专利名称：参芪扶正注射液的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及参芪扶正注射液的质量控制方法，特别是涉及参芪扶正注射液的指纹图谱控制方法。
背景技术：
党参(Radix Codonopsis)药性平和，用途广，具有多方面的药理活性，不仅对消化、心血管系统有作用，而且还能调节免疫系统功能，增强机体的抵抗力，毒性甚微。黄芪(Radix Astragalus)是补气主药，能明显增加巨噬细胞的吞噬功能，与党参合用，能使巨噬细胞吞噬有害物质的作用增强。参芪扶正注射液是由党参、黄芪经提取制成的纯中药制剂，以益气扶正为主。党参和黄芪两种药物的性味及归经一致，功效基本相同，两者相加，起到君臣相佐、相使的协同作用，明显增强了临床疗效。但是，目前还没有参芪扶正注射液指纹图谱的控制方法，难于保证产品的稳定性和临床使用安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、灵敏的参芪扶正注射液的质量控制方法。
本发明所提供的参芪扶正注射液的质量控制方法，包括如下步骤1)参芪扶正注射液样品的测试溶液制备将参芪扶正注射液样品浓缩后通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用一定浓度的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液浓缩至干，残渣加水或一定浓度的乙醇溶解，得参芪扶正注射液样品的测试溶液；2)对照品溶液的制备将毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶于甲醇，作为酚酸类指纹图谱的对照品溶液；将黄芪甲苷对照品溶于甲醇，作为皂苷类指纹图谱的对照品溶液。
3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙睛-水为流动相，梯度洗脱；以紫外检测器分别检测200-215nm和250-280nm下的酚酸类指纹图谱；以蒸发光散射检测器检测皂苷类指纹图谱；4)高效液相色谱检测取参芪扶正注射液样品的测试溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到参芪扶正注射液样品的指纹图谱三张酚酸类指纹图谱两张和皂苷类指纹图谱一张；5)比对将所得参芪扶正注射液样品的指纹图谱分别与参芪扶正注射液的对照指纹图谱进行比对，相似度大于0.9的参芪扶正注射液样品是合格产品；①200-215nm下的酚酸类指纹图谱共有8个色谱峰，以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰相对保留时间为0.20-0.30，相对峰面积为1.60-3.50；2号峰相对保留时间为0.25-0.33，相对峰面积为0.70-1.50；3号峰相对保留时间为0.40-0.50，相对峰面积为1.20-2.90；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；4号峰相对保留时间为0.90-1.20，相对峰面积为0.22-0.40；5号峰相对保留时间为1.20-1.40，相对峰面积为0.22-0.40；6号峰相对保留时间为1.38-1.46，相对峰面积为0.90-1.50；7号峰相对保留时间为1.42-1.53，相对峰面积为0.23-0.42；②250-280nm下的酚酸类指纹图谱共有6个色谱峰，以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰相对保留时间为0.15-0.28，相对峰面积为0.80-1.80；2号峰相对保留时间为0.25-0.33，相对峰面积为1.25-2.50；3号峰相对保留时间为0.25-0.33，相对峰面积为0.80-1.70；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；4号峰相对保留时间为0.33-0.40，相对峰面积为0.50-1.30；5号峰相对保留时间为0.40-0.50，相对峰面积为1.20-2.50；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；③皂苷类指纹图谱共有9个色谱峰，以黄芪甲苷的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰相对保留时间为0.51-0.58，相对峰面积为0.70-1.20；2号峰相对保留时间为0.74-0.82，相对峰面积为0.45-1.20；3号峰相对保留时间为0.78-0.85，相对峰面积为0.15-0.23；4号峰相对保留时间为0.88-0.93，相对峰面积为0.17-0.25；5号峰相对保留时间为0.90-1.00，相对峰面积为0.09-0.17；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；6号峰相对保留时间为0.95-1.10，相对峰面积为0.30-0.40；7号峰相对保留时间为0.98-1.10，相对峰面积为0.60-0.80；8号峰相对保留时间为0.10-1.15，相对峰面积为0.60-1.0。
其中，酚酸类指纹图谱的测试溶液制备过程优选为精密量取参芪扶正注射液样品25ml，置水浴中浓缩至约5ml，缓缓通过AB-8大孔吸附树脂柱(柱内径为1.5cm，柱长为20cm)，用水70ml洗脱，弃去水洗脱液，续用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，置水浴中浓缩至干，残渣加水溶解并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
皂苷类指纹图谱的测试溶液制备过程优选为精密量取参芪扶正注射液样品200ml，置水浴中浓缩至约10ml，缓缓通过AB-8大孔吸附树脂柱(柱内径为1.5cm，柱长为20cm)，用水80ml洗脱，弃去水洗脱液；续用20％乙醇80ml洗脱，弃去20％乙醇洗脱液；再用80％乙醇100ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，置水浴中浓缩至干，残渣加80％乙醇溶解并转移至5ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
步骤2)所述对照品溶液的制备过程优选为取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.06mg的溶液，作为酚酸类指纹图谱的对照品溶液；取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.1mg的溶液，作为皂苷类指纹图谱的对照品溶液。
步骤3)色谱条件优选为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，型号为Discovery C18，250×4.6mm，5μm，理论塔板数在酚酸类指纹图谱中按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷计不低于3000，在皂苷类指纹图谱中按黄芪甲苷计不低于4000。柱温30℃；酚酸类指纹图谱用紫外检测器检测，检测波长为208nm、266nm；皂苷类指纹图谱用蒸发光散射检测器检测，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；
步骤4)高效液相色谱检测过程优选为精密吸取对照品溶液和参芪扶正注射液样品的测试溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录时间为70分钟。
本发明的原理是建立起参芪扶正注射液的HPLC指纹图谱，对参芪扶正注射液中的酚酸类成分和皂苷类成分用多张指纹图谱分别检测，从各个色谱图的整体面貌特征上把握参芪扶正注射液质量情况，避免了因只测定一、二个化学成分而评价参芪扶正注射液整体质量的片面性，减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握等特点，同时可用本方法区分与参芪扶正注射液在外观色泽十相似的中药注射剂，以防假冒，应用前景广阔。
图1～图3分别为参芪扶正注射液的标准指纹图谱(分别为266nm、208nm的酚酸类指纹图谱和皂苷类指纹图谱)；图4为酚酸类指纹图谱(208nm)S峰的确定；图5为酚酸类指纹图谱(266nm)S峰的确定；图6为皂苷类指纹图谱S峰的确定；图7A-图7C分别为黄芪注射液指纹图谱(分别为266nm、208nm的酚酸类指纹图谱和皂苷类指纹图谱)；图8A-图8C分别为丹参滴注液指纹图谱(分别为266nm、208nm的酚酸类指纹图谱和皂苷类指纹图谱)；图9A-图9C分别为参芪扶正注射液指纹图谱(分别为266nm、208nm的酚酸类指纹图谱和皂苷类指纹图谱)。
具体实施例方式
实施例1、参芪扶正注射液的标准指纹图谱的建立1、标准测试溶液的制备①酚酸类指纹图谱的测试样品精密量取参芪扶正注射液样品25ml，置水浴中浓缩至约5ml，缓缓通过AB-8大孔吸附树脂柱(柱内径为1.5cm，柱长为20cm)，用水70ml洗脱，弃去水洗脱液，续用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，置水浴中浓缩至干，残渣加水溶解并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
②皂苷类指纹图谱的测试样品精密量取参芪扶正注射液样品200ml，置水浴中浓缩至约10ml，缓缓通过AB-8大孔吸附树脂柱(柱内径为1.5cm，柱长为20cm)，用水80ml洗脱，弃去水洗脱液；续用20％乙醇80ml洗脱，弃去20％乙醇洗脱液；再用80％乙醇100ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，置水浴中浓缩至干，残渣加80％乙醇溶解并转移至5ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2、对照品溶液的制备取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.06mg的溶液，作为酚酸类指纹图谱的对照品溶液；取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.1mg的溶液，作为皂苷类指纹图谱的对照品溶液；3、色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，型号为Discovery C18，250×4.6mm，5μm，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1的梯度进行梯度洗脱；柱温30℃；酚酸类指纹图谱用紫外检测器检测，检测波长为208nm、266nm；皂苷类指纹图谱用蒸发光散射检测器检测。理论塔板数在酚酸类指纹图谱中按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷计不低于3000，在皂苷类指纹图谱中按黄芪甲苷计不低于4000。
表1 洗脱梯度表
4、测定精密吸取标准测试溶液和对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪中，记录70分钟的色谱图，即得，并计算相似度。
5、确定共有峰
①酚酸类指纹图谱(208nm)共有峰的确定建立酚酸类指纹图谱(208nm)，是对酚酸类指纹图谱(266nm)的辅助检测，可检测到在266nm波长处检测不到的成分，主要集中在35～50min内，故将这段内较稳定的4，5，6，7色谱峰均列入共有峰内，另选择峰面积较大的色谱峰也列为共有峰。对比毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液的色谱图，选择S峰，见图4。
选择20批参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂提供)模拟出参照谱图。
在相似度软件里，对共有峰进行匹配后，计算相似度结果如下
综上所述，参芪扶正注射液的酚酸类指纹图谱(208nm)如图2所示。
②酚酸类指纹图谱(266nm)共有峰的确定所选择的共有峰峰面积较大，较为稳定，其余峰峰面积小，受基线干扰大，重现性不佳，故在相似度计算时不对其进行校正，不列为共有峰。对比毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液的色谱图，选择S峰，见图5。
在相似度软件里，对共有峰进行匹配后，计算相似度结果如下
综上所述，参芪扶正注射液的酚酸类指纹图谱(266nm)如图1所示。
③皂苷类指纹图谱共有峰的确定在图谱上，35～45min内的色谱峰多且不稳定，45～70min内的色谱峰为皂苷类成份，故主要选择这一段内的色谱峰为共有峰。对比黄芪甲苷对照品溶液的色谱图，选择S峰，见图6。
在相似度软件里，对共有峰进行匹配后，计算相似度结果如下
综上所述，参芪扶正注射液的皂苷类指纹图谱如图3所示。
6、指纹图谱的重现性和稳定性实验①酚酸类指纹图谱(208nm)取参芪注射液050815，进行了稳定性，精密度，重现性的方法学试验。对其相似度计算结果如下表2，表3，表4。
表2稳定性试验相似度计算结果表
表3精密度试验相似度计算结果表
表4重现性试验相似度计算结果表
结果显示本方法稳定性、精密度、重现性良好。
②酚酸类指纹图谱(266nm)取参芪注射液050815，进行了稳定性，精密度，重现性的方法学试验。对其相似度计算结果如下表5，表6，表7。
表5稳定性试验相似度计算结果表
表6精密度试验相似度计算结果表
表7重现性试验相似度计算结果表
结果显示本方法稳定性、精密度、重现性良好。
③皂苷类指纹图谱
取参芪注射液050815，进行了稳定性，精密度，重现性的方法学试验。对其相似度计算结果如下表8，表9，表10。
表8稳定性试验相似度计算结果表
表9精密度试验相似度计算结果表
表10重现性试验相似度计算结果表
结果显示本方法稳定性、精密度、重现性良好。
实施例2、本方法应用于参芪扶正注射液的质量控制选取市售的黄芪注射液，丹参滴注液，参芪扶正注射液，按照实施例1的方法测定其指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，相似度大于0.9的为参芪扶正注射液，其余的均低于0.9，可用于判别参芪扶正注射液的真伪。
黄芪注射液208nm、266纳米的酚酸类指纹图谱以及皂苷类指纹图谱分别如图7A-图7C，其相似度分别为0.409、0.315、0.611。
丹参滴注液208nm、266纳米的酚酸类指纹图谱以及皂苷类指纹图谱分别如图8A-图8C，其相似度分别为0.292、0.257、0.000。
参芪扶正注射液208nm、266纳米的酚酸类指纹图谱以及皂苷类指纹图谱分别如图9A-图9C，其相似度分别为0.983、0.985、0.981。
对市售的多批参芪扶正注射液按照实施例1的方法测定其指纹图谱，与标准指纹图谱进行比较，相似度均大于0.9，证实未发现劣质产品。
权利要求
1.一种参芪扶正注射液的质量控制方法，包括如下步骤1)参芪扶正注射液样品的测试溶液制备将参芪扶正注射液样品浓缩后通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液浓缩至干，残渣加水或乙醇溶解，得参芪扶正注射液样品的测试溶液；2)对照品溶液的制备将毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶于甲醇，作为酚酸类指纹图谱的对照品溶液；将黄芪甲苷对照品溶于甲醇，作为皂苷类指纹图谱的对照品溶液；3)色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙睛-水为流动相，梯度洗脱；以紫外检测器分别检测200-215nm和250-280nm下的酚酸类指纹图谱；以蒸发光散射检测器检测皂苷类指纹图谱。4)高效液相色谱检测取参芪扶正注射液样品的测试溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到参芪扶正注射液样品的指纹图谱；5)比对将所得参芪扶正注射液样品的指纹图谱与参芪扶正注射液的对照指纹图谱进行比对，相似度大于0.9的参芪扶正注射液样品是合格产品；①200-215nm下的酚酸类指纹图谱共有8个色谱峰，以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰相对保留时间为0.20-0.30，相对峰面积为1.60-3.50；2号峰相对保留时间为0.25-0.33，相对峰面积为0.70-1.50；3号峰相对保留时间为0.40-0.50，相对峰面积为1.20-2.90；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；4号峰相对保留时间为0.90-1.20，相对峰面积为0.22-0.40；5号峰相对保留时间为1.20-1.40，相对峰面积为0.22-0.40；6号峰相对保留时间为1.38-1.46，相对峰面积为0.90-1.50；7号峰相对保留时间为1.42-1.53，相对峰面积为0.23-0.42；②250-280nm下的酚酸类指纹图谱共有6个色谱峰，以毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰相对保留时间为0.15-0.28，相对峰面积为0.80-1.80；2号峰相对保留时间为0.25-0.33，相对峰面积为1.25-2.50；3号峰相对保留时间为0.25-0.33，相对峰面积为0.80-1.70；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；4号峰相对保留时间为0.33-0.40，相对峰面积为0.50-1.30；5号峰相对保留时间为0.40-0.50，相对峰面积为1.20-2.50；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；③皂苷类指纹图谱共有9个色谱峰，以黄芪甲苷的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰相对保留时间为0.51-0.58，相对峰面积为0.70-1.20；2号峰相对保留时间为0.74-0.82，相对峰面积为0.45-1.20；3号峰相对保留时间为0.78-0.85，相对峰面积为0.15-0.23；4号峰相对保留时间为0.88-0.93，相对峰面积为0.17-0.25；5号峰相对保留时间为0.90-1.00，相对峰面积为0.09-0.17；S号峰相对保留时间为1，相对峰面积为1；6号峰相对保留时间为0.95-1.10，相对峰面积为0.30-0.40；7号峰相对保留时间为0.98-1.10，相对峰面积为0.60-0.80；8号峰相对保留时间为0.10-1.15，相对峰面积为0.60-1.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于酚酸类指纹图谱的测试溶液制备过程为精密量取参芪扶正注射液样品25ml，置水浴中浓缩至5ml，缓缓通过AB-8大孔吸附树脂柱，柱内径为1.5cm，柱长为20cm；先用水70ml洗脱，弃去水洗脱液，续用70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，置水浴中浓缩至干，残渣加水溶解并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于皂苷类指纹图谱的测试溶液制备过程为精密量取参芪扶正注射液样品200ml，置水浴中浓缩至10ml，缓缓通过AB-8大孔吸附树脂柱，柱内径为1.5cm，柱长为20cm；先用水80ml洗脱，弃去水洗脱液；续用20％乙醇80ml洗脱，弃去20％乙醇洗脱液；再用80％乙醇100ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，置水浴中浓缩至于，残渣加80％乙醇溶解并转移至5ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于对照品溶液的制备过程为取毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.06mg的溶液，作为酚酸类指纹图谱的对照品溶液；取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml溶液中含0.1mg的溶液，作为皂苷类指纹图谱的对照品溶液；
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于步骤3)色谱条件为色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，型号为Discovery C18，250×4.6mm，5μm，理论塔板数在酚酸类指纹图谱中按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷计不低于3000，在皂苷类指纹图谱中按黄芪甲苷计不低于4000；柱温30℃；酚酸类指纹图谱用紫外检测器检测，检测波长为208nm、266nm；皂苷类指纹图谱用蒸发光散射检测器检测；以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱梯度如下时间(分钟)乙腈(％) 水(％)0～8 2→5 98→958～18 5→1295→8818～4012→25 88→7540～5025→32.5 75→67.550～6532.5→55 67.5→4565～7055→95 45→570～7595 575～7895→25→9878～83298
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于步骤4)高效液相色谱检测过程为精密吸取对照品溶液和参芪扶正注射液样品的测试溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录时间为70分钟。
全文摘要
本发明公开了参芪扶正注射液的质量控制方法。本发明方法包括如下步骤1)参芪扶正注射液样品的测试溶液制备；2)对照品溶液的制备；3)选择色谱条件；4)高效液相色谱检测，得到参芪扶正注射液样品的指纹图谱；5)比对将所得参芪扶正注射液样品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，相似度大于0.9的参芪扶正注射液样品是合格产品。本发明的原理是建立起参芪扶正注射液的HPLC指纹图谱，从色谱的整体面貌特征上把握参芪扶正注射液质量情况，避免了因只测定一、二个化学成分而评价参芪扶正注射液整体质量的片面性，减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握等特点，同时可用本方法区分与参芪扶正注射液在外观色泽十相似的中药注射剂，以防假冒，应用前景广阔。
文档编号A61P37/04GK1899362SQ20061009895
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者刘学华, 屠芳芳, 陶德萍 申请人:丽珠集团利民制药厂