专利名称：一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学中的肿瘤治疗学，涉及肿瘤超声治疗领域中的一种新型治疗型超声微泡，特别涉及其组成成分和制备方法。
背景技术：
随着对微泡超声造影剂的深入研究，其潜在的非创伤性治疗作用引人注目，主要表现在以下两方面。首先，各种微泡(尤其是脂膜微泡，其结构类似脂质体)是一种良好的药物载体，容易与基因、蛋白类或者脂溶性药物结合，如Unger等用脂质微泡包裹携带抗肿瘤药物紫杉醇(Unger EC，et al.InvestRadiol，1998，33886-892)、Porter等用白蛋白微泡PESDA携带反义寡核酐酸等(Tsutsui JM，Cardiovascular Ultrasound 2004，223)。用于治疗的超声微泡有多种类型，根据治疗的目的不同所携带的药物不同。其次，微泡作为一种十分有效的空化核，容易诱导超声空化发生，空化发生在生物体内可以产生“声孔效应”，引起邻近细胞被“超声打孔”，导致细胞膜通透性增高，利于药物释放。当组织血管被高浓度微泡灌注时，空化核密度大量增加，空化阈值降低，低能量超声作用也可能引起强烈的空化效应，导致微小血管机械性破裂出血以及血栓形成。
利用超声能量非创伤性治疗肿瘤一直是业界追求的目标。用物理方法阻断肿瘤微循环的研究工作前景诱人，它主要利用超声波与微泡相互作用所产生的空化效应机械性损伤血管内皮细胞，使基底膜暴露，从而启动内源性凝血系统，导致肿瘤微循环栓塞，阻断肿瘤血供。与正常微血管不同，肿瘤微血管生长迅速导致结构紊乱，表现为管壁缺乏肌层，壁薄而脆、通透性高，所以更容易受到空化损伤。毫无疑问，在超声联合微泡损伤肿瘤血管内皮细胞的基础上，引入凝血因子，可以进一步加快内源性凝血，促进肿瘤微循环栓塞。美国Hwang等认为超声结合微泡导致内皮细胞损伤是凝血连锁反应中的一个重要步骤。他们用兔的耳缘血管模型证实，在脉冲式聚焦超声照射下，微泡空化能损伤静脉内皮细胞，促进血小板黏附而加速凝血反应，当同时输入小剂量的凝血酶，很快导致血管内血栓形成；而对照组无微泡，仅为超声照射加相同剂量凝血酶，则未形成血栓(Hwang，et al.Ultrasound Med.&Biol.2005，31553-564)。国内东南大学吴魏等用20KHz的低频超声联合5ml利声显微泡造影剂(Levovist)辐照正常家兔肝脏，可致照射野大约90％的微血管栓塞，原因可能是空化效应引起血管内皮损伤，促发内外源性凝血，而且微血管内血流速缓慢，容易形成血栓。Skyba等观察了超声波破坏鼠斜方肌微血管内微泡的生物效应，在输入微泡前，超声照射并不引起微血管的破坏；同样，输入微泡不使用超声照射也不引起微血管破坏。而在输入Optison、DMP-115、Imagent、SonoVue等任意一种造影剂经超声照射后，直径≤7μm的微血管发生了损伤，红细胞外渗于组织间隙，同时邻近组织内还发现了死亡细胞。这种效应与使用的机械指数呈线性相关。Miller等体内实验研究表明，微泡造影剂在超声作用下所产生的“声孔效应”可使毛细血管破坏，引起出血，形成瘀点。这种效应在微泡注射完成后持续发生作用时间达数小时，且与微泡量呈正相关。
但是，他们的基础研究均基于普通微泡超声造影剂，在微泡空化时并不能立刻释放凝血因子，而是依靠循环中的凝血因子在局部被激活后发挥凝血作用。这样，对肿瘤微循环的栓塞阻断可能不充分。
基于以上实验，我们设计将一定量的凝血酶原复合物或者纤维蛋白原等凝血因子与诊断型超声造影剂微泡相结合，制备出结合凝血因子的治疗型微泡，不但能增强超声空化效应对微血管内皮的“打孔”损伤，而且在损伤肿瘤微血管内皮同时释放凝血因子，极大加速凝血过程，促进肿瘤微血管血栓形成，从而达到非创伤性治疗肿瘤的目的。理论上，结合凝血因子的超声微泡具有更强的促凝血效应，会导致内皮损伤后血栓迅速形成，优于微泡和凝血因子各自单独使用。
目前，国内外尚无将凝血因子与超声微泡相结合，制备成治疗型微泡的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，由超声造影剂微泡携带凝血因子，构成结合凝血因子的治疗型超声微泡。本发明还涉及制备所述治疗型超声微泡的方法。
本发明采用的技术方案是将凝血因子与各种超声微泡结合。所述结合包括凝血因子吸附于微泡表面，或吸附微泡表面和包裹于微泡内。
所述凝血因子为凝血酶原复合物或/和纤维蛋白原。其用量原则上可参照临床允许的剂量。比如每毫升超声造影剂微泡混悬液加入5-50mg凝血酶原复合物；或每毫升微泡混悬液加10-80mg纤维蛋白原。所述微泡混悬液即为微泡乳化液，其浓度即为产品已配制好的浓度。
所述超声造影剂微泡包括脂质超声造影剂微泡、人血白蛋白超声造影剂微泡、高分子材料超声造影剂微泡。所有的微泡为已知的或有文献报道的。
其中(1)脂质超声造影剂微泡包括各种用磷脂或磷脂类衍生物作为成膜材料的脂质微泡，例如声诺维(SonoVue)、Definity、Imagent等。上面所述的磷脂或磷脂类衍生物，例如1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐(DPPA)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)等。
(2)人血白蛋白超声造影剂微泡包括各种用人血白蛋白作为成膜材料的超声微泡，如Optison等。
(3)高分子材料超声造影剂微泡包括微泡壳成分中含有各种高分子作为成膜材料的超声微泡，如POINT Biomedical公司的PBl27、Acusphere公司的AI-700等。上面所述的高分子材料具体包括分子量在3000至10000的聚乙二醇、乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)、氰基丙烯酸酯等。
所述的超声造影剂微泡的气体内核成分包括常温下呈气态的全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫。
超声造影剂微泡通过以下具体方法与凝血因子结合(1)超声造影剂微泡形成前加入将凝血因子与脂质超声造影剂微泡的成膜材料的脂质混悬液未振荡成微泡前加入，然后通过机械振荡法振荡后即形成含有大量微气泡的混悬液，其中振荡频率为4000～5500次/分，幅度为10～30毫米，时间为30～90秒；振荡后凝血因子通过静电直接结合到微泡壳内表面或外表面。
或(2)超声造影剂微泡形成后加入将制作完成的超声造影剂微泡混悬液直接与含有凝血因子的溶液混合，再使用旋涡振荡器或手摇方式使凝血因子充分与微泡混合并结合于微泡外表面。
上述方法(1)主要针对脂质超声造影剂微泡。在超声造影剂微泡形成前，将凝血因子溶液(凝血酶原复合物或纤维蛋白原溶液)与脂质混悬液(微泡制备液)混合，盛有以上混合液的西林瓶气体头部充满全氟丙烷或者全氟丁烷气体，再通过高速机械振荡，在微泡形成的同时将凝血因子整合在微泡膜上或包裹在微泡壳内。机械振荡时，将盛有造影剂的西林振荡瓶置于机械振荡装置的夹头上，按设置好的工作参数进行机械振荡(水平往复式振荡，工作频率≥4500次/分钟，振动幅度15±1mm，时间45s)，振荡后即形成整合有凝血因子的脂质氟碳微气泡的混悬液。
上述方法(2)也可以称为直接连接法又称为被动吸附或静电吸附法，是文献中采用较多的超声造影剂微泡与配体的连接方法。以脂质超声造影剂微泡为例，大分子脂质是一种卵磷脂的衍生物，具有化学双极性以及疏水端和亲水端，在不添加任何外在化学成分的情况下可通过自身离子键、物理吸附(范德华力)等方式将配体直接连接到微泡上(图1)。人血白蛋白微泡和高分子材料微泡表面也存在同样的情况，采用直接连接法也可以成功结合凝血因子。
在上述方法(1)中，与现有技术相比，区别在于在微泡的制作中加入了凝血因子，而在方法(2)中，直接将已有的微泡产品与凝血因子混合。
本发明治疗型超声微泡在适当的治疗超声作用下，可以促进局部组织微循环血栓形成，可用于肿瘤等疾病治疗。该治疗型超声微泡在多种形式的超声能量(高强度聚焦超声、脉冲式聚焦超声或平面超声)作用下，以增强超声空化消融肿瘤、超声热消融肿瘤或者促进局部微循环血栓形成等方式治疗肿瘤。
附图1为结合了凝血因子的治疗型超声微泡模式图；附图2为结合了凝血酶原复合物荧光微泡(x200)镜下图；附图3为流式细胞仪检测洗涤前(左图)与洗涤后(右图)，微泡与FITC-PCC的结合率(横坐标为波长、纵坐标为计数)；附图4为纤维蛋白原微泡治疗超声组治疗后，照射区肠系膜微血管栓塞，伊文思蓝染色仍呈红色(黑箭头)，未照射区血管呈蓝色。
具体实施例本发明的技术方案及其效果可以通过实施例进一步说明实施例1本发明治疗型微泡的性质评价首先制备脂质混悬液；再将绿色荧光标记的凝血酶原复合物(FITC-PCC)配成10mg/ml的溶解液；然后分三组制备第一组，完成脂超声造影剂膜微泡的制备(水平往复式机械振荡，工作频率≥4500次/分钟，振动幅度15±1mm，时间45s)；第二组，在脂质混悬液中加入0.5ml FITC-PCC后，用氟碳气体置换空气，按相同的工作参数进行机械振荡45s；第三组，在完成微泡制备后，揭开瓶塞加入0.5ml FITC-PCC，漩涡混合振荡仪振荡或手摇1min。上述制备完成后室温孵育30min，取出一半静置，另一半采用浮选法洗涤即将造影剂置于离心管中，加入等量的0.9％Nacl，400rpm离心1min(至微泡聚集在液相的顶部)，弃去下清液，重复洗涤两次。在微泡制备完成后检测微泡理化性质光学显微镜观察洗涤前后不同组别微泡的形态、大小、分布及稳定性；血球分析仪测定微泡浓度；荧光倒置显微镜观察微泡的形态、大小、分布；流式细胞仪计数50000个微泡，检测不同组别、洗涤前后FITC-PCC与微泡的结合率。在已知FITC-PCC与微泡可直接连接后，将上述制备步骤中FITC-PCC更换成PCC，完成制备。最后采用等比稀释法分别制备浓度为40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml的PCC溶液各1ml；然后用全自动凝血仪分别检测上述不同浓度凝血酶原复合物溶解液中IX因子活性；最后检测不同组别洗涤前后结合凝血酶原复合物微泡IX因子活性，并与相同浓度凝血酶原复合物溶解液比较。结果①与第一组(空白组)比较，第二组(机械振荡前加入FITC-PCC)、第三组(机械振荡后加入FITC-PCC)制备的微泡浓度、粒径及粒径分布无明显变化，但易静置分层。②荧光显微镜观察洗涤前结合FITC-PCC的各组微泡均能激发出明亮的绿色荧光(图2)；洗涤后微泡浓度由1010左右降到107左右，微泡荧光亮度由“3级”变为“2级”。③微泡与凝血酶原复合物的结合率洗涤前或洗涤后各组间比较均无明显差异(P＞0.05)，但洗涤后结合率均值由洗涤前的平均99.4％左右降为88.7％左右(P＜0.05，图3)。④IX因子凝血活性检测洗涤前结合凝血酶原复合物的各组微泡均能保持较高活性，与相同浓度的凝血酶原复合物溶液比较无明显差异(P＞0.05)，各组间亦无明显差异(P＞0.05)；洗涤后活性均值组间仍无明显差异(P＞0.05)，但活性明显下降，由洗涤前的90％左右降为19％左右(P＜0.01)。实际操作中，微泡洗涤过程没有必要。
上述实验表明结合到微泡膜上的凝血因子仍然能够保持较高的活性。
实施例2本发明微泡的治疗型栓塞实验
1.实验方法用2％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，麻醉后将兔仰卧位固定于实验台上，建立耳缘静脉通路，腹部备皮，于中腹部沿腹正中线作8cm切口，开腹沿盲肠游离端所指方向轻轻将一段回肠及肠系膜拉出腹外，置于体视显微镜下，将显微镜调至适宜倍数(×90)，使其清晰显示肠系膜微血管内血液流动情况选择有细小血管走行、脂肪少的肠系膜区域作为照射区。
2.实验分组①纤维蛋白原微泡治疗超声组按照0.5ml/kg微泡和0.034g/kg纤维蛋白原的比例将两者混合，采用本实验室已成熟运用的直接连接法制备携带纤维蛋白原的微泡混悬液，照射前3min配好，经耳缘静脉团注，共10ml；超声治疗头用塑料薄膜包裹，与肠系膜之间有厚约1.5cm的耦合剂层，垂直照射选定区域，照射20s、间隔5s，共10min。照射过程中，避免对肠系膜产生压力，并不断向照射区域加生理盐水保持耦合。实验过程对外露肠管及系膜保温、保湿。
②单纯治疗超声组用10ml生理盐水代替纤维蛋白原微泡混悬液，余同①。
③单纯纤维蛋白原微泡组超声治疗头不发射能量，假照10min，余同①。
④纤维蛋白原治疗超声组静脉注射仅用纤维蛋白原配成的10ml溶液，余同①。
3.观察方法照射后镜下观察微血管内血液流动情况，与照射前对比。静脉推注剂量为50mg/kg浓度为2％过滤灭菌的伊文思蓝溶液，3min后肉眼观察照射区域微血管伊文思蓝灌注后染色情况。
4.实验结果超声治疗仪声学检测结果输出声功率1.02W，声强0.3W/cm2。
体视显微镜观察单纯治疗超声组、单纯纤维蛋白原微泡组和纤维蛋白原治疗超声组照射前肠系膜微血管内血液流动通畅、迅速，照射后血液流动亦通畅、迅速，未见明显变化；纤维蛋白原微泡治疗超声组照射前肠系膜微血管内血液流动通畅、迅速，照射后照射区域血液流动消失，血栓形成，未照射区域血液流动通畅、迅速(表1)。
伊文思蓝染色单纯治疗超声组、单纯纤维蛋白原微泡组和纤维蛋白原治疗超声组静注伊文思蓝后照射区域微血管呈蓝色；纤维蛋白原微泡治疗超声组静注伊文思蓝后照射区域微血管伊文思蓝染色未见充填，仍呈红色，未照射区血管呈蓝色(图4)。
表-1不同处理组对肠系膜微血管的改变
综上所述，连接了纤维蛋白原的脂质微泡通过超声空化释放，有效栓塞了肠系膜微血管，阻断了局部微循环。
权利要求
1.一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是包括含气体内核的超声造影剂微泡和凝血因子，由凝血因子吸附于超声造影剂微泡表面，或由凝血因子吸附于微泡表面和包裹在其内构成结合凝血因子的超声微泡。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是超声造影剂微泡为(1)脂质超声造影剂微泡；或(2)人血白蛋白超声造影剂微泡；或(3)高分子材料超声造影剂微泡。
3.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是所述凝血因子为凝血酶原复合物或/和纤维蛋白原。
4.根据权利要求2所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是所述脂质超声造影剂微泡为各种用磷脂或磷脂类衍生物作为成膜材料的脂质微泡，所述的磷脂或磷脂类衍生物，包括1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐(DPPG)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐(DPPA)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)。
5.根据权利要求2所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是所述人血白蛋白超声造影剂微泡为各种用人血白蛋白作为成膜材料的超声微泡，包括Optison。
6.根据权利要求2所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是所述高分子材料超声造影剂微泡为微泡壳成分中含有各种高分子作为成膜材料的超声微泡，所述的高分子材料具体包括分子量在3000至10000的聚乙二醇、乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)、氰基丙烯酸酯。
7.根据权利要求1～6所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是所述的超声微泡的气体内核成分包括常温下呈气态的全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫。
8.根据权利要求1～6所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，其特征是超声微泡壳外表面或内表面通过静电吸附、分子共价或者范德华力方式连接活性凝血因子；其中凝血酶原复合物加入的比例是每毫升微泡混悬液加入5-50mg凝血酶原复合物；或每毫升微泡混悬液加10-80mg纤维蛋白原。
9.一种制备如权利要求1所述的一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡的方法，包括含气体内核的超声造影剂；其特征是含气体内核的超声造影剂微泡通过以下具体方法与凝血因子结合(1)微泡形成前加入将凝血因子与脂质微泡的成膜材料的脂质混悬液未振荡成微泡前加入，然后通过机械振荡法振荡后即形成含有大量微气泡的混悬液，其中振荡频率为4000～5500次/分，幅度为10～30毫米，时间为30～90秒；振荡后凝血因子通过静电直接结合到含气体内核的超声造影剂微泡壳内表面和外表面；或(2)微泡形成后加入将制作完成的微泡混悬液直接与含有凝血因子的溶液混合，再使用旋涡振荡器或手摇方式使凝血因子充分与微泡混合并结合于含气体内核的超声造影剂微泡外表面。
全文摘要
本发明涉及一种用于肿瘤超声治疗的治疗型超声微泡，它包括含气体内核的超声造影剂微泡和凝血因子，由凝血因子吸附于超声造影剂微泡表面，或由凝血因子吸附于微泡表面和包裹在其内构成结合凝血因子的超声微泡。该治疗型超声微泡在适当的治疗超声作用下，可以促进局部组织微循环血栓形成，可用于肿瘤等疾病治疗。该治疗型超声微泡在多种形式的超声能量(高强度聚焦超声、脉冲式聚焦超声或平面超声)作用下，以增强超声空化消融肿瘤、超声热消融肿瘤或者促进局部微循环血栓形成等方式治疗肿瘤。
文档编号A61K38/16GK1935257SQ20061009507
公开日2007年3月28日 申请日期2006年8月30日 优先权日2006年8月30日
发明者刘政, 谭开彬, 杨莉, 高云华, 刘平, 李秋颖 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院