
3-2.非洲锥虫病原生动物增殖抑制筛选试验将试验中使用的本发明化合物、阳性对象药(美拉胂醇(Melarsoprol))溶解于二甲亚砜(DMSO)中，制成预定浓度的试验液。在96孔培养板的孔中加入含有原生动物的个数为8×103个的培养基和含有预定浓度的药物的试验液或不含药物的DMSO，分别加入培养基，使终浓度为100μL，进行调整。将试验液分成两份。在培养箱中培养培养板72小时后，检测增殖抑制活性。检测按下述方式进行。在各孔中加入10μL的Alamar Blue水溶液，再培养2小时。接着，将培养板培养板安装于荧光微板读数器(Spectramax Gemeni XS；美国molecular device公司制)中，用536nM的激发波长照射，测定588nM的荧光强度，计算试验液添加组和对照的锥虫属原生动物感染率。根据按上述求出的原生动物感染率用下式计算增殖抑制率，求出50％增殖抑制浓度(EC50)。
增殖抑制率(％)＝{1-(b-A)/(C-A)}×100a初期感染率b试验液添加时的感染率c对照的感染率3-3.非洲锥虫病的药效判定用下式计算可以作为对非洲锥虫病原生动物的选择毒性的指标使用的选择毒性系数，进行了药效判定。
选择毒性系数＝(试样对于大鼠L6细胞的EC50值)÷(试样对于非洲锥虫病原生动物的EC50值)试样对于本发明化合物和阳性对象药的非洲锥虫病原生动物和大鼠L6细胞的各EC50值，以及选择毒性系数示于表3。
表3


本发明的化合物显示出与已知药物美拉胂醇(Melarsoprol)同等的非洲锥虫病增殖抑制效果。并且，对正常细胞显示出比已知药物更弱的毒性、或同等毒性。也就是说，可以评定为副作用少的抗非洲锥虫病(非洲睡眠病)药是有效的。并且，由于这些发明物的分子内没有砷原子，因此不会给患者造成砷中毒等严重的副作用。
实施例44-1.美国锥虫属原生动物的培养本实施例中使用了克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(Tulahuen C2C4株)的原生动物的感染于大鼠L6细胞的无鞭毛体和锥鞭毛体。实验中使用的培养基为在含有L6细胞的RPMI1640培养基上以1％的终浓度添加L-谷氨酰胺(200mM)，以10％的终浓度添加胎儿牛血清，37℃下培养。
4-2.美国锥虫属原生动物增殖抑制筛选试验将试验中使用的本发明化合物、阳性对象药(苄硝唑(Benznidazol))溶解于DMSO中，制成预定浓度的试验液。在96孔培养板的孔中加入含有原生动物的个数为5×103个的培养基，进行48小时前培养。交换培养基后，加入含有预定浓度的药物的试验液或不含药物的DMSO。将试验液分成两份。在培养箱中培养培养板96小时后，检测增殖抑制活性。检测按下述方式进行。
在各孔中加入50μL的CPRG/Nonidet，再放置2～6小时。接着，将培养板培养板安装于荧光微板读数器中，测定540nM的吸光度，计算试验液添加组和对照的锥虫属原生动物感染率，根据按上述求出的原生动物感染率用下式计算增殖抑制率，求出50％增殖抑制浓度(EC50)。
增殖抑制率(％)＝{1-(b-A)/(C-A)}×100a初期感染率b试验液添加时的感染率c对照的感染率4-3.美国锥虫属的药效判定用下式计算可以作为对美国锥虫属原生动物的选择毒性的指标使用的选择毒性系数，进行了药效判定。
选择毒性系数＝(试样对于大鼠L6细胞的EC50值)÷(试样对于美国锥虫属原生动物的EC50值)试样对于本发明化合物和阳性对象药的美国锥虫属原生动物和大鼠L6细胞的各EC50值，以及选择毒性系数示于表4。
表4


本发明的化合物显示出与已知药物苄硝唑(Benznidazol)同等的美国锥虫属原生动物增殖抑制效果。而且，对正常细胞毒性也不强。也就是说，可以评定为作为副作用少的抗美国锥虫属(恰加斯(氏)病(Chagas))药是有效的。
实施例55-1.利什曼病原生动物的培养本实施例中使用杜氏利什曼虫(Leishmania Donovani)(MHOM/ET/67/L82株)。原生动物用叙利亚金地鼠(Syrian Golden hamster)传代，由其获得无鞭毛体。实验中，使用加入了10％经加热处理的胎儿牛血清的SM培养基，调整成pH5.4，在CO2浓度为5％的空气下、于37℃进行培养。
5-2.利什曼病原生动物增殖抑制筛选试验将试验中使用的本发明化合物、阳性对象药(灭特复星(Miltefosine))溶解于DMSO中，制成预定浓度的试验液。在96孔培养板的孔中加入含有预定个数的原生动物的培养基，进行前处理后，用CASY细胞分析系统(ドイツ·SchaRfe公司制)测量无鞭毛的浓度。然后，含有预定浓度的药物的试验液或不含药物的DMSO。将试验液分成两份。在培养箱中培养培养板72小时后，检测增殖抑制活性。检测按下述方式进行。
在各孔中加入10μL的Alamar Blue水溶液，再培养2小时。接着，将培养板培养板安装于荧光微板读数器(Spectramax Gemeni XS；美国molecular device公司制)中，用536nM的激发波长照射，测定588nM的荧光强度，计算试验液添加组和对照的利什曼病原生动物感染率。根据按上述求出的原生动物感染率用下式计算增殖抑制率，求出50％增殖抑制浓度(EC50)。
增殖抑制率(％)＝{1-(b-A)/(C-A)}×100a初期感染率b试验液添加时的感染率c对照的感染率5-3.利什曼病的药效判定用下式计算可以作为对利什曼病原生动物的选择毒性的指标使用的选择毒性系数，进行了药效判定。
选择毒性系数＝(试样对于大鼠L6细胞的EC50值)÷(试样对于利什曼病原生动物的EC50值)试样对于本发明化合物和阳性对象药的利什曼病原生动物和大鼠L6细胞的各EC50值，以及选择毒性系数示于表5。
表5


本发明的化合物显示出与已知药物灭特复星(Miltefosine)同等的利什曼病原生动物增殖抑制效果。并且，对正常细胞毒性也弱。也就是说，可以评定为作为副作用少的抗利什曼病药是有效的。
根据以上的实施例1～5的结果，清楚了即使本发明的化合物通过低用量给药，也显示出对寄生性的原生动物感染病的增殖抑制效果，即使通过比显示出原生动物增殖抑制的用量更高用量的给药也不会损伤哺乳类细胞。也就是说，由此清楚了本发明的化合物适于作为原生动物寄生感染病的预防药或治疗药。
工业上利用的可能性如果根据本发明，可以提供对寄生性的原生动物感染病具有高选择毒性，并且具有高预防或治疗效果的原生动物感染病的预防或治疗用药物组合物。
权利要求
1.一种原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于含有下述通式(1)表示的化合物作为有效成分化1
(式中、R表示烷基、芳基或杂环基，A和B，各自独立地表示含有至少1个不同原子的5元环或6元环、或其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环，Y表示S，O，Se，或-NR1-(R1表示烷基、芳基或杂环基)，L1，L2，L3，L4和L5各自独立地表示次甲基，Q表示生理学上可允许的阴离子，k表示使分子整体的电荷为零所必需的0～2的整数，p和q分别表示在0～3范围内且p和q之和为1以上6以下的整数。)。
2.根据权利要求1中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于L1和/或L5为取代次甲基，构成L1和A的原子和/或构成L5和B的原子结合形成5或6元环。
3.根据权利要求1或2中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于通式(1)表示的化合物是下述通式(2)表示的化合物化2
(式中、R2和R3各自独立地表示烷基，X1和X2各自独立地表示S，O，Se，-CH＝CH-、-CR4R5-(R4和R5各自独立地表示烷基。)、或-NR6-(R6表示烷基、芳基、或杂环基。)，Z1和Z2各自独立地表示5元环或6元环、或为了形成在其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环所必需的原子团，m和n分别表示0或1。)
4.根据权利要求3中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于L1和/或L5为取代次甲基，L1和R2和/或L5和R3结合从而形成5或6元环。
5.根据权利要求1～4任一项中记载的原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于Q是卤素离子、磺酸离子、或羧酸离子。
6.根据权利要求求1～5任一项中记载的原虫寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于原生动物寄生感染病是疟疾、利什曼病、非洲锥虫病、或美洲锥虫病。
全文摘要
本发明提供了一种对寄生性的原生动物感染病具有高选择毒性，并且具有高预防或治疗效果的原生动物感染病的预防或治疗用药物组合物。原生动物寄生感染病的预防或治疗用药物组合物，其特征在于含有下述通式(1)表示的化合物作为有效成分。化1，(式中、R表示烷基、芳基或杂环基，A和B，各自独立地表示含有至少1个不同原子的5元环或6元环、或其中缩合了1个或2个以上的3～8元环的缩合环，Y表示S，O，Se，或－NR
文档编号A61P33/02GK101031295SQ20058003317
公开日2007年9月5日 申请日期2005年9月30日 优先权日2004年10月4日
发明者井原正隆, 高须清诚, 普多霍姆·卡尼塔, 北口博司, 川上雅之, 佐藤幸藏 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 富士胶片株式会社