专利名称：一种糜胰蛋白酶的制备方法
技术领域：
本发明公开了一种糜胰蛋白酶(Trsnsin-Chsmotrypsin)的制备方法，特别是，公开了一种糜胰蛋白酶及其透析与亲和层析相结合的制备方法。
背景技术：
糜胰蛋白酶(Trsnsin-Chsmotrypsin)是从牛、猪胰分离出来的一种蛋白水解酶。1963年我国科学家首先从猪胰中获得了糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合晶体，命名为糜胰蛋白酶，1976年又研制成功注射用结晶糜胰蛋白酶，是我国独创的酶制剂。糜胰蛋白酶具有糜蛋白酶和胰蛋白酶两种酶协同水解蛋白质肽键的作用。其药理作用与从牛胰中制取的胰蛋白酶α-糜蛋白酶基本相同。比单独使用一种酶的效果更好，适用范围更广，对各种炎症、炎性水肿、粘连、溃疡及血栓等均有较好疗效。其具体作用有1、糜胰蛋白酶具有很好的抗炎消肿作用，促进局部血凝块的溶解，使血液和体液流通流畅。2、糜胰蛋白酶能分解粘稠的粘液和粘蛋白，有助于痰液液化，易于咳出。3、糜胰蛋白酶能使细胞通透性增加，与抗癌药及抗生素合用时可以增加药效。在临床上应用非常广泛，主要用于外科的手术或外伤后的炎症、炎性水肿、血肿、粘连、溃疡等；胸科的脓胸、血胸、术后咳痰困难，肺不张等；内科的慢性支气管炎、支气管哮喘等；妇产科的宫颈炎、输卵管炎、盆腔炎等；眼科及五官科的角膜炎、化脓性中耳炎等疾病的治疗。
本发明产品采用清真宰牲场的牛胰脏为基础原料，适合于在中东及穆斯林国家销售及使用，为穆斯林国家及世界各国医药界十分需求的制品。
本发明在资料分析和发明者以往丰富的工作经验的基础上，广泛的研究了各种制造胰蛋白酶和糜蛋白酶的工艺，结合透析与亲和层析等新技术，现采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、乙醇醇析的产品工艺。该工艺路线优点是操作方便、产品活力高。糜胰蛋白酶和弹性酶、胰酶三种酶分子的三维结构很相似，而且它们的活性部位丝氨酸附近的几个氨基酸顺序也是完全一样的。但是由于它们与底物结合的部位在结构上存在差异，从而导致它们在催化功能的专一性上有较大差异。由于这些酶分子在结构上及其他很多性质上的相似之处，使得传统的一些分离、纯化技术难以达到十分满意的效果，制剂中往往混杂有彼此的组分而难以除净。只是在采用了透析与亲和层析技术以后，才大大提高了分离纯化的效果。
发明内容
本发明的目的是提供了一种糜胰蛋白酶。在工艺技术上，克服了传统技术对糜胰蛋白酶和弹性酶、胰酶三者的分离、纯化效果差、制剂中往往混杂有彼此的组分而难以除净的困难。本发明通过常规原料，采用透析与亲和层析相结合的方法，分离出具有较高生物活性的糜胰蛋白酶。本发明在原料选择上，不采用猪胰等非清真原料，而是采用源于清真宰牲场的牛胰为主要原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道；并且采用透析与亲和层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高。
——本发明是这样实现的本发明公开了一种糜胰蛋白酶，蛋白酶活力≥2500U/mg，生物活性更强，对各种炎症、炎性水肿、粘连、溃疡及血栓等均有更好的疗效。本发明在原料选择上，不采用猪胰等非清真原料，而是采用源于清真宰牲场的牛胰为主要原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道；并且采用透析与亲和层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高。
本发明公开的一种糜胰蛋白酶的制备方法，依次包括如下步骤1取清真宰牲场的新鲜或冷冻牛胰，去除脂肪杂物绞碎，加硫酸溶液，保温搅拌提取，溶液放置过夜，次日用双层纱布过滤，滤饼用等体积的冷硫酸再提取一次，合并滤液。
2在不断搅拌下，逐渐加入工业品硫酸铵，并加入少量活性白土助滤，放置12h后过滤。滤液再加硫酸铵，放置12h后过滤，得粗制滤饼。
3将此滤饼溶于冷蒸馏水中，用分析纯硫酸铵按上述步骤重复两次，取沉淀部分，得粗制滤饼。
4将上述粗制滤饼溶于冷蒸馏水中，在低温下用醋酸缓冲液透析，透析液过滤，清液加硫酸铵，沉淀，真空抽滤，得透析滤饼。
5滤饼溶于冷蒸馏水中，调pH，加硫酸铵，放置3～5h后，用活性碳助滤，得澄清溶液为亲和层析样品。
6将固定化卵粘蛋白装柱，用Tris-盐酸缓冲液平衡。上样完毕，用Tris-盐酸缓冲平衡液淋洗。然后用甲酸钠-氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱峰。
7在低温下缓慢加入无水乙醇使，沉淀物真空过滤，丙酮脱水，真空干燥，得注射用结晶糜胰蛋白酶原料。
8成品取样进行全项检测。
本发明以清真的牛胰脏为主要原料，在深入的资料分析和发明者以往丰富工作经验的基础上，广泛的研究了各种制造胰蛋白酶和糜蛋白酶的工艺，结合透析与亲和层析等新技术，现采用低温酸提、梯度盐析、冰水透析、亲和层析、乙醇醇析产品的工艺。该工艺路线优点是操作方便、产品活力高。
工艺路线牛胰脏→硫酸溶液浸取→一次透析→二次透析→活性炭吸附→亲和层析→乙醇醇析→无菌过滤、脱水→真空干燥→糜胰蛋白酶精品(二)工艺过程(按以下次序进行)1取清真宰牲场的新鲜或冷冻牛胰，去除脂肪杂物绞碎，加2倍体积的0.125mol/L硫酸溶液，保温10℃以下，搅拌提取1h，溶液pH约为3.0，于5℃放置过夜，次日用双层纱布过滤，滤饼用等体积0.125mol/L的冷硫酸再提取一次，合并滤液。
2在不断搅拌下，逐渐加入工业品硫酸铵至0.25饱和度，并加入少量活性白土助滤，0～5℃放置12h后过滤。滤液再加硫酸铵至0.65饱和度，0～5℃放置12h后过滤，得粗制滤饼。
3将此滤饼溶于5倍体积冷蒸馏水中，用分析纯硫酸铵按上述步骤重复两次，取0.25～0.65饱和度沉淀部分，得粗制滤饼。
4将上述粗制滤饼溶于3倍冷蒸馏水中，在低温下用0.01mol/L pH5.5的醋酸缓冲液透析，透析液过滤，清液加硫酸铵至0.65饱和度，沉淀，真空抽滤，得透析滤饼。
5滤饼溶于3倍量的冷蒸馏水中，调pH3.0～3.5，加硫酸铵至0.25饱和度，室温放置3～5h后，用0.5％活性碳助滤，得澄清溶液为亲和层析样品。
6将固定化卵粘蛋白装柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲液平衡。上样液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上样完毕，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲平衡液淋洗，直至280在0.02为止。然后用0.1mol/L甲酸钠-0.5mol/L氯化钠pH2.5溶液进行洗脱，流速控制在1.0cm/min，收集洗脱峰。
7在低温下缓慢加入无水乙醇使乙醇浓度达70％，沉淀物真空过滤，丙酮脱水3次，真空干燥，得注射用结晶糜胰蛋白酶原料。
8成品取样进行全项检测。
本发明采用源于清真宰牲场的牛胰为主要原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道；并且采用透析与亲和层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高，生物活性更强，对各种炎症、炎性水肿、粘连、溃疡及血栓等均有更好的疗效。
糜胰蛋白酶是一类很有前途的生化药物，具有糜蛋白酶和胰蛋白酶两种酶协同水解蛋白质肽键的作用。其药理作用与从牛胰中制取的胰蛋白酶α-糜蛋白酶基本相同。比单独使用一种酶的效果更好，适用范围更广。
实际例1.
取清真宰牲场的新鲜或冷冻牛胰160Kg，去除脂肪杂物绞碎，加378L的0.125mol/L硫酸溶液，保温10℃以下，搅拌提取1h，溶液pH约为3.0，于5℃放置过夜，次日用双层纱布过滤，滤饼用0.125mol/L的冷硫酸130L再提取一次，合并滤液。在不断搅拌下，逐渐加入工业品硫酸铵至0.25饱和度，并加入少量活性白土助滤，0～5℃放置12h后过滤。滤液再加硫酸铵至0.65饱和度，0～5℃放置12h后过滤，得粗制滤饼。将此滤饼溶于8L冷蒸馏水中，用分析纯硫酸铵按上述步骤重复两次，取0.25～0.65饱和度沉淀部分，得粗制滤饼。将上述粗制滤饼溶于3.2L冷蒸馏水中，在低温下用0.01mol/L pH5.5的醋酸缓冲液透析，透析液过滤，清液加硫酸铵至0.65饱和度，沉淀，真空抽滤，得透析滤饼。滤饼溶于2.1L的冷蒸馏水中，调pH3.0～3.5，加硫酸铵至0.25饱和度，室温放置3～5h后，用11g活性碳助滤，得澄清溶液1950ml为亲和层析样品。将固定化卵粘蛋白装柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲液平衡。上样液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上样完毕，用0.1mol/L pH7.5T的Tris-盐酸缓冲平衡液淋洗，直至280在0.02以下为止。然后用0.1mol/L甲酸钠0.5mol/L氯化钠pH2.5溶液进行洗脱，流速控制在1.0cm/min，收集洗脱峰。在低温下缓慢加入无水乙醇13.6L(乙醇浓度70％)，沉淀物真空过滤，丙酮脱水3次，真空干燥，得注射用结晶糜胰蛋白酶622g。成品取样进行全项检测(蛋白酶活力3050U/mg)。
实际例2.
取清真宰牲场的新鲜或冷冻牛胰140Kg，去除脂肪杂物绞碎，加333L的0.125mol/L硫酸溶液，保温10℃以下，搅拌提取1h，溶液pH约为3.0，于5℃放置过夜，次日用双层纱布过滤，滤饼用114L冷的0.125mol/L硫酸再提取一次，合并滤液。在不断搅拌下，逐渐加入工业品硫酸铵至0.25饱和度，并加入少量活性白土助滤，0～5℃放置12h后过滤。滤液再加硫酸铵至0.65饱和度，0～5℃放置12h后过滤，得粗制滤饼。将此滤饼溶于7L冷蒸馏水中，用分析纯硫酸铵按上述步骤重复两次，取0.25～0.65饱和度沉淀部分，得粗制滤饼。将上述粗制滤饼溶于2.8L冷蒸馏水中，在低温下用0.01mol/L pH5.5的醋酸缓冲液透析，透析液过滤，清液加硫酸铵至0.65饱和度，沉淀，真空抽滤，得透析滤饼。滤饼溶于1.85L的冷蒸馏水中，调pH3.0～3.5，加硫酸铵至0.25饱和度，室温放置3～5h后，用9.4g活性碳助滤，得澄清溶液1720ml为亲和层析样品。将固定化卵粘蛋白装柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲液平衡。上样液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上样完毕，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲平衡液淋洗，直至280在0.02以下为止。然后用0.1mol/L甲酸钠-0.5mol/L氯化钠pH2.5溶液进行洗脱，流速控制在1.0cm/min，收集洗脱峰。在低温下缓慢加入无水乙醇12L(乙醇浓度70％)，沉淀物真空过滤，丙酮脱水3次，真空干燥，得注射用结晶糜胰蛋白酶551g。成品取样进行全项检测(蛋白酶活力2930U/mg)。
权利要求
1.一种糜胰蛋白酶，其特征在于其蛋白酶活力≥2500U/mg，具有糜蛋白酶和胰蛋白酶两种酶协同水解蛋白质肽键的作用；比单独使用一种酶的效果更好，适用范围更广，生物活性更强，对各种炎症、炎性水肿、粘连、溃疡及血栓等均有更好的疗效。
2.本发明还公开了一种糜胰蛋白酶的透析与亲和层析相结合的制备方法，依次包括如下步骤1取清真宰牲场的新鲜或冷冻牛胰，去除脂肪杂物绞碎，加2倍体积的0.125mol/L硫酸溶液，保温10℃以下，搅拌提取1h，溶液pH约为3.0，于5℃放置过夜，次日用双层纱布过滤，滤饼用等体积0.125mol/L的冷硫酸再提取一次，合并滤液。2在不断搅拌下，逐渐加入工业品硫酸铵至0.25饱和度，并加入少量活性白土助滤，0～5℃放置12小时后过滤。滤液再加硫酸铵至0.65饱和度，0～5℃放置12小时后过滤，得粗制滤饼。3将此滤饼溶于5倍体积冷蒸馏水中，用分析纯硫酸铵按上述步骤重复两次，取0.25～0.65饱和度沉淀部分，得粗制滤饼。4将上述粗制滤饼溶于3倍冷蒸馏水中，在低温下用0.01mol/L pH5.5的醋酸缓冲液透析，透析液过滤，清液加硫酸铵至0.65饱和度，沉淀真空抽滤，得透析滤饼。5滤饼溶于3倍量的冷蒸馏水中，调pH3.0～3.5，加硫酸铵至0.25饱和度，室温放置3～5h后，用0.5％活性碳助滤，得澄清溶液为亲和层析样品。6将固定化卵粘蛋白装柱，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲液平衡。上样液流速控制在1.5cm/min上柱吸附。上样完毕，用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲液淋洗，直至280在0.02为止。然后用0.1mol/L甲酸钠-0.5mol/L氯化钠pH2.5溶液进行洗脱，流速控制在1.0cm/min，收集洗脱峰。7在低温下缓慢加入无水乙醇使乙醇浓度达70％，沉淀物真空过滤，丙酮脱水3次，真空干燥，得注射用结晶糜胰蛋白酶原料。8成品取样进行全项检测。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，选用清真宰牲场的牛胰为主要原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤23中采用工业硫酸铵和分析纯硫酸铵在0.25～0.65饱和度盐析，节省了硫酸铵的原料成本，同时又取得了较好的分离纯化效果。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中在低温下用0.01mol/L、pH5.5的醋酸缓冲液透析，既能很好的保护糜胰蛋白酶的活性，又达到了理想的分离效果。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6中采用固定化卵粘蛋白装柱，能够大大延长卵粘蛋白的使用寿命，且具有更好的吸附层析分离效果。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6中用0.1mol/L pH7.5的Tris-盐酸缓冲平衡液淋洗，能够很好的保护产品活性，又能达到快速高效的洗脱效果。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所得糜胰蛋白酶为无菌、无内毒素，酶活力≥2500U/mg，可广泛用于医药、化工和生物工程等行业的酶制剂。
全文摘要
本发明公开了一种糜胰蛋白酶，蛋白酶活力≥2500U/mg，具有糜蛋白酶和胰蛋白酶两种酶协同水解蛋白质肽键的作用。其药理作用与从牛胰中制取的胰蛋白酶α－糜蛋白酶基本相同。比单独使用一种酶的效果更好，适用范围更广，生物活性更强，对各种炎症、炎性水肿、粘连、溃疡及血栓等均有更好的疗效。本发明在原料选择上，不采用猪胰等非清真原料，而是采用源于清真宰牲场的牛胰为主要原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道；并且采用透析与亲和层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高。
文档编号A61K38/43GK1807612SQ20061002358
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者苏翰, 苏有录, 唐甜, 周钰, 韩彬 申请人:上海阿敏生物技术有限公司