专利名称：造影剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类对蛋白聚糖具有亲和性的化合物和含有此类化合物的 药物组合物。更具体地说，该化合物可用作靼向此类蛋白聚糖的造影剂。
本发明还涉及如上所述的药物组合物在诊断成像中作为造影剂的用途。
背景技术：
蛋白聚糖是分布在身体内的大分子。可在细胞内、细胞表面上和细胞外基 质中发现蛋白聚糖。蛋白聚糖代表高度糖基化的一类特殊的糖蛋白。它们由核
心蛋白和一种或多种共价结合的糖胺聚糖链组成。这些糖胺聚糖(GAG)链是长 的线形糖类多聚物(carbohydratepolymer),其由于硫酸盐和糖醛睃基团的存 在而在生理条件下带负电荷。
硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是一組蛋白聚糖。它们含有连接于核心蛋白 的D-葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的重复二糖(GAGs)。单独 的GAG的大小可达100 kDa。由于在很多糖残基上存在硫酸盐或羧基或两者， GAGs带负电荷的程度4艮高，导致HSPG整体上带负电荷。
糖胺聚糖(GAGs)或粘多糖是由重复的二糖单元组成的长的、无分支多糖。 所述单元由N-乙酰-己糖胺和己糖或己糖醛酸组成，其中之一或两者可硫酸化。 糖胺聚糖家族成员含有的己糖胺、己糖或己糖醛酸单元类型(例如葡糖醛酸、 艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺、葡糖胺)不同。它们糖苷键的几何学也不同。 该糖家族对于脊推动物和多种低等动物的生活是必需的或重要的。
GAG形成了结締組织的重要成分。
蛋白聚糖(表达)的上调与多种疾病和病症有关，例如阿尔兹海默氏病、主动 脉动脉瘤(aneurismal aortas)、动脉粥样硬化、肝纤维化、微血管内皮 (microvascular endothelia)和癌症例如乳腺癌、子宫颈癌、结肠肿瘤、结肠直 肠癌、胰腺癌、前列腺癌和韦尔斯氏肺瘤。
很多研究小组已经在积极地寻找用于体内鉴定蛋白聚糖的产品和方法，例 如以下出版物WO 00/23109 (加州大学董事会)提议了用于人癌症的诊断剂，其含有结合 于报告分子的结合分子(具体讲是一种抗体)，该诊断剂结合于磷脂酰肌醇蛋 白聚糖(glypican) -1和多配体蛋白聚糖(syndecan) -1之一。
US 2002/0122806 (Chinnaiyan等)提议了嵌合分子(例如，重组多肽和包含 荧光或化学发光的多肽和硫酸软骨素蛋白聚糖结合多肽的药物组合物)及其在诊 断成像中的应用。
WO 88/03413 (新英格兰Deaconess医院)^^开了一种寻找把标的、生物 活性分子，该分子与血管系统中用放射性核素标记的异常或核磁共振成像实体 相关。该生物活性抗体对例如硫酸软骨素蛋白聚糖具有亲和性，该抗体优选是 单克隆抗体。
WO 91/13919 (新英格兰Deaconess医院)涉及衍生自脉管相关蛋白的肽， 其对血管壁成分(可以是蛋白聚糖，可孝皮可检测标记物标记)有亲和性。
US 6,991,778 (Nitrosci)提议了用于增强关节成像的MR成像方法，其中使 用水溶性、带正电荷的硝酰-官能化树型化合物使关节中存在的软骨蛋白聚糖显 像。
如上所述，蛋白聚糖(尤其HSPG)是用于诊断多种疾病的有吸引力的标 记物。HSPG的有效耙向和成像需要在化学性质上强效(robust)和稳定且对靶 结构具有高亲和性的载体。本发明的化合物满足了这些条件。
发明概述
本发明提供新颖的化合物和含有此类化合物的药物组合物，所述化合物 对蛋白聚糖具有亲和性。该化合物包含连接有带正电荷部分(positively charged moieties )的核心单元。该化合物还包含至少一种在体内成像中可检 测到的成像部分，使该化合物用作蛋白聚糖成像中的诊断造影剂，从而用于 例如以下医学状况的诊断变性疾病、心血管疾病和癌症。
包含本发明所述化合物的药物组合物、其用途和成像方法也是本发明的一 部分。
发明详述
第一种实施方式中，本发明提供对蛋白聚糖具有亲和性的式I所定义的 化合物和其药学上可接受的盐，
R-Sp - C - (L - P)n (I)
其中C代表包含氨基酸残基的核心单元，其连接于L单元，且当S存在时连 接于S单元或当S不存在时连接于R部分(moiety);
L相同或不同，并代表双官能接头单元(bifunctional linker unit);
P相同或不同，并代表带正电荷的肽单元；
S代表间隔单元(spacer unit) 5
R代表成像部分(imaging moiety );
p代表0或1的整数；
n代表1-16的整数。
所附权利要求书中进一步说明了本发明的各个方面。
C代表包含氨基酸残基的核心单元，其连接于L单元，且当S存在时连 接于S单元或当S不存在时连接于R部分，所述氨基酸残基是天然氨基酸、 非天然氨基酸和任选的胺的氨基酸残基。所述氨基酸是D或L氨基酸，优 选是D氨基酸。所述氨基酸是赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸以及胺，例如优 选下式的那些胺
NH2
胺基优选接枝在氨基酸链上。优选C含有2-16个氨基酸残基，最优选2-8 个氨基酸残基。
甚至更优选地，单元C包含赖氨酸残基，任选还含有其它单元，例如含 有促进与单元L和单元S或所迷部分R位点特异性缀合(site specific conjugation)的官能团的其它氨基酸。此类官能团的例子是NH2、 OH、 SH、 ONH2、 NHNH2o
在尤其优选的实施方案中，所迷单元C含有2-4个氨基酸残基。所述氨 基酸残基最优选是赖氨酸残基，其中任何游离的C末端羟基残基可通过形成 酰胺残基而^t官能化。
所述优选的C单元的例子包括
核心单元C也可包含改进(modify)式(I)化合物的生物分布的单元。此 类单元称为生物修饰单元(biomodifierunits)。因此，引入例如醚将有助于使 血浆蛋白结合最小化。生物修饰单元还可包含聚乙二醇(PEG)结构单元(buildingblock)或1-10个氩基酸残基的肽链或它们的組合，生物修饰单元的 作用是改进式(I)化合物的体内药代动力学和血液清除率。此类生物修饰单元 的存在加速或减少显影剂从背景组织(例如肌肉或肝脏)和/或血液中的清除，因 此由于背景干扰较少而使诊断成像效果更好。当用于增加血液滞留时间时，对 于化合物在病理学位点与靶实体相互作用的最大化是有益的。生物修饰单元也 可用于促进特定的排泄途径，例如经由肾脏排泄而非通过肝脏排泄。
如上所述，L相同或不同，并代表将P单元与C单元连接的双官能接头 单元，优选L是中性的或带负电荷。PEG接头单元是优选的。PEG接头可 在末端基团官能化以促进与C和P单元的结合。此类官能化的例子包括羧基 化和酰胺化。
当L含有PEG单元时，优选含有衍生自式(II)的单^t性PEG样结构 (monodisperse PEG- like structure )17 -#^-5-氧代國6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十 七酸(tetraoxaheptadecanoic)的寡聚的单元
式(II)
其中，q等于l-10的整数，其结合于氨基酸的g和JL^部分。 还优选称为"PEG 12"的下式的单元L
o
如上所述，各P单元相同或不同，并含有至多20个氨基酸，优选2-16 个氨基酸。所述氨基酸是D或L氨基酸。
各P单元整体上带正电荷。因此，P含有至少一个氨基酸(优选至少两个 氨基酸)，所述氨基酸是在生理pH值下带正电荷的常见氨基酸或非常见氨基 酸。P可含有在生理pH值下呈中性的氨基酸以及任选带有一个或两个负电 荷的氨基酸，只要该P单元在生理pH值下保持整体正电性。特别优选的氨 基酸还包括氨基酸模拟物(mimetics)。优选实施方案中，P包含选自以下 的至少一种氨基酸精氨酸、精氨酸模拟物、赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、鸟 氨酸和组氨酸，但对于本领域技术人员显而易见的是，可使用各种其他的氨 基酸，并且氨基酸序列可根据受体位点的亲和性和体内结合位点的pH值而变化。
另一种优选实施方案中，各单元P具有至少2个正电荷，更优选至少3 个正电荷，最优选至少4个正电荷。整体而言，式(I)化合物应具有最少8 个正电荷，优选8-32个正电荷。
最优选地，P包含至少一种含有胍基或胍衍生基团的氨基酸。胍具有结 构式(H2N)2C=NH,在中性pH下带正电荷，为胍离子形式。含有此类胍基 或胍衍生基团的氨基酸例子是精氨酸和精氨酸模拟物(例如正精氨酸 (norArg)、苯丙氨酸(4-胍)、高精氨酸和反式脯氨酸(transPro ) (4-胍)。 也可使用其他带正电荷的非常见氨基酸。肽单元P的N末端可任选加帽 (capped)。
单元S是使单元C远离成像部分R的间隔。这种间隔在成像部分相对 庞大时(例如当成像部分含有金属络合物或放射性碘原子时)尤其重要，以 致式(I)化合物的结合不受成像部分的妨害。这可通过柔性结合来实现，例 如通过包含烷基链，从而使得成像部分能够自由地将自己定位在远离结合位 点的地方。单元S可与单元L相同或相似，即，它可以是PEG单元。
成像部分R包含"成像实体(entity)",该成像实体可在哺乳动物身 体外部检测到，或可通过使用设计用于体内的检测器(例如设计用于体内操 作使用的血管内放射或光检测器，例如内窥镜或辐射检测器)检测到。
测到的成像实体。R优选包含可在MR、 SPECT、 PET、光学或X射线成像 模式中成像的成像实体。最优选的是放射性成像实体，尤其是放射性金属离 子、发射Y射线的放射性卣素(gamma-emitting radioactive halogen)和发 射正电子的放射'性非金属(positron-emitting radioactive non-metals)， 尤 其是适于用SPECT或PET成像的那些。还特别优选包含用于光学成像的染 料的成像实体。
所述成像部分可由直接结合于式(I)的S或C单元的成像实体本身组 成，例如非金属化学实体，如卣素原子或染料。当所述成像实体是金属化合 物(例如金属离子)时，该成像实体是结合于S或C的成像部分的一部分， 例如络合剂。这种情况下，成像部分R包含成像实体。
成像实体优选选自
(i)放射性金属离子；
15(ii)顺磁性金属离子；
(Hi)发射Y射线的放射性卤素；
(iv) 发射正电子的放射性非金属；
(v) 超极化NMR-活性核；
(vi) 适于体内光学成像的报告物(reporter);
(vii) 适于血管内检测的P射线发射体。
当成像实体是放射性金属离子，即射电金属(radiometal)时，术语射 电金属包括放射性的过渡元素、镧系元素、锕系元素和金属主族元素。排除 半金属砷、硒和碲。合适的射电金属可以是正电子发射体，例如"Cu、 48V、 52Fe、 ssCo、 9ViTc或68Ga;Y射线发射体，例如"mTc、 mIn、 113mIn或67Ga。 优选的射电金属是"，c、 "Cu、 68Ga和111111。最优选的射电金属是Y射线 发射体，尤其是""^c。
当成像实体是顺磁性金属离子时，适合的此类金属离子包括Gd(III)、 Mn(II)、 Cu(II)、 Cr(III)、 Fe(III)、 Co(II)、 Er(II)、 Ni(II)、 Eu(III)或Dy(III)。 优选的顺磁性金属离子是Gd(III)、 Mn(II)和Fe(III)，其中特别优选Gd(III)。
当成像实体是发射Y射线的放射性卣素时，该放射性卤素适宜地选自 1231、 ^I或"Br。优选的发射Y射线的放射性卤素是1231。
当成像实体是发射正电子的放射性非金属时，适合的此类正电子发射体 包括"C、 13N、 150、 17F、 18F、 75Br、 76Br或124I。优选的发射正电子的放 射性非金属是"C、 13N、 "F和1241，尤其优选"C和"F，最特别优选"F。
当成像实体是超极化NMR-活性核时，此类NMR-活性核具有非零核自 旋，包括13C、 15N、 19F、 29Si和31P。其中优选13C。术语"超极化"表示 NMR-活性核的极化程度增强，超过其平衡极化程度，13c (相对于12<:)的天 然丰度为约1%,合适的130标记的化合物在超极化之前，适合地富集至丰 度为至少5%，优选至少50%,最优选至少90%。
当成像实体是适于体内光学成像的报告物时，该报告物是能够直接地或 者间接地在光学成像程序中检测到的任何实体。该报告物可以是光散射体 (例如有色或无色粒子)、光吸收体或光发射体。更优选该报告物是染料， 例如发色团或荧光化合物。染料可以是与波长为从紫外光到近红外光的电磁 波镨中的光相互作用的任何染料。最优选报告物具有荧光特性。
优选的有机发色和发荧光(fluorophoric)的报告物包括具有广泛离域电子系统(extensive delocalized electron)的报告物，例如花青、部花青、丐l咮菁(indocyanines )、 酞菁、萘肽菁(naphthalocyanines )、三苯基次甲基染料(triphenylmethines) 、 ？卜琳、pyrilium染料、thiapyriliup染料、squarylium染料、croconium染料、azulenium染料、欷苯胺(indoanilines )、苯并吩噁秦鎗(benzophenoxazinium )染料、苯并硫杂吩漆秦鎗(benzothiaphenothiazinium )染料、蒽醌、napthoquinones 、 阴丹士林(indathrenes )、邻苯二甲跣吖咬酮(pMhaloylacridones )、三(苯盼合苯醌)(trisphenoquinones )、偶氮染料、分子内和分子间电荷传递染料和染料络合物、环庚三烯酮、四溱、二(二硫醇烯(dithiolene)络合物、双(苯-二硫羟酸盐(ditWolate))络合物、碘苯胺(iodoaniline)染料、二( S，O-二硫醇烯)络合物。也可用荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)和具有不同的吸收/发射特性的改性GFP。某些情况下，也可使用某些稀土金属(例如铕、衫、铽或镝)络合物，如焚光纳米晶体(量子点)。
可使用的发色团的具体例子包括荧光素、磺基罗丹明(sulforhodamine)101 (德克萨斯红)、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明19、吲哚花青绿、Cy2、Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、 Cy5**、 Cy7、 Marina Blue, Pacific Blue、 OregonGreen 88、 Oregon Green 514、四甲基罗丹明和Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor430、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 555、 Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、 Alexa Fluor 647、 Alexa Fluor 660、 AlexaFluor 680、 Alexa Fluor 700、 Alexa Fluor 750、及它们的衍生物。
尤其优选的是在400纳米~3微米之间(尤其在600-1300纳米之间)的可见光或近红外区域具有最大吸收的染料。光学成像方式和测量技术包括但不限于发光成像；内窥镜术；荧光内窥镜术；光学相干断层摄影(coherencetomography);透射成《象；时间分辨透射成像；共焦成〗象；非线性显微术；光声成像；声光成像；分光术；反射光谱法；干涉量度；相千千涉量度(coherence interferometry ); 扩散光学断层摄影 (diffuse opticaltomography)和荧光调节的扩散光学断层摄影(连续波、时域与频域系统)和光散射、吸收、极化、发光、荧光寿命、量子产率和猝灭的检测。
当成像实体是P射线发射体，例如适于血管内检测的P射线发射体时，此类13射线发射体包括射电金属67Cn、 89Sr、 90Y、 153Sm、 186Re、 188Re或192Ir以及非金属32p、 33P、 38S、 38C1、 39C1、 82Br*83B。当成像部分包含金属离子时，金属离子作为金属络合物存在。术语"金属络合物"指金属离子与一种或多种配体的配位络合物。强烈优选金属络合
物是动力学稳定的，因此抗转移螯合(transchelation),也就是说不容易与针对金属配位点的其他可能的竟争性配体发生配位体变换。
用于本发明中、形成抗转移螯合的金属络合物的合适配体包括螯合剂，其中2-6个(优选2-4个)金属供体原子排列形成5元或6元的螯环(通过具有连接金属供体原子的碳原子或非配位杂原子的非配位骨架)；或包含强烈结合金属离子的供体原子的单齿配体，例如异腈、膦或二氮烯化物(diazenides )。作为螯合剂的一部分很好地结合金属的供体原子类型的实例为胺、硫醇、酰胺、肝和膦。膦形成非常稳固的金属络合物，即使单齿膦或二齿膦也形成合适的金属络合物。异腈和二氮烯化物的线形几何学使它们自己不易并入螯合剂中，因此通常用作单齿配体。合适的异腈的例子包括简单的烷基异腈，例如叔丁基异腈；瞇取代的异腈，例如mibi(即1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。合适的膦的例子包括Tetrofosmin和单齿配体膦，例如三(3-甲氧基丙基)膦。合适的二氮烯化物的例子包括HYNIC系列配体，即肼取代的吡啶或烟酰胺。
优选的配基是形成动力学稳定的金属络合物的螯合剂和单齿配体，例如膦、异腈和二氮烯化物。最优选的配体是如上所定义的螯合剂。
形成抗转移螯合金属络合物的合适锝螯合剂的例子包括但不限于
(i)式(III)的二胺二肝(diaminedioximes ):
其中E、E6各自独立地是R，基团；各R'是H或Cw()烷基、C3-10烷基芳基、C2.1()烷氧基烷基、Cw。羟基烷基、Cm。氟代烷基、C2-1G羧基烷基或Cwo氨基烷基，或两个或多个R，基团与它们所连接的原子形成饱和或不饱和的碳环、杂环，其中一个或多个R，基团与分支单元缀合(conjugated) ， Q是式-(J)f的桥连(bridging)基团，其中f是3、 4或5,各J独立地是-O-、-NR'-或-C(R')2-，条件是-(J)f含有最大的一个J基团(a maximum of one J
式(m)group)，其为-O-或-NR'-。优选的Q基团如下
Q =-(CH2)(CHR')(CH2)-，即，丙二胺肝(propyleneamine oxime )或PnAO衍生物；
Q =-(CH2)2(CHR')(CH2)2-，即，戊二胺肟(pentyleneamine oxime)或PentAO衍生物；
Q=-CH2)2NR (CH2)2-。
E^EG优选选自Cw烷基、烷基芳基、烷氧基烷基、羟基烷基、氟代烷基、羧基烷基或氨基烷基。最优选各E^ES基团是CH3。
分支单元优选是在Ei或EG基团，或Q基团的R'基团缀合。当分支单元缀合至Q基团的R，基团时，R，基团优选在桥头(bridgehead)位置。这种情况下，Q 优选为-(CH2)(CHR)(CH2)- 、 -(CH2)2(CHR')(CH2)2-或-(CH2)2NR'(CH2)2-，最优选國(CH2)2(CHR)(CH2)2國。
一种特别优选的双官能二胺二肟螯合剂具有式
其中单元C或S之一通过桥头-CH2CH2NH2基团缀合。进一步优选的螯合剂是
(ii) N3S配体，其具有硫醇三酖胺(thioltriamide)供体组件(donor set),例如MAG3 (巯基乙酰基次氨基三乙酸(mercaptoacetyltriglycine ))的及相关配体；或具有二酰胺吡咬硫醇(diamidepyridinethiol )供体组件，例如Pica;
(iii) N2S2配体，其具有二胺二硫醇(diaminedi也iol)供体组件，例如BAT或ECD (即双半胱氨酸乙酯(ethylcysteinate) 二聚物)或酰胺胺二硫醇供体组件，例如MAMA;
(iv) N4配体，其为具有四胺、酰胺三胺或二酰胺二胺供体组件的开链或大环配体,例如cyclam、单氧代cyclam或二氧代cyclam;(v)N202配体，其具有二胺二酚供体组件。 上述配体特别适用于络合锝例如MmTc或"mTc, Jurisson等[Chem. Rev.: 99， 2205 2218 (1999)1中有更详细的描述。这些配体也用于其他金属，例如铜 (64Cu或67Cu)、钒(例如48V)、铁(例如"Fe)或钴(例如55Co)。其他合适的配 体描述于Sandoz WO 91/01144中，其中包括特别适用于铟、钇和钆的配体， 尤其是大环氨基羧酸酯(aminocarboxylate )和氨基膦酸配体。形成钆的非 离子(即，中性)金属络合物的配体是已知的，并描述于US 4885363中。 当射电金属离子是锝时，配体优选是四齿螯合剂。优选的锝螯合剂是二胺二
肟，或如上所述具有N2S2或N3S供体組件的螯合剂。
优选地，单元P结合于金属络合物的方式使得这种键合(linkages)不容 易在血液中发生代谢，因为否则将导致标记化合物到达所需的体内靶位点之 前金属络合物裂解。因此，单元P可通过不容易代谢的键S共价键合于金属 络合物。当成像实体是放射性卣素例如碘时，合适地选择分支单元以包括 非放射性卣素原子，例如芳基碘化物或溴化物(以允许放射性碘交换)；活 化芳环(例如酚基)；有机金属前体化合物(例如三烷基锡或三烷基曱硅烷 基)；有机前体，例如三氮烯或用于亲核取代的良好离去基团，例如碘鎿盐。 引入放射性卣素(包括HI及OFF)的方法描述于Bolton [J. Lab. Comp. Radiopharm.， 45, 485-528 (2002)。可连接放射性卣素(特别碘)的合适的芳 基实例为
这两种实体均含有允许将放射性碘容易地置换到芳环上的取代基。可经 由放射性鹵素交换，通过直接碘化作用来合成含有放射性碘的可供选取的代 基。当成像实体是碘放射性同位素时，放射性碘原子优选经由直接共价键连 接于芳环(例如苯环)或连接于乙烯基，因为已知健合于饱和脂族系统的碘 原子易于在体内代谢，并因此损失放射性碘。
当成像部分包含氟放射性同位素(例如"F)时，可使用"F-氟化物与具有 良好离去基团(例如烷基溴、甲磺酸烷基醋或甲苯磺酸烷基酯)的合适前体反应而进行直接标记，从而实现放射卣化。也可通过胺前体与烷化剂(例如
18F(CH2)3OMs (其中Ms是甲磺酸酯(mesylate ))的N-烷基化来引入18F，得 到N-(CH2)318F，或与F(CH2)3OMs或18F(CH2) 3Br进行羟基的O-烷基化来 引入18F。也可通过18F(CH2)3OH反应物将N-卣代乙酰基团烷基化来引入18F, 得到-NH(CO)ch20(ch2),F衍生物。对芳基系统而言，"F-氟化物从芳基 重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐中进行亲核置换是产生芳基-"F衍生 物的合适路线。
本发明的优选实施方案中，提供式(I)化合物和药学上可接受的盐，其
中
核心单元C包含氨基酸赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸及胺； 接头L相同，并包含PEG连接单元； 单元P相同，并带有2-8个正电荷和至多20个氨基酸； S存在或不存在，当S存在时包含烷基链或PEG单元； R包含成像实体(i) (vii)之一；
(i) 放射性金属离子；
(ii) 顺磁性金属离子；
(iii) 发射y射线的放射性卤素；
(iv) 发射正电子的放射性非金属；
(v) 超极化NMR-活性核；
(vi) 适于体内光学成像的报告物；
(vii) 适于血管内检测的P射线发射体； p代表0或l的整数；和
n代表l-4的整数。
可通过本领域技术人员已知的几种合成途径，由可通过商业途径获得的 起始原料合成通式(I)的化合物。可使用化学合成领域的已知方法合成单元 C和P。使用自动肽合成仪的Merrifield固相方法(J. Am. Chem. Soc" 85: 2149 (1964))特别有用。合成策略的标准程序描述于E. Atherton & R. C. Sheppard "Solid phase peptide synthesis: a practical approach, 1989， IRL prcss， Oxford中《
通过固相技术进行肽合成是基于任选通过接头单元连接至固相支持物 的受保护的氨基酸的顺序加入(equential addition)。在一种通常使用的方
21法中，用对酸敏感或对碱敏感的保护基适宜地保护OC-氨基。加入并偶合第一 个氨基酸残基后，脱除ct-氨基保护基。通过顺序加成其它受保护的氨基酸衍
生物或肽片段来延伸肽链。
式(la )化合物
Sp國C-(L-P)n
式(la)
其中，S、 p、 C、 L、 P和n具有如上定义，并包括非肽接头单元，可使用完 全自动合成程序组装S (当存在时)和P。下一步中，通过常规合成方法将 成像部分R与S或C单元偶合。如上所述，非金属成像实体可与C单元直 接偶合，或者它可结合于载体，例如结合于用于碘元素的芳基实体。当成像 实体是金属离子时，将合适的络合剂偶合于S或C单元，根据本领域已知方 法程序例如WO 03/006070所述方法，将盐或氧化物形式的金属离子加成到 带有络合剂的化合物。
本发明化合物的制备可基于结构单元(building blocks)和分步合成。 核心单元C用作笫一结构单元，其中所述核心被活性基团取代，所述活性基 团允许连接L以及Sp或R。 L或其前体与取代的第一结构单元反应形成由核 心C和L组成的第二结构单元。对于该反应，L包含可与第一结构单元的活 性基团反应的活性基团以使L连接于所述第一结构单元。在接下来的步骤中， P或其前体连接于第二结构单元，形成由核心C、 L和P组成的第三结构单 元。当存在时，Sp或其前体连接于第三结构单元，形成由核心Sp、 C、 L和 P组成的第四结构单元。取决于Sp是否存在，R或其前体连接于第三或第四 结构单元。
因此，制备本发明化合物的方法包括
f) 使用被活性基团取代的核心单元C作为第一结构单元，该活性基团允 许连接L以及Sp或R;
g) 使L或其前体与所述第一结构单元反应，形成由核心C和L组成的第 二结构单元；
h) 4吏P或其前体与所述笫二结构单元反应，形成由核心C、 L和P组成 的第三结构单元；
i) 任选地使Sp或其前体与所述第三结构单元反应，形成由核心Sp、 C、 L和P组成的第四结构单元；j)使R或其前体与所述笫三或第四结构单元反应。
本发明的式(I)化合物对蛋白聚糖具有亲和性。蛋白聚糖的例子是多 配体蛋白聚糖-1和GPC1 (在胰腺癌中上调)、多配体蛋白聚糖-2 (在结肠 癌中上调)和多配体蛋白聚糖-4 (在肝细胞癌中上调)。优选的本发明化合 物对HSPG有亲和性，并通过与葡糖胺聚糖的负电荷相互作用而靶向HSPG 的葡糖胺聚糖(GAG)。式(I)化合物的结构肽序列P与GAG的重复棒 样(stick-like)结构相配，形成交叉结合的靶向效应。肽结构P可结合一个 GAG的几个区域或交叉结合于几个GAG链。这可提供比具有一个带正电荷 的单一肽链的那些化合物更高的结合亲和性。
给予本发明化合物至哺乳动物体内后，可检测到成像部分。为了给药， 将式(I)化合物配制为适于体内注射的无菌组合物或适于口服的组合物，或 适于给予到体内管腔(例如直肠和子宫)中的组合物。
第二方面中，本发明提供适于哺乳动物给药形式的药物组合物，其包含如 上所述化合物和生物相容性载体。"生物相容性载体"是流体，特别是液体， 化合物可悬浮或溶解于其中，提供生理上可耐受形式的组合物，该组合物可给 药至哺乳动物体内而无毒性或过度的不适。生物相容性载体宜为可注射的载体 液体，例如无菌的、无热原的注射用水；水溶液，例如盐水(可有利地平衡以 使用于注射的成品是等渗的或非低渗的)； 一种或多种毒性调节物质的水溶液 (例如具有生物相容性平衡离子的血浆阳离子盐(salts of plasma cations with biocompatible coimterions));糖(例如葡萄糖或蔗糖)；糖醇(例如山梨糖 醇或甘露糖醇)；甘醇(例如甘油)；或其他非离子多元醇物质(例如聚乙二 醇、丙二醇等等)。
本发明还提供所述药物组合物在诊断成像方法中的应用。该方法包括将 药物组合物给予人体或非人体。所述人体或非人体用诊断装置检查，从检查 中收集数据。如果需要，所迷数据可进一步处理以便于这些数据可用于产生 影像并用于获得诊断。这些数据可用于如上所述的与蛋白聚糖上调相关疾病 和病症的可视化和鉴定。可通过注射或输注无菌组合物来给予所述化合物， 或作为适于口服的组合物给药，或给予到体内管腔例如直肠和子宫中。
另一方面，本发明还提供人体或非人体的诊断成像方法，其包括对之前 已给予上述药物组合物的人体或非人体成像。这种实施方式中，本发明药物 组合物用于成像方法或成像过程，其中术语"之前已给予"指已经进行了需要医学上合格的人员将所述组合物给予患者的任何步骤。
另一方面，本发明提供产生人体或动物体的影像的方法，其中将本文公 开的化合物或包含此类化合物的药物組合物给予人体或非人体，其中产生已 经分布有所述化合物的至少一部分至所述人体或非人体的影像。
实施例
使用以下缩写
Ac: 乙耽基 Arg: 精氨酸 Boc: 叔丁氧羰基
Dde: l-( 4,4 -二甲基-2，6-二氧代环己-l-亚基-(ylidene ))乙基
DMF: 二甲基甲酰胺 Fmoc: 9-芴基甲氧羰基 Glu: 谷氨酸 Gly: 甘氨酸
HATU: N-[(二甲基氨基)-lH-l，2，3三唑并[4，5-b吡啶-l-基亚甲
基-N-甲基六氟磷酸甲铵 N-氧化物 (N-methylmethanaminium hexafluorophosohate N画oxide )
HBTU: 2-(lH-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
(tetramethyluronium hexafluorophosphate )
HOAt: l-羟基-7-氮杂苯并三唑
HPLC: 高效液相色谱法
Lys: 赖氨酸
NMM: 4-甲基吗淋
Ot-Bu: 叔丁醇盐(Tert butoxide)
Pbf: 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
PEG: 聚乙二醇
PEG4: 17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七酸
PEG12: 39腸氨基誦4，7,10，13，16，19，22，25，28，31，34,37誦十二氧杂丙酸
(dodecaoxapropionic acid ) PyAOP: [7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷)膦鎗
((pyrrolidino)phosphonium )國六氟裤酸盐
24TFA:
脯氨酸
三氟乙酸
三异丙基硅烷
Rink amide (TM) 聚笨乙烯基树脂
实施例l-8说明了对应于上述式(la)化合物(当p等于0时)的式C-(L-P)n的中间体的制备。实施例9-13说明式(I)化合物。
实施例1
Ac-D-Arg-D隱Arg-D誦Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-PEG12隱D-LvsfPEG12-D-A rg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-D國Arg-D-Arg-Ac、-D-Lvs-NHL的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k-NH2
I
Ac-r-r-r-G-G-G扁r-PEG12
用Rink Amide MBHA树脂(Novabiochem， 0.58毫摩尔/g;标称 (scale)=0.10亳摩尔)-0.172g作为起始材料手动組装Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-D-Lys(Dde)-OH和Fmoc PEG12。在肽合成期间，使用含20%哌啶 (Fluka)的二甲基甲酰胺(Rathburn)脱除Fmoc基团，使用含2%肼(Aldrich) 的DMF脱除Dde保护基。用含HATU (Applied biosystems， 114 mg， 0.3毫 摩尔)和4-甲基吗啉(Fluka， 66 M L， 0.6毫摩尔)的DMF预活化 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (Novabiochem， 141 mg, 0.3亳摩尔)，然后将预活化的 Fmoc-D-Lys(Boc)-OH与树脂偶合。以同样方式，使用Fmoc-D-Lys(Dde)-OH (Novabiochem， 266.3 mg, 0.5毫摩尔)、配制在DMF中的HATU (Appliedbiosystems， 190 mg， 0.5毫摩尔)和4-甲基吗啉(Fluka，110 p L， 1.0毫摩尔)以 及39-(Fmoc-氨基酸)-4，7，10，13,16，19，22，25,28，31，34，37-十二氧杂丙酸 (Polypure， 336 mg， 0.4亳摩尔)、DMF中配制的HATU (Applied biosystems, 152mg，0.4亳摩尔)和4-甲基吗啉(Fluka， 88 pL，0.8毫摩尔)进行接下来 的氨基酸偶合。使用购自Applied Biosystems的1亳摩尔氨基酸柱 (cartridges)利用完全自动合成(ABI 433A )进行其余氨基酸序列 (D誦Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)画Gly國Gly-Gly-D-Arg(Pbf))的组装。在偶 合之前用HBTU (Applied biosystems )预活化氨基酸。用含乙酸酐(Merck， 10 eq.)和4-甲基吗啉(Fluka， 20 eq.)的DMF将树脂乙酰化。在含有2.5 % 水和2.5 。/。三异丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同时进行侧链保护基 的脱除和肽从树脂的脱除，持续6小时。通过过滤和真空蒸发滤液除去树脂。 将二乙醚(Eternell)加到残留物中。得到的沉淀物用乙醚洗涤并风干。用反 相制备色谱(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶剂A-水/ 0.1% TFA 和B= CH3CN/0.1% TFA;梯度10-25 % B,经60 min;流速10 ml /分钟;在214 和254nm处检测)纯化粗制品。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶剂A-水+0."/。TFA和B=CH3CN+0.1% TFA;梯度 10-25 % B,经20 min;流速1.0 ml /分钟;保留时间11.8分钟；在214和254nm 处检测)。用质谱法进一步表征，得到m/z值1050.7 [M-3H+1。
实施例2
Ac隱r-r-r-G國G-G-r-G-e-PEG12-k-k-NH: Ac-r-r-r-G-G-G-r-G-e-PEG12<formula>formula see original document page 27</formula>
使用NovaPEG Rink Amide树脂(Novabiochem， 0.62毫摩尔/g;标称= 0.05毫摩尔)=0.081 g)，利用完全自动合成方法(Liberty CEM微波肽合成) 组装氨基酸序列D國Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)-Gly-Gly-Gly画D-Arg (Pbf)-Gly國D-Glu(Ot-Bu)-PEG12-D-Lys(-PEG12-D漏Glu(Ot-Bu)-Gly画D-Arg(P bf)國Gly-Gly國Gly-D國Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)曙D-Arg(Pbf)-D-Lys(Boc)。在偶合之 前用HBTU ( Applied Wosystems )预活^ffc氨基酸(Iris Biotech和 Novabiochem)。用二曱基甲酰胺(Rathburn)中的乙酸酐(Merck, 10 eq.) 和4-甲基吗啉(Fluka， 20 eq.)将树脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 %三异 丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同时进行侧链保护基的脱除和肽从 树脂的脱除，持续过夜。通过过滤和真空蒸发滤液除去树脂。将二乙醚 (Eternell)加到残留物中。得到的沉淀物用乙醚洗涤并风干。用反相制备色 语(Phenomenex Luna C18柱，00G隱4252誦P0;溶剂A-水/0.10/。 TFA和B= CH3CN/0.1% TFA;梯度00-30 % B,经40 min;流速10 ml /分钟;检测214 和254 nm)纯化一半的粗制品，获得13.1 mg纯化合物。用分析HPLC表 征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶剂人=水+0.1% TFA / B= CH3CN + 0.1°/。 TFA;梯度10-45 % B,经20 min;流速1.0 ml /分钟;保留 时间8.8分钟；检测214和254 nm )。用质诿法进一步表征，得到m/z值 1761.8 [M誦2H+1。
实施例3
Ac画D-Arg誦D-Pro-D-Arg-D-Pro-D國Arg画D-Pro-D-Arg-D國Pro-PEG4画D-Lvs 0PEG4-D國Pro-D國Arg-D-Pro國D-Arg-D國Pro-D画Arg-D-Pro-D-Arg-Ac、-D-Lvs-N
H^的合成<formula>formula see original document page 28</formula>
使用NovaPEG Rink Amide树脂(Novabiochem， 0.62毫摩尔/g;标称=0.05 毫摩尔)=0.081g)，利用完全自动合成方法(Liberty CEM微波肽合成)组装氨 基,列(D-Arg(Pbf)画D-Pro國D國Arg(Pbf)-D-Pro國D-Arg(Pbf)-D國Pro-D-Arg (Pbf)國D國Pro-PEG4-D國Lys(PEG4國D画Pro國D-Arg(Pbf)謹D-Pro画D-Arg(Pbf)-D-Pr o-D-Arg(Pbf)-D-Pro-D-Arg(Pbf))國D-Lys(Boc)。在偶合之前用HBTU( Applied biosystems)预活化氨基酸(Iris Biotech和Novabiochem )。用含乙酸酐 (Merck, 10 eq.)和4-甲基吗啉(Fluka， 20 eq.)的二曱基曱酰胺(Rathburn ) 将树脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 。/。三异丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸 (Fluka)中同时进行側链保护基的脱除和肽从树脂的脱除，持续过夜。通过过 滤和真空蒸发滤液除去树脂。将二乙醚(Eternell)加到残留物中。得到的沉 淀物用乙醚洗涤并风干。用反相制备色谙(Phenomenex Lima C18柱， 00G-4252誦P0;溶剂A-水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-30 % B,经40min;流速10ml/分钟;检测214和254 nm )纯化一半的粗制品， 获得21.8 mg纯化合物。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18 柱，00G-4252-E0;溶剂A-水十0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度 10-25 % B,经20 min;流速1.0 ml /分钟;保留时间9.6分钟；检测214和254nm )。用质谱法进一步表征，得到m/z值1824.4 [M-2H+ + 3TFA。 实施例4
Ac-D-Arg國D國Arg-D國Arg-Glv誦GW-Glv國D-Arg画PEG12-D画Lvsn EG12-D-A rg-Glv國Glv-Glv-D-Arg-D-Arg國D-Arg國Ac、-WAc-D國Arg-D-Arg画D-Arg國Glv-Glv -GIv-D-Arg-PEGU-D-LvsfPEGU-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Ac))-D-Lvs-NH^的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k-k-N
i
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k Ac-r-r國r-G-G-G-r-P E G12
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使用NovaPEG Rink Amide树脂(Novabiochem， 0.62亳摩尔/g;标称=0.025 毫摩尔)=0.040 g)，利用完全自动合成方法(Liberty CEM微波肽合成)组装氨 基 酸 序 列
(D画Arg(Pbf)-D-Arg(Pbi)-D-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Gly-D-Arg(Pbf)-PEG12國D-Lys(PEG12國D國Arg(Pbf)國Gly-Gly-Gly-D-Arg(Pbi)國D画Arg(Pbf)國D-Arg(Pbf))-D-Lys(D-Arg(Pbi)-D画Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Gly誦D-Arg(Pbf)國PEG12-D陽Lys(PEG12-D-Arg(Pbf)-Gly画Gly-Gly-D垂Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbi)))扁D-Lys(Boc)。在偶合之前用HBTU (Applied biosystems )预活化氨基酸(Iris Biotech和Novabiochem )。用含乙酸酐(Merely 10 eq.)和4 -甲基吗琳(Fluka， 20 eq.)的二甲基甲酰胺(Rathbura)将树脂乙跣化。在含有2.5 %水和2.5 %三异丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同时进行侧链保护基的脱除和肽从树脂的脱除，持续过夜。通过过滤和真空蒸发滤液除去树脂。将二乙醚(Eternell)加到残留物中。得到的沉淀物用乙醚洗涤并风干。用反相制备色谱(PhenomenexLuna C18柱，00G-4252-P0;溶剂A-水/ 0.1% TFA和B=CH3CN / 0.1% TFA;梯度00-30 %B，经40min;流速10ml/分钟;检测214和254 nm )纯化1/4的粗制品，获得2.8 mg纯化合物。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶剂入=水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 %B，经20min;流速1.0ml/分钟;保留时间9.0分钟；检测214和254nm )。
实施例5
Ac-D國Arg-D-Pro-D画Arg-D-Pro-D-Arg-D國Pro-D誦Arg-D-Pro-PEG4fPEG4-D國Pro-D國Arg-D國Pro-D-Arg-D-Pro-D國Arg-D國Pro國D-Arg隱Ac)-kfAc-D國Arg-D-Pro-D-Arg-D-Pro-D-Arg-D-Pro-D-Arg-D-Pro-PEG4-D-Lvs(PEG4-D-Pro-D-Arg隱D-Pro-D-Arg-D-Pro画D-Arg曙D-Pro-D-Arg-Ac))-D國Lvs-NHi的合成
Ac-r-p-r扁p-r-p-r-p-PEG4Ac-r-p-r-p-r-p-r-p-P EG4-k-k-k-N HAc-r-p-r-p-r-p-r陽p-P E G4-kAc-r-p-r-p-r-p-r-p-PEG4
30<formula>formula see original document page 31</formula>
使用NovaPEG Rink Amide树脂(NovaWochem， 0.62毫摩尔/g;标称=0.025毫摩尔)=0.040 g)和完全自动合成方法(Liberty CEM微波肽合成)组 装 氨 基 酸 序 列
(D-Arg(Pbf)-D-Pro誦D-Arg(Pbf)-D-Pro國D-Arg(Pbf)國D國Pro-D-Arg(Pbf)-D國Pro誦PEG4 (PEG4國D-Pro國D-Arg(Pbf)-D-Pro画D-Arg(Pbf)-D國Pro-D画Arg(Pbf)
國D-Pro-D-Arg(Pbf))-D-Lys(D-Arg(Pbf)-D-Pro-D-Arg(Fbf)誦D-Pro墨D-Arg(Pbf)画D-Pro-D-Arg(Pbf)國D-Pro誦PEG4國D画Lys(PEG4國D國Pro國D-Arg(Pbf)-D-Pro-D-Arg(Pbf)國D-Pro國D國Arg(Pbf)-D誦Pro-D-Arg(Pbf)))-D國Lys(Boc))。在偶合之前用HBTU ( Applied biosystems )预活4乜氨基酸(Iris Biotech和Novabiochem )。用含乙酸酐(Merck, 10 eq.)和4 -甲基吗啉(Fluka， 20 eq.)的二甲基曱酰胺(Rathburn)将树脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 %三异丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同时进行侧链保护基的脱除和肽从树脂的脱除，持续过夜。通过过滤和真空蒸发滤液除去树脂。将二乙醚(Eternell)加到残留物中。得到的沉淀物用乙醚洗涤并风干。用反相制备色谱(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶剂入=水/0.1% TFA和B=CH3CN/0.1% TFA;梯度00-30 % B，经40 min;流速10 ml/分钟;检测214和254nm)纯化一半的粗制品，获得6.8mg纯化合物。用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶剂A-水十0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-25 % B,经20 min;流速1.0 ml /分钟;保留时间10.5分钟；检测214和254 nm )。实施例6
Ac-D-Arg-D-Lvs-D-Lvs國D-Arg-D-Arg-D-Orn-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Gly-D-Glu國D-Glu-PEG12-D國LvsrPEG12國D-Glu國D-Glu國D-Glv-D-Arg-D-Arg-D-Arg國D-Orn國D-Arg-D画Arg-D陽Lvs,D國Lvs-D陽Arg-Ac、-D國Os國NH，的合成
<formula>formula see original document page 32</formula>用0.05 mmolNovaPEG Rink Amide树脂(Novabiochem)作为起始材料，使 用Fmoc化学在CEM Liberty微波肽合成仪上组装氨基酸序列 D國Arg(Pbf)國D画Lys(Boc)國D國Lys(Boc)-D-Arg(Pbf)國D-Arg(Pbf)誦D-Orn(Boc)-D-Arg (Pbf)-D-Arg(Pbf)-D國Arg(Pbf)幽Gly-D國Glu(OtBu)-D-Glu(OtBu)-PEG12-D-Lys(P EG12-D-Glu(OtBu)-D國Glu(OtBu)-Gly画D-Arg(Pbf)-D隱Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)陽D-0 rn(Boc)國D誦Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc)-D-Arg(Pbf))-D-Cys(Tr t)。各偶合步骤中使用0.4 mmol氨基酸(Iris Biotech, Fluka和Novabiochem)， 用HATU (GenScript Corp.)、 HOAt (GenScript Corp.)和DIEA (Fluka)进行原 位活化。用含乙酸酐(Merely 10 eq.)和DIEA (Fluka, lleq.)的二甲基曱酰胺 (Rathburn)将树脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 。/。三异丙基硅烷(Aldrich) 的三氟乙酸(Fluka)中同时进行侧链保护基的脱除和肽从树脂的脱除，持续过 夜。通过过滤和真空蒸发滤液除去树脂。将二乙醚(Eterndl)加到残留物中。 得到的沉淀物用乙醚洗涤并风干。用反相制备色谱(Phenomenex Luna C18柱， 00G-4252隱P0;溶剂入=水/0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-50 % B，经40min;流速10ml/分钟;检测214和254 nm)纯化一半的粗制品，获 得纯化合物。用分析HPLC表征化合物:Phe加menex Luna 3 n C18 (2) 20 x 2 mm;溶剂A-水+ 0.1% TFA/ B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-50 % B,经5 min;流速0.6ml/分钟;保留时间1.77分钟；检测214 nm)。用质谱法进一步 表征，得到m/z值1593.3 [M3H3+I。
实施例7
Ac-D-Arg國D-Lvs陽D-Lvs-D-Arg-D國Arg-D-Orn國D画Arg-D-Arg誦D-Arg画PEG 12國D-LvsfPEG12-D-D画Arg-D-Arg國D画Arg-D-Orn國D-Arg國D-Arg-D-Lvs-D-Lvs -D-Arg扁Ac)-D-Os-NH，的合成
Ac-r-k-k-r-r-o-r-r-r-PEG12-k-c-NH2
i
Ac-r-k-k-r-r-o-r-r-r-PEG12, 000 000 000 0^0 000 0^V^V^
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用0.05 mmolNovaPEGRink Amide树脂(Novabiochem)作为起始材料，使 用Fmoc化学在CEM Liberty微波肽合成仪上组装氨基酸序列 D-Arg(Pbf)-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc)-D-Arg(Pbf)國D-Arg(Pbf)-D-Orn(Boc)-D國Arg (Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-PEG12-D-Lys(PEG12-D-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)國D-Orn(Boc)國D-Arg(Pbf)陽D-Arg(Pbf)-D國Lys(Boc)國D-Lys(Boc)-D-Arg (Pbf))-D-Cys(Trt)。各偶合步骤中使用0.4 mmol #^酸(Iris Biotech, Fluka和 Novabiochem),用HATU (GenScript Corp.)、 HO At (GenScript Corp.)和 DIEA (Fluka)进行原位活化。用含乙酸酐(Merely 10 eq.)和DIEA ( Fluka， lleq.)的二曱基甲酰胺(Rathburn)将树脂乙酰化。在含有2.5 %水和2.5 % 三异丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同时进行侧链保护基的脱除和肽从 树脂的脱除，持续过夜。通过过滤和真空蒸发滤液除去树脂。将二乙醚 (Eteraell)加到残留物中。得到的沉淀物用乙醚洗涤并风干。用反相制备色谱 (Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶剂A-水/0.10/。 TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-35 % B,经40 min;流速10 ml /分钟;检测214和254 nm )纯化一半的粗制品，获得纯化合物。用分析HPLC表征化合 物:Phenomenex Luna3 p C18 (2) 20 x 2 mm;溶剂A-水+ 0.1% TFA/ B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-30 % B，经5 min;流速0.6 ml /分钟；保留时间 2.80分钟；检测214mn)。用质谱法进一步表征，得到m/z值1265.3 [(M4H + 8TFA)4+。 实施例8
Ac-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Glv画Glv-D画Arg誦D-Arg画D-Arg-Glv-Glv-D-Arg醫D-Arg-PEG12-D-LvsfPEG12-D-Arg画D-Arg-Glv-Glv誦D-Arg誦D-Arg-D誦Arg-Gl v-Glv-D-Arg-D-Arg國D國Arg國Ac、-D-Lvs國NH^的合成
Ac-r-r-r-G-G-r-r-r-G-G-r-r-PEG12-k-k-NH2
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Ac-r-r-r隱G-G-r-r-r-G-G-r-r-PEG12
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C 、oV 一
用0.05 mmol NovaPEG Rink Amide树脂(Novabiochem)作为起始材 料，使用Fmoc化学在CEM Liberty微波肽合成仪上组装氨基酸序列 D誦Arg(Pbf)隱D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-Gly誦Gly-D-Arg(Pbf)画D國Arg(Pbf)画D-Arg( Pbf)-Gly-Gly-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-PEG12-D-Lys(PEG12-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-Gly-Gly國D画Arg(Pbf)陽D國Arg(Pbf)誦D-Arg(Pbf)-Gly-Gly-D-Arg(Pbf)國 D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf))-D國Lys(Boc)。各偶合步骤中使用0.4 mmol氨基酸 (Iris Biotech, Fluka和Novabiochem )，用HATU (GenScript Corp.)、 HOAt (GenScript Corp.)和DIEA (Fluka)进行原位活化。用含乙酸酐(Merck, 10 eq.)和DIEA ( Fluka， lleq.)的二甲基甲酰胺(Rathburn )将树脂乙酰化。 在含有2.5 %水和2.5 。/o三异丙基硅烷(Aldrich)的三氟乙酸(Fluka)中同时进 行侧链保护基的脱除和肽从树脂的脱除，持续过夜。通过过滤和真空蒸发滤 液除去树脂。将二乙醚(Eternell)加到残留物中。得到的沉淀物用乙醚洗涤 并风干。用反相制备色谱(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶剂A= 水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-35 % B,经40 min;流速 10ml/分钟;检测214和254 nm)纯化一半的粗制品，获得纯化合物。用 分析HPLC表征化合物:Phenomenex Luna3 m C18 (2) 20 x 2 mm;溶剂A-水 + 0.1% TFA/ B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-30 % B，经5 min;流速0.6 ml
35/分钟;保留时间2.19分钟；检测214 nm)。用质谱法进一步表征，得到 m/z值808.5 [(M6H + 3TFA)"。
实施例9
<formula>formula see original document page 36</formula>
将实施例1组装的肽(3.4mg, 1.1微摩尔)加入到含(S)-2(叔丁氧Hl^-羧甲基 画^^)-3-(l-三苯甲基-lH-咪唑-4-基)-丙酸叔丁酯(1.0 mg， 1.6微摩尔)、PyAOP (Applied Biosystems， 0.86 mg， 1.6 ^#尔)和二异丙基乙胺(Fluka， 0,55 ^L， 3.2 微摩尔)的二甲基曱酰胺(Ra也bura， 0.6 mL)中。将该溶液静置过夜，然后用反 相制备色谱(Phenomenex Lima C18柱，00G-4252-P0;溶剂A-水/ 0.1% TFA 和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-40 % B,经40 min;流速10 ml /分钟;检测 214和254 nm)纯化粗制品(含有二甲基甲酰胺)。用质谱法进一步表征，得 到m/z值1438.0 [M-3H+ + 5TFAj 。使用三氟乙酸(Fluka) ( 95% )、水(2.5 % ) 和三异丙基硅烷(Aldrich) (2.5 % )脱除螯合物上的保护基。1小时后减压蒸发 TFA，用反相制备色谱(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-N0;溶剂A-水/0.1。/oHCOOH和B=CH3CN/0.1% HCOOH;梯度00-20 %B,经30min;流速 5ml/分钟;检测214和254 nm )纯化粗制品，获得1.5 mg纯化合物。用分析 HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G陽4252-E0;溶剂A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 % B,经20 min;流速1.0 ml /分钟； 保留时间8.7分钟；检测214和254 nm)。用质谱法进一步表征，得到m/z 值1672.3 [M画2H+I。
将由此获得的下式
Ac國D國Arg-D-Arg隱D-Arg-Gly-Gly國Gly隱D國Arg國PEG12-D隱Lys(-PEG12國D-Arg國 Gly-Gly-Gly-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Ac)-D-Lys(COCH2NH-His-OH)-NH2的产
物通过羧酸基团和咪唑与99mTc配位。
实施例10
Ac-D-Arg-D-Arg-D画Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-PEG12-D國Lvs(-PEG12-D-Arg-Glv-Glv誦Glv-D誦Arg-D國Arg-D-Arg-Ac、-D-LvsfCOCH2CHfCH2NHCH2C H,NH+、-NH,及其"mTc络合物的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(COCH2CH(CH2NHCH2CH2NH2)2)-NH2 Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12
<formula>formula see original document page 37</formula>一
将实施例1组装的肽(3.4mg, 1.1微摩尔)加入到含N-琥珀酰亚胺基 (Succinimidyl) 4-(2-#J^-乙#^)-3-[(2-#^-乙#^)-甲基-丁酸酯(1.2 mg， 1.6微摩尔)、HOAt (Genscript Corp, 0.20 mg， 1.6微摩尔)和二异丙基乙胺(Fluka，0，SS^iL，i2微摩尔)的二甲基甲酰胺(Rathburn, 0.6 mL)中。将该溶液 静置过夜，然后用反相制备色语(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-P0;溶剂 A-水/ 0.1°/。 TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-50 % B,经40 min;流速 10ml/分钟;检测214和254 nm)纯化粗制品(含二甲基甲酰胺)。用质谱进 一步表征，得到m/z值1440.2 [M-3H+ + 5TFA。使用三氟乙酸(Fluka)( 97.5% ) 和水(2.5 % )脱除螯合物上的保护基。1小时后减压蒸发TFA，用反相制备色 谱(Phe加menex Lima C18柱，10G-42102-P0;溶剂A-水/0.1。/。 TFA和B-CH3CN/0.1% TFA;梯度10-40 %B,经40 min;流速10 ml/分钟;检测214和 2104 mn)纯化粗制品，获得1.9 mg纯化合物。用分析HPLC表征化合 物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶剂A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 % B,经20 min;流速1.0 ml /分钟;保留时间8.5 分钟；检测214和254 nm)。用质谱法进一步表征，得到m/z值1674.8 [M-2H+]。
可用已知方法例如WO 03/006070所述方法加入放射性成像实体(优选 99mTc)。
实施例11
Ac-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-PEG12-D-Lvs"PEG12-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Ac、國D-Lvs"3"4-hvdroxv-Dhenvl)Dro Dionvl)-NH2及其碘化(iodinated)衍生物的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(3-(4-hydroxy-phenyl)propionyl)-NH2 Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12气 ,
久V^^M人V1^ 110。 。0。 。0。 。0。 。0。 。0。 。11
。,
WKJ义NH *^^
入N、 1 H O H O 、
将实施例1组装的肽(3.4mg， 1.1微摩尔)加入到含3-(4-羟基苯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma， 0.40 mg， 1.6微摩尔)和二异丙基乙胺(Fluka， 0，55 ^L， 3.2微摩尔)的二甲基甲酰胺(Ra也burn， 0.6mL)中。将该溶液静置过夜，然后 利用反相制备色谱(Phenomenex Lima C18柱，00G-4252-P0;溶剂A二水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度10-50 % B，经40 min;流速10 ml /分钟; 检测214和254nm)纯化粗制品(含二甲基甲酰胺)，得到2.0 mg纯化合物。 用分析HPLC表征化合物:Phenomenex Lima C18柱,00G-4252-E0;溶剂A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-40 % B,经20 min;流速1.0 ml / 分钟;保留时间9.7分钟；检测214和254nm)。用质镨法进一步表征，得到 m/z值1289.4 [M-3H+ + 5TFA]。
碘化衍生物
>.、<formula>formula see original document page 40</formula>
为制备碘化衍生物，可采用Bolton, [J丄ab.Comp.Radiopharm.， 45 485-528 (2002)1所述方法在酚基的邻位上51入碘原子。
实施例12
Ac-D隱Arg-D誦Arg-D-Arg-Glv-Glv-Glv-D國Arg-PEG12-D丄vs"PEG12-D-Arg-Glv誦Glv-Glv-D國Arg-D-Arg-D-Arg-Ac)-D誦LvsfQ5.5)國NH,的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(Cy5.5)-NH2 Ac-r-r-r國G-G-G-r-P EG 12h nh
hn、 hm、
、Yt5iY入 厶V^。 。0。 。0。 。0。 。0。 。0。 。^y11^^ "。
< ，H s L" 。z。
、\ 。 w"
将溶解在二甲基曱酰胺(Rathburn， 0.25 mL)中的实施例1组装的肽(2.8 mg， 0.89##尔)加入到溶解在1\-曱基吡咯烷酮(Applied biosystems， 0.25 mL) 中的Cy5.5 NHS酯(GE Healthcare, 1.5 mg， 1.3微摩尔)和对称可力丁 (sym,collidine) (Fluka， 1.2 jiL， 9.1微摩尔)的溶液中，将澄清的蓝色反应混合 物避光并搅拌过夜。然后该反应混合物用水/ 0.1 % TFA ( 6 mL)稀释，利用制 备HPLC提供反相制备色谱(Phenomenex Luna C18柱，00G-4252画P0;溶剂A= 水/ 0.1% TFA和B= CH3CN / 0.1% TFA;梯度00-40 % B,经40 min;流速10 ml /分钟;检测214和254 nm)纯化产品，得到1.1 mg纯化合物。用分析 HPLC表征化合物:Phenomenex Luna C18柱，00G-4252-E0;溶剂A-水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-25 % B，经20 min;流速1.0 ml /分钟； 保留时间16.5分钟；检测214和254 nm)。 用质镨法进一步表征，得到m/z 值1350.4 [M國3H+。
实施例13
Ac-D-Arg-D-Arg-D-Arg-Glv-GW-Glv-D-Arg-PEG12-D-Lvsf-PEG12-D-Arg國Glv-Glv-Glv-D画Arg-D-Arg-D-Arg國Ac)-D画LvsfCv5")-NH二的合成
Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12-k-k(Cy5**)-NH2 Ac-r-r-r-G-G-G-r-PEG12<formula>formula see original document page 42</formula>
将溶解在二甲基甲酰胺(Rathburn， 0.25 mL)中的实施例1组装的肽(2.8 mg， 0.89微摩尔)加入溶解在N-甲基吡咯烷酮(Applied biosystems， 0.25 mL)中 的Cy5** NHS酯(GE Healthcare, 1.8 mg， 1.3微摩尔)和对称可力丁(Fluka， 1.2 ^L，9.1微摩尔)的溶液，将澄清的蓝色反应混合物避光并搅拌过夜。然后该反应 混合物用水/ 0.1 % TFA (6mL)稀释，利用制备HPLC提供反相制备色镨 (Phenomenex Luna C18柱，00G画4252國P0;溶剂A-水/ 0.1% TFA和B= CH3CN/0.1% TFA;梯度10-40 %B,经40 min;流速10 ml/分钟;检测214和 254 nm)纯化产品，得到1.2 mg纯化合物。用分析HPLC表征化合物 Phenomenex Lima C18柱，00G-4252-E0;溶剂人=水+ 0.1% TFA和B= CH3CN + 0.1% TFA;梯度10-25 % B，经20 min;流速1.0 ml/分钟;保留时间14.5分钟； 检测214和254 nm)。用质谱法进一步表征，得到m/z值1340.6 [M-3H+。
权利要求
1.对蛋白聚糖具有亲和性的式I化合物和其药学上可接受的盐R-Sp-C-(L-P)n(I)其中C代表包含氨基酸残基的核心单元，其连接于L单元，且当S存在时连接于S单元或当S不存在时连接于R部分；L相同或不同，并代表双官能接头单元；P相同或不同，并代表带正电荷的肽单元；S代表间隔单元；R代表成像部分；p代表0或1的整数；n代表1-16的整数。
2. 如权利要求l所述的化合物，其中，核心单元C包含氨基酸赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸及胺； 接头L相同，并包含PEG连接单元； 单元P相同，并带有2-8个正电荷和至多20个氨基酸； S存在或不存在，存在时包含烷基链或PEG单元； R包含成像实体(i) - (vii)之一(i) 放射性金属离子；(ii) 顺磁性金属离子；(iii) 发射Y射线的放射性卤素；(iv) 发射正电子的放射性非金属；(v) 超极化NMR-活性核；(vi) 适于体内光学成像的报告物；(vii) 适于血管内检测的P射线发射体； p代表O或1的整数；和n代表l-4的整数。
3. 如权利要求1-2所述的化合物，其中，C包含2-16个氨基酸残基。
4. 如权利要求l-3所述的化合物，其中，C包含2-4个赖氨酸残基，其中 游离的末端羧基残基通过形成酰胺残基而被官能化。
5. 如权利要求1-2所述的化合物，其中，L包含PEG接头，该PEG接 头在末端基团通过羧基化和/或酰胺化而被官能化。
6. 如权利要求5所述的化合物，其中，L包含式(II)的PEG接头其中，q等于l-10的整数，其结合于氨基酸的氯基和氨基实体。
7.如权利要求5所述的化合物，其中，L包含下式的PEG接头
8. 如权利要求1-2所述的化合物，其中，P含有2-16个氨基酸，其中至 少2个氨基酸在生理pH下带正电荷。
9. 如权利要求1-2所述的化合物，其中，R选自(i)放射性金属离子；(ii) 顺磁性金属离子；或(iii)发射Y射线的放射性卣素；其中金属离子通过螯合实 体结合。
10. 如权利要求9所述的化合物，其中，R选自被式(III)的螯合剂螯合 的放射性金属离子其中E^E6各自独立地是R，基团；各R，是H或Cwo烷基、C3-10烷基芳基、 (:2.1()烷氧基烷基、Cwo羟基烷基、Cwo氟代烷基、<:2.1()羧基烷基或Cwo氨 基烷基，或两个或多个R，基团与它们所连接的原子形成饱和或不饱和的碳 环、杂环，其中一个或多个R，基团与分支单元缀合，Q是式-(J)f的桥连基团， 其中f是3、 4或5,各J独立地是-O-、 -NR'-或-C(R')2-，条件是-(J)f含有最 大的一个J基团，其为-O-或-NR'-。
11.如权利要求2所述的化合物，其中，p代表整数0;和式(II)式(m)n代表2或4的整数。
12.与放射性金属实体，优选"mTc螯合的、具有以下结构的式(I)化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
13.适于光学成像的、具有以下结构的式(I)化合物
14.具有以下结构的、式(Ia)的中间体<formula>formula see original document page 5</formula>式(Ia)<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula><formula>formula see original document page 7</formula><formula>formula see original document page 8</formula><formula>formula see original document page 9</formula>
15.如权利要求l-12所述的化合物，其对硫酸乙酰肝素蛋白聚糖有亲和性,
16. 含有如权利要求1-13所述的化合物和一种或多种药学上可接受的栽 体或赋形剂的药物组合物。
17. 产生人体或动物体的影像的方法，其中，将如任何权利要求1-13所 述的化合物给予人体或非人体，其中产生已经分布有所迷化合物的至少一部 分所述人体或非人体的影像。
18. 使之前已给予包含权利要求1-13中任一项所述化合物的药物组合物 的人体或非人体成像的方法，包括产生已经分布有所述造影剂组合物的至少 一部分所述人体或非人体的影像。
19. 制备权利要求l-12所述化合物的方法，其包括 a)使用被活性基团取代的核心羊元C作为笫一结构羊元，该活性基团允许连接L以及Sp或R;b) 使L或其前体与所述第一结构单元反应，形成由核心C和L组成的第 二结构单元；c) 使P或其前体与所述第二结构单元反应，形成由核心C、 L和P组成 的第三结构单元；d) 任选地使Sp或其前体与所述第三结构单元反应，形成由核心Sp、 C、 L和P组成的第四结构单元；e) 使R或其前体与所述第三或第四结构单元反应。
全文摘要
本发明提供新颖的化合物和含有此类化合物的药物组合物，其中所述化合物对蛋白聚糖具有亲和性。所述化合物包含基于氨基酸的核心单元，该核心单元与带正电荷的部分相连。该化合物还包含至少一种成像部分，该成像部分可在体内成像中检测到，从而使所述化合物可用作蛋白聚糖例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖成像的诊断造影剂。
文档编号A61K49/00GK101641119SQ200780047610
公开日2010年2月3日 申请日期2007年12月19日 优先权日2006年12月20日
发明者A·库思伯特森, H·卡尔森, H·托莱肖格 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司