专利名称：一种检测参芪扶正注射液中大分子物质的方法
技术领域：
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及ー种检测參芪扶正注射液中大分子物质的方法。
背景技术：
參芪扶正注射液作为ー种中药注射液，主要由党參、黄芪制备而成，參芪扶正注射液的原料的提取过程中会产生大量的如蛋白质、多糖、多肽、鞣质等大分子杂质，而大分子杂质是产生过敏性反应等不良反应的主要原因，其中，大分子多糖一般为蛋白多糖，该糖蛋、白的抗原性高于原有的蛋白质，同时单纯的多糖也能够作为免疫佐剂来增强过敏反应。因此在注射液生产过程中这些大分子如果不能去除干净，有可能引起患者过敏、红肿等不良反应。广东省不良反应检测中心开展了对參芪扶正注射液上市后安全性再评价研究，其不良反应累积发生率为O. 2%，属“偶见”，主要表现为皮疹、刺激痛、过敏等。这些不良反应主要是因为注射液中存在的大分子物质引起的。因此，建立对有害大分子物质的检查及限量监控方法对于保证參芪扶正注射液的安全性是非常重要的。目前学术界对于产生不良反应的大分子物质的分子量没有形成统ー的界限，认为中药注射液的疗效来自所含的小分子物质，与分子量大于3000的物质无关，然而许多中药中分子量大于3000的多糖和蛋白的大分子物质仍具有很强的药物活性，若将此类中药注射液中分子量大于3000的物质除去，该注射液的安全性会増加，但是药效则会大大降低。目前未有文献公开參芪注射液中易发生副反应的大分子物质的具体分子量界限，而常规多糖和蛋白质检测方法无法对不同分子量的大分子物质分别进行检测，对于參芪扶正注射液而言，既能保证其安全性，又能保证其有效性的检测方法未见相关文献报道。參芪扶正注射液不同于普通注射液之处在干，由于中药提取过程中不可避免地产生的色素残留，若直接使用如Folin-酹试剂法、Bradford法等显色反应检测蛋白质和多糖会导致检测结果产生严重误差，因此使用显色法进行检测前，需要除去注射液中的色素，诸如中国专利申请201010504574. 4公开了中药注射液中的微量蛋白质检测方法，而在中药注射液本身具有色素的情况下(如參芪扶正注射液为黄色液体)，则需要増加脱色步骤才不会影响最終結果，而使用蛋白特异性吸附膜脱色时，浸泡时间至少需要15小吋，由此可见，该方法操作时间过长，步骤繁琐。參芪扶正注射液作为ー种中药注射液，注射液中的蛋白质、多糖大分子成分不能使用常规检测方法检测，因为使用常规方法进行检测时，其他成分可能会对检测结果产生较大的影响。为了消除其他成分的影响，中药注射液中大分子物质的检测方法通常比较复杂。中国专利ZL200610001838. 8公开了ー种测定注射液高分子物质含量的方法，该方法采用高效液相色谱法，虽然测定结果的灵敏度高，但是需要使用參照物，操作步骤较为繁杂。中国专利申请201110002873. 2采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定生脉注射液中微量蛋白，该方法操作步骤较多，成本较高。
现行药典(2010版)制定了中药注射液中的蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐的物质检测标准，但没有特别制定大分子物质蛋白质、多肽、多糖的质量控制标准。而且药典中控制中药注射液蛋白的磺基水杨酸比浊法灵敏度低，且易受到注射液本身顔色的干扰影响判断。
发明内容
鉴于现有的蛋白质和多糖的质量控制标准，已经远远落后于中药注射液的质量控制需要，为了提高对中药注射液的有效成分的质控水平，本发明以參芪扶正注射液为研究实例，建立了ー种简便有效的检测方法，可用于检测注射液中大分子物质蛋白质、多糖的存在情況。该方法对于大分子物质多糖、蛋白质类检测灵敏度均可达微克级，远低于引起过敏反应的量，可应用在注射液成品及生产、贮存过程中的大分子物质的监控及检测，以防止在临床使用中产生过敏反应。
本发明实验证明，參芪扶正注射液分子量大于3. 8KD的大分子多糖和蛋白容易导致不良反应的发生。因此，本发明采用超滤离心的方法分离分子量大于3. 8KD的大分子物质，再用常规的BCA法和Molish法检测分离出来的大分子蛋白和多糖，即可消除注射液中的其他成分对实验结果的影响。 本发明通过以下技术方案实现上述目的。本发明提供一种检验參芪扶正注射液中大分子物质的方法，该方法包括如下步骤(I)采用超滤离心法对參芪扶正注射液进行超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液；(2)采用BCA法和Molish法检测步骤(I)获得的上层截留液，以确定所述參芪扶正注射液中是否存在大分子物质。上述检测方法中，步骤(I)中，使用的超滤离心管优选为Millipore Ultra-15
3.OkD-3. 8kD。上述检测方法中，步骤(I)中，每次超滤离心后的上层截留液体积为150 μ 1-250 μ I。上述检测方法中，步骤(I)中，加入超纯水的次数优选为8-10次，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性。上述检测方法中，所述參芪扶正注射液大分子物质是指大分子蛋白和多糖。根据本发明的ー个具体实施方案，所述检测方法包括如下步骤(I)精密吸取參芪扶正注射液IOml置于Millipore Ultra-153. OkD-3. 8kD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剰余体积为150 μ 1-250 μ 1，往上层截留液加入超纯水5ml,用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余体积为150 μ 1-250 μ I,重复加水8 10次，毎次2ml，毎次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，以确保不干扰大分子物质部分的检测。收集上层截留液，定容至10ml。(2)采用BCA法检测注射液中是否含有大分子的蛋白质，具体方法为使用BCA蛋白试剂盒，于96孔板中加入20 μ I样品液及200 μ IBCA工作液，37°C放置30min，观察是否有紫色络合物出现。采用Molish法检测注射液中是否含有大分子的多糖物质，具体方法为小试管中加入Iml样品液和两三滴Molish试液，摇匀，沿管壁慢慢加入Iml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现.采用BCA法检测是否含有大分子蛋白质类物质，如反应为阳性，则表示含有大分子蛋白质，反之则不含该类物质；采用Molish法检测是否含有大分子糖类物质，若反应阳性则含有大分子多糖，反之则不含该类物质。经过试验，此法对于大分子 糖类及蛋白质类检测灵敏度均可达微克级，远低于引起过敏反应的量。由于超滤离心仅保留了注射液中的大分子物质，克服了由于其他非大分子物质对检测结果所帯来的影响，同时在超滤离心的过程中不断用超纯水洗涤，也消除了參芪扶正注射液本身的色素对后续显色反应结果所产生的影响，无需単独除色即可进行后续显色反应。因此只要通过此方法未检测出相应大分子物质，即可认为产品不含大分子物质，质量合格。本发明建立了一种对參芪扶正注射液能存在的大分子物质(蛋白质类及多糖类)的经济实用的限量检查方法，该方法检测灵敏度高，操作简单，成本低廉，同时克服了非大分子物质对检测结果的影响，可以无需単独脱色即可方便有效的检测出注射液中相应大分子物质的存在情况，所用仪器材料均较常见，可以方便的运用于生产实际中，对于生产过程中的产品质量控制具有较强的现实意义。该方法对參芪扶正注射液品质量控制提供參考，进ー步保证參芪扶正注射液的安全性。
具体实施例方式下面结合具体实施例子对本方法做进ー步说明。实施例I :注射液样品大分子物质的检测精密吸取各批參芪扶正注射液、丹參注射液、參附注射液样品和各參芪扶正注射液中间体样品各IOml置于Millipore Ultra-153. OkD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剩余150μ 1，往上层截留液中加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余150 μ 1，重复加水(8 10次，每次2ml)，每次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，以确保不干扰大分子物质部分的检测。收集上层截留液，定容至10ml，采用BCA法和Molish法分别检测是否含有大分子的蛋白质类和糖类物质。从而判断这些样品中大分子物质的存在情况。Molish反应步骤小试管中加入Iml样品液和两三滴Molish试液，摇匀。把试管倾斜，沿管壁慢慢加入Iml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现；BCA反应步骤使用BCA蛋白试剂盒(碧云天POOIOBCA蛋白浓度测定试剂盒)，于96孔板中加入20 μ I样品液及200 μ IBCA工作液，37°C放置30min，观察是否有紫色络合物出现。另外，将已知大分子蛋白质及多糖的含量超滤浓缩液样品的上层截留液部分，按照一定梯度加入到參芪扶正注射液样品中稀释，使其中大分子物质含量是原来超滤浓缩液样品的1/10，1/50，1/100，1/200，1/500，1/1000。按照上述的分离检测方法进行检测。经过检测，其中大分子物质含量在原来超滤浓缩液样品1/500吋，即多糖I. 08μ g/ml，蛋白质
O.92yg/ml，糖类和蛋白质类检出均已相当弱，这已经达到检测下限，大分子物质为原超滤浓缩液样品1/1000吋，已经完全检测不出。可以认为对于糖类和蛋白质类检测限度均在I μ g/ml级，远低于引起过敏反应的量(mg级)。故只要通过此方法未检测出相应大分子物质，即可认为产品不含大分子物质，质量合格。检测结果如表I所示。表I各批注射液样品大分子物质检测结果
WmM WM^ 参芪扶正注射液 SQZSY-I
SQZSY-2--
SQZSY-3--
参芪扶正注射液 SQZSY-4 (储藏期18个月)--
不同贮藏期样品 SQZSY-5 (储藏期12个月)--
SQZSY-6 (储藏期6个月)--
参芪提取物样品 SQOl++
参芪提取物超滤前样品 SQ02++
参苗提取物超滤后样品SQ02-1+ (少量)+ (少量)
参芪提取物超滤浓缩液样品 SQ02-2++
丹参注射液DSOl-
参附注射液 SFOl--实施例2 :注射液样品大分子物质的检测
精密吸取各批參芪扶正注射液和參芪扶正注射液中间体样品各IOml置于Millipore Ultra-153. 8kD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剩余250 μ I,往上层截留液中加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剰余250μ 1，重复加水(8 10次，毎次2ml)，毎次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，以确保不干扰大分子物质部分的检测。收集上层截留液，定容至10ml，采用BCA法和Molish法分别检测是否含有大分子的蛋白质类和糖类物质。Molish反应步骤小试管中加入Iml样品液和两三滴Molish试液，摇匀。把试管倾斜，沿管壁慢慢加入Iml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现；BCA反应步骤使用BCA蛋白试剂盒(碧云天POOIOBCA蛋白浓度测定试剂盒)，于96孔板中加入20 μ I样品液及200 μ IBCA工作液，37°C放置30min，观察是否有紫色络合物出现。另外，将已知大分子蛋白质及多糖的含量超滤浓缩液样品的上层截留液部分，按照一定梯度加入到參芪扶正注射液样品中稀释，使其中大分子物质含量是原来超滤浓缩液样品的1/10，1/50，1/100，1/200，1/500，1/1000。按照上述的分离检测方法进行检测。经过检测，其中大分子物质含量在原来超滤浓缩液样品1/500吋，即多糖I. 18μ g/ml，蛋白质
I.02yg/ml，糖类和蛋白质类检出均已相当弱，这已经达到检测下限，大分子物质为原超滤浓缩液样品1/1000吋，已经完全检测不出。可以认为对于糖类和蛋白质类检测限度均在I μ g/ml级，远低于引起过敏反应的量(mg级)。故只要通过此方法未检测出相应大分子物质，即可认为产品不含大分子物质，质量合格。检测结果如表2所示。
表2各批注射液样品大分子物质检测结果
权利要求
1.一种检验參芪扶正注射液大分子物质的方法，该方法包括如下步骤 (1)采用超滤离心法对中药注射注射液超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液； (2)采用BCA法和Molish法检测步骤(I)获得的上层截留液，以确定所述中药注射注射液否存在大分子物质。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中，使用的超滤离心管优选为 Millipore Ultra_153.0KD_3.8KD。
3.根据权利要求I或2所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中，毎次超滤离心后的上层截留液体积为150 μ 1-250 μ I。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中，加入超纯水的次数优选为8-10次。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述大分子物质是指參芪扶正注射液中的大分子蛋白和大分子多糖。
6.根据权利要求I至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤 (1)精密吸取參芪扶正注射液IOml置于MiIlipore Ultra-153. OKD-3. 8KD超滤离心管中，5000转离心至上层截留液剰余体积为150 μ 1-250 μ 1，往上层截留液加入超纯水5ml，用移液枪吹打混匀后，再次离心至上层截留液剩余体积为150 μ 1-250 μ 1，重复加水8 10次，毎次2ml，毎次加水后都要充分混匀再离心，直至下层洗出部分用Molish反应检测阴性，收集上层截留液，定容至IOml ； (2)采用BCA法检测注射注射液否含有大分子的蛋白质，具体方法为使用BCA蛋白试剂盒，于96孔板中加入20 μ I样品液及200 μ IBCA工作液，37°C放置30min，观察是否有紫色络合物出现；采用Molish法检测注射注射液否含有大分子的多糖物质，具体方法为小试管中加入Iml样品液和两三滴Molish试液，摇匀，沿管壁慢慢加入Iml浓硫酸，观察两层液面交界处是否有紫色环的出现。
全文摘要
本发明涉及一种检测参芪扶正注射液大分子物质的方法。该方法包括如下步骤(1)采用超滤离心法对参芪扶正注射液超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液；(2)采用BCA法和Molish法检测步骤(1)获得的上层截留液，以确定所述参芪扶正注射液否存在大分子物质。此法所采用的仪器材料及试验方法都简单常见，成本低廉，可以方便的运用于生产实际中，为产家生产过程中的质量控制提供参考，进一步保证参芪扶正注射液的安全性。
文档编号G01N31/22GK102680642SQ20121011680
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者刘学华, 彭维, 林锋, 王永刚, 苏薇薇 申请人:中山大学, 丽珠集团利民制药厂