主要含有GalGlcNAcMan的制作方法

专利名称：主要含有GalGlcNAcMan的制作方法
技术领域：
本发明涉及用来生产具有特定N-连接糖基化模式的糖蛋白的组合物和方法。特别地，本发明涉及包含多种具有特定N-聚糖结构的N-聚糖的、免疫球蛋白糖蛋白的组合物，更特别地，涉及含有免疫球蛋白糖蛋白的组合物，其中在调控譬如促进特定效应功能的免疫球蛋白上有一个或多个占有优势的糖形(glycoform)结构。
背景技术：
糖蛋白可在人体和其它哺乳动物中调控多种基本功能，包括催化作用、信号作用、细胞-细胞通讯、以及分子识别和联系。在真核生物中，糖蛋白构成了多数非胞液蛋白(Lis and Sharon，1993，Eur.J.Biochem.2181-27)。已开发了许多糖蛋白用于治疗目的，在过去的20年中，天然存在的糖蛋白的重组载体已经成为生物技术产业的主要部分。用于治疗的重组糖基化蛋白的例子包括红细胞生成素(EPO)、治疗用单克隆抗体(mAbs)、组织纤维酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、及人绒毛膜促性腺激素(hCH)(Cumming et al.，1991，Glycobiology 1115-130)。由于生产的重组蛋白可作为临床上预防性及治疗性手段，因此重组生产的糖蛋白中糖基化模式的变化近来在科学界中已经成为非常引人关注的主题。抗体或免疫球蛋白(Ig)是在体液免疫应答中发挥中心作用的糖蛋白。抗体可视为在体液和细胞防御机制间提供连接的“接头”分子。
抗体对抗原的特异性识别可引发形成免疫复合物，其能够活化多种效应机制，导致复合物的去除及破坏。在免疫球蛋白的通常分类中，可根据生化及功能区分为5种类型的抗体——IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，而更为细微的差异集中在特异结合抗原的可变区。在这5类Igs中，只有两种类型的轻链，命名为lambda(λ)和kappa(κ)。在具有λ和κ链的抗体间没有功能差异，但两种类型轻链的比例因物种而异。存在5种类型的重链或同种型，它们决定了抗体分子的功能活性。免疫球蛋白的5种功能类型是免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。每种同种型在免疫应答中具有特定功能，它们与众不同的功能特性是由重链的羧基末端部分赋予的，与轻链没有关系。IgG是血浆中最丰富的免疫球蛋白同种型(参见例如Immunobiology，Janeway etal，6thEdition，2004，Ga rland Publishing，New York)。
免疫球蛋白G(IgG)分子含有一个具有恒定区和可变区的Fab(抗原结合片段)结构域以及Fc(可结晶片段)结构域。每个重链的CH2结构域在连接N-聚糖与Ig分子的天冬酰胺残基处含有单个的N-连接糖基化位点，通常是残基Asn-297(Kabat et al.，Sequences of proteins ofimmunological interest，Fifth Ed.，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。
由于以下三个主要原因，对N-连接寡糖的结构与功能特性的分析具有重要的生物学意义(1)CH2结构域的糖基化在进化中得以保留，表明寡糖具有重要的作用；(2)免疫球蛋白分子可作为分析异源寡糖的模式系统(Rademacher and Dwek，1984；Rademacher et al.，1982)；(3)抗体包含以二聚体连接的两条重链，这使得两个寡糖单元彼此直接接触，因此免疫球蛋白参与特定的蛋白-糖类以及糖类-糖类相互作用。
已表明Igs的不同的糖基化模式与不同的生物学性状相关联(Jefferis and Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol.，65111-128；Wright and Morrison，1997，Trends Biotechnol.，1526-32)。不过，仅已知几个提供期望生物学功能的特定的糖形。例如，已报道一种在N-连接聚糖上具有减少的岩藻糖基化的免疫球蛋白组合物可增强与人FcγRIII的结合，并因此增强抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)(Shieldset al.，2002，J.Biol Chem，27726733-26740；Shinkawa et al.，2003，J.Biol.Chem.2783466-3473)。并且，据报道，与异源抗体组合物相比较，在CHO细胞中生成的岩藻糖基化G2(GaI2GIcNAc2-Man3GlcNAc2)IgG组合物可显著增加补体依赖的细胞毒作用(CDC)活性(Raju，2004，US Pat.Appl.No.2004/0136986)。也表明合适的肿瘤抗体可优先结合以活化Fc受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIII)，而且对FcγRIIb受体的抑制最小(Clynes et al.，2000，Nature，6443-446)。因此，亟待在Ig糖蛋白上富集特定糖形的能力。
通常，糖蛋白上的糖基化结构(寡糖)依据表达宿主与培养条件而变化。在非人类宿主细胞生产的治疗用蛋白可能含有在人体中引发免疫应答的非人类糖基化，譬如，酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185440-470)、植物中的α(l，3)-海藻糖和β(l，2)-木糖(Cabanes-Macheteau et al.，1999，Glycobiology，9365-372)、在中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi et al.，1995.J.Biochem.1175-62)和小鼠中的Galα-l，3Gal糖基化(Borrebaeck et al.，1993，Immun.Today，14477-479)。此外，半乳糖苷化可随细胞培养条件而变化，这可依据其特定的半乳糖模式给予某些免疫球蛋白组合物免疫性(Patel et al.，1992.BiochemJ.285839-845)。由非人类哺乳动物细胞所生产的糖蛋白的寡糖结构可能与人类糖蛋白中的结构有更近的关系。因此，绝大多数商品化的免疫球蛋白均在哺乳动物细胞中生产。不过，哺乳动物细胞作为蛋白生产宿主细胞有几个严重缺点。除了昂贵之外，在哺乳动物细胞中表达蛋白的过程中会产生异源糖形群体、具有较低的容量滴度(volumetric titers)、并需要持续负载病毒及相当长的时间来产生稳定的细胞系。
应理解不同的糖形可显著影响治疗的特性，包括药物动力学、药效学、受体相互作用和组织特异性定位(Graddis et al.，2002，CurrPharm Biotechnol.3285-297)。特别是，对抗体而言，寡糖的结构可影响与蛋白酶抗性、FcRn受体介导的抗体的血清半衰期、与诱导补体依赖的细胞毒作用(CDC)的补体复合物C1的结合，及与负责调控抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)途径的FcγR受体的结合、吞噬作用以及抗体的反馈作用相关的特性(Nose and Wigzell，1983；Leatherbarrow and Dwek，1983；Leatherbarrow et al.，1985；Walker etal.，1989；Carter et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289)。
由于不同的糖形与不同的生物特性相关，因此可通过富集一个或多个特定糖形的能力来评估特定糖形与特定的生物功能之间的关系。若所需的生物功能与某个特定的糖形模式相关，则可产生富集了有利的糖形结构的糖蛋白组合物。因此，非常需要可产生富集了特定糖形的糖蛋白组合物的能力。
发明概述本发明提供一种含多个免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。在优选的技术方案中，超过百分之50摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。更优选地，超过百分之75摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。最优选地，超过百分之90摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。在其它优选的技术方案中，所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖结构的水平至少比所述多种N-聚糖中占第二优势的N-聚糖结构高出约百分之5到约50摩尔百分数。
本发明还提供了通过在免疫球蛋白上富集特定糖形(譬如，GalGlcNAcMan5GlcNAc2)来增加FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的结合以及降低FcγRIIb受体的结合的方法。一个优选的技术方案提供了一种生产含多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成，所述方法包括培养改造或筛选宿主细胞使其表达所述免疫球蛋白或其片段。另一个优选的技术方案提供了生产含多个免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成，所述方法包括培养改造或筛选低等真核宿主细胞使其表达所述免疫球蛋白或其片段。在本发明的其它技术方案中，宿主细胞含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，改造或筛选所述真核宿主细胞使其表达所述免疫球蛋白或其片段，从而生产含有多种免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。在本发明另外的其它技术方案中，低等真核宿主细胞含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因，改造或筛选所述真核宿主细胞使其表达所述免疫球蛋白或其片段，从而生产含有多种免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
在本发明优选的技术方案中，含有多种免疫球蛋白组合物中每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成，其中所述免疫球蛋白具有降低的与FcγRIIb受体的结合亲和性。在本发明其它优选的技术方案中，含有多种免疫球蛋白组合物中每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成，其中所述免疫球蛋白具有增加的与FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的结合亲和性。在本发明另一个优选的技术方案中，含有多种免疫球蛋白组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成，其中所述免疫球蛋白具有增加的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。
在一个技术方案中，本发明的组合物含有基本上不含海藻糖的免疫球蛋白。在另一个技术方案中，本发明的组合物含有缺少海藻糖的免疫球蛋白。本发明的组合物还含有药物组合物及药学上可接受的载体。本发明的组合物还含有已纯化并包含在试剂盒中的免疫球蛋白的药物组合物。
因此，本发明提供了用来生产具有占有优势的糖基化结构的糖蛋白组合物的材料和方法，具体而言，提供具有主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成的N-聚糖免疫球蛋白或者抗体分子。
附图的简要描述

图1.具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构的IgG的示意图。
图2.在YAS385-1中表达(如实施例2所述)并通过蛋白A柱(泳道1)和苯基琼脂糖凝胶柱(泳道2)从培养基中纯化(如实施例3所述)的JC-IgG的考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶。(2.5μg蛋白/泳道)图3.在YAS385-1中表达(如实施例2所述)并通过蛋白A柱(泳道1)和苯基琼脂糖凝胶柱(泳道2)从培养基中纯化(如实施例3所述)的DX-IgG的考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶。(2.5μg蛋白/泳道)图4A.在YAS385-1中表达的、用半乳糖基转移酶处理的主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG的MALDI-TOF图谱。B.在YAS385-1中表达的、用半乳糖基转移酶处理的主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG的MALDI-TOF图谱。
图5A.FcγRIIIb与JC-IgG及Rtuximab的ELISA结合试验。B.FcyRIIIB与DX-IgG及Rtuximab的ELISA结合试验。(GGM5＝GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)图6.FcγRIIIa-158F与JC-IgG及Rtuximab的ELISA结合试验。(GGM5＝GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)图7A.FcγRIIb与JC-IgG及Rtuximab的ELISA结合试验。图7B.FcgRIIb与DX-IgG及Rtuximab的ELISA结合试验。(GGM5＝GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖)序列的简要描述SEQ ID NO1编码DX-IgGl轻链中鼠可变与人恒定区的核苷酸序列。
SEQ ID NO2编码DX-IgGl重链中鼠可变与人恒定区的核苷酸序列。
SEQ ID NO3编码IgGl轻链中人恒定区的核苷酸序列。
SEQ ID NO4编码IgGl重链中人恒定区的核苷酸序列。
SEQ ID NO5至19编码15个用于通过聚合酶链反应(PCR)来合成鼠DX-IgGl轻链可变区的重叠的寡核苷酸。
SEQ ID NO20至23编码4个用于连接鼠DX-IgGl轻链可变区与人轻链恒定区的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO24至40编码17个用于通过PCR来合成鼠DX-IgGl重链可变区的重叠的寡核苷酸。
SEQ ED NO41到44编码4个用于连接鼠DX-IgGl重链可变区与人重链恒定区的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO45编码核苷酸序列——它可编码带有N-末端EcoRI位点的Kar2(Bip)信号序列。
SEQ ID NO46到49编码4个用于连接Kar2信号序列与DX-IgGl轻链和重链的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO50编码与鼠JC-IgGl轻链(GenBank#AF013576)中IgGl可变区相对应的核苷酸序列。
SEQ ID NO51编码与鼠JC-IgGl重链(GenBank#AF013577)中IgGl可变区相对应的核苷酸序列。
SEQ ID NO52至63编码12个用于PCR合成鼠JC-IgGl轻链可变区的重叠的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO64至75编码12个用于PCR合成鼠JC-IgGl重链Fab片段的重叠的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO76至87编码12个用于通过PCR来合成鼠JC-IgGl重链Fc片段的重叠的寡核苷酸序列。
SEQ ID NO88编码与Fc片段3’末端相对应的3′Kpnl引物。
SEQ ID NO89编码人血清白蛋白(HSA)的核苷酸序列。
SEQ ID NO90编码用于本发明中凝血酶水解的核苷酸序列。
发明的详细描述除非在本文中另有定义，否则与本发明相关的科学及技术术语和短语均为本领域普通技术人员所一般了解的含义。此外，除非是上下文另有需要，否则单数术语将包括复数、复数术语也包括单数。通常，本文所述的用于与生物化学、酶学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质与核酸化学及杂交等技术相关的命名，均为本领域所熟知并常用的。本发明中的方法和技术，除非另有说明，通常根据本领域所熟知的常规方法来进行，在所引用的多个综合的及更为具体的文献中有所描述，并在本技术说明中进行了讨论。参见，例如，Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Harlow andLane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1 990)；Taylor andDrickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of BiochemistrySectionA Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of BiochemistrySection A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1999)；Immunobiology，Janeway et al，6thEdition，2004，GarlandPublishing，New York)。
本文所提及的所有出版物、专利和其它文献，均作为参考完整地整合在本文中。
下面的术语。除非另有说明，应理解为具有以下含义在本文用法中，术语“N-聚糖”、“聚糖”和“糖形”可替换使用，指的是N-连接的寡糖，譬如，通过N-乙酰氨基葡萄糖残基与或者曾经与蛋白质中天冬酰胺残基的氨基氮相连接的寡糖。在糖蛋白中所发现的占有优势的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以及唾液酸(譬如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。糖基的加工在ER内腔中与翻译同时进行，并在高尔基体中加工成N-连接的糖蛋白。
N-聚糖有一个共有的5糖核心——Man3GlcNAc2(“Man”指的是甘露糖；“Glc”指的是葡萄糖；“NAc”指的是N-乙酰基；GlcNAc指的是N-乙酰氨基葡萄糖)。N-聚糖的不同之处在于所含有的外周糖类(譬如，GlcNAc、半乳糖、海藻糖和唾液酸)分枝(突出)的数目，这些分枝添加到Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构上——该结构也称为“3甘露糖核心”、“5糖核心”、或“寡甘露糖核心”。N-聚糖根据其分枝组成进行分类(譬如，高甘露糖、复合或杂合)。“高甘露糖”类型的N-聚糖含有5个或者更多的甘露糖残基。典型的“复合”型的N-聚糖具有至少一个附在“3甘露糖核心”中1，3甘露糖臂上的GlcNAc，以及至少一个附在“3甘露糖核心”中1，6甘露糖臂上的GlcNAc。复合的N-聚糖也可以含有被唾液酸或衍生物(譬如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”指的是神经氨酸，“Ac”指的是乙酰基)所修饰的半乳糖(“Gal”)或者N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)残基。复合的N-聚糖也可以具有由“分开的”GlcNAc与核心海藻糖(“Fuc”)所组成的链内替代。复合的N-聚糖还可以在“3甘露糖核心”上具有多个突出，通常称之为“多突出聚糖”。“杂合”的N-聚糖在3甘露糖核心的1，3甘露糖臂末端具有至少一个GlcNAc，在3甘露糖核心的1，6甘露糖臂上有0个或者更多个甘露糖。多种N-聚糖也被称为“糖形”。
本文所用的缩写均为本领域的通常用法，参见，例如上述的糖的缩写。其它常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“葡萄糖苷酶”，它们均指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。
“分离的”或者“基本上纯的”核酸或多核苷酸(譬如RNA、DNA或混合多聚物)是指从自然情况下在其自然宿主细胞中就含有天然的多核苷酸的其它细胞组分——譬如，天然相关的核糖体、聚合酶及基因组序列——中充分分离出的核酸或多核苷酸。该术语指核酸或者多核苷酸(1)已经从其天然所处环境中分离出来，(2)与发现“分离的多核苷酸”的环境中的所有或者部分多核苷酸不再有联系，(3)能够有效连接到在自然情况下不与其连接的多核苷酸上，(4)在自然界中不存在。术语分离的”或者“基本上纯净的”也用来指重组的或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或者通过异源系统合成的多核苷酸类似物。
不过，“分离的”并不必需要求所描述的核酸或者多核苷酸本身一定要与其天然环境发生物理上的分离。例如，如果外源序列被置于内源核酸序列附件而使内源核酸序列的表达发生改变，则机体基因组中的内源核酸序列在本文中也可被视为“分离的”。在该语境中，异源序列是与内源核酸序列自然状态下不相邻的序列，而不管异源序列自身是内源的(来自相同的宿主细胞或其后裔)还是外源的(来自不同的宿主细胞或其后代)。作为例子，宿主细胞基因组中基因天然的启动子的启动子序列可以被替换(譬如，通过同源重组)，这样该基因的表达模式会发生改变。该基因现在就是“分离的”，因为它与至少一部分与其天然相接的序列分离了。
核酸，如果它含有任何基因组中相应核酸天然状态不存在的修饰，也可认为是“分离的”。例如，内源编码序列如果含有人工——譬如通过人类干预——引入的插入、缺失或点突变，就可认为是“分离的”。“分离的核酸”也包括在异源位点整合到宿主细胞染色体上的核酸，以及以游离基因形式参与的核酸构建体。此外，当“分离的核酸”是使用重组技术来进行生产时，基本上不含其它细胞物质，或者基本上不含培养基，当通过化学合成来生产时，基本上不含化学前体或者其它化学试剂。
在本文用法中，短语参考核酸序列的“简并变异体”是指根据标准遗传密码子含有可被翻译的核酸序列，可提供与参考核酸序列翻译后-样的氨基酸序列。术语“简并寡核苷酸”或者“简并引物”用来表示能够与目标核酸序列杂交的寡核苷酸，它们在序列上不必完全一致，只要彼此直接在一个或多个特定片段有同源性即可。
在文中，术语核酸序列的“百分比序列同一性”或“同一性”是指两个序列进行最大对应的比对时其中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是至少约9个核苷酸的一段，通常至少约20个核苷酸，更常见的是至少约24个核苷酸，典型地为至少约28个核苷酸，更典型地为至少约32个核苷酸，优选地为至少约36个或更多核苷酸。在本领域有许多已知的不同算法可用来测定核苷酸序列的同一性。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit——它们是Wisconsin Package Version10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序——来比较多核苷酸序列。FASTA可提供查询序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)(作为参考完整地整合在本文中)。例如，核酸序列之间的百分比序列同一性可通过FASTA用其缺省参数(字长为6，记分矩阵使用NOPAM因子)、或通过Gap用其由GCG Version 6.1所提供的缺省参数来确定，作为参考整合在本文中。此外，可使用计算机程序BLAST(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Gishand States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang and Madden，Genome Res.7649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))来比较序列。
术语“基本上同源性”或者“基本上相似”，当用来指核酸或其片段时，表明当与另一个核酸(或其互补链)进行可有适当核苷酸插入或删除的最优比对时，核苷酸序列的同一性至少为约50％、更优选地为60％的核苷酸碱基，通常为至少约70％、更常见的为至少约80％，优选的为至少约90％，更优选地为至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基，——这些是通过任何已知的序列同一性算法，譬如上述讨论的FASTA，BLAST或Gap来测定的。
此外，若核酸或其片段在严紧杂交条件下可与另一条核酸、另一条核酸的一条链、或其互补链杂交，则基本上同源或者相似。在本文中核酸杂交实验的“严紧杂交条件”及“严紧洗脱条件”依赖于多个不同的物理参数。核酸杂交受诸如盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区的长度、杂交核酸之间错配的核苷酸碱基数这样的条件的影响，本领域的技术人员可容易意识到这些。本领域的普通技术人员了解如何调整这些参数以获得杂交特定的严紧度。
通常，在一系列特定的条件下，在比特定DNA杂合子的解链温度(Tm)低约25℃时进行“严紧杂交”。在一系列特定的条件下，在比特定DNA杂合子的Tm低约5℃的温度下进行“严紧洗脱”。Tm是50％的目标序列与完全匹配探针杂交时的温度。参见Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1 989)，页码为9.51，作为参考整合在本文中。在本文用法中，所定义的“严紧条件”是针对溶液相杂交的，如在6×SSC(其中20×SSC含有3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠)、1％SDS的水中杂交(即，不含甲酰胺)，于65℃杂交8-12小时，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中，于65℃洗脱20分钟，共洗两次。本领域的技术人员知道，在65℃的杂交速率并不同，依赖于包括杂交序列长度及百分同一性在内的多种因素。
术语“突变”当用于核酸序列时，指核酸序列中的核苷酸与参考核酸序列相比，可以被插入、缺失或改变。在一个基因座上可以产生单个改变(点突变)，或在单个基因座上插入、缺失或改变多个核苷酸。此外，在核酸序列中的任意数目个基因座上可产生一个或多个改变。可通过本领域中任何已知方法来突变核酸序列，包括但并不限于诸如“易错PCR”(在DNA聚合酶的拷贝保真性较低的条件下进行PCR反应的过程，这样在整个PCR产物的全长范围内可获得高比例的点突变；参见，例如Leung et al.，Technique，111-15(1989)以及Caldwelland Joyce，PCR Methods Applic.228-33(1992))以及“寡核苷酸定点的突变”(可在任意所需的克隆DNA片段中生成位点特异性突变的过程；参见，例如Reidhaar-Olson and Sauer，Science 24153-57(1988))这样的突变产生技术。
本文所用术语“载体”用来指能够运输另一个与之相连的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环状双链DNA环，其中可连接额外的DNA片段。其它载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可连接到病毒基因组中(下文将更详细讨论)。某些载体在其所转入的宿主细胞中能够自主复制(譬如，具有在宿主细胞中可发挥功能的复制起点的载体)。其它载体在转入宿主细胞后可整合到宿主细胞基因组中，因此与宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与其有效连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简单些，“表达载体”)。
在本文用法中，术语“目标序列“或者”目标基因“是指通常不在宿主细胞中产生的——典型地，编码蛋白的——核酸序列。本文所描述的方法允许一个或者多个目标序列或者目标基因稳定整合到宿主细胞基因组中。目标序列的非限制性例子包括编码一种或多种具有酶活性的多肽——譬如，诸如甘露糖基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转运子、半乳糖基转移酶、UDP-N-乙酰基半乳糖转移酶、唾液酸转移酶和海藻糖转移酶这样的在宿主中影响N-聚糖合成的酶——的序列。
术语“标记序列”或者“标记基因”是指在宿主细胞中能够表现出活性从而可对存在或者缺失序列进行阳性或阴性选择的核酸序列。例如，P.pastoris URA5基因是一个标记基因，因为可根据含有该基因的细胞能够在缺少尿嘧啶的环境中生长的能力来选择它的存在。也可根据含有该基因的细胞不能够在存在5-FOA的环境中生长的特点来反向选择它的存在。标记序列或基因不是必须同时具有阳性及阴性选择性。来自P.pastoris的标记序列或基因的非限制性例子包括ADEl、ARG4、HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记基因，卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素及潮霉素抗性基因通常用于允许在存在这些抗生素的情况下进行生长。
“有效连接的”表达调控序列是指一种连接，其中表达调控序列与目标基因相邻以控制目标基因，以及跨越或者在一定距离上控制目标基因的表达调控序列。
在本文用法中术语“表达调控序列”是指与编码序列有效连接、影响其表达所必需的多核苷酸序列。表达调控序列是控制核酸序列转录、转录后事件及翻译的序列。表达调控序列包括合适的转录起始、终止、启动子及增强子序列；诸如剪接及多聚腺苷酸化信号这样的RNA加工信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(譬如，核糖体结合位点)；增强蛋白稳定性的序列；及若有需要，增强蛋白分泌的信号。这些调控序列的性质依据宿主机体而有所不同；在原核生物中，这类调控序列一般包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列。
术语“调控序列”是指在最小程度上包括表达所必需的全部组分，也可包括其存在是有利的额外的组分，例如，引导序列和融合部分序列。
本文所用术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”，“表达宿主系统”，“表达系统”，或简称“宿主细胞”)，是指其中引入了重组载体的细胞。应理解这些术语不仅是指特定的受体细胞，而且包括这种细胞的后代。由于突变或者环境影响在以后的世代中会发生某些修饰，因此，实际上，这些后代可以与亲代细胞不一致，但仍包括在本文所有术语“宿主细胞”的范畴内。重组宿主细胞可以是生长在培养基中的分离的细胞或者细胞系，也可以是位于活体组织或者机体内的细胞。
术语“真核的”是指有细胞核的细胞或者机体，包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞及低等真核细胞。术语“低等真核细胞”包括酵母、真菌、囊鞭毛虫、微孢子虫、alveolates(譬如，沟鞭藻类)、发鞭藻门(譬如，褐藻、原生动物)、红藻门(譬如，红藻)、植物(譬如，绿藻、植物细胞、苔藓)及其它原生生物、酵母和真菌包括，但不限定于毕赤氏酵母(Pichia sp.)，譬如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、Pichia fnlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜蹼毕赤氏酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤氏酵母(Pichiasalictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母(Pichia pijperi)、具柄(Pichia stiptis)和Pichia methanolica；酿酒酵母(Saccharomycessp.)，譬如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha )、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces sp.)，譬如乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)；白色假丝酵母(Candidaalbicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、木霉Trichoderma reesei、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)，镰孢菌(Fusarium sp.)，譬如禾谷镰孢菌(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum；Physcomitrellapatens和粗糙链饱霉(Neurospora crassa)。
本文所用术语“肽”是指短多肽，譬如，典型地小于50个氨基酸长及更典型地小于30个氨基酸长的多肽。本文所用术语包含具有相似结构及生物功能的相似物与类似物。
术语“多肽”包含天然存在的和非天然存在的蛋白及其片段、变异体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或者聚合的。此外，多肽可包括某些不同的结构域，每个具有一种或多种独特的活性。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是指蛋白或者多肽，依据起源或来源，(1)不与其天然状态下所伴随的相关组分存在天然状态的关联，(2)以自然界所没有的纯度形式存在，其中纯度可根据其它细胞物质的存在来认定(譬如，不存在同种类的其它蛋白)，(3)由不同种类的细胞表达，或者(4)在自然界不存在(譬如，在自然界所发现的是多肽的一个片段，或者它包含自然界所没有的氨基酸同源物或衍生物，或者是其它标准肽骨架上所没有的连接物)。因此，化学合成的或者在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽，就是从其天然相关组分中“分离的”。也可以使用本领域所周知的蛋白纯化技术通过分离来使多肽或蛋白基本上不含天然状态下的相关组分。因此按照定义，“分离的”并不要求所述蛋白、多肽、肽或者寡肽要与其天然环境物理分离。
本文所用术语“多肽片段”是指有所删除的多肽，譬如，同全长多肽相比，删除了氨基末端和/或羧基末端。在一个优选的技术方案中，多肽片段是一个连续的序列，其中片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置相一致。典型地，片段至少有5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选地，至少为12、14、16或18个氨基酸长，更优选地，至少为20个氨基酸长，更加优选地为至少25、30、35、40或45个氨基酸，更加优选地为至少50或60个氨基酸长，更加优选地是至少70个氨基酸长。
“经修饰的衍生物”是指在一级结构上实际同源的多肽或其片段，包括，譬如，体内或体外化学及生物修饰或者整合了天然多肽中没有的氨基酸。这类修饰包括，譬如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记——譬如放射性核，以及多种酶修饰，本领域的技术人员很容易就会理解这些。标记多肽及替代的多种方法或者用于该目的的标记物在本领域是周知的，包括诸如125I、32p、35S和3H这样的放射性同位素、可与标记的抗配体(譬如抗体)结合的配体、荧光团、化学反光试剂、酶、以及可作为标记配体的特异结合匹配成员的抗配体。标记物的选择依赖于所需的敏感性、与引物结合的容易程度、所要求的稳定性、以及可用的仪器。标记多肽的方法在本领域是周知的。参见，例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，及2002的补充)(作为参考整合在本文中)术语“融合蛋白”是指含有与异源氨基酸序列相连接的多肽或者片段的多肽。融合蛋白很有用处，因为它们被构建成含有来自2个或者多个不同蛋白的2个或者多个所需功能元件。融合蛋白包含至少10个来自所需多肽的连续的氨基酸，更优选地为至少20或30个氨基酸，更优选地为至少40、50或60个氨基酸，更优选地为至少75、100或125个氨基酸。含有本发明中整个蛋白的融合是特别有用的。本发明融合蛋白中包含的异源多肽长度至少为6个氨基酸，通常长度为至少8个氨基酸，有用的长度至少为15、20及25个氨基酸。融合包括诸如免疫球蛋白Fc片段或者免疫球蛋白Fab片段这样较大的多肽，或者甚至诸如绿色荧光蛋白(“GFP”)含有发色团的蛋白或具有特定用途的全长免疫球蛋白这样的整个蛋白。可通过构建核酸序列——它所编码多肽或其片段与编码不同蛋白或肽的核酸序列在同一个阅读框内、然后表达该融合蛋白的方式来重组生产融合蛋白。或者，可通过将多肽或其片段与另一个蛋白相交联的方式来化学生产融合蛋白。
在本文用法中，术语“抗体”、“免疫球蛋白”、“IgG”及“Ig分子”可替换使用。每种抗体具有可使其与特异抗原相结合的独特结构，但所有的抗体/免疫球蛋白均具有如本文所述的相同的一般结构。已知基本的抗体结构单元由亚基的四聚体组成。每个四聚体具有两对一样的多肽链，每对含有一条“轻”链(约25kDa)及一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包含一个约100到110个或者更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分是主要负责效应功能的恒定区。轻链可分为κ或者λ两类。重链可分为γ、μ、α、δ或者ε，并分别确定抗体的类型为IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。轻链和重链可进一步分为可变区与恒定区(参见，FundamentalImmunology(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.，1989)，第七章(作为参考将其所有用途完整地整合在本文中)。每条轻/重链对的可变区形成了抗体结合位点。因此，一个完整抗体具有两个结合位点。除了双功能或者双特异性抗体外，这两个结合位点是相同的。所有的链均具有相同的由3个高变区所连接的相对保守的框架区(FR)的常规结构，也称为补体决定区或者CDRs。来自每对两条链的CDRs通过框架区对齐，可以与特异的抗原决定簇结合。术语包括天然存在的形式，以及片段和衍生物。包括在术语的范畴内的有Igs类，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。包括在术语范畴内的还有IgGs亚类，即，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。术语均以最广义来使用，包括单一的单克隆抗体(包括激动型抗体及拮抗型抗体)以及与多个抗原决定簇或者抗原结合的抗体组分。术语明确覆盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(譬如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们至少含有或者经修饰后含有重链免疫球蛋白恒定区——它含有CH2结构域的N-连接糖基化位点——CH2结构域部分，或者其变异体。包括在术语之内的是含有Fc区的分子，譬如免疫粘着素(美国专利申请No.2004/0136986)、Fc融合分子及抗体类似分子。或者，这些术语可以指至少Fab区的抗体片段，其至少含有N-连接糖基化位点。
术语“Fc”片段是指含有CH2及CH3结构域的抗体C-末端区域的“结晶片段”(图1)。术语“Fab”片段是指“”含有VH、CH1、VL和CL结构域的抗体的“抗原结合片段”区域(图1)。
在本文用法中，术语“单克隆抗体”(mAb)是指从一群基本上同源的抗体中获得的抗体，即，由群体构成的单一抗体，除了可能的以较低数量存在的天然自发突变外，它们都是一致的。单克隆抗体是高度特异的，针对单一的抗原位点。此外，同常规的(多克隆)抗体制备——典型地，包括针对不同决定子(抗原决定簇)的不同抗体——相比，每种mAb针对抗原上单一的决定子。除了其特异性外，单克隆抗体的优势在于它们可通过杂交瘤培养来合成，不受其它免疫球蛋白的污染。术语“单克隆的”表示抗体的特征，是从基本上同源的抗体群体中获得的，不应理解为在抗体生产中需要任何特殊的方法。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可以通过Kohler et al.，(1975)Nature，256495，or may be made by recombinant DNA methods(see，e.g.，U.S.Pat.No.4,816,567 to Cabilly et al.)首次阐释的杂交瘤方法来制备。
本文中的单克隆抗体包括通过杂合的及重组的抗体，通过将某个抗体的可变(包括高可变)结构域与恒定结构域(譬如，“人源化”抗体)、或者将轻链与重链、或者将来自某个物种的一条链与来自另一个物种的一条链、或者将融合子与异源蛋白进行剪接的方式来生产，而不必考虑物种来源或者所选免疫球蛋白的类群或亚类(参见，譬如，Cabilly et al的美国专利No.4,816,567；Mage and Lamoyi，inMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与抗体所来源的第一个物种中的相应序列一致或同源，或者属于特定的抗体类群或亚类，而链的剩余部分与抗体所来源的其它物种中的相应序列一致或同源，或者属于不同的抗体类群或亚类，这些抗体的片段也如此，只要它们含有或者修饰后含有至少一个CH2即可。非人源(譬如，鼠)抗体的“人源化”形式是特异嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(譬如Fv、Fab、Fab’、 F(ab′)2或者抗体其它的结合抗原的亚序列)，它们含有源自人免疫球蛋白的序列。抗体的Fv片段是抗体维持整个分子结合特征及特异性的最小单位。Fv片段与抗体重链及轻链可变区的异源二聚物是非共价连接的。F(ab′)2片段是含有通过二硫键桥相连接的Fab片段的两个臂的片段。
人源化抗体最常见的类型是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体补体决定区(CDR)的残基被来自诸如小鼠、大鼠、或者兔子这样的非人物种(供体抗体)中具有所需的特异性、亲和性及负载的CDR的残基替换了。在某些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人源残基替代。此外，人源化抗体可以含有在受体抗体及引入的CDR或框架序列中所没有的残基。产生这些修饰是为了进一步改进及最优化抗体性能。通常，人源化抗体基本上含有至少一个、典型地为2个全部的可变结构域，其中全部或者基本上全部CDR区与非人源免疫球蛋白的区域相对应，全部或者基本上全部CDR区是人免疫球蛋白的一致序列。优化的人源化抗体也至少包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，典型地是人免疫球蛋白的一部分。进一步的细节参见Jones et al.，1986，Nature 321522-524；Reichmann et al.，1988，Nature332323-327，and Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596.。
在术语抗体或者免疫球蛋白范畴内的“片段”包括通过用多种蛋白酶消化产生的片段、通过化学剪切和/或化学解离产生的片段、以及重组产生的片段——只要片段仍能够与靶分子特异结合即可。在这类片段中有Fc、Fab、Fab′、Fv、F(ab′)2，以及单链Fv(scFv)片段。
本发明中抗体所针对的靶包括生长因子受体(譬如，FGFR、PDGFR、EGFR、NGFR及VEGF)及其配体。其它靶有G蛋白受体，包括底物K受体、血管紧张肽受体、α-及β-肾上腺素受体、血清素受体及PAF受体。参见，例如Gilman，Ann.Rev.Biochem.56625-649(1987)。其它靶包括离子通道(譬如，钙、钠、钾通道)、毒蕈碱受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸受体及多巴胺受体(参见Harpold，U.S.5,401,629及U.S.5,436,128)。其它靶有诸如整合素、选择素及免疫球蛋白超家族成员这样的吸附蛋白(参见Springer，Nature 346425-433(1990).Osborn，Cell 623(1990)；Hynes，Cell 6911(1992))。其它靶有诸如白介素IL-1至IL-13、肿瘤坏死因子α&β、干扰素α、β及γ、肿瘤生长因子Beta(TGF-β)、集落刺激因子(CSF)及粒细胞单核细胞集落刺激因子(GMCSF)这样的细胞因子。参见Human CytokinesHandbook for Basic & Clinical Research(Aggrawal et al.eds.，BlackwellScientific，Boston，MA 1991)。其它靶有激素、酶、以及诸如腺嘌呤环化酶、鸟苷酸环化酶及磷脂酶C这样的细胞内与细胞间信号分子。其它目标靶有诸如CD20和CD33这样的白细胞抗原。药物也可以是所需的靶。靶分子可以是人类、哺乳动物或者细菌的。其它靶有诸如来自微生物病原——病毒、细菌及肿瘤——的蛋白、糖蛋白及糖类这样的抗原。在U.S.4,366,241中描述了其它的靶。
本文讨论的免疫Fc受体，可包括FcγRI、FcyRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb及FcRn(新生儿受体)。除非另外有说明，否则术语FcγRI可指任意FcγRI亚型。除非另外有说明，否则术语FcγRII可指任意FcγRII亚型。除非另外有说明，否则术语FcγRIII可指任意FcγRIII亚型。
在术语范畴内的“衍生物”包括在序列中被修饰了的、但仍能够与靶分子特异结合的抗体(或其片段)，包括种间嵌合及人源化抗体、抗体融合物、异聚性抗体复合物及抗体融合物，譬如双价抗体(双特异性抗体)、单链双价抗体及内抗体(参见，譬如IntracellularAntibodiesResearch and Disease Applications，(Marasco，ed.，Springer-Verlag New York，Inc.，1998)。
术语“非肽类似物”是指与参考多肽具有相似性质的化合物。非肽混合物也可称为“模拟肽”或者“拟肽”。参见，例如Jones，AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxford University Press(1992)；Jung，Combinatorial Peptide and Nonpeptide LibrariesA Handbook，JohnWiley(1997)；Bodanszky et al.，Peptide Chemistry--A Practical Textbook，Springer Verlag(1993)；Synthetic PeptidesA Users Guide，(Grant，ed.，W.H.Freeman and Co.，1992)；Evans et al.，J.Med.Chem.301229(1987)；Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber and Freidinger，Trends Neurosci.，8392-396(1985)；上述所引用的每个参考文献均作为参考整合在本文中。这类化合物通常借助于计算机处理的分子模型来开发。与本发明中有用的肽在结构上相似的模拟肽可用来生产等价效应物，因此可视为本发明的一部分。
氨基酸替代可包括这些“(1)降低对蛋白酶水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变对所形成的蛋白复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性或者酶活性，以及(5)给予或修饰这类类似物的其它物理化学或者功能特性。
在本文用法中，20种常规氨基酸及其缩写使用常规用法。参见Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.，2nded.1991)，作为参考整合在本文中。20种常规氨基酸的立体异构体(譬如，D-氨基酸)、诸如α-，α-双替代氨基酸这样的非天然氨基酸、N-羟基氨基酸、以及其它非常规氨基酸可以是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、N-甲基精氨酸、以及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(譬如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，在侧末端对应于氨基末端，右侧末端对应于羧基末端，与标准用法和常规一致。
如果一个蛋白的核酸序列与编码第二个蛋白的核酸序列有相似序列，则具有“同源性”或者是“同源的”。或者，如果两个蛋白具有“相似的”氨基酸序列，则该蛋白与第二个蛋白具有同源性。(因此，所定义的术语“同源蛋白”是指两个蛋白具有相似的氨基酸序列。)在一个优选的技术方案中，同源蛋白是与野生型蛋白具有至少65％序列同源性的蛋白，更优选地为至少70％序列同源性。更加优选的是同源蛋白与野生型蛋白具有至少75％、80％、85％或90％序列同源性。在另一个更加优选的技术方案中，同源蛋白具有至少95％、98％、99％或99.9％的序列同一性。在本文用法中，氨基酸序列两个区域之间的同源性(尤其是对于预测的结构相似性)可视为在功能上具有相似性。
当“同源性”用来指蛋白或者多肽时，可以认为不同的残基位置通常有不同的保守氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是指序列中的氨基酸残基被另一个其侧链(R基团)具有相似化学性质(譬如，电荷或疏水性)的氨基酸残基所取代。通常，保守氨基酸替代不会使蛋白的功能特性发生实质改变。在由于保守替代使得两个或者多个氨基酸序列彼此不同的情况下，可向上调节百分比序列同一性或者同源程度，以对替代的保守性质进行校正。进行这种调节的方法对于本领域的技术人员而言是已知的。参见，譬如，Pearson，1994，Methods MoI.Biol.24307-31 and 25365-89(此处作为参考整合在本文中)。
下面6个组每组所含的是彼此之间为保守替代的氨基酸1)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
多肽的序列同源性，也称为百分比序列同-性，典型地，可使用序列分析软件来测定。参见，譬如the Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group(GCG)，University ofWisconsin Biotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705。蛋白分析软件使用同源性测定方法——对各种替代、删除及其它修饰，包括保守的氨基酸替代进行赋值——来匹配相似序列。譬如，GCG含有诸如“Gap”及“Bestfit”这样的程序，可使用缺省参数来确定较近关系的多肽——譬如来自生物中不同种类的同源多肽或野生型蛋白与其突变蛋白——之间的序列同源性或者序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1。
当将特定的多肽序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，一个优选的算法就是计算机程序BLAST(Altschul et al.，J.Mol. Biol.215403-410(1990)；Gish and States，Nature Genet.3266-272(1993)；Madden et al.，Meth.Enzymol.266131-141(1996)；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)；Zhang and Madden，GenomeRes.7649-656(1997))；尤其是blastp或tblastn(Altschul et al.，NucleicAcids Res.253389-3402(1997))。
BLASTp的优选的参数为期望值10(缺省)；过滤seg(缺省)；空位开放代价11(缺省)；空位拓展代价1(缺省)；最大比对100(缺省)；字长11(缺省)；记述数目100(缺省)；罚分矩阵BLOWSUM62。
进行同源性比较的多肽序列的长度一般至少为约16个氨基酸残基，通常为至少约20个残基，更常见的为至少约24个残基，典型地为至少约28个残基，优选地为多于约35个残基。当搜索含有大量来自不同生物的序列的数据库时，优选地，应比较氨基酸序列。用氨基酸序列进行数据库搜索可通过本领域已知的不同于blastp的算法来进行。例如，可使用FATA——GCG Version 6.1中的程序——来比较多肽序列。FASTA提供了查询与搜索序列之间最佳重叠区域的序列比对及百分比序列同一性。Pearson，Methods Enzymol.18363-98(1990)(作为参考整合在本文中)。例如，氨基酸序列之间的百分比序列同一性可以通过FASTA用其缺省参数(字长为2，使用PAM250记分矩阵)——如GCG Version 6.1中提供的那样——来确定，作为参考整合在本文中。
“特异结合”是指在环境中两个分子相对于与其它分子结合的彼此相互结合的能力。典型地，“特异结合”通过至少2倍、更典型地为至少10倍、通常为至少100倍来区分反应中的偶然结合。典型地，特异结合反应的亲和性或者亲和力——通过解离常数来定量——约为10-7M或更强(譬如，约10-8M、10-9M或者更强)。
本文所用术语“区域”是指生物分子一级结构中物理上毗邻的部分。在蛋白中，区域通过该蛋白氨基酸序列中毗邻的部分来确定。
本文所用术语术语“结构域”是指生物分子中具有已知或未知功能的生物分子的结构。结构域可以与区域或其部分具有相同的范畴；结构域也可包括生物分子中独立的、非临近的区域。
本文所用术语“分子”是指任意化合物，包括但不限定于，小分子、肽、蛋白、糖蛋白、糖、核苷酸、核酸、脂等，这类化合物可以是天然的或者合成的。
本文所用术语“包括”或者诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”这样的词形变化，应理解为包含一定的整体或者整体组，但不排除任何其它整体或者整体组。
本文所用术语“基本上由......组成”应理解为包含一定的整体或者整体组，但排除了实际上会影响或者改变给定整体的修饰或者其它整体。关于N-聚糖的种类，术语给定的N-聚糖“实际上由给定的N-聚糖组成”应理解为包括N-聚糖，而不管N-聚糖是否在N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)——它直接与糖蛋白的天冬氨酸残基相连——上发生了海藻糖基化。
本文所用术语“占有优势地”或者诸如“主要的”或“是最显著的”这样的变型，应理解为是指在糖蛋白用PNGase处理并释放出通过质谱——例如，MALDI-TOF MS——进行分析的聚糖后，在全部N-聚糖中具有最高摩尔百分比(％)的聚糖种类。换言之，短语“占有优势地”定义为一个单独的实体——譬如一个特定的糖形，它比其它任何单独的实体具有更高的摩尔百分比。例如，如果某个组分含有40摩尔百分比的种类A，35摩尔百分比的种类B及25摩尔百分比的种类C，则该组分主要含有种类A，种类B是第二有优势的种类。
本文所用术语“基本上不含”特定的糖基——譬如海藻糖或半乳糖等，是用来表明糖蛋白组分基本上不含有这些残基的N-聚糖。根据纯度来表述，基本上不含是指含有这些糖基的N-聚糖结构不到10％，优选地低于5％，更优选地低于1％，最优选地低于0.5％，其中百分比是重量或摩尔百分比。因此，基本上本发明的糖蛋白组合物中所用的N-聚糖结构都不含海藻糖、半乳糖、或这二者。
本文用法中，当无论何时在N-聚糖结构上也没有可检测量的某种糖基时，糖蛋白组合物“缺少”或者“没有”该特定的糖基，譬如海藻糖或半乳糖。例如，在本发明优选的技术方案中，糖蛋白组合物通过如上所述的低等真核生物——包括酵母[譬如，Pichia sp.；Saccharomyces sp.；Kluyveromyces sp.；Aspergillus sp.]——来生产，将会“缺少海藻糖”，因为这些生物的细胞没有产生海藻糖基化的N-聚糖结构所必需的酶。因此，术语“基本上不含海藻糖”包括术语“缺少海藻糖”。但是，即使组合物在某个时间含有如上所述的海藻糖基化的N-聚糖结构或者含有有限的、没有可检测量的海藻糖基化的N-聚糖结构，也可以是“基本上不含海藻糖”。
本文所用短语“增强的结合活性”可以与“增强的结合亲和性”替换使用，是指IgG分子与受体或其它已知分子的结合增加了。本文所用短语“降低的结合活性”可以与“降低的结合亲和性”替换使用，是指IgG分子与受体或其它已知分子的结合降低了。
本文所用短语“吞噬作用”是指免疫复合物的清除。吞噬作用是免疫细胞——包括但不限定于巨噬细胞及嗜中性粒细胞——的一种免疫活性。
抗体及抗体-抗原复合物与免疫系统中细胞的相互作用以及各种应答，包括抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)及补体依赖的细胞毒作用(CDC)、免疫复合物的清除(吞噬作用)、通过B细胞产生抗体、以及IgG血清半衰期，均在下列文献中分别定义Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15203-234；Ward and Ghetie，1995，TherapeuticImmunol.277-94；Cox and Greenberg，2001，Semin.Immunol.13339-345；Heyman，2003，Immunol.Lett.88157-161；and Ravetch，1997，Curr.Opin.Immunol.9121-125。
除非另有说明，否则本文所用所有技术和科学术语均为与本发明相关的领域中普通人员通常所理解的含义。下面会描述作为示例的方法及材料，与本文所述相类似的或等价的方法及材料也可用于本发明实践中，对于本领域的技术人员而言这是显而易见的。所提及的所有出版物和其它参考文献均作为参考完整的整合在本文中。如有冲突，以本叙述——包括定义在内——为准。所给出的材料、方法及示例，只是为了进行阐释而非进行限定。
重组Ig-GalGlcNAcMan5GlcNAc2分子本发明提供了含有糖基化的Ig群体的组合物，所述的Ig主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-连接糖形。本发明还提供了主要含有具备介导诸如受体结合这样的抗体效应功能GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-连接糖形的Ig及组合物。优选地，本发明中的Ig与FcγRIII受体之间的相互作用使直接结合活性增强了。并且优选地，本发明中的Ig与FcγRIIb受体之间的相互作用使直接结合活性降低(或没有)了。在另一个技术方案中，本发明的Ig或组合物对通过某种糖形结构的富集/优势所赋予的结合活性降低了。本发明的一个突出特征是提供了主要含有特异的糖形——它介导抗体效应功能，譬如增强ADCC活性或者增加B细胞产生的抗体——的Ig及组合物。在另一个技术方案中，本发明的Ig或者其组合物通过某种糖形的富集/优势，具有增强的ADCC活性或者增加了B细胞产生的抗体。此外，对于本领域的技术人员显而易见的是生产具有占有优势的糖形的Ig的一个有利之处是，这样避免了生产出具有不想要的糖形的Ig和/或生产出Igs异源混合物——这会引发意想不到的效应和/或稀释更为有效的Ig糖形的浓度。因此，可以预期含有主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的Igs的药物组合物会有更好的特征，包括但不限定于，降低与FcγRIIb的结合，并增强与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合，因此在较低剂量时也很有效，具有更高的功效/潜能。
在一个技术方案中，本发明的Ig分子在Ig分子介导抗体效应功能的Fc区域的重链CH2结构域的Asn-297含有至少一种GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构。优选地，GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构在二聚体Ig的每个CH2区的Asn-297上(图1)。在另一个技术方案中，本发明提供在Asn-297具有基本上为GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构糖基化的Igs的组合物(图1)。选择性地，可在Ig分子中删除和/或增加一个或多个碳水化合物部分，从而增加或降低Ig上糖基化位点的数目。另外，Ig分子CH2区的N-连接糖基化位点的位置可通过引入天冬酰胺(ASN)或改变分子中N-聚糖的位点而改变。其中Asn-297是典型的在鼠和人IgG分子中发现的N-聚糖(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991)位点，该位点不是唯一预期的，而且该位点也不是维持功能必需的。通过已知的突变方法，技术人员可改变编码本发明的Ig的DNA分子，从而删除Asn-297的N-糖基化位点，而且可以进一步改变DNA分子，从而在Ig分子的其它位点创造一个或多个N-糖基化位点。优选地，在Ig分子的CH2区创造N-糖基化位点。但是，30％血清抗体中的Ig的Fab区的N-糖基化通常在Asn-75(Rademacher et al.，1986，Biochem.Soc.Symp.，51131-148)。Ig分子Fab区的糖基化是另外的与Fc区糖基化联合存在的或单独存在的位点。
在一个技术方案中，本发明提供一种重组的Ig组合物，具有主要为 GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖结构，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构存在的水平至少比重组Ig组合物中第二种主要聚糖结构高约5摩尔百分数。在优选技术方案中，本发明提供重组的Ig组合物，具有主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖结构，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构存在的水平至少比重组的Ig组合物中第二种主要聚糖结构高约10到约25摩尔百分数。在更优选技术方案中，本发明提供重组的Ig组合物，具有主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖结构，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构存在的水平至少比重组Ig组合物中第二种主要聚糖结构高约25到约50摩尔百分数。在优选的技术方案中，本发明提供提供重组的Ig组合物，具有主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖结构，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构存在的水平至少比重组Ig组合物中第二种主要聚糖结构高约50摩尔百分数。在另一个优选的技术方案中，本发明提供重组的Ig组合物，具有主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖结构，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构存在的水平至少比重组Ig组合物中第二种主要聚糖结构高约75摩尔百分数。在另一个技术方案中，本发明提供重组的Ig组合物，具有主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2的N-聚糖结构，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构存在的水平至少比重组Ig组合物中第二种主要聚糖结构高约90摩尔百分数。主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖(59.2％)的JC-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析如图4A所示。主要为GalGlcNAcMan5GlcNAc2(66％)的DX-IgG的N-聚糖的MALDI-TOF分析如图4B所示。
Ig-GalGlcNAcMan5GlcNAc2与FcγRIII受体结合的增强Ig与FcγRIIIa和FcγRIIIb相结合的效应功能，譬如ADCC的激活，是由Ig分子的Fc区来介导的。通过该区的不同结构域来介导不同的功能。因此，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区域主要含有能够实现效应功能的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。在一个技术方案中，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Fc区域增强了与FcγRIIIa(图6)和FcγRIIIb(图5)的结合。在另一个技术方案中，Fc主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。对于本领域技术人员显而易见的是诸如免疫黏附剂(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends BiotechnoL.1452-60；Ashkenazi and Chamow，1997，CurrOpin.Immunol.9195-200)、Fc融合物及类抗体分子这样的含有Fc区域的分子，也包含在本发明范围内。
Ig分子与Fc受体的结合活性(亲和性)可以通过实验来测定。在实施例6中描述了FcγRIII与IgG结合实验的例子。本领域的技术人员知道该实验很容易适用于检验任意的免疫球蛋白分子。
如图5A所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(一种根据本发明制备的Ig)与FcγRIIIb的结合活性增强了10倍，如图6所示，与FcγRIIIa的结合活性高于10倍。如图5B所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(一种根据本发明制备的Ig)与FcγRIIIb的结合活性增强了约10倍。
最有趣地是，FcγRIIIa基因二态性生成了两种异型FcγRIIIa-158V和FcγRIIIa-158F(Dall’Ozzo et al.，2004，Cancer Res.644664-4669)。纯合的FcγRIIIa-158V基因型与针对Rituximab的更高的临床应答相关(Cartron et al.，2002，Blood，99754-758)。不过，绝大多数人群都携带一条FcγRIIIa-158F等位基因，因此使得对于多数人而言，Rituximab通过结合FcγRIIIa而引发ADCC的有效性降低了。然而，当在缺少海藻糖转移酶活性的宿主细胞中表达类Rituximab的抗-CD20抗体时，通过FcγRIIIa-158F以及通过FcγRIIIa-158V的抗体在增强ADCC方面是等效的(Niwa et al,，2004，Clin.Canc Res.106248-6255)。本发明某些优选技术方案中的抗体是在其N-聚糖上没有海藻糖的宿主细胞中表达的(譬如P.pastoris——一种缺少海藻糖的酵母宿主；参见实施例1和2)。因此，可以预计，本发明中缺少海藻糖并可增强与FcγRIIIa-158F结合的抗体在治疗许多针对Rituximab的临床应答有所降低的病人中尤为有用。
Ig-GalGlcNAcMan5GlcNAc2与FcγRIIIb受体结合的降低Ig与FcγRIIb相结合的效应功能，譬如由B细胞所产生的抗体的增加以及ADCC活性的增强，是由Ig分子的Fc区来介导的。通过该区的不同结构域来介导不同的功能。因此，本发明提供了Ig分子和组合物，其中Ig分子上的Fc区域主要含有能够实现效应功能的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖。在一个技术方案中，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的Ig的Fc区域降低了与FcγRIIb受体的结合。对于本领域技术人员显而易见的是诸如免疫黏附剂(Chamow and Ashkenazi，1996，Trends Biotechnol.1452-60；Ashkenazi and Chamow，1997，Curr Opin.Immunol.9195-200)、Fc融合物及类抗体分子这样的含有Fc区域的分子，也包含在本发明范围内。
Ig分子与Fc受体的结合活性(亲和性)可以通过实验来测定。在实施例6中描述了FcγRIIb与IgG1结合实验的例子。本领域的技术人员知道该实验很容易适用于任意的免疫球蛋白分子。
如图7A所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(一种根据本发明制备的Ig)与FcγRIIb的结合活性降低了约4倍。如图7B所示，同Rituximab相比，主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(一种根据本发明制备的Ig)与FcγRIIb的结合活性降低了约4倍。
抗体依赖细胞介导的细胞毒作用的增加在一个技术方案中，FcγRIIIa或FcγRIIIb与以GalGlcNAcMan5GlcNAc2为主要N-聚糖的Ig分子或组合物的结合增强，从而增加FcγRIII介导的ADCC。已非常明确FcγRIII(CDl6)与ADCC活性有关(Daeron et al.，1997，Annu.Rev.Immunol.15203-234)。在另一个技术方案中，FcγRIIb与以GalGlcNAcMan5GlcNAc2为主要N-聚糖的Ig分子或组合物的结合的降低，可增强ADCC(Clyneset al.，2000，同上)。在另一个技术方案中，本发明的Ig分子或组合物由于具有占有优势的GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖而增强ADCC活性。
在实施例7中描述了体外实验检测B细胞消耗以及荧光释放ADCC实验的例子。本领域的技术人员知道这些所述实验很容易适用于任意Ig分子。此外，根据Borchmann et al.，2003，Blood，1023737-3742，Niwa et al.，2004，Cancer Research，642127-2133及实施例7，动物模型中的体内ADCC实验也可用于任意特定的IgG。
B细胞产生抗体的增加已知可通过调控FcγR途径而用抗体治疗肿瘤(Clynes et al.，2000，Nature，6443-446)。具体地，已知当FcγRIIb与基于诸如B细胞受体(BCR)、FcγRI、FcγRIII和FcεRI这样的含有(ITAM)受体的激活元件的免疫受体酪氨酸共交联时，可抑制ITAM介导的信号(Vivierand Daeron，1997，Immunol.Today，18286-291)。另外，添加FcgRII特异的抗体可阻断Fc与FcgRIIB的结合，从而导致B细胞的增殖(Wagle et al.，1999，J of Immunol.1622732-2740)。因此，在一个技术方案中，本发明的Ig分子可引发FcγRIIb受体结合的降低，导致B细胞——它通过浆细胞催化产生抗体——的活化(Parker，D.C.1993，Annu.Rev.Immunol.11331-360)。在实施例6中描述了一个检测含IgG1的B细胞产生抗体的实验的例子。本领域的技术人员知道该实验很容易适用于检测任意的免疫球蛋白分子。
其他的免疫活性已表明改变嗜中性粒细胞上效应细胞分子的表面表达可增强对细菌感染的敏感性(Ohsaka et al.，1997，Br.J.Haematol.98108-113)。进一步表明与FcγRIIIa效应细胞受体结合的IgG可调节肿瘤坏死因子alpha(TNF-α)的表达(Blom et al.，2004，Arthritis Rheum.，481002-1014)。此外，FcγR诱导的TNF-α也提高了嗜中性粒细胞结合并吞噬包被IgG的红细胞的能力(Capsoni et al.，1991，J.Clin.Lab Immunol.34115-124)。因此可以预测本发明的与FcγRIII的结合增强的Ig分子及组合物可提高TNF-α的表达。
已表明增强FcγRIII受体的活性可提高溶酶体中β-葡糖苷酸酶以及其它溶酶体酶类的分泌(Kavai et al.，1982，Adv.Exp Med.Biol.141575-582；Ward and Ghetie，1995，Therapeutic Immunol.，277-94)。此外，免疫受体通过其配基接合后的一个重要步骤是它们内移并递送到溶酶体中(Bonnerot et al.，1998，EMBOJ.，174906-4916)。因此可预测本发明中的与FcγRIIIa及FcγRJIIb结合增强的Ig分子或组合物可提高溶酶体酶类的分泌。
专一存在于嗜中性粒细胞上的FcγRIIIb在免疫复合物的装配方面起重要作用，其聚集可激活吞噬作用、细胞脱粒、及呼吸爆发，引发易被吞噬细胞吞噬的病原体的破坏。嗜中性粒细胞的活化会导致受体两个细胞外结构域以蛋白水解剪切的可溶形式来分泌。可溶的FcγRIIIb通过FcγR依赖的效应功能及通过与补体受体CR3结合的竞争性抑制来发挥调控功能，导致产生引起炎症的介导物(Sautes-Fridman et al.，2003，ASHI Quarterly，148-151)。
本发明因此提供了含有主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成的N-聚糖的免疫球蛋白分子；并提供了含有免疫球蛋白及附在其上的多种N-聚糖的组合物，其中在上述多种N-聚糖中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。在本文所示任一实施例中，免疫球蛋白上所述的占有优势的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖优选地提供了所需的治疗效应活性，此外改善了与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合并降低了与FcγRIIb的结合。
免疫球蛋白亚类已表明IgG亚类对Fc受体具有不同的结合亲和性(Huizinga et al.，1989，J.of Immunol.，1422359-2364)。每种IgG亚类在本发明的不同方面具有特定的优势。因此，一方面，本发明提供了以附着在IgG1分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作为主要N-聚糖的IgG1组合物。另一方面，本发明包含以附着在IgG2分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作为主要N-聚糖的IgG2组合物。另外一个方面，本发明含以附着在IgG3分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作为主要N-聚糖的IgG3组合物。另一方面，本发明包含以附着在IgG4分子上的GalGlcNAcMan5GlcNAc2作为主要N-聚糖的IgG4组合物。
选择性地，本发明可应用于全部5种主要的免疫球蛋白种类IgA、IgD、IgE、IgM和IgG。本发明优选的免疫球蛋白是人IgG，并且优选地是来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的某一个。更优选地，本发明的免疫球蛋白为IgG1分子。
介导抗体效应功能与活性的重组免疫球蛋白(Ig)分子的生产一方面，本发明提供了生产重组Ig分子——它在CH2结构域297位Asn上的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构组成——的方法，其中Ig分子介导抗体效应功能和活性，并且类似地，提供了生产免疫球蛋白的组合物的方法，其中附着在免疫球蛋白上的占有优势的N-聚糖是GalGlcNAcMan5GlcNAc2。
在一个技术方案中，使用重叠的寡核苷酸合成Ig的重链和轻链，并分别克隆到表达载体中(实施例1)，在宿主细胞中进行表达。在一个优选的技术方案中，在主要催化增加GalGlcNAcMan5GlcNAc2的宿主菌株中表达重组Ig重链和轻链。在一个技术方案中，该糖形结构更具体表示为[Gal-(GlcNAcβ1，2-Manα1，3)(Manα1，3 Manα1，6 Manα1，6)Manβ1，4-GlcNAc β1，4-GlcNAc]——它在Ig上Fc区域297位Asn氨基酸的氮与GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖上的N-乙酰-β-D-葡萄糖胺的羟基基团之间形成一个连接。在另外一个技术方案中，该占有优势的聚糖可添加到Ig分子内不同位点上的天冬氨酸上(除了297位Asn)，或连接在Fab区域的N-糖基化位点上。
在低等真核生物中生产主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2的Ig本发明的一个方面提供了重组真核宿主细胞——它可用于生产主要是GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形的免疫球蛋白或抗体分子，与在天然生产产量很低的上述糖形的哺乳动物细胞中所表达的糖蛋白组合物相比，它更有优势。
本发明的另一个优势在于糖蛋白组合物以预先确定的、易于再生的糖基化模式来提供。为了所需的特性，可对这类组合物的性质进行评估和优化，最小化或者完全避免不利的效应。
本发明还提供了生产经改造或选择以表达一种或多种核酸——用于生产含有主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成的N-聚糖的Ig分子以及具有占有优势的GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构的Ig组合物——的重组宿主细胞的方法。在本发明某些优选的技术方案中，重组宿主细胞，优选地为重组低等真核宿主细胞，用于生产上述主要含GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖的Ig分子和组合物。
在其它优选的技术方案中，本发明包含可从重组宿主细胞或通过本发明的方法获得的糖蛋白。
可以用编码所需Ig区域的载体、及用编码一种或多种本文所述与糖基化相关的酶的载体来转化本发明中的宿主细胞，然后筛选表达具有占有优势的GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的重组Ig分子或组合物。本发明的重组宿主细胞可以是诸如动物、植物、昆虫、细菌细胞或其它类似的真核或原核宿主细胞——它们经改造或筛选后可产生主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖结构的Ig组合物。
优选地，本发明的重组宿主细胞是如本领域所述的常规改造的低等真核宿主细胞(WO 02/00879，WO 03/056914，WO 04/074498，WO04/074499，Choi et al.，2003，PNAS，1005022-5027；Hamilton et al.，2003，Nature，3011244-1246 and Bobrowicz et al.，2004，Glycobiology，14757-766)。具体地，WO 02/00879和WO 04/074499描述了表达具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的方法，并描述了将β-1，4半乳糖转移酶转入低等真核生物的方法。更具体地，美国申请No.11/108088描述了主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白(包括免疫球蛋白)。
在一个技术方案中，将编码IgG1的载体——例如含有JC-IgG1(实施例1)的AOX1/pPICZA载体——转入到酵母P.pastoris YAS385-1菌株中。该YAS385-1菌株与除去K3报告蛋白的YSH44菌株相似(Hamilton et al.，2003，Sclence，3011244-1246)，并含有已描述的(美国专利申请No.11/020808)被敲除的PNO1和MNN4b基因，以及含有已描述的(美国专利申请No.11/108088)导入的β-1，4半乳糖转移酶I基因。ΔpnolΔmnn4b双敲除会导致丧失甘露糖基-磷酸化作用。可通过在5-氟乳清酸(5-FOA)上培养菌株来删除如所述关于YSH44(Hamiltonet al.，2003)那样导入的侧翼为URA5基因的甘露糖苷酶II基因(Guthrie and Fink，1991，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Vol. 169，Academic Press，SanDiego)。甘露糖苷酶II基因的删除可维持5甘露糖核心结构——末端的α-1，3和α-1，6甘露糖与α-1，6甘露糖臂相连、α-1，3甘露糖上的β-1，2 GlcNAc及末端β-1，4半乳糖与β-1，2 GlcNAc相连。然后使用UR43敲除质粒，它在AMR2基因座上插入了URA3基因而破坏AMR2基因(Guthrie and Fink，1991，同上)，从而删除了β-甘露糖化(美国专利申请No.11/118008)。该YAS385-1菌株表达主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2及GlcNAcMan5-GlcNAc2的糖蛋白，因此生成了主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2及GlcNAcMan5-GlcNAc2的JC-IgG。用β-1，4半乳糖基转移酶处理该主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2及GlcNAcMan5-GlcNAc2的JC-IgG(实施例3)，可生成主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的JC-IgG(图4A)。
在另一个技术方案中，将含有DX-IgG的AOX1/pPICZA中编码IgG1的载体(实施例1)也导入到酵母P.pastoris YAS385-1菌株中(同上)，纯化，然后用β-1，4半乳糖基转移酶处理(实施例3)，从而得到主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的DX-IgG(图4B)。
选择性地，本发明的抗体可通过本领域中已知的多种方法来表达(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.79-97 Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
糖基转移酶的表达以及温度遗传整合到低等真核生物中已描述了使用诸如URA3、URA5、HIS4、SUC2、G418、BLA或HBLA这样的选择标记来将异源基因导入并确认整合到低等真核宿主菌株(譬如P.pastoris)中的方法。当在低等真核生物中产生表达系统时，可调整这些方法以生产本发明的Ig。此外，已描述了考虑到重复使用URA3标记以除去不需要的甘露糖基转移酶活性的方法。Alaniet al.，1987，Genetics，116541-545及美国专利No.6,051,419描述了基于P.pastoris中URA3基因被破坏的选择体系。优选地，P基于pURA3-或者PpURA5-的破坏盒可用于破坏URA3、URA5或尿嘧啶生物合成途径中的任意基因，并可基于尿嘧啶营养缺陷型及对5-氟乳清酸(5FOA)的抗性进行阳性和阴性选择(Boeke，et al.，1984，Mol.Gen.Genet.，197345-346)。因此，技术人员知道这个系统通过选择与反向选择可插入多个异源基因。
进一步的酶修饰进一步酶法删除对于分离不含甘露糖磷酸化或者β-甘露糖化——它们在人体内可能会引起异常的免疫反应活性——的Ig是有益的或必需的。如上所述，美国专利申请No.11/020808描述了除去甘露糖磷酸化的方法，美国专利申请No.11/118008描述了除去β-甘露糖化的方法。
在其它蛋白表达体系中生产主要含有GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构的Ig技术人员知道对于异源蛋白表达，可以选择需要或者不需要进行加工以表达含有占有优势的聚糖结构的表达宿主体系(机体)。本文提供的实施例是对在297位Asn具有特定聚糖或者在其它位点具有N-糖基化或者二者皆有的Ig进行表达的方法的示例。本领域的技术人员可轻易改造发明中任意蛋白表达体系(机体)的细节以及实施例。
其它蛋白表达宿主体系——包括动物、植物、昆虫、细菌细胞及其它类似体系，可用于生产本发明的Ig分子及组合物。可改造或筛选这类蛋白表达宿主体系以表达占有优势的糖形，或者选择地，可天然生产具有占有优势的聚糖结构的糖蛋白。改造生产具有占有优势的糖形的糖蛋白的蛋白表达宿主体系的例子包括基因敲除/突变(Shields etal.，2002，JBC，27726733-26740)、基因工程( et，al.，1999，Nature Biotech.，17176-180))或者二者的组合。或者，某些可天然表达某种占有优势的糖形的特定细胞--例如，鸡、人及牛(Raju et al.，2000，Glycobiology，10477-486)。因此，根据本领域的技术人员所选择的至少一种表达宿主体系，可实现本发明的具有占有优势的某种特定聚糖结构的Ig糖蛋白或组合物的表达。本领域中发现的用于生产糖蛋白的进一步的表达宿主体系包括CHO细胞——RajuWO9922764A1和Presta WO03/035835A1；杂交瘤细胞——Trebak etal.，1999，J.Immunol.Methods，23059-70；昆虫细胞——Hsu et al.，1997，JBG，2729062-970；以及植物细胞——Gerngross et al.，WO04/074499A2。
IgG的纯化纯化及分离抗体的方法在本领域是已知的且已得到描述。参见，例如，Kohler & Milstein，(1975)Nature 256495；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-104(Academic Press，1986)；及Jakobovitset，al.(1993)Proc.Natl.Acad.ScL USA 902551-255与Jakobovits et al，(1993)Nature 362255-258。在一个进一步的技术方案中，从通过McCafferty et al.(1990)Nature，348552-554(1990)描述的技术生成的抗体噬菌体文库中，使用目标抗原筛选合适的抗体或抗体片段，从而分离抗体或抗体片段。
根据本发明方法生产的重组Ig分子可根据实施例3中叙述的方法来纯化。图2所示的是从YAS385-1中纯化的JC-IgG的SDS-PAGE考马斯亮兰染色凝胶。图3所示的是从YAS385-1中纯化的DX-IgG的SDS-PAGE考马斯亮兰染色凝胶。在另一个技术方案中，纯化的Ig抗体以GlcNAcMan5GlcNAc2作为主要的N-聚糖。可通过本领域技术人员已知的几种质谱方法——包括但不限定于HPLC、NMR、LCMS和MALDI-TOF MS-来分析聚糖并确定其在任意Ig分子上的分布。在一个优选的技术方案中，聚糖的分布通过MALDI-TOF MS分析来确定，如实施例5所示。图4A所示的是从YAS385-1中纯化的并用β-1，4半乳糖基转移酶处理的JC-IgG的MALDI-TOF图谱(实施例3)。该MALDI-TOF表明约59.2％摩尔比的总N-聚糖为GalGlcNAcMan5GlcNAc2。图4B所示的是从YAS385-1中纯化的并用β-1，4半乳糖基转移酶处理的DX-IgG的MALDI-TOF图谱。该MALDI-TOF表明约66％摩尔比的总N-聚糖为GalGlcNAcMan5GlcNAc2。
药物组合物本发明的抗体可整合在含抗体的药物组合物中作为活性治疗制剂和各种其它药学上可接受的组分。参见Remington′s PharmaceuticalScience(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选的形式依赖于预定的给药方式和治疗用途。根据所需的配方，该组合物也包括药学上可接受的、无毒的载体或稀释液，作为载体，通常用于阐明动物或人给药的药物组合物。选择的稀释液不影响组合物的生物学活性。这种稀释液的例子是蒸馏水、磷酸生理盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液及Hank′s溶液。另外，药物组合物或配方也包括其它载体、佐剂或无毒、无治疗性、非免疫性稳定剂等。
肠道外给药的药物组合物是无菌的，基本等压的、不含热源、根据FDA的GMP或同样设备制备的。抗体可以通过该物质的溶液或悬浮液进行注射剂量的给药，该物质溶解在具有药学上载体的生理上可接受的稀释液中，可以是无菌的液体，例如水、油、盐、甘油或乙醇中。另外，辅助物质，例如加湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于组合物中。其它药物组合物的组包括石油、动物、植物，或者合成来源的，例如，花生油、豆油及矿物油。通常，诸如丙稀乙二醇或者聚乙烯乙二醇这样的乙二醇是优选的液体载体，对于可注射溶液尤为如此。抗体可以以可持续释放活性成分的方式配制的贮存注射剂或者植入制剂的形式给药。典型地，以液体溶液或者悬浮液的可注射形式制备组合物；也可制备固体形式，它可在注射前溶于或者悬浮于液体载体中。如上所述，制剂也可以是乳化的，或者包装在脂质体胶囊内，或者是诸如聚交酯、聚乙二醇这样的微颗粒，或者是共聚物中，用于增强佐剂的效果(参见Langer，Science 249，1527(1990)以及Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28，97-119(1997))。
诊断性产品本发明的抗体可包含在多种诊断试剂盒及其它诊断性产品，例如阵列中。通常提供的抗体预先结合在固相上，例如微孔板的孔中。试剂盒通常也含有检测抗体结合和标记以提供指导的试剂。免疫或三明治检测法是优选的诊断试剂盒的形式(参见美国专利4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375)。抗体阵列描述在，例如，US5,922,615、US 5,458,852、US 6,019,944和US 6,143,576中。
治疗性应用本发明提供在糖蛋白中主要含特定糖形的糖蛋白组合物。本发明的一个特征是，在优选技术方案中，当给药哺乳动物包括人时，含新型糖蛋白组合物的药物成分与其它具有相同基本结构的糖蛋白组合物相比较，利于表现出更好的体内特性。因此，本发明的新型组合物可用作目前所用的糖蛋白药物制剂，在生产批次上可利于提供改善的特性和增强的一致性。本发明的制剂根据特定的药物或药剂及其目标领域可作为溶液、单位剂量形式例如片剂和胶囊用于口服，及悬浮液、药膏等。
在特定方面，本发明提供糖蛋白药物制剂、药物或药剂的新型组合物，其中糖蛋白包括免疫球蛋白分子，组合物主要包括糖蛋白制剂的特定糖形。根据本发明的特定方面，提供的组合物包括此处所述的主要为N-连接寡糖的GalGlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构。在优选方面，糖蛋白是抗体，特别是单克隆抗体。本发明进一步提供生产本发明的组合物的方法和工具。
本发明进一步包括含本发明糖形制剂的药物组合物。该组合物优选地是无菌的。当组合物是水溶液时，优选地糖蛋白是可溶的。当组合物是冻干粉时，优选地可在合适的溶剂中重溶。
在其它方面，本发明包括治疗疾病的方法，包括给药所需哺乳动物治疗有效剂量的本发明的药物组合物。本发明的进一步的目标是提供可使用的商品或试剂盒形式的糖形制剂，用于治疗疾病或失调。
本发明的主要含有GalGlcNAc-Man5GlcNAc2N-聚糖的Ig分子具有治疗多种适应症的用途，例如癌症、炎症疾病、感染、免疫疾病、自免疫疾病，包括原发性血小板减少性紫癜、关节炎、系统性红斑狼疮和自身免疫性溶血性贫血。
以下实施例用于说明本发明关于生产Ig糖蛋白组合物的组合物和方法。这些实施例仅为了说明的目的，并非对本发明进行限定。技术人员应理解本发明的各种修改和扩充包括优化是可能的。这种修改或扩充被认为是本发明的一部分。
实施例1在毕赤酵母中克隆和表达DX-IgGlDX-IgGl(抗CD20 IgGl)的轻链(L)和重链(H)由小鼠可变区和人恒定区组成。轻链表示为SEQ ID NO1，重链为SEQ ID NO2。重链和轻链序列是通过购自Integrated DNA Technologies(IDT)的重叠寡核苷酸合成的。对轻链可变区，购买了15条重叠寡核苷酸(SEQID NOs5-19)，用PCR反应中的Extaq(Takada)通过退火而产生具有5′MlyI位点的轻链可变区片段。然后将轻链可变区片段与重链恒定区(SEQ ID NO3)(Gene Art，Toronto，Canada)通过用5′MlyI引物CD20L/up(SEQ ID NO20)、3′可变区/5′恒定区引物LfusionRTVAAPS/up(SEQ ID NO21)、3′恒定区引物LfusionRTVAAPS/lp(SEQ ID NO22)和3′CD20L/lp (SEQ ID NO23)进行重叠PCR而进行连接。然后将最终的MlyI-轻链片段(包括5′AG碱基对)插入到pCR2.1 topo载体中(Invitrogen)，得到pDX343。对于重链，从IDT购买了17条对应于鼠重链可变区的重叠寡核苷酸(SEQID NOs24-40)，并用Extaq进行退火。然后将该重链可变区片段与重链恒定区(SEQ ID NO4) (Gene Art)以5′MlyI引物CD20H/up(SEQ ID NO41)、5′可变区/5′恒定区引物HchainASTKGPS/up(SEQID NO42)、3′可变区/恒定区引物HchainASTKGPS/lp(SEQ ID NO43)、3′恒定区引物HFckpnl/lp(SEQ ID NO44)通过重叠PCR而连接。及最终得到的MlyI-重链片段(包括5′AG碱基对)插入到pCR2.1topo载体(Invitrogen)中，得到pDX360。从topo载体中分离全长轻链和全长重链，作为MlyI和NotI片段。然后将正向轻链和重链片段通过4个重叠寡核苷酸——P.BiPss/UPl-EcoRI、P.BiPss/LPl、P.BiPss/UP2和P.BiP/LP2(序列分别为SEQ ID NOS46-49)连接到Kar2(Bip)信号序列(SEQ ID NO45)上，然后连接到pPICZA的EcoRI-NotI位点，从而得到携带Kar2-轻链的pDX344和携带Kar2-重链的pDX468。然后将来自pDX344的BglII-BamHI片段亚克隆到含用于染色体整合的AOX2启动子基因的pBK85中，从而得到pDX458。将来自携带重链的pDX468的BglII-BamHI片段亚克隆到pDX458中，得到位于AOX1启动子下、同时含CD20重链和轻链的pDX478。然后将携带重链的pDX468中的BglII-BamHI片段亚克隆到pDX458中，得到位于AOX1启动子下、同时含CD20重链和轻链的pDX478。然后在转化前用SpeI将该质粒线性化，以与用Zeocin抗性筛选的转化子一起整合到AOX2位点(参见实施例2)。
在毕氏酵母中克隆和表达JC-IgGJC-IgGl的轻链(L)和重链(H)由小鼠可变区和人恒定区组成。鼠可变轻链表示为SEQ ID NO50(GenBank#AF013576)，鼠可变重链为SEQ ID NO51(GenBank#AF013577)。重链和轻链序列是通过购自Integrated DNA Technologies(IDT)的重叠寡核苷酸合成的。对轻链，购买了12条重叠寡核苷酸(SEQ ID NOs52-63)，用PCR反应中的Extaq(Takada)通过退火而产生具有5′EcoRI位点和3’KpnI位点的660个碱基的轻链。然后将该轻链亚克隆到pPICZa载体(Invitrogen)中，得到EcoRI-KpnI片段。对于重链，购买了12条对应于Fab片段的重叠寡核苷酸(SEQ ID NOs64-75)，用Extaq退火以产生660碱基的Fab片段。Fc片段用12条重叠寡核苷酸(SEQ ID NOs76-87)通过同样的重叠PCR反应进行合成。然后将重链Fab和Fc片段用对应于重链Fab片段5’末端的5’EcoRI引物(SEQ ID NO64)和对应于Fc片段3’末端的3′KpnI引物(SEQ ID NO88)用pFU Turbo聚合酶(Stratagene)进行退火，得到1,330个碱基对的重链。用含5′EcoRI和3′KpnI位点的引物将重链克隆到pPICZa载体中。将作为整合位点的AOX2引物序列亚克隆到最终的pPICZa载体中，然后，将含AOX1启动子的BglII-BstBl片段和含来自人肝脏cDNA文库的HSA序列的BstBl-BamHI片段(SEQ ID NO89)、凝血酶位点(SEQ IDNO90)和JC轻链均亚克隆到AOX2/pPICZa载体的BamHI位点。然后，将另一个含AOXl启动子的BlgII-BstBI片段和含HAS序列、凝血酶位点和JC重链的BstIBl-BamHI片段亚克隆到同样的pPICZa载体的BamHI位点。最终的载体含AOX2整合位点、带HSA-标签的JC轻链和带HSA-标签的JC重链，从而得到pJC140。将该表达盒与筛选转化子的零霉素抗性整合到毕氏酵母菌株的AOX2位点(参见实施例2)上。
RituximabRituxan是购自Biogen-IDEC/Genentech，SanFrancisco，CA的抗CD20小鼠/人嵌合型IgGl。
PCR扩增。用Eppendorf Mastercycler热循环仪进行所有PCR反应。PCR反应含模板DNA、125μM dNTPs、0.2μM正向和反向引物、Ex Taq聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.)和Ex Taq聚合酶或pFU Turbo聚合酶缓冲液(Stratagene)和pFU Turbo聚合酶。通过30个循环扩增DNA片段，97℃15秒，55℃15秒，72℃90秒，最初的变性步骤为在97℃进行2分钟，最后在72℃延伸7分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR样品，提取DNA带，用Qiagen的胶回收试剂盒进行提取。所有的DNA纯化物在10mM Tris，pH8.0下洗脱，而最终的PCR(所有3个片段的重叠)用去离子水洗脱。
实施例2将IgG载体转化到毕氏酵母菌株YAS385-1中。通过加入醋酸钠至终浓度为0.3 M而制备DNA。然后向DNA样品中加入100％冷乙醇至终浓度为70％。通过离心(12000g×10分钟)使DNA沉淀，并用70％冷乙醇洗涤2次。干燥DNA，并重悬到50μl 10mM Tris，pH8.0中。待转化的YAS385-1酵母培养物(Choi et al.，2003；Hamilton et al.，2003)通过扩大培养BMGY(缓冲基础甘油100mM硫酸钾，pH6.0；1.34％酵母氮源，4×10-5％生物素；1％甘油)中的小培养至O.D.为～2～6而制备感受态细胞。然后将酵母细胞在1M山梨醇中洗涤3次，并重悬在约1-2毫升的1M山梨醇中。将DNA(1-2μg)与100μl感受态细胞混合，在冰上温育10分钟。然后用BTX Electrocell Manipulator600对酵母细胞进行电穿孔，使用以下参数1.5kV、129ohms和25μF。向电穿孔细胞中加入1ml YPDS(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡聚糖、1M山梨醇)。然后将转化的酵母在含零霉素的选择性琼脂糖平板进行转化。
IgG1在毕赤酵母中的培养条件。将用pDX478或pJC140转化的单克隆YAS385-1接种到含10ml BMGY培养基(含1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM硫酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％酵母氮源、4×105％生物素和1％甘油)的50ml Falcon离心管中。培养物在24℃振荡培养48小时至培养物饱和。然后向500ml挡板式烧瓶中加入100ml BMGY。然后将种子培养物转移到含100ml BMGY培养基的挡板式烧瓶中。将培养物在24℃振荡培养24小时。将烧瓶中内容物轻轻倒入到2个50mlFalcon离心管中，3000rpm离心10分钟。用不含甘油的20ml BMGY洗涤细胞沉淀1次，然后轻轻重悬在20ml BMMY(BMGY用1％MeOH代替1％甘油)中。将悬浮的细胞转移到250ml挡板式烧瓶中。将培养物在24℃/170-190rpm振荡培养24小时。将烧瓶中内容物轻轻倒入到2个50ml Falcon离心管中，3000rpm离心10分钟。通过ELISA分析培养物上清，以在蛋白分离前测定大约的抗体滴度(参见实施例3)。
通过酶联免疫吸收检测法(ELISAs)对培养上清中的抗体进行定量用24μg溶在10ml PBS，pH7.4中的羊抗人Fab(Biocarta，Inc，SanDiego，CA)包被高结合性微孔板(Costar)，4℃放置过夜。除去缓冲液，加入封闭缓冲液(含3％BSA的PBS)，然后室温温育1小时。除去封闭缓冲液，用PBS将板洗涤3次。在最后一次洗涤后，加入逐渐增加体积量的抗体培养上清(0.4、0.8、1.5、3.2、6.25、12.5、25和50μl)，室温温育1小时。然后用PBS+0.05％Tween 20洗涤板。在最后一次洗涤后，加入溶在1∶2000 PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室温温育1小时。然后用PBS-Tween 20将板洗涤4次。用TMB底物试剂盒(Pierce Biotechnology)根据说明书来分析板。
实施例3IgGl的纯化用Streamline蛋白A柱从培养上清中捕获单克隆抗体。用Tris-甘氨酸pH3.5洗脱抗体，并用1M Tris pH8.0进行中和。用疏水相互作用色谱(HIC)进行进一步的纯化。根据抗体选择特定类型的HIC柱。对JC-IgG和DX-IgG而言，可使用苯基琼脂糖柱(也可使用辛基琼脂糖)，缓冲液为20mM Tris(7.0)，1M(Na)2SO4缓冲液，用线性梯度缓冲液1M到0M(NH4)2SO4洗脱。收集苯基琼脂糖柱上的抗体组分，并交换到50mM NaOAc/Tris pH5.2缓冲液中，通过阳离子交换柱(SP琼脂糖快速洗脱柱)(GE Healthcare)进行最终纯化。用50mMTris，1M NaCl(pH7.0)对抗体进行线性洗脱。
用β-1，4半乳糖基转移酶处理YAS385-1中的JC-IgG和DX-IgG将5mg纯化的IgG(JC-IgG或DX-IgG)缓冲交换到50mMNH4Ac，pH5.0中。在硅化的管中，向溶在50mM NH4Ac，pH5.0中的纯化的IgG中加入0.3U来源于牛奶中的β-1，4半乳糖基转移酶(EMDBiosciences，La Jolla，CA)，37℃温育16-24小时。将该样品浓缩干燥，重悬到水中，用MALDI-TOF进行分析。然后如上所述通过苯基琼脂糖纯化β-1，4半乳糖基转移酶中的抗体。
实施例4纯化的Ig的检测将纯化的JC-IgG或DX-IgG与大约等体积的样品上样缓冲液混合，通过预制胶(NuPAGE bis-Tris electrophoresis system；InvitrogenCorporation，Carlsbad，Calif)根据产品说明书进行十二烷基璜酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。用考马斯亮兰染色液(Bio-Rad，Hercules，CA)对凝胶蛋白进行染色。参见图2和3。
抗体浓度通过Bradford检测法(Bradford，M.1976，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)，以白蛋白(Pierce，Rockford，IL)为标准测定蛋白色谱组分的浓度。
实施例5IgGl碳水化合物分析基质辅助激光解吸附电离/飞行时间质谱技术(MALDI-TOFMS)。天冬氨酸连接的寡糖的MALDI-TOF分析用P apac et al.，Glycobiology 8，445-454(1998)修改的程序释放JC-IgG和DX-IgG中的N-连接聚糖。将抗体样品还原，并进行羧甲基化，封闭膜，用水将孔洗涤3次。通过加入30ul含1mU N-糖苷酶(EMD Biosciences，La Jolla，CA)的10 mM NH4HCO3(pH8.3)而使IgG蛋白去糖基化。在37℃反应16小时后，通过离心除去含聚糖的溶液，并浓缩干燥。将每个孔中的干燥聚糖溶解在15μl水中，并用0.5μl点样在不锈钢样品板中，与0.5μl S-DHB底物(9mg/ml二羟基苯甲酸/1mg/ml of 5-甲氧基-水杨酸溶在1∶1水/乙腈/0.1％三氟乙酸)混合，并进行干燥。通过脉冲氮激光器(337nm)以4-ns的脉冲时间通过放射而产生离子。该仪器以125-ns延迟的延迟引出模式和加速电压为20kV进行操作。电网电压为93.00％，导线电压为0.1％，内部压力＜5×10-7torr(1torr＝133Pa)，低分子门槛为75 Da。从100-200个激光脉冲中产生光谱，并通过500-MHz数字转换器获得光谱。以(Man)5(GlcNAc)2寡糖作为外部分子量标准。所有的光谱是用仪器在阳离子模式下获得的。
实施例6抗原结合的ELISA检测法用溶在PBS，pH7.4中的10ug抗原包被高结合微孔板(Costar)，4℃过夜。除去缓冲液，加入封闭缓冲液(含3％BSA的PBS)，然后在室温温育1小时。除去封闭缓冲液，用PBS将板洗涤3次。在最后一次洗涤后，加入从0.2ng到100ng逐渐增加量的纯化抗体，室温温育1小时。然后用PBS+0.05％Tween 20洗涤板。在最后一次洗涤后，加入溶在1∶2000 PBS溶液中的抗人Fc-HRP，然后室温温育1小时。然后用PBS-Tween 20将板洗涤4次。用TMB底物试剂盒(PierceBiotechnology)根据说明书来分析板。
Fc受体结合检测法根据以前描述的程序对FcγRIIb、FcγRIIIa和FcyRIIIb进行Fc受体结合检测法(Shields et al.，2001，J.Biol.Chem，2766591-6604)。对FcγRIII结合在4℃，用溶在PBS中的1μg/ml FcγRIIIb(图5)和FγRIIb(图7)融合蛋白或0.8μg/ml FcγRIIIa-LF(图6)融合蛋白包被ELISA板(Nalge-Nunc，Naperville，IL)48小时。用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在25℃将板封闭1小时。将JC-IgG或DX-IgG与HRP-耦联的F(Ab′)2anti-F(Ab′)2以2∶1的摩尔量在25℃混合1小时，从而制备溶在含1％BSA的PBS中的JC-IgG或DX-IgG二聚体复合物。然后将二聚体复合物在1％BSA/PBS中以1∶2系列稀释，并在25℃，在板上包被1小时。所用底物为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Vector Laboratories)。根据仪器说明书读取450nm处的吸收值(Vector Laboratories)。
B细胞中抗体反馈的ELISPOT检测法本检测法根据Westman，et al.，1997，Scand.J.Immunol.4610-15所述进行。首先将BSA(牛血清白蛋白)与IgG抗体耦联，得到BSA-IgG复合物。通过ELISPOT检测法测定分泌BSA特异的IgG的细胞数目。从注射的鼠中除去脾脏，在含0.5％正常鼠血清的DMEM(Gibco，NewYork)中制备细胞悬液。将100微升细胞悬液加到BSA包被的微孔板(参见如上ELISA程序)中，在37℃、5％CO2条件下温育3.5小时。洗涤板，并与溶在PBS-Tween中1/100稀释的50μl耦联碱性磷酸酶的羊抗鼠IgG在4℃温育。室温下，在50μl 5-溴-3氯-吲哚基(indoyl)磷酸(Sigma-Aldrich)中将样品显色1小时，并在立体显微镜下计数。
实施例7血基质研究法(例如B细胞消耗)测定ADCC。如Vugmeyster andHowell，2004，Int.Immunopharm.41117-1124所述。将无血浆和红细胞(RBCs)的全血在染色缓冲液(含1％BSA和0.1％叠氮钠的Hank′s平衡盐溶液(HBSS))中再生，使白细胞在染色缓冲液中悬浮。然后将全血样品1000g离心5分钟，除去上清(血浆)，沉淀用氯化铵裂解(ACL)试剂处理，洗涤，并重悬在等体积的染色缓冲液中。B-细胞消耗检测法将10μl 100μg/ml抗体溶液或染色缓冲液加到90μl SB底物中，37℃温育1小时。立即用抗-CD 19-FITC和抗-CD45-PE在25℃对样品染色30分钟。然后将样品在1％甲醛中固定，进行3次重复。通过流式细胞计数法测定B细胞消耗的量。B细胞消耗的流式细胞计数分析使用带自动FACS上样和细胞计数软件的FACS Calibur(BDBiosciences)仪器分析所有样品。血细胞计数器QC和设置包括连续的CaliBrite微球和SpheroTech彩色微球(BD Biosciences)，以验证仪器的功能和检测器的线性。在每次检测中运行同种型和补偿对照，以验证仪器的设置。通过以下门控策略获得总淋巴细胞中B细胞的百分比。淋巴细胞群标记为正向散射/侧向散射的散射谱，定义为区域1(R1)。根据R1中的事件，荧光强度点区表现为CD 19和CD45标记物。用荧光标记的同种型对照测定CD19和CD45阳性各自的临界点。用CellQuest测定％B，表示为R1区域中具有CD19-阳性、CD45-阳性表型的细胞的百分数。对每个处理组进行3次重复样品。用公式平均[100*(l-用对照抗体处理的％B/平均[用SB处理的％B]计算B细胞消耗的百分比。荧光梁料释放ADCC检测法；PBMC分离在肝素化的采血管(Becton Dickinson Vacutainer Systems，Rutherford，NJ，USA)中收集健康个体或献血者的外周静脉血(10-20)。输液2只鼠约需5ml血。通过OptiPrep根据说明书通过离心分离外周血单核细胞(BMCs)。用含RPMI 1640、2mM L-谷氨酸、100IU/ml青霉素、l00g/ml链霉素(Gibco/BRL)，补加20％胎牛血清的完全培养基(CM)洗涤PBMCs一次，然后重悬在CM中，浓度为1×106/ml，并转移到250ml培养瓶(Falcon，NJ，USA)中，进行单核细胞消耗。在37℃、5％CO2下温育1小时，收集未贴壁细胞，用培养基洗涤一次，将外周血淋巴细胞(PRLs)调整浓度为25×1007/ml CM。荧光梁料释放ADCC。在ADCC检测法之后的前提是与CD20或CD40抗原呈递靶细胞(分别为Raji细胞系或BCLl-3B3细胞)结合的抗体可刺激靶细胞与效应细胞上的Fcγ受体结合。这反过来可促进呈递CD20或CD40抗原的靶细胞的裂解，释放可定量的内部荧光染料。用Alamar-blue荧光替代标记51Cr的靶细胞，在96孔组织培养板中，将50ul CD20-呈递Raji细胞悬液(1×104细胞)与50ul抗-DX-IgG或抗-JC-IgG mAb(各种浓度)及50ul如上所述分离的PBMC效应细胞混合(效应细胞与靶细胞的比例为100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1)，37℃、5％CO2下温育4小时以利于Raji或BCL1-3B3细胞的裂解。加入50μl Alamar blue，继续温育5小时，使染料被吸收并被代谢为荧光状态。在振荡器上将板冷却至室温，在荧光仪中读取激发530nm，发射590nm的荧光值。将相对荧光单位(RFU)与mAb的浓度作图，从对照抗体，例如Rituximab的标准曲线中计算样品的浓度。用严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内检测ADCC(Niwa et al.，2004，Cancer Research，642127-2133)。可通过移植健康献血者的人外周血单核细胞(PMBCs)的鼠模型测定体内的ADCC活性，包括异源(FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LV)和同源(FcγRIIIa-LV/FcγRIIIa-LV and FcγRIIIa-LF/FcγRIIIa-LF)基因型。用该模型系统检测到，与Rituximab或任何其它对照抗体相比较，主要含N-聚糖的Igs具有增强的ADCC活性。该体内ADCC检测法的详细程序参见Niwa et al.，2004，同上。
序列表
SEQ ID NO01(小鼠/人嵌合IgG1轻链)caatcgtcttgtctcaatccccagctattttgtctgctccccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctcttcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttcctctccaaagccatggacctacgctacttccaacttggcttccggtgttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctcttaccatctccagagagaagccgaggacgctgctacttactactgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccaaattggagattaagagaactgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgactttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggtttacgcttgtgaggttacacatcagggtttgtcctccccagttactaagtccttcaacagaggagagtgttaaSEQ ID NO02(小鼠/人嵌合IgG1重链)caagtccagttgcaacagcctggtgccgagttggtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggttacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaatccasstagaggtttggagtggttggtgccatctacccaggtaacggtgacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttaccgctgataagtcctcttccaccgcctatcatgcaattgtottccttgacttctgaagattctgctgtttactactgtgctagatccacctactncggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccactgtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccgtttttccattsgctccatcctctaagtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccaccatgtccagctccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgaggacccagaggttaagttcaactggtacgttgacggtgttgaagucacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagactatciccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacattgctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgactgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgcalgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaaSEQ ID NO03(队轻链恒定区IgG1)agaaccgttgctgctccatccgttttcattttcccaccatccgacgaacaattgaagtctggtacagcttccgttgtttgtttgttgaacaacttctacccaagagaggctaaggttcagtggaaggttgacaacgctttgcaatccggtaactcccaagaatccgttactgagcaggattctaaggattccacttactccttgtcctccactttgacttgtccaaggctgattacgagaagcacaaggttcacgcttgtgaggttacacatcagggtttttcctccccagttactangtccttcaacagaggagagtgttaaSEQ ID NO04(队重链恒定区IgG1)tctactaagggaccatccgtttttccattggctccatcctctugtctacttccggtggtactgctgctttgggatgtttggttaaggactacttcccagagcctgttactgtttcttggaactccggtgctttgacttctggtgttcacactttcccagctgttttgcaatcttccggtttgtactccttgtcctccgttgttactgttccatcctcttccttgggtactcagacttacatctgtaacgttaaccacaagccatccaacactaaggttgacaagaaggctgagccaaagtcctgtgacaagacacatacttgtccatgtccagatccagaattgttgggtggtccatccgttttcttgttcccaccaaagccaaaggacactttgatgatctccagaactccagaggttacatgtgttgttgttgacgtttctcacgasgacccagaggttaagttcaactggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagagaggagcagtacaactccacttacagagttgtttccgttttgactgttttgcaccaggattggttgaacggaaaggagtacaagtgtaaggtttccaacaaggctttgccagctccaatcgaaaagactatctccaaggctaagggtcaaccaagagagccacaggtttacactttgccaccatccagagatgagttgactaagaaccaggtttccttgacttgtttggttaaaggattctacccatccgacangctgttgagtgggaatctaacggtcaaccagagaacaactacaagactactccaccagttttggattctgacggttccttcttcttgtactccaagttgacttgttgacaagtccagatggaacagggtaacgttttctcctgttccgttatgcatgaggctttgcacaaccactacactcaaaagtccttgtctttgtccccaggtaagtaa
SEQ ID NO05(CD20LF1)aggagtcgtattcaaatcgtcttgtctcaatccccagctattttgSEQ ID NO06(CD20LF2)tctgcttcccctggagagaaggtcaccatgacttgtagagcctctSEQ ID NO07(CD20LF3)tcctctgtctcttacattcactggttccagcaaaagccaggttccSEQ ID NO08(CD20LF4)tctccaaagccatggatctacgctacttccaacttggcttccggtSEQ ID NO09(CD20LF5)gttccagttagattctctggttctggttccggtacctcctactctSEQ ID NO10(CD20LF6)cttaccatctccagagttgaagccgaggacgctgctacttactacSEQ ID NO11(CD20LF7)tgtcagcaatggacttctaacccaccaactttcggtggtggtaccSEQ ID NO12(CD20LF8)aaattggagattaagagaactgttgctgctccatccSEQ ID NO13(CD20LR1)caacagttctcttaatctccaatttggtaccaccaccgaaagttgSEQ ID NO14(CD20LR2)gtgggttagaagtccattgctgacagtagtaagtagcagcgtcctSEQ ID NO15(CD20LR3)cggcttcaactctggagatggtaagagagtaggaggtaccggaacSEQ ID NO16(CD20LR4)agaaccagagaatctaactggaacaccggaagccaagttggaagSEQ ID NO17(CD20LR5)tagcgtagatccatggctttggagaggaacctggcttttgctggaSEQ ID NO18(CD20LR6)ccagtgaatgtaagagacagaggaagaggctctacaagtcatggSEQ ID NO19(CD20tR7)tgaccttctctccaggggaagcagacaaaatagctggggattgagSEQ ID NO20(CD20L/up)aggagtcgtattcaaatcgtcSEQ ID NO21(LfusionRTVAAPS/up)
agaactgttgctgctccatccSEQ ID NO22(LfusionRTVAAPS/lp)ggatggagcagcaacagttcSEQ ID NO23(CD20L/lp)ctggtaccttaacactctcctctgttgaagSEQ ID NO24(CD20HF1)aggagtcgtattcaagtccagttgcaacagcctggtgccgagttgSEQ ID NO25(CD20HF2)gtcaagccaggtgcttctgttaagatgtcctgtaaggcttctggtSEQ ID NO26(CD20HF3)tacactttcacctcctacaacatgcactgggtcaagcaaactccaSEQ ID NO27(CD20HF4)ggtagaggtttggagtggattggtgccatctacccaggtaacggtSEQ ID NO28(CD20HF5)gacacttcttacaaccaaaaattcaagggaaaggctactcttaccSEQ ID NO29(CD20HF6)gctgaataagtcctcttccaccgcctacatgcaattgtcttccttgSEQ ID NO30(CD20HF7)acttctgaagactctgctgtttactactgtgctagatccacctacSEQ ID NO31(CD20HF8)tacggtggagactggtacttcaacgtttggggtgctggtaccactSEQID NO32(CD20HF9)gtcaccgtttccgctgcttctactaagggaccatccSEQ ID NO33(CD20HR1)tagtagaagcagcggaaacggtgacagtggtaccagcaccccaaaSEQ ID NO34(CD20HR2)cgttgaagtaccagtctccaccgtagtaggtggatctagcacagSEQ ID NO35(CD20HR3)agtaaacagcagagtcttcagaagtcaaggaagacaattgcatgtSEQ ID NO36(CD20HR4)aggcggtggaagaggacttatcagcggtaagagtgcctttccctSEQ ID NO37(CD20HR5)tgaatttttggttgtaagaagtgtcaccgttacctgggtagatgg
SEQ ID NO38(CD20HR6)caccaatccactccaaacctctacctggagtttgcttgacccagtSEQ ID NO39(CD20HR7)gcatgttgtaggaggtgaaagtgtaaccagaagccttacaggacaSEQ ID NO40(CD20HR8)tcttaacagaagcacctggcttgaccaactcggcaccaggctgttSEQ ID NO41(CD20H/up)AggagtcgtattcaagtccagSEQ ID NO42 (HchainASTKGPs/up)gcttctactaagggaccatccSEQ ID NO43(HchainASTKGPs/lp)ggatggtcccttagtagaagcSEQ ID NO44(HFckpnl/lp)ctggtattacttacctggggacaaagacSEQ ID NO45(带有EcoRI的Kar2信号序列)gaattcgaaacgatgctgtcgttaaaaccatcttggctgactttggcggcattaatgtatgccatgctattggtcgtagtgccatttgctaaacctgttagagctSEQ ID NO46(P.BiPss/UP1-EcoRI)aattcgaaacgatgctgtctttgaagccatcttggcttactttggctgctttgatgtacgctatgcttttSEQ ID NO47(P.BiPss/LP1)ccaaagtaagccaagatggcttcaaagacagcatcgtttcgSEQ ID NO48(P.BiPss/UP2)ggttgttgttccatttgctaagccagttagagctSEQ ID NO49(P.BiPss/LP2)agctctaactggcttagcaaatggaacaacaaccaaaagcatagcgtacatcaaagcagSEQ ID NO50(GenBank#AF013576)gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagatcctctcaatctttggaaaactctaacggtaacactttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagattttctggtgttccagatagattttctggttctggttctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttactcatgttccatacacttttggtggtggtactactttggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtactgcttctgttgtttgtcttcttaacaacttctacccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaacaagattctaaggattctacttactctttgtcttctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtcttctccagttactaagtcctttaacagaggtgaatgttag
SEQ ID NO51(GenBank#AF013577)gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgttactggttactctattactactaactacaactggaactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatacaccccatctttgaagaacagagtttctattactagagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgctagattggattactggggtcaaggtacttctgttactgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtactgctgctttgggttgtttggttaaggattactttccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaatcttctggtttgtactctttgtcttctgttgttactgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttgataagagagttgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatcagttttcttgttcccaccaaaaccaaaggatacccttatgatttctagaactcctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgatggtgttgaagttcataatgctaagacaaagccaagagaagaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaatacaagtgtaaggtctccaacaaagctcttccagctccaattgagaaaaccatttccaaagctaaaggtcaaccaagagaaccacaagtttacaccttgccaccatccagagatgaactgactaagaaccaagtctctctgacttgtctggttaaaggtttctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctggattctgatggttccttcttcctttactctaagcttactgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactcagaagtctctttccctgtctccaggtaaataaSEQ ID NO52 mh285L-1 cggaattc-gatgctgttatgactcaaaacccattgtctttgcctgtttctcttggtgatgaagcttctatttcttgtagSEQ ID NO53 mh285L-2agaaccagttcaagaaagtgttaccgttagagttttccaaagattgagaggatctacaagaaatagaagcttcatSEQ ID NO54 mh285L-3actttcttgaactggttctttcagaagccaggtcaatctccacaattgttgatttacagagtttctaacagatttSEQ ID NO55 mh285L-4caaagtgaaatcagtaccagaaccagaaccagaaaatctatctggaacaccagaaaatctgttagaaactctgtaSEQ ID NO56 mh285L-5tctggtactgatttcactttgaagatttctagagttgaagctgaagatttgggtgtttacttctgtttgcaagttacSEQ ID NO57 mh285L-6caacagttctcttaatttccaaagtagtaccaccaccaaaagtgtatggaacatgagtaacttgcaaacagaagtaaSEQ ID NO58mh285L-7tggaaattaagagaactgttgctgctccatctgtcttcatctttccaccatctgatgaacaattgaagtctggtaSEQ ID NO59 mh285L-8tgaaccttagcttctcttgggtagaagttgttaagaagacaaacaacagaagcagtaccagacttcaattgttcat
SEQ ID NO60 mh285L-9cccaagagaagctaaggttcagtggaaggttgataacgctttgcaatctggtaactctcaagaatctgttactgaaSEQ ID NO61 mh285L-10ccttagacaaagtcaaagtagaagacaaagagtaagtagaatccttagaatcttgttcagtaacagattcttgagaSEQ ID NO62 mh285L-11ctactttgactttgtctaaggctgattacgaaaagcataaggtttacgcttgtgaagttactcatcaaggtttgtcSEQ ID NO63 mh285L-12ggggtaccctaacattcacctctgttaaaggacttagtaactggagaagacaaaccttgatgagtaacSEQ ID NO64 mh285H-1cggaattc-gatattcaattgcaacaatctggtccaggtttggttaagccatctcaatctttgtctttgacttgttctgSEQ ID NO65 mh285H-2ggaaattgtctaatccagttccagttgtagttagtagtaatagagtaaccagtaacagaacaagtcaaagacaaagSEQ ID NO66 mh285H-3aactggattagacaatttccaggtaacaagttggaatggatgggttacattagatacgatggtacttctgaatacSEQ ID NO67 mh285H-4attggttcatagaagtatctctagtaatagaaactctgttcttcaaagatggggtgtattcagaagtaccatcgtaSEQ ID NO68 mh285H-5gagatacttctatgaaccaattcttcttgagattgacttctgttactccagaagatactgctacttactactgtgcSEQ ID NO69 mh285H-6agtagaagcagaagaaacagtaacagaagtaccttgaccccagtaatccaatctagcacagtagtaagtagcagtaSEQ ID NO70mh285H-7ctgtttcttctgcttctactaagggtccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttctggtggtaSEQ ID NO71 mh285H-8gaaacagtaactggttctggaaagtaatccttaaccaaacaacccaaagcagcagtaccaccagaagtagactta
SEQID NO72 mh285H-9tccagaaccagttactgtttcttggaactctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagctgttttgcaaSEQ ID NO73 mh285H-10ccaaagaagaagatggaacagtaacaacagaagacaaagagtacaaaccagaagattgcaaaacagctggaaaagtSEQ ID NO74 mh285H-11ctgttccatcttcttctttgggtactcaaacttacatttgtaacgttaaccataagccatctaacactaaggttgaSEQ ID NO75 mh285H-12tgtatgagttttatcacaagattttggttcaactctcttatcaaccttagtgttagatggSEQ ID NO76Fc-15’gctgaaccaaaatcttgtgataaaactcatacatgtccaccatgtccagctcctgaacttctgggtggaccatcagtttt 3’SEQ IDNO77 Fc-25’atgtgacttcaggagttctagaaatcataagggtatcctttggttttggtggtgggaacaagaaaactgatggtccacccaga3’SEQ ID NO78Fc-35’ctagaacccctgaagtcacatgtgttgttgttgatgtttctcatgaagatcctgaagtcaagttcaactggtacgttgat3’SEQ ID NO79 Fc-45’taagtagagttgtattgttcttctcttggctttgtcttagcattatgaacttcaacaccatcaacgtaccagttgaactt3’SEQ ID NO80 Fc-55’agaacaatacaactctacttacagagttgtctctgttcttactgttctgcatcaagattggctgaatggtaaggaataca 3’SEQ ID NO81 Fc-65’agctttggaaatggttttctcaattggagctggaagagctttgttggagaccttacacttgtattccttaccattcagcc 3’SEQ ID NO82 Fc-75’gagaaaaccatttccaaagctaaggtcaaccaagagaaccacaagttttacaccttgccaccatccagagatgaactgac 3’SEQ ID NO83 Fc-85’cagcaatatcagatggatagaaacctttaaccagacaagtcagagagacttggttcttagtcagttcatctctggatggt3’
SEQ ID NO84 Fc-95’tctatccatctgatattgctgttgaatgggagtctaatggtcaaccagaaaacaactacaagactactcctcctgttctg 3tSEQ ID NO85Fc-105’tgccatctggacttatcaacagtaagcttagagtaaaggaagaaggaaccatcagaatccagaacaggaggagtagtctt 3’SEQ ID NO86Fc-115’tgttgataagtccagatggcaacaaggtaacgtcttctcatgttccgttatgcatgaagctttgcataaccattacactc 3’SEQ ID NO87 Fc-125’ttatttacctggagacagggaaagagacttctgagtgtaatggttatgcaaag 3’SEQ ID NO88Fc/LP55’ggggtaccttatttacctggagacagggaaagagacttct 3’SEQ ID NO89(人血清白蛋白，HSA)atgaagtgggtacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatgaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagSEQ ID NO90(凝血酶位点)ctcgagcccggcggcggcggcggccgcctggttcctcgtggcttcggtacc
序列表<110>GlycoFi，Inc.
Gerngross，Tillman U.
Li，HuijuanWildt，Stefan<120>主要含有GALGLCNACMAN5GLCNAC2糖形的免疫球蛋白<130>GF0018Y<140>PCT/US05/025663<141>2005-07-19<150>60/639,657<151>2004-12-23<150>60/639,698<151>2004-12-23<160>90<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>642<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的人/小鼠嵌合IgG1轻链序列<400>1caaatcgtct tgtctcaatc cccagctatt ttgtctgctt cccctggaga gaaggtcacc 60atgacttgta gagcctcttc ctctgtctct tacattcact ggttccagca aaagccaggt 120
tcctctccaa agccatggat ctacgctact tccaacttgg cttccggtgt tccagttaga 180ttctctggtt ctggttccgg tacctcctac tctcttacca tctccagagt tgaagccgag 240gacgctgcta cttactactg tcagcaatgg acttctaacc caccaacttt cggtggtggt 300accaaattgg agattaagag aactgttgct gctccatccg ttttcatttt cccaccatcc 360gacgaacaat tgaagtctgg tacagcttcc gttgtttgtt tgttgaacaa cttctaccca 420agagaggcta aggttcagtg gaaggttgac aacgctttgc aatccggtaa ctcccaagaa 480tccgttactg agcaggattc taaggattcc acttactcct tgtcctccac tttgactttg 540tccaaggctg attacgagaa gcacaaggtt tacgcttgtg aggttacaca tcagggtttg 600tcctccccag ttactaagtc cttcaacaga ggagagtgtt aa 642<210>2<211>1354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的人/小鼠嵌合IgG1重链序列<400>2caagtccagt tgcaacagcc tggtgccgag ttggtcaagc caggtgcttc tgttaagatg 60tcctgtaagg cttctggtta cactttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120ccaggtagag gtttggagtg gttggtgcca tctacccagg taacggtgac acttcttaca 180accaaaaatt caagggaaag gctactctta ccgctgataa gtcctcttcc accgcctaca 240tgcaattgtc ttccttgact tctgaagatt ctgctgttta ctactgtgct agatccacct 300actacggtgg agactggtac ttcaacgttt ggggtgctgg taccactgtc accgtttccg 360ctgcttctac taagggacca tccgtttttc cattggctcc atcctctaag tctacttccg 420gtggtactgc tgctttggga tgtttggtta aggactactt cccagagcct gttactgttt 480cttggaactc cggtgctttg acttctggtg ttcacacttt cccagctgtt ttgcaatctt 540ccggtttgta ctccttgtcc tccgttgtta ctgttccatc ctcttccttg ggtactcaga 600cttacatctg taacgttaac cacaagccat ccaacactaa ggttgacaag aaggctgagc 660caaagtcctg tgacaagaca catacttgtc caccatgtcc agctccagaa ttgttgggtg 720gtccatccgt tttcttgttc ccaccaaagc caaaggacac tttgatgatc tccagaactc 780cagaggttac atgtgttgtt gttgacgttt ctcacgagga cccagaggtt aagttcaact 840ggtacgttga cggtgttgaa gttcacaacg ctaagactaa gccaagagag gagcagtaca 900actccactta cagagttgtt tccgttttga ctgttttgca ccaggattgg ttgaacggaa 960aggagtacaa gtgtaaggtt tccaacaagg ctttgccagc tccaatcgaa aagactatct 1020ccaaggctaa gggtcaacca agagagccac aggtttacac tttgccacca tccagagatg 1080
agttgactaa gaaccaggtt tccttgactt gtttggttaa aggattctac ccatccgaca 1140ttgctgttga gtgggaatct aacggtcaac cagagaacaa ctacaagact actccaccag 1200ttttggattc tgacggttcc ttcttcttgt actccaagtt gactgttgac aagtccagat 1260ggaacagggt aacgttttct cctgttccgt tatgcatgag gctttgcaca accactacac 1320tcaaaagtcc ttgtctttgt ccccaggtaa gtaa 1354<210>3<211>324<212>DNA<213>Homo Sapiens<400>3agaactgttg ctgctccatc cgttttcatt ttcccaccat ccgacgaaca attgaagtct 60ggtacagctt ccgttgtttg tttgttgaac aacttctacc caagagaggc taaggttcag 120tggaaggttg acaacgcttt gcaatccggt aactcccaag aatccgttac tgagcaggat 180tctaaggatt ccacttactc cttgtcctcc actttgactt tgtccaaggc tgattacgag 240aagcacaagg tttacgcttg tgaggttaca catcagggtt tgtcctcccc agttactaag 300tccttcaaca gaggagagtg ttaa 324<210>4<211>989<212>DNA<213>Homo Sapiens<400>4tctactaagg gaccatccgt ttttccattg gctccatcct ctaagtctac ttccggtggt 60actgctgctt tgggatgttt ggttaaggac tacttcccag agcctgttac tgtttcttgg 120aactccggtg ctttgacttc tggtgttcac actttcccag ctgttttgca atcttccggt 180ttgtactcct tgtcctccgt tgttactgtt ccatcctctt ccttgggtac tcagacttac 240atctgtaacg ttaaccacaa gccatccaac actaaggttg acaagaaggc tgagccaaag 300tcctgtgaca agacacatac ttgtccacca tgtccagctc cagaattgtt gggtggtcca 360tccgttttct tgttcccacc aaagccaaag gacactttga tgatctccag aactccagag 420gttacatgtg ttgttgttga cgtttctcac gaggacccag aggttaagtt caactggtac 480gttgacggtg ttgaagttca caacgctaag actaagccaa gagaggagca gtacaactcc 540acttacagag ttgtttccgt tttgactgtt ttgcaccagg attggttgaa cggaaaggag 600tacaagtgta aggtttccaa caaggctttg ccagctccaa tcgaaaagac tatctccaag 660gctaagggtc aaccaagaga gccacaggtt tacactttgc caccatccag agatgagttg 720
actaagaacc aggtttcctt gacttgtttg gttaaaggat tctacccatc cgacattgct 780gttgagtggg aatctaacgg tcaaccagag aacaactaca agactactcc accagttttg 840gattctgacg gttccttctt cttgtactcc aagttgactg ttgacaagtc cagatggaac 900agggtaacgt tttctcctgt tccgttatgc atgaggcttt gcacaaccac tacactcaaa 960agtccttgtc tttgtcccca ggtaagtaa 989<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>5aggagtcgta ttcaaatcgt cttgtctcaa tccccagctattttg 45<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>6tctgcttccc ctggagagaa ggtcaccatg acttgtagag cctct 45<210>7<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7
tcctctgtct cttacattca ctggttccag caaaagccag gttcc45<210>8<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8tctccaaagc catggatcta cgctacttcc aacttggctt ccggt45<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>9gttccagtta gattctctgg ttctggttcc ggtacctcct actct45<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>10cttaccatct ccagagttga agccgaggac gctgctactt actac 45<210>11<211>45
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>11tgtcagcaat ggacttctaa cccaccaact ttcggtggtg gtacc45<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>12aaattggaga ttaagagaac tgttgctgct ccatcc 36<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>13caacagttct cttaatctcc aatttggtac caccaccgaa agttg45<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>14gtgggttaga agtccattgc tgacagtagt aagtagcagc gtcct 45<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>15cggcttcaac tctggagatg gtaagagagt aggaggtacc ggaac 45<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>16agaaccagag aatctaactg gaacaccgga agccaagttg gaag44<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>17
tagcgtagat ccatggcttt ggagaggaac ctggcttttg ctgga45<210>18<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>18ccagtgaatg taagagacag aggaagaggc tctacaagtc atgg44<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>19tgaccttctc tccaggggaa gcagacaaaa tagctgggga ttgag 45<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>20aggagtcgta ttcaaatcgt c 21<210>21<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>21agaactgttg ctgctccatc c 21<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>22ggatggagca gcaacagttc 20<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>23ctggtacctt aacactctcc tctgttgaag 30<210>24<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>24aggagtcgta ttcaagtcca gttgcaacag cctggtgccg agttg45<210>25<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>25gtcaagccag gtgcttctgt taagatgtcc tgtaaggctt ctggt45<210>26<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>26tacactttca cctcctacaa catgcactgg gtcaagcaaa ctcca45<210>27<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>27
ggtagaggtt tggagtggat tggtgccatc tacccaggta acggt45<210>28<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>28gacacttctt acaaccaaaa attcaaggga aaggctactc ttacc45<210>29<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>29gctgataagt cctcttccac cgcctacatg caattgtctt ccttg45<210>30<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>30acttctgaag actctgctgt ttactactgt gctagatcca cctac45<210>31<211>45
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>31tacggtggag actggtacttcaacgtttgg ggtgctggta ccact45<210>32<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>32gtcaccgttt ccgctgcttc tactaaggga ccatcc 36<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>33tagtagaagc agcggaaacg gtgacagtgg taccagcacc ccaaa45<210>34<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>34cgttgaagta ccagtctcca ccgtagtagg tggatctagc acag 44<210>35<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>35agtaaacagc agagtcttca gaagtcaagg aagacaattg catg 45<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>36aggcggtgga agaggactta tcagcggtaa gagtagcctt tccct 45<210>37<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>37
tgaatttttg gttgtaagaa gtgtcaccgt tacctgggta gatgg45<210>38<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>38caccaatcca ctccaaacctctacctggag tttgcttgac ccagt 45<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>39gcatgttgta ggaggtgaaa gtgtaaccag aagccttaca ggaca45<210>40<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>40tcttaacaga agcacctggc ttgaccaact cggcaccagg ctgtt45<210>41<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>41aggagtcgta ttcaagtcca g 21<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>42gcttctacta agggaccatc c 21<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>43ggatggtccc ttagtagaag c21<210>44<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>44ctggtattac ttacctgggg acaaagac 28<210>45<211>105<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>45gaattcgaaa cgatgctgtc gttaaaacca tcttggctga ctttggcggc attaatgtat 60gccatgctat tggtcgtagt gccatttgct aaacctgtta gagct 105<210>46<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>46aattcgaaac gatgctgtct ttgaagccat cttggcttac tttggctgct ttgatgtacg 60ctatgctttt70<210>47<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>47ccaaagtaag ccaagatggc ttcaaagaca gcatcgtttc g 41<210>48<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>48ggttgttgtt ccatttgcta agccagttag agct 34<210>49<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>49agctctaact ggcttagcaa atggaacaac aaccaaaagc atagcgtaca tcaaagcag 59<210>50<211>660<212>DNA<213>Mus Musculus<400>50gatgctgtta tgactcaaaa cccattgtct ttgcctgttt ctcttggtga tgaagcttct 60atttcttgta gatcctctca atctttggaa aactctaacg gtaacacttt cttgaactgg 120ttctttcaga agccaggtca atctccacaa ttgttgattt acagagtttc taacagattt 180tctggtgttc cagatagatt ttctggttct ggttctggta ctgatttcac tttgaagatt 240tctagagttg aagctgaaga tttgggtgtt tacttctgtt tgcaagttac tcatgttcca 300
tacacttttg gtggtggtac tactttggaa attaagagaa ctgttgctgc tccatctgtc 360ttcatctttc caccatctga tgaacaattg aagtctggta ctgcttctgt tgtttgtctt 420cttaacaact tctacccaag agaagctaag gttcagtgga aggttgataa cgctttgcaa 480tctggtaact ctcaagaatc tgttactgaa caagattcta aggattctac ttactctttg 540tcttctactt tgactttgtc taaggctgat tacgaaaagc ataaggttta cgcttgtgaa 600gttactcatc aaggtttgtc ttctccagtt actaagtcct ttaacagagg tgaatgttag 660<210>51<211>1329<212>DNA<213>Mus Musculus<400>51gatattcaat tgcaacaatc tggtccaggt ttggttaagc catctcaatc tttgtctttg 60acttgttctg ttactggtta ctctattact actaactaca actggaactg gattagacaa 120tttccaggta acaagttgga atggatgggt tacattagat acgatggtac ttctgaatac 180accccatctt tgaagaacag agtttctatt actagagata cttctatgaa ccaattcttc 240ttgagattga cttctgttac tccagaagat actgctactt actactgtgc tagattggat 300tactggggtc aaggtacttc tgttactgtt tcttctgctt ctactaaggg tccatctgtt 360tttccacttg ctccatcttc taagtctact tctggtggta ctgctgcttt gggttgtttg 420gttaaggatt actttccaga accagttact gtttcttgga actctggtgc tttgacttct 480ggtgttcata cttttccagc tgttttgcaa tcttctggtt tgtactcttt gtcttctgtt 540gttactgttc catcttcttc tttgggtact caaacttaca tttgtaacgt taaccataag 600ccatctaaca ctaaggttga taagagagtt gaaccaaaat cttgtgataa aactcataca 660tgtccaccat gtccagctcc tgaacttctg ggtggaccat cagttttctt gttcccacca 720aaaccaaagg atacccttat gatttctaga actcctgaag tcacatgtgt tgttgttgat 780gtttctcatg aagatcctga agtcaagttc aactggtacg ttgatggtgt tgaagttcat 840aatgctaaga caaagccaag agaagaacaa tacaactcta cttacagagt tgtctctgtt 900cttactgttc tgcatcaaga ttggctgaat ggtaaggaat acaagtgtaa ggtctccaac 960aaagctcttc cagctccaat tgagaaaacc atttccaaag ctaaaggtca accaagagaa 1020ccacaagttt acaccttgcc accatccaga gatgaactga ctaagaacca agtctctctg 1080acttgtctgg ttaaaggttt ctatccatct gatattgctg ttgaatggga gtctaatggt 1140caaccagaaa acaactacaa gactactcct cctgttctgg attctgatgg ttccttcttc 1200ctttactcta agcttactgt tgataagtcc agatggcaac aaggtaacgt cttctcatgt 1260tccgttatgc atgaagcttt gcataaccat tacactcaga agtctctttc cctgtctcca 1320ggtaaataa 1329
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<223>合成的寡核苷酸<400>52cggaattcga tgctgttatg actcaaaacc cattgtcttt gcctgtttct cttggtgatg 60aagcttctat ttcttgtag 79<210>53<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成的寡核苷酸<400>69agtagaagca gaagaaacag taacagaagt accttgaccc cagtaatcca atctagcaca 60gtagtaagta gcagta 76<210>70<211>75<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>70ctgtttcttc tgcttctact aagggtccat ctgtttttcc acttgctcca tcttctaagt 60ctacttctgg tggta 75<210>71<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>71gaaacagtaa ctggttctgg aaagtaatcc ttaaccaaac aacccaaagc agcagtacca 60ccagaagtag actta 75<210>72<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>72tccagaacca gttactgttt cttggaactc tggtgctttg acttctggtg ttcatacttt 60tccagctgtt ttgcaa 76<210>73<211>76<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>73ccaaagaaga agatggaaca gtaacaacag aagacaaaga gtacaaacca gaagattgca 60aaacagctgg aaaagt 76<210>74<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>74ctgttccatc ttcttctttg ggtactcaaa cttacatttg taacgttaac cataagccat 60ctaacactaa ggttga 76<210>75<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>75tgtatgagtt ttatcacaag attttggttc aactctctta tcaaccttag tgttagatgg 60<210>76<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>76gctgaaccaa aatcttgtga taaaactcatacatgtccac catgtccagc tcctgaactt 60ctgggtggac catcagtttt 80<210>77<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>77atgtgacttc aggagttcta gaaatcataa gggtatcctt tggttttggt gggaacaaga 60aaactgatgg tccacccaga 80<210>78<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>78ctagaacccc tgaagtcaca tgtgttgttg ttgatgtttc tcatgaagat cctgaagtca 60agttcaactg gtacgttgat 80<210>79<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>79taagtagagt tgtattgttc ttctcttggc tttgtcttag cattatgaac ttcaacacca 60tcaacgtacc agttgaactt 80<210>80<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>80agaacaatac aactctacttacagagttgt ctctgttcttactgttctgc atcaagattg 60gctgaatggt aaggaataca 80<210>81<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>81agctttggaa atggttttct caattggagctggaagagct ttgttggaga ccttacactt 60gtattcctta ccattcagcc80<210>82<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>82gagaaaacca tttccaaagc taaaggtcaa ccaagagaac cacaagttta caccttgcca 60ccatccagag atgaactgac 80<210>83<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>83cagcaatatc agatggatag aaacctttaa ccagacaagt cagagagact tggttcttag 60tcagttcatc tctggatggt 80<210>84<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>84tctatccatc tgatattgct gttgaatggg agtctaatggtcaaccagaa aacaactaca 60agactactcc tcctgttctg 80<210>85<211>80<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>85tgccatctgg acttatcaac agtaagctta gagtaaagga agaaggaacc atcagaatcc 60agaacaggag gagtagtctt 80<210>86<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>86tgttgataag tccagatggc aacaaggtaa cgtcttctca tgttccgtta tgcatgaagc 60tttgcataac cattacactc 80<210>87<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>87ttatttacct ggagacaggg aaagagactt ctgagtgtaa tggttatgca aag 53<210>88<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>88ggggtacctt atttacctgg agacagggaa agagacttct40<210>89<211>1423<212>DNA<213>Homo Sapiens<400>89atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aag1423
<210>90<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>90ctcgagcccg gcggcggcgg cggccgcctg gttcctcgtg gcttcggtac c51
权利要求书(按照条约第19条的修改)1.一种含多种免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中超过百分之50摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
2.权利要求1的组合物，其中超过百分之75摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
3.权利要求1的组合物，其中超过百分之90摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
4.权利要求1的组合物，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的水平至少比所述多种N-聚糖中占第二优势的N-聚糖结构高出百分之5到50摩尔百分数。
5.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出与FcγRIIb受体的结合亲和性降低。
6.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出与FcγRIII受体的结合亲和性增加。
7.权利要求6的组合物，其中所述FcγRIII受体是一种FcγRIIIa受体。
8.权利要求6的组合物，其中所述FcγRIII受体是一种FcγRIIIb受体。
9.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出具有增加的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)活性。
10.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
11.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
12.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白与选自生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原结合。
13.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4区的Fc区。
14.一种药物组合物，含有权利要求1的组合物以及药学上可接受的载体。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
16.权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
17.权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有与选自生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原相结合的抗体。
18.权利要求14的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4区的Fc区。
19.一种含有权利要求1中组合物的试剂盒。
20.一种含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主细胞，改造或筛选所述真核宿主细胞使其表达所述免疫球蛋白或其片段，从而生产含有多种免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成.
21.权利要求20的宿主细胞，其中宿主细胞是低等真核宿主细胞。
22.一种在真核宿主细胞中生产含有多种免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中在所述多种N-聚糖中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
23.权利要求22的方法，其中宿主细胞是低等真核宿主细胞。
权利要求
1.一种含多种免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
2.权利要求1的组合物，其中超过百分之50摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
3.权利要求1的组合物，其中超过百分之75摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
4.权利要求1的组合物，其中超过百分之90摩尔百分数的所述多种N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
5.权利要求1的组合物，其中所述GalGlcNAcMan5GlcNAc2N-聚糖的水平至少比所述多种N-聚糖中占第二优势的N-聚糖结构高出百分之5到50摩尔百分数。
6.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出与FcγRIIb受体的结合亲和性降低。
7.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出与FcγRIII受体的结合亲和性增加。
8.权利要求7中的组合物，其中所述FcγRIII受体是一种FcγRIIIa受体。
9.权利要求7中的组合物，其中所述FcγRIII受体是一种FcγRIIIb受体。
10.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白显示出具有增加的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)活性。
11.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
12.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
13.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白与选自生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原结合。
14.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区的Fc区。
15.一种药物组合物，含有权利要求1-14任何一条中的组合物以及药学上可接受的载体。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白基本上不含海藻糖。
17.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白缺少海藻糖。
18.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有与选自生长因子、FGFR、EGFR、VEGF、白细胞抗原、CD20、CD33、细胞因子、TNF-α及TNF-β的抗原相结合的抗体。
19.权利要求15的药物组合物，其中所述免疫球蛋白含有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区的Fc区。
20.一种含有权利要求1中组合物的试剂盒。
21.一种含有编码免疫球蛋白或其片段的外源基因的真核宿主细胞，改造或筛选所述真核宿主细胞使其表达所述免疫球蛋白或其片段，从而生产含有多种免疫球蛋白的组合物，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
22.权利要求21的宿主细胞，其中宿主细胞是低等真核宿主细胞。
23.一种在真核宿主细胞中生产含有多种免疫球蛋白的组合物的方法，每个免疫球蛋白至少含一个与其连接的N-聚糖，因此所述组合物含多种N-聚糖，其中在所述多种N-聚糖中占有优势的N-聚糖主要由GalGlcNAcMan5GlcNAc2组成。
24.权利要求23的方法，其中宿主细胞是低等真核宿主细胞。
全文摘要
本发明涉及在免疫球蛋白糖蛋白中具有占有优势的可提供特定效应功能的N－聚糖结构的免疫球蛋白糖蛋白组合物。另外，本发明涉及含有具有特别富集的N－聚糖结构的抗体的药物组合物，其中所述N－聚糖结构为GalGlcNAcMan
文档编号A61K39/395GK101087806SQ200580044453
公开日2007年12月12日 申请日期2005年7月19日 优先权日2004年12月23日
发明者T·U·格恩格罗斯, H·李, S·维尔德特 申请人:格利科菲公司