专利名称：针对由原生动物引起的疾病的多肽的用途的制作方法
针对由原生动物引起的疾病的多肽的用途本发明涉及与地衣芽孢杆菌多肽(SEQ ID NO: 2的氨基酸l-85)相关的多 肽用于治疗和预防由原生动物引起的疾病的用途，例如在药物应用，包括兽 医应用中，作为抗3求虫药(coccidiostat)和/或抗组织滴虫药(histomonastat)。本 发明的多肽的实例是来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580的所谓L12蛋白质，其 具有本文SEQ ID NO: 2的氨基酸+1至+85的氨基酸序列(下文称作SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85)。球虫是单细胞原生动物生物体的属名，其为感染脊推动物和无脊推动物 的肠道寄生虫。这种生物体导致球虫病，并通常寄生在小肠，如结肠中。动 物，例如农畜(farm animal),感染J求虫不仅严重降低生长，而且会危及生命。 球虫感染的症状包括上皮细胞消亡、消化道粘膜剥落和腹泻(经常伴随失血)。 对于一些农畜，如家禽，球虫感染可致命，不然就是严重损害动物的健康。因为下述几个原因，家禽特别易受球虫感染(1)6至8天的寄生周期使 家禽在第二周-第四周的关键阶段受到感染，此时通常表现出最大的生长。 因为寄生虫实际上会^C坏全部肠道上皮细胞，所以营养物的吸收显著降氐， 导致明显的生长抑制。直到第5或6周屠宰时，没有足够的时间来恢复。(2) 艾美球虫属(Eimeria)有7种能感染家禽，多于任何其它动物种类，而且其中 至少4种在商业操作中常见。因此，当一个感染周期结束时，另一个周期已 经处于早期，使得球虫病成为慢性病。(3)在家禽中观察到大多数致病种(柔 嫩艾美球虫(&men'ate"e〃a)、毒害艾美球虫(E "ecaWx)),其诱发严重出血， 且在某些情况下能引起高达50%的死亡率。这种球虫病急性病例能够轻;hM崔 毁家禽伺养者。(4)厚垫草(deep litter)上高密度管理的家禽(一间禽舍里有 100，000只或者更多)使家禽容易通过食粪行为而接触粪便中感染期的球虫， 因此使得此疾病在全部家禽群体中快速传播。如果卫生条件不严格，疾病还 将转移到同 一农场的其它禽舍中并在当地持续多年之久。组织滴虫病也由原生动物引起。在这样特定的情况下，原生动物感染火 鸡、鸡、有时为其它鸡形目(galliform)鸟类的盲肠，然后是肝脏。在火鸡中， 大多数感染是致命的；在其它鸟类中，死亡率通常较低。原生动物寄生虫火4鸡组织滴虫(//^towo"as me/^^Wofo)最经常传播到盲肠线虫鸡异刺线虫 (//"era仏ga〃/朋ram)的孵化卵中，有时通过接触受感染鸟类直接传播。大爆 发通过直接接触迅速在群体中传播。大多数鸡(chicken)都携带这种寄生虫， 而两种性别的成虫(adult worm)内都存在滴虫。三个种的蚯封l能携带包含火鸡 组织滴虫的鸡异刺线虫幼虫，其对鸡和火鸡都有传染性。火鸡组织滴虫可以 在异刺线虫属虫卵中长期存活，所述虫卵具有抗性，而且能在土壤中保持存 活多年。在进入这种线虫几天之后，异刺线虫属幼虫在盲肠中释放组织滴虫， 组织滴虫迅速在盲肠组织中复制。这种寄生虫迁移到粘膜下层和肌肉粘膜 中，并引起大范围的严重坏死。组织滴虫通过血管系统或经由腹膜腔到达肝 脏，而肝脏表面上会迅速出现圓形的坏死性损伤。组织滴虫与其它消化道生 物(如细菌和球虫)相互作用，并依赖于这些而发挥全部的毒力。传统上认为组织滴虫病感染火鸡，对鸡的伤害很小。然而，鸡中这种疾 病的爆发可导致高的发病率、中等的死亡率和大范围的淘汰/宰杀(culling)。 鸡中的肝损伤倾向不太严重，但是在年幼的蛋鸡(young layer)和种鸡小母鸡 (breeder pullet)中发病率特别高。术语动物包括所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动 物包括，例如，动物如绵羊、山羊和牲畜(cattle),例如牛(cow)如肉牛和奶牛。 在特定的实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括宠物，例如狗或 猫，和单胃动物，例如猪(pig or swine)(包括，但不限于，小猪、饲育猪(growing pig)和母猪)；家禽如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡(broiler chick)、蛋鸡)； 鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和曱壳类动物(包括但 不限于小虫下(shrimp)和对虫下(prawn))。本发明基于下述发现下文定义的多肽具有针对由原生动物引起的疾病 的活性，优选针对球虫病和组织滴虫病，因此能够在药物应用中用作例如抗 球虫药和/或抗组织滴虫药。虽然已建议将所述多肽作为动物如]料的添加剂 (WO-A-2006/099871),《旦是至今为止尚未认识到这些化合物具有针对球虫的 活性。事实上，在WO-A-2006/099871中，向动物饲料中替换加入多肽，目 的是通过改善饲料转化率(FCR)，和/或调节肠道微生物菌群，从而改善对动 物飼料利用率(animal feed utilization),而且并未提及针对球虫病或组织滴虫 病的任何活性。因此，在第一方面，本发明涉及多肽在制备药物组合物中的用途，所述和/或组织滴虫病，所述多肽选自下组(a) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85具有至少33%同一性 程度的氨基酸序列；(b) 多肽，其由在低严紧条件下与以下杂交的核酸序列编码(i)SEQID NO: 1的核普酸124-378, (ii) (i)的至少100个核苷酸的子序列，或(iii) (i)或(ii)的互补链；(c) 具有SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85的氨基酸序列的多肽的变体，其 包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、延伸和/或插入；(d) (a)或(b)的等位变体；和(e) (a)、 (b)、 (c)或(d)的片l殳。通过使用如上所述的多肽作为例如抗球虫药，可以使用天然存在的化合 物，其更可能被由于球虫病接受治疗的人或动物接受。同样，工业和消费者 团体经常赞成使用天然存在的化合物，而不是合成的化合物。所述多肽是有 机物，因此比合成的无机化合物更廉价。在第二方面，本发明涉及在人或动物体内治疗或预防球虫病和/或组织滴 虫病的方法，所述方法包含对人或动物施用根据本发明的多肽。本发明的多肽可以用于(i)治疗，即治疗球虫病和/或组织滴虫病，和/或 (ii)预防，即处理以防止球虫病和/或组织滴虫病的发作("初级"预防)，和/ 或防止已经得到控制的现有传染中症状的复发("二级，，预防，维持治疗)。本发明的多肽可以用于(a)兽用医药，其为对陪伴动物(companion)、家养 动物(domestic)、夕卜来动物(exotic)、野生动物(wildlife)和生产动物(production animal)施用药物、诊断和治疗原则；和/或(b)人类医药。在第三方面，本发明涉及包括兽用组合物的药物，其包含本发明的多肽。 在具体的实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的多肽和合适 的载体。WO-A-2006/099871中描述了编码如上文所限定的多肽的分离的核酸序 列，包含所述核酸序列用于表达和产生如上文所限定的分离的多肽的核酸构 建体、载体和宿主细胞，以及根据本发明进一步使用和制备的多肽组合物， 和如下文例示的菌株。该公开的内容，特别是根据该发明的菌抹和多肽的变 体及其生产，通过纟是述并入本文。在具体实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85至少33% 同一性程度的氨基酸序列，或基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基 酸序列组成，例如SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85的多肽。其它特定实例为SEQ ID NO: 8、9和10中任一个的氨基酸1-85的多肽(基于本文中实施例1的PCR-测试鉴定为L12-样多肽)。本发明的多肽可以是细菌或真菌多肽。在另一个具 体的实施方案中，多肽是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属多肽或其变体， 例如地衣芽孢杆菌多肽，例如源自地衣芽孢杆菌ATCC 14580，其为地衣芽孢 杆菌的模式株(type strain),可以应要求从美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)，即ATCC获得。地衣芽孢杆菌的优选菌抹 在本文实施例1的测试中呈阳性，如地衣芽孢杆菌的下述菌抹ATCC 14580 (=NCIB 9375)、 NCIMB 6346 (=DSM 8785)、 NCTC 1024、 NCTC 1025、 NCTC 2120、 NCTC 7589、 NCTC 9932、 ATCC 21424、 NCIMB 10689和ATCC 53757。根据本发明，多肽可作为分离的纯多肽或以多肽混合物的形式使用。如本文所定义的，术语"分离的"或"纯"多肽指，如通过SDS-PAGE (例 如，用本领域已知的方法通过考马斯-染色和随后扫描)测定的，其为基本不含 其它多肽，例如至少80%纯，优选至少85%、 86%、 87%、 88%、 89%纯，或 至少90%纯，更优选至少91%、 92%、 93%、 94%、 95%,或至少96。/。纯的多 肽。纯度也可以用HPLC测定，优选RP-HPLC(例如，^使用Waters |>Bondapak C18柱，流动相A: 0.1。/。TFA,流动相B:乙腈+0.1。/。TFA，在280nm检测)。 SI)S-PAGE纯度，以及HPLC纯度，指相对于总蛋白量的本发明多肽的量。 在可选的实施方案中，多肽可为至少20%、 40%、 60%或至少70%纯。总蛋白的量可以用本领域已知的任何方法测定，例如Kjeldahl方法 (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis第14版.，Association of Official Analytical Chemists, Washington DC),而本发明多肽的量可以通过SDS-PAGE 和随后的扫描来测定，也用本领域已知的方法进行。由本发明的核S臾序列编码的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编 码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合于本发明的核酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中(in frame),并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。在具体的实施方案中，多肽是低致敏性变体，其经过设计当接触动物包 括人时引起降低的免疫响应。术语免疫响应应理解为由接触多肽的动物的免 疫系统产生的任何反应。 一类免疫响应是导致接触的动物中IgE水平升高的 过敏响应。可以使用本领域已知的技术制备低致敏性变体。例如多肽可以和 与免疫响应有关的多肽的表位或聚合物基团保护部分偶联。与聚合物偶联可涉及聚合物与多肽的体外化学偶联，例如，如WO 96/17929、 WO98/30682、 WO98/35026和/或WO99/00489所述。偶联可以另外或可选地涉及聚合物与 多肽的体内偶联。这样的偶联可以通过对编码多肽的核苷酸序列进行基因工 程改造而实现。提供低致敏性变体的另 一种方法是对编码多肽的核苷酸序列 进行基因工程改造，使多肽发生自身低聚，结果使多肽单体可以保护其它多 肽单体的表位，从而降低低聚物的抗原性。这些产品及其制备在例如WO 96/16177中描述。免疫响应中涉及的表位可以通过各种方法鉴定，如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示，或EP 561907中描述的随^L 方法。 一旦表位得到鉴定，可以通过已知的基因操作技术，如定点诱变(参 见例如WO 00/26230、 WO 00/26354和/或WO 00/22103),改变其氨基酸序 列以产生免疫性质改变的多肽，和/或可以在充分接近表位的情况下进行聚合 物的偶联以保护表位。可以根据本领域已知的方法制备药物组合物，而且所述组合物可以是液 体或干燥组合物的形式。可以根据本领域已知的方法使包括于组合物中的多 肽稳定。本发明的多肽组合物的剂量和使用组合物的其它条件可以基于本领域 已《口的方法确定。'通常，本发明的组合物包含有效量的本发明的抗微生物多肽。本文使用 的术语"有效量"意欲表示足以抑制所研究微生物的生长的本发明多肽的量。可将本发明的多肽的配制物施用于受到或容易受到球虫病感染的宿主。 通常，本发明的多肽的剂量足以将微生物群落减少至少约50%。本发明的多 肽(或化合物)可以以减少微生物群落同时将任何副作用降至最低的剂量施 用。期望在医生或兽医的指导下获得和使用组合物用于体内使用。可以使用各种给药方法。药物配制物可以口服，或者可以血管内、皮下、 腹膜注射，通过气雾剂、眼科(opthalmically)、膀胱内、局部等方式给药。取 决于给药的频率、给药方式等，治疗配制物的剂量将有很大变化。初始剂量8可以较大，然后是较小的维持剂量。施用剂量的不频繁程度为每周一次或每 两周一次，或分成更小的剂量并且每天、每半周给药一次或几次等，以维持 有效的剂量水平。在很多情况下，口服给药比静脉内给药要求更高的剂量。 可以修饰酰胺键以及氨基和羧基末端，用于更高的口服给药稳定性。例如， 可以将羧基末端酰胺化。可将本发明的化合物并入多种配制物用于治疗施用。更具体地，可以通 过与合适的、药学可接受的载体或稀释剂组合将本发明的化合物配制成药物 组合物，并且可以以固体、半固体、液体或气态形式配制成制备物，如片剂、 胶嚢、粉剂、颗粒剂、软膏、乳剂、泡沫、溶液、栓剂和注射剂。同样地，可以用多种方式实现化合物的给药，包括口服、含服(buccal)、直肠、肠胃外、 腹膜内、皮内、透皮、气管内等给药。可以通过使用植入物或在植入部位起 作用以保留活性剂量的其它配制物使本发明的多肽定位。对于口服制备物，所述化合物能够单独使用或与适当的添加剂组合使 用，以制成片剂、粉剂、颗粒或胶嚢，例如，与常规添加剂组合使用，如乳 糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂组合使用，如结晶纤维素 (crystalline cellulose)、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩散 剂组合使用，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂组合使 用，如滑石或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、緩沖剂、润湿剂、防腐 剂和调味剂组合使用。可将所述化合物配制成注射用制备物，通过将它们溶解、悬浮或乳化在 水性溶剂或非水性溶剂中，如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、 高级脂肪酸酯或丙二醇中；并且如果需要，可与常规添加剂组合使用，如增 溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。此外，所述化合物可通过与多种基底(bases)例如乳化基底(emulsifying base)或水溶性基底(water-soluble base)混合制成栓剂。本发明的化合物可以通 过栓剂直肠给药。所述栓剂可包括在体温熔化而在室温固化的运载体(vehicle) 如可可脂(cocoabutter)、碳蜡和聚乙二醇。可以纟是供用于口服或直肠施用的单位剂型(unit dosage form)如糖浆、酏 剂和悬浮剂，其中每剂量单位，例如，茶匙、汤匙、片剂或栓剂，包含预定 量的含有本发明的一种或多种化合物的组合物。相似地，用于注射或静脉内 施用的单位剂型可以在组合物中包含本发明的化合物，所述组合物如常规盐水、另一种药学可接受的载体或无菌水中的溶液。用于持续释放配制物的植入物是本领域中公知的。将植入物与生物可降解或非-生物可降解的聚合物配制为微球、板等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的可侵蚀的(erodible)聚合物。将包含本发明的抗微 生物多肽的植入物置于感染部位附近，使得活性剂的局部浓度相对于身体其它4p分;t曾力口。术语"单位剂型，，用于本文指适合作为人和动物受试者的单位剂量的物理上的离散单位(physically discrete unit),每单位含有预定量的本发明的化合 物连同药学上可接受的稀释剂、载体或运载体，本发明的化合物的量经计算 足以产生期望的效果。本发明的单位剂型的规格取决于采用的具体化合物和 要实现的效果，以及与宿主中的化合物相关的药效学。药学可接受的赋形剂，如运载体、佐剂、载体或稀释剂，对公众来说可 以容易地获得。此外，药学可接受的辅助物质，如pH调节剂和緩冲剂、张 力调节剂、稳定剂、润湿剂等，对公众来说可以容易地获得。组合物可以进一步包含另外的药学活性剂，比如其它的杀生物剂，如表 现出如上文所限定的抗微生物活性的其它抗微生物多肽或如其它抗球虫药。杀生物剂可以是抗生素，如本领域已知的。抗生素的类别包括青霉素类， 例如青霉素G、青霉素V、曱氧西林、苯唑西林、羧苄西林、萘夫西林、氨 千青霉素等；与下述组合的青霉素p-内酰胺酶抑制物，头孢菌素，例如头 孢克洛、头孢唑啉、头孢呋辛、拉氧头孢等；碳青霉烯类；单酰胺菌素 (monobactam);氨基糖苷类；四环素类；大坏内酯类；林肯霉素类；多粘菌 素类；磺胺类；喹诺酮类；氯霉素(cloramphenical);曱硝。达唑；壮观霉素； 曱氧千啶；万古霉素等。杀生物剂还可以是抗-霉菌剂，包括多烯类，例如 两性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn;和唑类，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康 哇和氟康峻。也可以使用抗霉菌剂，包括多烯类，例如两性霉素B、制霉菌素； 5-flucosyn;和唑类，例如咪康唑、酮康峻、伊曲康唑和氟康唑。抗结核药物 包括异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和利福平。本发明的抗菌多肽配制物中还可 以包括细胞因子，例如干扰素Y、肺瘤坏死因子a、白细胞介素12等。还可 以使用的其它抗球虫药的实例为离子载体如拉沙里菌素、莫能菌素、盐霉素、 马杜拉霉素(maduramycin)、山杜霉素(semduramycin)和化学剂如安普罗林、竭卡巴。秦(nicarbazin)、地克J朱利。
如WO-A-2003/009700中所公开的，已经发现多不饱和脂肪酸也具有抗 球虫活性。因此，在本发明的特别优选的实施方案中，药物组合物的其它活 性组分为多不饱和脂肪酸(PUFA)。
PUFA可以是单一的PUFA或者两种或多种不同的PUFA。每种PUFA 可以是n-3或n-6家族的。优选其为C18、 C20或C22 PUFA。其可以具有至 少18个碳原子和3个双4A。 PUFA可以以下述形式提供游离脂肪酸，盐， 脂肪酸酯(例如甲酯或乙酯)、磷脂和/或以单-、二-或三酸甘油酯的形式提供。 合适的(n-3和n-6) PUFA包括 -二十二碳六烯酸(DHA, 22: 6Q3)，合适地来自藻类或真菌，如(腰鞭毛虫)
隐甲藻属(Crypthecodinium)或(真菌)破嚢壶菌属(Thraustochytrium); -Y-亚麻酸(y-linolenic acid) (GLA, 18: Q6); -a-亚麻酸(a-linolenic acid) (ALA， 18: D3);
- 缀合的亚油酸(十八碳二烯酸，CLA);
- 双高-Y-亚麻酸(dihomo-y-linolenic acid) (DGLA， 20: Q6);
- 花生四烯酸(ARA,20: Q6);和 -二十碳五烯酸(EPA, 20: 5 Q3)。
优选的PUFA包括花生四烯酸(ARA)、 二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳 五烯酸(EPA)和/或y-亚油酸(y-linoleic acid) (GLA)。具体地，优选ARA。
PUFA可以来自天然(例如植物或海洋)来源或者可以源自单细胞或微生 物来源。具体地，PUFA可以由细菌、藻类、真菌或酵母产生。优选真菌， 优选毛霉目的真菌，例如被孢霉属(Mortierella)、须霉属(Phycomyces)、布拉 霉属(Blakeslea)、曲霉属(Aspergillus)、石皮嚢壶菌属、腐霉属(Pythium)或虫霉 属(Entomophthora)。 ARA的优选来源为来自高山^L孑包霉(MoW/ere〃a a/p/"a)、 三孑包布才立審("/flA:es/ea ^7'5poraf) 、 土曲審(y^/ erg/〃ws ferrew"或尸;z/72/wm /似Wo^w。藻类可以是腰鞭毛虫属和/或包括紫球藻属(Porphyridium)、菱形 藻属(Nitszchia)，或隐曱藻属(例如寇氏隐曱藻(Co^Aecod/m'ww co/2""))。酵 母包括毕赤酵母属(Pichia)或酵母属(Saccharomyces)的酵母，如尸/c/z/a 纟田菌可以是丙酉殳才干菌属(Propionibacterium)。
PUFA可以作为油(例如食用油)存在于组合物中，或者添加到组合物中。 油可以是液体(室温时)。油可以是微生物(例如单细胞)油、海洋(例如金枪鱼)油或植物油。包括ARA的合适的油可由DSMN. V.， Alexander Fleminglaan 1 或Wateringseweg 1, P. O. Box 1,2600 MA Delft, The Netherlands,以商标 VEVODAR得到。另 一种商业上可得到的(ARA)油是来自Martek Corporation, 6480 Dobbin Road, Columbia, MD 21045, United States of America的 ARASCO。可以获得其它PUFA，例如作为DHA油的DHA(来自Martek Corporation的DHASCO和来自Pronova， Norway的DHA,商标为PAX)。
很多文献描述了粗PUFA油的生产。WO-A-92/13086 (Martek)中公开了 包含ARA的微生物油，WO-A-91/14427 (Martek)中公开了包含EPA的微生 物油，而WO-A-91/11918 (Martek)中公开了包含DHA的微生物油。在 WO-A-97/36996和WO-A-97/37032 (均属于Gist-brocades)中可以找到从微生 物来源提取PUFA油的多种方法。WO-A-92/lZ711 (Martek)中还描述了含 ARA 、 DHA和EPA的油的制备。
优选大多数PUFA为甘油三酸酯的形式。因此，优选PUFA的至少50%, 如至少60%,或最佳地至少70。/。是甘油三酸酯的形式。然而，甘油三酸酯的 量可以更高，如油的至少85%，优选至少90%,最佳地至少95%或98%。
在第四方面，本发明涉及在本文实施例1的测试中呈阳性的芽孢杆菌属 的菌抹的药物用途，以及上文提及的所有其它用途。
因此，本发明第一、第二和第三方面的每个具体的实施方案也特定地适 用于本发明的这一方面，并特定地包括在本文中，例如
I. 本文实施例1的测试中呈阳性的芽孢杆菌属菌抹在制备用于治疗球 虫病的药物配制物(例如药物)中的用途。
II. 医疗方法，其包括对需要药物治疗球虫病的个体施用在本文实施例 1的测试中呈阳性的芽孢杆菌属菌抹。
III. 药物组合物用作抗球虫药，其包含本文实施例1的测试中呈阳性的 芽孢杆菌属菌抹和合适的载体。
表述"本文实施例1的测试中呈阳性的芽孢杆菌属菌抹"指当收获所述 芽孢杆菌属菌抹的DNA并将其在以SEQ ID NO: 4和5作为引物的PCR反 应中用作DNA模板时，产生大小约0.4kb的PCR片段。这个测试用来鉴定 具有L12-样基因的菌林。
在具体的实施方案中，以孢子形式使用芽孢杆菌属菌抹。孢子可以是外
生孢子或，优选地，内生孢子。内生孢子是在生物体(通常是细菌)内产生的
12任何孢子。
在另一个具体实施方案中，在纯化并测序后，PCR片段编码与SEQ ID NO:2的氨基酸1-85具有至少33%同 一性的氨基酸序列。在进一步具体的 实施方案中，在纯化并测序后，PCR片段编码与SEQ IDNO:2的氨基酸1-85 具有至少35%,或至少37%、 40%、 42%、 45%、 47%、 50%、 52%、 55%、 57%、 60%、 62%、 65%、 67%、 70%、 72%、 75%、 77%、 80%、 82%、 85%、 87%、 90%、 92%、 95%、 97%或至少99%同 一性程度的氨基酸序列。
在进一步具体的实施方案中，芽孢杆菌属的菌抹是地衣芽孢杆菌的菌抹， 优选选自下述地衣芽孢杆菌的菌抹ATCC 14580 (=NCIB 9375)、 NCIMB 6346 (=DSM 8785)、NCTC 1024、NCTC 1025、KfCTC 2120、NCTC 7589、NCTC 9932、 ATCC 21424、 NCIMB 10689和ATCC 53757。优选的亚组包括地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 (=NCIB 9375)和地衣芽孢杆菌NCIMB 6346 (=DSM 8785)。
芽孢杆菌属的菌抹，如地衣芽孢杆菌的菌抹，是本领域中已知的，而且 可以由例如培养物中心(像上述ATTC)获得，或者可以从自然中分离。活的 或者可养活的(livable)芽孢杆菌属细胞的制备物可以如本领域已知的来制 备。这些细胞的实例为营养细胞，和孢子如内生孢子。在一个实施方案中， 使用芽孢杆菌属菌抹的发酵提取物，例如以经喷雾干燥的发酵液的形式。
实施例1的测试为PCR反应，在这个实施例中使用分离自地衣芽孢杆 菌的多个菌抹的DNA进行PCR反应。在这个测试的具体实施方案中，用作 PCR反应的模板的DNA是能够用本领域已知的方法分离的染色体DNA。当 获得正确大小的PCR片段时，实施例l测试的结果为阳性。在实施例1中， 正确的指定为0.4kb。在具体的实施方案中，正确的大小为0.35 kb-0.44 kb (=350bp-440bp)。在可选的实施方案中，正确的大小是330-430 bp、 340-420 bp、 350-410 bp、 360-400 bp、 370-390 bp，或385-395 bp。 SEQIDNO:l的 编码序列(CDS)的大小为大约380 bp(即378 bp)。
本文中描述的和要求保护的本发明并非受限于本文公开的具体实施方 案的范围内，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同 的实施方案意欲在本发明的范围之内。事实上，从前面的说明中，除本文所 显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员来说是显而易见 的。这些修改也意欲落入所附的权利要求的范围之内。在沖突的情况下，将 以包括定义部分的本公开为准。实施例1:通过PCR鉴定具有L12-样基因的芽孢杆菌属菌株
通过PCR在很多其它地衣芽孢杆菌菌抹中鉴定与编码L12蛋白质(SEQ ID NO: l)的基因相似的基因。在PCR反应中用作模板的DNA分离自在TY 琼脂平板(配方参见WO-A-2006/099871的实施例l)上37。C过夜培养的十一 个不同地衣芽孢杆菌菌株。将装有来自每个菌抹的细胞的一个接种管悬浮在 0.1 ml H20中并煮沸IO分钟，离心，并将每管中的5 pl上清液用作如下所 述PCR反应中的DNA模板。
在来自Amersham Biosciences的"Pure Taq Ready-To—Go PCR Beads" 中进行PCR反应5 jil DNA模板+ 2 x 1 ^引物pep481 (SEQ ID NO: 4)和 Pep4S2 (SEQ ID NO: 5) + 18 |il H20。
PCR程序1)95。C3分钟；2)95。C10秒钟；3)65。C30秒钟，每个循环-1 °C (-l。C pr. cycle); 4)72。Cl分钟；5)转向步骤2)进行9次；6)95。C10秒钟； 7) 55。C 30秒钟；8) 72°C 1分钟；9)转向6)进行19次；10) 72°C 5分钟；11) 4°C 长时间，表示步骤IO)后将温度降低至4°C。
引物
Pep481 AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3' (SEQ ID NO: 4)
将获得的k自五抹阳性菌抹(阳性表示得到正确大小的DNA条带)的0.4 kb PCR片段纯化并用于DNA测序实验，再次使用Pep481 (SEQ ID NO: 4) 和Pep482 (SEQ ID NO: 5)引物作为测序引物。
五抹阳性菌抹中的三抹得到了相同的DNA序列地衣芽孢杆菌 ATCC14580、地衣芽孢杆菌NCIMB 6346 (=DSM 8785)和地衣芽孢杆菌菌抹 712，得到SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。在地衣芽孢杆菌菌抹470中，DNA 变化导致两个氨基酸发生变化(SEQIDNO: 7)，然而成熟肽没有变化。在地 衣芽孢杆菌菌抹009中，DNA变化导致十五个氨基酸发生变化(SEQ ID NO: 6)，其中八个在成熟肽中。此外，共有序列(SEQIDNO: 8)衍生自SEQ ID NO: 2、 6和7。
要注意的是，在这个实验中，编码SEQIDNO:2的七个C-末端氨基酸的 核芬酸包括在Pep481引物(SEQIDNO:4)中，因此SEQ ID NO: 6-7的七个C-末端氨基酸残基可能不正确。但是SEQ ID NO: 6-7的正确性稍后验证。
14此外，如上所述测试了 44抹其它的地衣芽孢杆菌菌株。在这些菌抹的
27抹中发现了阳性PCR-响应。发现呈L12阳性的其它可公开获得的地衣芽 孢杆菌菌抹的实例具有下述保藏号NCTC 1024、 NCTC 1025、 NCTC 2120、 NCTC 7589、 NCTC 9932、 ATCC 21424、 NCIMB 10689、 ATCC 53757。 NCTC 是国家典型培养物保藏中心(National Collection of Type Cultures)。 ATCC是美 国典型培养物保藏中心。NCIMB是国家工业、海洋与食品细菌保藏中心 (National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria)。
权利要求
1.分离的多肽在制备药物配制物中的用途，所述药物配制物用于治疗或预防由原生动物引起的疾病，优选用于治疗或预防球虫病和/或组织滴虫病，所述分离的多肽选自下组(a)多肽，其包含与SEQ ID NO2的氨基酸1-85具有至少33％同一性程度的氨基酸序列；(b)多肽，其由在低严紧条件下与以下杂交的核酸序列编码(i)SEQ ID NO1的核苷酸124-378，(ii)(i)的至少100个核苷酸的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸1-85的氨基酸序列的多肽的变体，其包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、延伸和/或插入；(d)(a)或(b)的等位变体；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的片段。
2. 芽孢杆菌属的菌抹在制备药物配制物中的用途，所述药物配制物用于 治疗或预防球虫病和/或组织滴虫病，当收获所述菌抹的DNA并将其在以 SEQ ID NO: 6和7作为引物的PCR反应中用作DNA模板时，产生约0.4 kb 大小的PCR片I殳。
3. 权利要求1或2的用途，其中所述药物配制物是兽用或人用药物。
4. 根据权利要求1-3中任一项的用途，其中向所述配制物中添加至少一 种具有抗球虫活性的多不饱和脂肪酸(PUFA)。
5. 治疗或预防人或动物体内^求虫病和/或组织滴虫病的方法，所述方法 包括将选自下组的多肽施用于所述的人或动物(a) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85具有至少33%同一性 程度的氨基酸序列；(b) 多肽，其由在低严紧条件下与以下杂交的核酸序列编码(i) SEQ ID NO: 1的核苷酸124-378，(ii) (i)的至少100个核苷酸的子序列，或(iii) (i)或(ii)的互补链；(c) 具有SEQ ID NO: 2的氨基酸1-85的氨基酸序列的多肽的变体，其包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、延伸和/或插入；(d) (a)或(b)的等位变体；和(e) (a)、 (b)、 (c)或(d)的片段。
6. 治疗或预防人或动物体内由原生动物引发的疾病，优选球虫病和/或 组织滴虫病的方法，所述方法包括将芽孢杆菌属的菌抹施用于所述的人或动 物，当收获所述菌抹的DNA并将其在以SEQ ID NO: 6和7作为引物的PCR 反应中用作DNA模板时，产生约0.4 kb大小的PCR片段。
7. 根据权利要求5或6的方法，所述方法包括，除了所述多肽或菌抹之 外，将PUFA施用于所述的人或动物。
8. 作为抗球虫药和/或抗组织滴虫药的药物组合物，其包含根据权利要 求1的多肽或根据权利要求2的芽孢杆菌属的菌抹。
9. 根据权利要求8的组合物，其进一步包含至少一种多不饱和脂肪酸 (PIJFA)。
全文摘要
本发明涉及分离的多肽作为抗球虫药和/或抗组织滴虫药的用途。本发明的多肽的实例是来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580的所谓的L12蛋白质。
文档编号A61K35/66GK101568549SQ200780047586
公开日2009年10月28日 申请日期2007年12月17日 优先权日2006年12月22日
发明者吉尔伯特·韦伯, 吉里·布罗兹 申请人:诺维信公司