含有pedf以及fgf2的伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗药物的制作方法

专利名称：含有pedf以及fgf2的伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用携带神经营养因子的慢病毒载体治疗伴随眼组织 细胞凋亡变性的疾患的治疗药物。技术背景对眼科领域的疾患而言，不适当的治疗会导致致盲性的重症发生。由 于没有根本性的治疗方法，不得不依赖对症疗法治疗的疾病不在少^:。最 近，发现眼科领域中一部分重症疾病的发生和恶化是与凋亡相关的。视网膜色素变性是一种多发性视网膜的视细胞层以及色素上皮层病 变，可导致凋亡发生的治愈困难的遗传性疾患。视细胞大致分为杆体和推 体两种细胞。杆体主要分布在稍微偏离视网膜中心的部位，与暗视条件下 的物体辨别以及视野的宽狭等有关。推体大多分布在视网膜中心的黄斑部 位，主要与中心视力以及色觉等有关。视网膜色素变性，由于视细胞受到 伤害，表现出夜盲，视野狭窄，视力下降的症状，随着病情发展致盲的病 例很多。视网膜色素变性中的一部分疾病是由于视细胞和视网膜色素上皮 细胞特异性功能基因异常而引起的，大部分的视网膜色素变性至今仍然原 因不明。作为目前为止已搞清的致病基因，在常染色体隐性遗传性视网膜 色素变性中已知有杆体的cGMP-磷酸二酯酶a以及b亚单位，杆体的环核 苷酸门控阳离子通道，视网膜的鸟氨酸环化酶，RPE65,细胞视黄醛结合蛋 白，停滞因子等基因。另外常染色体显性遗传性视网膜色素变性中已知有 视紫红质，盘膜边缘蛋白/视网膜緩慢变性(RDS, retinal degeneration slow 的缩略语)，杆体外节盘膜蛋白(ROMl), X-连锁视网膜色素变性中视网膜色 素变性GTP酶调节因子(RPGR)等基因。诊断是通过眼底观察(陈旧性病 例为视网膜血管狭小，粗糙的芝麻盐状视网膜，骨小体样色素沉着。非陈 旧性病例为无色素，白斑等)，视野(与向心性，环状，地图状，中心性 等病变部位对应的狭窄)，暗适应(暗适应曲线的第2次曲线阈值上升)， 视力下降，电生理学观察(视网膜电图(ERG)的振幅下降甚至消失)，荧光 眼底造影观察(视网膜色素上皮萎缩以及视网膜脉络膜萎缩引起的高焚光) 进行判断的。目前，尚无视网膜色素变性的有效治疗方法，仅仅是采用对症疗法， 但是基因治疗，视网膜移植，人工视网膜等的治疗方法的研究正在开展之 中。使用神经营养因子的基因治疗就是其中之一。据报道神经营养因子对抑制凋亡有效。神经营养因子的成纤维细胞生长因子2 (fibroblast growth factor 2: FGF2)通过使用视网膜光损伤模型(非专利文献l),视网膜色 素变性模型(非专利文献2-6),视网膜神经节细胞损伤(缺血再灌流，视 神经切断)模型(非专利文献7)等的动物实验，探讨了其对眼科领域中的 基因治疗的应用。另外，本发明人还探讨了神经營养因子之一的色素上皮 衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )在一见网膜色素变性的 治疗上的应用(非专利文献8)。本发明人们还通过向具有逆转录病毒的猴 免疫缺陷病毒(SIV: simian immunodeficiency vims )骨架的SIV载体中插 入PEDF，构建了 SIV-PEDF载体，并进行了模型动物的探讨，得到了良好 的结果(非专利文献8 )。但是，对于最终致盲的重症疾患的视网膜色素 变性，仍需要开发能发挥更高疗效的治疗方法。专利文献1 :国际申请号PCT/JP2002/005225 国际公开号 WO2002/101057专利文献2:国际申请号PCT/JP00/03955 国际公开号WO00/078987非专利文南史1: Lau D, Flannery J. Viral-mediated FGF-2 treatment of the constant light damage model of photoreceptor degeneration. Doc Ophthalmol. 2003 Jan;106(l):89-98.非专利文南足2: Akimoto M， Miyatake S, Kogishi J, Hangai M, Okazaki K, Takahashi JC， Saiki M, Iwaki M, Honda Y. Adenovirally expressed basic fibroblast growth factor rescues photoreceptor cells in RCS rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Feb;40(2):273-9.非专利文献3: Uteza Y， Rouillot JS, Kobetz A, Marchant D, Pecqueur S, Arnaud E, Prats H, Honiger J, Dufier JL, Abitbol M, Neuner-Jehle M. Intravitreous transplantation of encapsulated fibroblasts secreting the human fibroblast growth factor 2 delays photoreceptor cell degeneration in Royal College of Surgeons rats. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar
16;96(6):3126-31.非专利文献4: Neuner-Jehle M, Berghe LV， Bonnel S， Uteza Y， Benmeziane F, Rouillot JS, Marchant D, Kobetz A, Dufier JL, Menasche M, Abitbol M. Ocular cell transfection with the human basic fibroblast growth factor gene delays photoreceptor cell degeneration in RCS rats. Hum Gene Ther. 2000 Sep l;ll(13):1875-90.非专利文献5: Lau D, McGee LH， Zhou S, Rendahl KG, Manning WC, Escobedo JA, Flannery JG. Retinal degeneration is slowed in transgenic rats by AAV-mediated delivery of FGF-2. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Oct;41(ll):3622-33.非专利文献6: Spencer B, Agarwala S, Gentry L, Brandt CR. HSV-1 vector-delivered FGF2 to the retina is neuroprotective but does not preserve functional responses. Mol Ther. 2001 May;3(5 Pt 1):746-56.非专利文献7: Sapieha PS, Peltier M, Rendahl KG, Manning WC, Di Polo A. Fibroblast growth factor-2 gene delivery stimulates axon growth by adult retinal ganglion cells after acute optic nerve injury. Mol Cell Neurosci. 2003 Nov;24(3):656-72.非专利文献8: Miyazaki M, Ikeda Y, Yonemitsu Y, Goto Y, Sakamoto T， Tabata T, Ueda Y, Hasegawa M, Tobimatsu S, Ishibashi T， Sueishi K. Simian lentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigment epithelium-derived factor protects retinal degeneration and electrical defect in Royal College of Surgeons rats.Gene Ther. 2003 Aug;10(17):1503-11.非专利文献9 : Wahlin KJ， Campochiaro PA, Zack DJ， Adler R. Neurotrophic factors cause activation of intracellular signaling pathways in Muller cells and other cells of the inner retina, but not photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 ;41(3):927陽36.非专利文献10: Valter K, van Driel D, Bisti S, Stone J. FGFRl expression and FGFRl-FGF-2 colocalisation in rat retina: sites of FGF-2 action on rat photoreceptors. Growth Factors. 2002 ;20(4): 177-88.

发明内容
本发明为鉴于这种状况的发明，本发明要解决的问题是发现一种新的 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗方法。本发明人为彻底解决上述问题，进行了锐意研究，想到了用两种神经营养因子PEDF和FGF2进行同时给药的方法。通常认为PEDF和FGF2 的作用部位相异。PEDF的作用部位为视网膜的视细胞以及神经节细胞，而 FGF2的作用部位则有FGF2受体位于视网膜的内颗粒层的报道(非专利文 献9 )和位于视细胞的报道(非专利文献10 )。如果进行PEDF和FGF2的 同时给药的话，通过两者的协同作用，与以往相比可以获得更好的效果。 本发明人构建了 SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体。SIV载体是以猴免疫 缺陷病毒作为骨架的载体，由于可能使导入的外源基因在宿主内持续表达， 在慢性疾病的治疗中，能够提供特别适当的药物传输。在RCS大鼠视网膜 色素变性疾病模型的网膜下腔进行上述载体给药，并对其效果进行了探讨。 载体给药4周后，摘取大鼠后眼部分，对PEDF以及FGF2的表达量进行了 测定，证实SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2载体给药可以致使hPEDF以及hFGF2 基因表达。另外，在计数残存视细胞数量时，可以观察到单独给药组也有 视细胞保护效果，同时给药组比单独给药组有更显著的视细胞保护效果。 进而，通过视网膜电图对视网膜的功能进行了评价，表明单独给药组，同 时给药组这两组都有功能维持的作用，但是同时给药组的效果与单独给药 组相比具有更加显著的效果。而且，在载体给药8周后以及12周后，也表 明SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体的同时给药有显著的神经保护效果。本 发明人从上述结果首次发现，PEDF以及FGF2的同时给药对视网膜色素变 性疗效有更高的效果。PEDF以及FGF2的同时给药不仅仅对视网膜色素变 性，而且对伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗也是有效的。也就是说， 本发明是通过FGF2以及PEDF的同时给药对伴随眼组织细胞凋亡变性的疾 患进行治疗的，并就以下的发明进行更加具体的说明。[1] 一种伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患治疗用药品，其特征是与 药学可使用的介质一起，包含下述(a)到(d)的任意 一种。(a) 色素上皮书f生因子(Pigment印ithelium derived factor: PEDF )基 因以及成纤维细胞生长因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )基因(b) 色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF)蛋 白质以及成纤维细胞生长因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )蛋白质 (c) 色素上皮书亍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基 因以及成纤维细胞生长因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )蛋白质(d) 色素上皮书亍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )蛋 白质以及成纤维细胞生长因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 )基因[2] 项[l]中记述的药品，其特征是包含带有PEDF基因以及FGF2 基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的药品，该PEDF基因以及FGF2基因分别 由不同的重组猴免疫缺陷病毒载体带有，或者由一个重组猴免疫缺陷病毒 载体带有。[3] 项[2]中记述的药品，其特征是包含带有PEDF基因的重组猴免 疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体。[4] 项[2]中记述的药品，其中，包含带有PEDF基因以及FGF2基因 的重组猴免疫缺陷病毒载体。[5] 项[2]到[4]的任意一项中记述的药品，其中，猴免疫缺陷病毒载体 包含cPPT序列和/或WPRE序列。[6] 项[2]到[5]的任意一项中记述的药品，其中，猴免疫缺陷病毒载体 用VSV-G进行假型化。[7] 项[2]到[6]的任意一项中记述的药品，其中，猴免疫缺陷病毒载体 是来源于agm抹。[8] 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用试剂盒，其特征是包 含带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物、以及包含带有 FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物。[9] 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用试剂盒，其特征是内 含包含带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合 物。[10〗 项[1]到[7]的任意一项中记述的药品或者权利要求[8]或者[9]中 记述的试剂盒，其特征是伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患是指视网膜色 素变性，青光眼、视网膜脱落、视网膜缺血性疾病中的任意一种。[11] 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗方法，其特征是用 PEDF以及FGF2或者编码它们的基因进行给药。[l2] 项[ll]中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因的重组 猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行 给药。[13] 项[12]中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因的重组 猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒栽体进行 视网膜下腔给药。[14] 项[ll]中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因以及 FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行给药。[l5] 项[1司中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因以及 FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行一见网膜下腔给药。[16] 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法，其 特征是包括利用包含在序列号1所记述的碱基序列中插入PEDF基因 的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载 体的工艺。[17] 项[16]中记述的方法，其特征是包括利用包含序列号2所 记述的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病 毒载体的工艺。[18] 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法，其 特征是包括利用包含在序列号1所记述的碱基序列中插入FGF2基因 碱基序列的基因转移载体制备带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体 的工艺。[19] 项[18]中记述的方法，其特征是包括利用包含序列号3所 记述的碱基序列的基因转移载体制备带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病 毒载体的工艺。[20] 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法，其 特征是包括利用含在序列号1所记述的碱基序列中插入PEDF基因以 及FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因以及FGF2基 因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺。[21] 项[16]到[20]中的任意一项中记述的方法，其特征是包括向导 入有包含序列号4所记述的碱基序列的包装载体的包装细胞导入该基因 转移载体的工艺。示意图的简单说明


图1:为改造型基因转移载体，改造型包装载体，rev表达载体，VSV-G表达载体结构的示意图。图2A:由原始型基因转移载体构建改造型基因转移载体的工艺的示意图。(cx)表示下接图2B的工艺。图2B:为图2A的延续图。(a)表示上接图2A的工艺。图3:由原始型包装载体构建改造型包装载体工艺的示意图。图4A: rev表达载体的构建工艺的示意图。((3)表示下接图4B的工艺。图4B:表示图4A的延续图。(p)表示上接图4A的工艺。图5: (a)为原始型基因转移载体中cPPT单独，WPRE单独，cPPT以及WPRE同时携带的载体结构的示意图。(b)MOI为15的感染情况下，利用cPPT单独，WPRE单独，cPPT和WPRE同时携带的各种基因转移载体时，观察到的SIV载体产量的照片。左上原始型的无cPPT,WPRE的载体(对照)(-cPPT,-WPRE )，右上cPPT单独携带(十cPPT，-WPRE ),左下WPRE单独携带(-cPPT,十WPRE ),右下cPPT,WPRE同时携带(+cPPT，+WPRE )。图6:为利用cPPT单独，WPRE单独，cPPT和WPRE同时携带的各基因转移载体时，用外源基因(EGFP)阳性细胞数目比例对SIV载体的产量进行探讨的结果。(a) 表中的MOI表示的是每个细胞中所感染的载体粒子数目，0.3, 1.5, 7.5, 15表示的是实际进行感染实验的M01 (载体粒子数量/细胞数目)的数 值。在cPPT或者WPRE后面添加的(+ )号表示的是载体中含有cPPT或 者WPRE，(-)号表示的是载体中不含cPPT或者WPRE。表中数字为EGFP 阳性细胞的比例(百分率％)。(b) 图为(a)表的数值图形化表示。图的纵坐标表示的是EGFP阳性细胞 的比例(百分率％)。图7:表示的是MOI为15的感染情况下，利用cPPT单独，WPRE单 独，cPPT和WPRE同时携带的各种基因转移载体时，基因导入细胞中相对 细胞数量的蛋白表达量的比较结果。数值表示的是荧光强度的相对值(为 蛋白表达量的比较尺度)。图8:是表示对RCS大鼠进行SIV-hPEDF载体单独给药，SIV-hFGF2 载体单独给药，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体同时给药，并且同时给与SIV-EGFP的情况下，hPEDF蛋白质的表达量以及hFGF2蛋白质的表达量 的图形。图9:是表示对RCS大鼠进行SIV-hPEDF载体单独给药，SIV-hFGF2 载体单独给药，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体同时给药，并且同时给与 SIV-EGFP的情况下，给药后4周的残存视细胞数量的图形。图10:是表示对RCS大鼠进行SIV-hPEDF载体单独给药，SIV-hFGF2 载体单独给药，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体同时给药，并且同时给与 SIV-EGFP的情况下，给药后8周的残存视细胞数量的图形。图11:是表示对RCS大鼠进行SIV-hPEDF载体单独给药，SIV-hFGF2 载体单独给药，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体同时给药，并且同时给与 SIV-EGFP的情况下，给药后12周的残存视细胞数量的图形。图12:是表示对RCS大鼠进行SIV-hPEDF载体单独给药，SIV-hFGF2 载体单独给药，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体同时给药，并且同时给与 SIV-EGFP的情况下的视网膜电图的结果图。图13:是表示对RCS大鼠进行SIV-hPEDF载体单独给药，SIV-hFGF2 载体单独给药，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体同时给药，并且同时给与 SIV-EGFP的情况下的视网膜电图的结果图。发明的具体实施方式
本发明涉及一种利用色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )以及成纤维细胞生长因子2 ( fibroblast growth factor 2: FGF2 ) 治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药品。本发明人着眼于PEDF和 FGF2的凋亡抑制作用的靶细胞的不同，对于伴随眼组织细胞凋亡变性的疾 患，PEDF或者FGF2的同时给药比它们任意的单独给药都有更加显著的效 果。在本发明的药品中所包含的PEDF和FGF2，即可以是蛋白质，也可以 是基因。人类PEDF(hPEDF)蛋白质的氨基酸序列用序列号5,人类FGF2 (hFGF2)蛋白质的氨基酸序列用序列号6来表示。另外hPEDF的cDNA 序列用序列号7， hFGF2蛋白质的cDNA序列用序列号8来表示。包含在本发明的医药品中的PEDF基因和FGF2基因可以用实验室常规 方法进行制备。例如可以将序列号7或者序列号8中记述的碱基序列 的一部分或者全部作为^l笨针，通过人^L网膜色素上皮细胞的cDNA文库进 行制备。或者将序列号7或者序列号8中记述的碱基序列的一部分作为 引物，用人视网膜色素上皮细胞的mRNA作为模板，使用常用的核酸扩增 法可进行制备。从上述基因制备本发明的药品的情况下，即使DNA的状态 不错，但是最优选的是处于插入载体状态的。PEDF基因以及FGF2基因可 以分别由不同的载体带有，也可以同时由一个载体带有。作为药品使用的 载体种类，只要是完全符合安全的载体是没有限制的，但最好是慢病毒载 体，最优选的是猴免疫缺陷病毒载体。病毒的生命周期大致分为感染和增殖两个阶段。其特征在于， 一般来 说病毒载体利用病毒的感染系统，可将基因高效地导入宿主细胞内。为确 保安全性，去除了多数病毒载体的增殖系统，使其缺失自我复制能力，防 止在导入的细胞内增殖。对载体粒子的结构做一 筒单的说明，载体粒子中有被称作衣壳的蛋白 质外壳。衣壳是由gag基因产物的结构蛋白质构成的。其衣壳的外侧有称作 被膜的膜结构。被膜具有决定所感染细胞种类的功能。在衣壳中，存在2 份载体基因组RNA拷贝和pol基因产物的逆转录酶。病毒载体一旦感染宿 主细胞，载体基因组RNA就会通过自己的上述逆转录酶进行逆转录，之后 整合进宿主染色体，成为前病毒DNA,而具有感染能力。一般来说病毒载体可以通过包装载体和基因转移载体进行制备。包装 载体携带有除去了包装信号的病毒DNA。病毒DNA含有病毒蛋白质序列。 将包装载体导入宿主后，在宿主细胞(包装细胞)中，由于没有包装信号， 形成空的病毒颗粒。另一方面，基因转移载体携带有整合进宿主染色体DNA 所必需的来源于病毒的基因序列及要导入的外源基因。将这个基因转移载 体导入到包装细胞后，由基因转移载体提供的载体基因组DNA被整合进宿 主染色体，通过转录形成载体基因组RNA。该载体基因组RNA被包埋进包 装细胞产生的病毒颗粒中，生成具有导入核酸分子进入宿主内部能力的病 毒颗粒。在本发明中的"病毒载体"是指缺乏自我复制能力，具有将核酸分子 导入宿主内部的能力的病毒颗粒。"重组"病毒载体是指通过基因重组技 术构建的病毒载体。利用编码病毒基因组的DNA和包装细胞构建的病毒载 体包含在重组病毒载体中。本发明中的"猴免疫缺陷病毒(SIV)载体"是指在病毒颗粒中的核酸
分子内，作为病毒载体功能所必需的序列为SIV基因组由来序列的载体。 本发明中的"作为病毒载体功能所必需的序列，，是指从5，端开始顺次为5'LTR的R区域、U5区域，包装信号(cp) ， RRE, 3'LTR的启动子区域 以外的U3区域，R区域序列。从5，LTR区域开始到包装信号的碱基序列表 示为序列号9, RRE序列表示为序列号10,缺失3'LTR的启动子区域的 U3区域到R区域的碱基序列表示为序列号11。本发明中的SIV载体只要 与上述定义相符也可加以改造，例如，"作为病毒载体功能所必需的序列" 只要来自SIV,其他来自SIV的序列或者来自SIV以外的序列也可以包含 在内。作为可包含的最适序列来讲，例如可以列举后面记述的cPPT ( central polypurine tract), 内鲁卩启动子(CMV) ， WPRE ( woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。在本发明中，猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency vims; SIV )包 括有SIV的所有抹以及其亚型。作为SIV单离林来说，可以例举出SIVagm, SIVcpz， SIVmac， SIV腿d， SIVsm, SIVsnm, SIVsyk等来，但并不仅仅于 这些病毒抹。猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Vims, SIV)是作为猴子的 HIV样病毒被发现的，与HIV —起构成灵长类慢病毒(Primates Lentivims ) 群(井户荣治，速水正宪，fvL免疫不全々O义co遺伝子t感染 病原性. 蛋白质核酸酵素Vol,.39,No.8. 1994)。进而这个群又大致分类为四个群 1)包含成为人类获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome, AIDS )病因的HIV-1和从黑猩猩分离的SIVcpz的HIV-1群，2)从 白顶白眉浙吳(Cercocebus atys )分离的SIVsmm和《弥浙吳(Macaca mulatta )分 离的SIVmac，以及对人类感染频率较低的，具有病原性的HIV-2 ( Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retroviral., 16(5), 327-32, 1997 )构 成的HIV-2群，3)由非洲绿猴(Cercopithecus aethiops )分离出来的SIVagm 为代表的SIVagm群，4)由山魈(Papio sphinx)分离出来的SIVmnd为代 表的SIVmnd群组成。其中，SIVagm以及SIVmnd没有自然宿主的病原性才艮道(Ohta， Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1)， 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol" 18(3-4)， 255-9， 1989;速水正宪，日本临床，47, 1， 1989 ),特别是在本实施例 中使用的SIVagm中的一种TYO-1抹，据报道即使是在自然宿主中，对食
蟹猴(Macaca facicularis ),猕猴 (Macaca mulatta)的感染实验中也为表 现出病原性(Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6)， 367-84， 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1)， 9-20， 1990)。由于没有关于SIVagm对人类感染，致 病的报道，对人类的病原性不得而知， 一般来说，灵长类的慢病毒有很高 的种特异性，从自然宿主致使其他种类感染，致病的病例很少，并且具有 其致病频率低或者进程緩慢的倾向。(Novembre， F. J. et al., J. Virol" 71(5), 4086-91,1997 )。因此，以SIVagm、特别是SIVagm TYO-l抹为基础制备 的病毒载体同以HIV-1以及其他慢病毒为基础制备的载体相比，安全性更 高，最适合在本发明中使用。SIVagm TYO-l林的基因组碱基序列用序列号 12来表示。本发明的猴免疫缺陷病毒载体可以拥有其它逆转录病毒的基因组RNA 序歹'J的一部分。例如，具有人类免疫在夹陷病毒(Human Immunodeficiency Virus; HIV)，猫免疫在夹陷病毒(Feline Immunodeficiency Vims: FIV) (Poeschla, E. M. et al.， Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998 )，山羊关节炎脑 炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus: CAEV ) ( Mselli-Lakhal， L. et al" Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998 )等其他慢病毒基因组序列的一部分与猴免 疫缺陷病毒基因组一部分相置换而成的嵌合序列的载体也包含在本发明的 猴免疫缺陷病毒载体中。带有本发明的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor: PEDF )基因的重組猴免疫缺陷病毒载体(SIV-PEDF载体)是指携带PEDF 基因的重组SIV载体。另外带有本发明的FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒 载体(SIV-FGF2载体)是指携带FGF2基因的重组SIV载体。还有带有本发 明的PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体是指携带PEDF 基因和FGF2基因两种基因的重组SIV载体。本发明的SIV-PEDF载体只要 符合上述定义，是与种类以及结构无关的，最优选的例子可例举利用包含 在序列号1中记述的碱基序列中插入PEDF基因碱基序列的基因转移载体 来制备SIV载体，更优选的例子可例举利用包含序列号2中记述的碱基序 列的基因转移载体制备的SIV载体。同样，本发明的SIV-FGF2载体只要符 合上述定义，是与种类以及结构无关的，最优选的例子可例举利用包含在 序列号1中记述的碱基序列中插入PEDF基因碱基序列的基因转移载体制 备SIV载体，更优选的例子可例举利用包含序列号3中记述的碱基序列的
基因转移载体制备SIV载体。另外同样，带有本发明的PEDF基因以及FGF2 基因的重组猴免疫缺陷病毒载体只要符合上述定义，是与种类以及结构无 关的，最优选的例子可例举利用包含在序列号l中记述的碱基序列中插入 PEDF基因以及FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备SIV载体。带有SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的本发明的PEDF基因和/ 或FGF2基因的SIV载体可以进行VSV-G假型化。VSV-G假型化是指，使 载体的被膜包含水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus; VSV)的表面糖 蛋白质VSV-G蛋白而言的。VSV-G蛋白可以是来源于任意VSV抹的蛋白。 例如，可以使用来自Indiana血清型毒抹(J. Virology 39: 519-528 (1981)) 的VSV-G蛋白，但不仅局限于此。另外，VSV-G蛋白可以是天然蛋白质的 衍生物，通过一个或者多个氨基酸发生置换、缺失、和/或增加等得到的修 饰蛋白。VSV-G假型化载体可以在病毒产生时通过与VSV-G蛋白共存来制 备。例如，通过VSV-G表达载体的转染，来自整合入宿主染色体DNA的 VSV-G基因的表达诱导，或者通过使VSV-G在包装细胞内进行表达，经由 这个细胞产生的病毒颗粒可以被VSV-G假型化。由于VSV-G蛋白质是一 种糖蛋白会形成一种稳定的3聚体，存在于细胞膜上，因此纯化过程中不 会引起载体粒子的破坏，可以用离心进行高浓度的浓缩(Yang, Y. et al., Hum GeneTher: Sep, 6(9), 1203-13. 1995 )。SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的带有本发明的PEDF基因和/ 或FGF2基因的SIV载体可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如， 作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白 质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白等。作为 这种逆转录病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白，例如可以使用来自小鼠白血病病 毒(MuMLV ) 4070A抹的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10A1 的净皮月莫蛋白(例如pCL-lOAl(Imgenex) ( Naviaux, R. K. et al.， J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。另外，作为疱渗病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性 疱瘆病毒的gB, gD, gH, gp85蛋白，EB病毒的gp350, gp220蛋白等。 作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。对于本发明的重组猴免疫缺陷病毒载体来说，可以对LTR( long terminal repeat)进行改造。LTR为逆转录病毒特征性序列，位于病毒基因组的两端。 5'LTR作为启动子发挥作用，促进来自前病毒的mRNA转录。因此，如果 将包装在病毒颗粒内带有编码病毒RNA基因组的基因转移载体的5'LTR的 启动子活性的部分置换为其它的强有力的启动子的话，可增加基因转移载 体的mRNA转录量，提高包装效率，使载体滴度提高。进而，例如慢病毒 的情况下，已知5' LTR的转录活性被病毒蛋白tat促进，将5' LTR置换成 不依赖tat蛋白的启动子时，可以从包装载体中删除tat。另外，感染细胞并 侵入细胞内的病毒RNA发生逆转录后，形成使两端的LTR结合在一起的环 状结构，结合部位与病毒的整合酶偶联，而被整合进细胞的染色体中。由 前病毒转录的mRNA是从5' LTR内的转录起始点开始至下游3' LTR的 polyA序列，5'LTR的启动子部分未被包装在病毒内。因此，即使置换启动 子，插入把细胞染色体的部分也不发生变化。综上所述，5' LTR的启动子 的置换实现了更高的滴度与更高安全性的载体制备。因此，可以进行基因 转移载体的5'端启动子的置换，提高被包装载体的滴度。另外，删除部分3'LTR的序列，通过制备防止靶细胞载体全长mRNA 转录的自我失活型载体(Self Inactivating Vector : SIN载体)，可以提高其 安全性。侵染到靶细胞染色体的慢病毒的前病毒形成3' LTR的U3部分与 5'端结合的形式。因此，基因转移载体的转录产物在逆转录后，处于整合 进耙细胞染色体的状态，U3定位于5'端，在此与来自基因转移载体的转录 产物具有同样结构的RNA可以被转录。假设在靶细胞内有慢病毒或者其类 似蛋白质存在的情况下，转录的RNA被再次包装，有可能对其他细胞进行 再次感染。另外通过3'LTR的启动子，位于病毒基因组的3'端的来自宿主 的基因有可能一皮表达(Rosenberg, N.， Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997 )。这种现象 在逆转录病毒载体中已经被视为一种问题，作为回避方法，开发了 SIN载 体(Yu, S. F. et al,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(10)， 3194-8， 1986)。通过使 基因转移载体上的3' LTR的U3部分缺失，令靶细胞内没有5' LTR及3' LTR 的启动子，就不会发生全长RNA及宿主基因的转录。然后，只有来自内部 启动子的目的基因进行转录，以实现安全性提高，以及载体表达提高。这 样的载体最适用于本发明。SIN载体的构建可以按照常规方法或者本发明人 的专利申请国际公开号WO2002/101057 (专利文献1 )的实施例1-4中记 述的方法等进行。使用逆转录病毒载体等在其基因组中包含LTR序列的病毒载体进行基
因治疗的问题之一是导入的基因表达逐渐下降。原因之一是这些载体一旦被整合进宿主基因组中，由于宿主的作用机理造成其LTR被甲基化，导入 基因的表达受到抑制。(Challita， P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994)。自我失活(SIN)型载体一旦被整合进宿主基因组就 会丢失大部分LTR序列，优点是不受LTR甲基化引起的基因表达钝化的影 响。本发明人通过将基因转移载体的3'LTR的U3区域置换为其他启动子序 列制备的自我失活型载体，在导入进灵长类ES细胞之后，已证实可以维持 两个月以上的稳定表达(专利文献1 )。这样，通过改造LTRU3区域进行 自我失活设计的SIN载体特别适用于本发明。具体来说，3'LTR的U3区域 的1或者多个碱基通过置换，缺失，和/或增加等进行改造的载体归属于本 发明。这个U3区域既可以仅为缺失，或者也可以为在该区域内插入其它的 启动子。作为这样的启动子来说，例如可以列举出CMV启动子、EF1启动 子、或者CAG启动子等。另外，最优选的设计为通过LTR以外的启动子转录编码本发明载体的 PEDF基因以及FGF2基因。例如，如上所述，将LTRU3区域置换成非LTR 启动子的情况下，最优选的是，通过这种改造的LTR驱动PEDF基因或者 FGF2基因的表达。或者如实施例所示，在与LTR区域不同的位置上加入非 LTR启动子，通过连接其下游PEDF基因或者FGF2基因，可以诱导非LTR 依赖的PEDF基因或者FGF2基因的表达。本发明人，通过构建非LTR启 动子驱动的外源基因表达的SIV载体表明在ES细胞中的外源基因可以长期 稳定地表达(专利文献l )。同样，在PEDF基因或者FGF2基因的上游连 接非LTR启动子，由该启动子导致的PEDF基因或者FGF2基因转录的载 体特别适用于本发明。作为非LTR启动子来说，例如可列举出CMV启动 子，EF1启动子，或者CAG启动子，尤其是CMV启动子最好。在本实施 例中使用的CMV启动子的碱基序列用序列号13来表示。这样的载体， 尤其是在上述自我失活(SIN)型载体构建中会发挥较高的效果。以HIV载体为首的慢病毒载体，在宿主基因组带有全部HIV前病毒的 情况下，有报道指出外源载体和内源性前病毒之间会发生重组，担心会不 会出现可复制的病毒。这在将来实际给HIV感染患者使用HIV载体时确实 是一个很大的问题。这次使用的SIV载体由于几乎没有与HIV相同的序列， 是删除掉80 %以上的病毒来源序列的不可复制病毒，因此这种危险性极小， 与其他慢病毒载体相比安全性很高。本发明的SIV-PEDF载体和SIV-FGF2 载体是一定程度之上删除了上述"作为病毒载体功能所必需的序列，，以外 的SIV基因组序列的载体，最优选的是这个载体中来源自SIV基因组序列 的40。/。以上，或者是50%以上，或者是60%以上，或者是70%以上，更 优选的是80%以上被删除掉的不可复制病毒。在逆转录病毒的产生中，使宿主细胞中具有包装信号的基因转移载体 DNA发生转录，在gag, pol蛋白以及被膜蛋白质存在的情况下，形成病毒 颗粒。包装细胞内的gag,pol蛋白可以使用包装载体进行提供。被膜蛋白也 可由包装载体进行提供，也可以由其他载体进行提供。例如实施例所示， 可以由VSV-G表达载体进行提供。本发明的基因转移载体最基本地要具有5'LTR,包装信号序列，PEDF 基因和/或FGF2基因，以及3 ，LTR序列。LTR序列可以进行上述的SIV载 体改造的LTR改造。另外，也可以加入上述的cPPT序列，CMV序列，RRE 序列等。基因转移载体DNA中编码的包装信号序列为了能维持该序列形成 的结构功能，最好尽可能长地被加入进去，另一方面，为了抑制该载体DNA 上的包装信号与供给gag， pol蛋白的包装载体之间发生重组出现的野生型 病毒的频率，需要将这些载体间的重复序列控制在最小限度范围内。因此， 在基因转移载体DNA的构建中，为了使包装效率以及安全性二者都得到满 足，最好使用包含有尽可能短的包装所必需的序列，。例如，使用来自SIVagm的包装载体的情况下，由于来自HIV的基因 转移载体未被包装，因此，作为用于基因转移载体DNA的包装信号来源， 只受SIV的限制。但是，使用来自HIV的包装载体的情况下，由于来自SIV 的基因转移载体也会被包装，使重组病毒的出现频率下降，所以可以将来 自不同慢病毒的基因转移载体和包装载体进行组合并形成载体粒子。如此 制备的SIV载体也包括在本发明的载体中。在这种情况下，最优选的是灵 长类慢病毒之间产生的组合(例如，HIV和SIV)。在基因转移载体DNA中，最好将gag蛋白改造为非表达。病毒gag蛋 白对于生命体来说，被作为异物识别，有可能表现出抗原性。另外，也有 可能影响到细胞的功能。要使gag蛋白不表达，可以通过gag起始密码子的 下游碱基的增加或者缺失等进行框移改造。另外，最好是在gag蛋白的编码 区域产生部分缺失。 一般来说，在病毒的包装中，gag蛋白的编码区域的5'
端是必要的。因此，在基因转移载体中，最好是使gag蛋白质的C末端的 编码区域缺失。在不对包装效率产生很大影响的范围内，尽可能大范围地删除gag编码区域。另外，最好将gag蛋白的起始密码子(ATG)置换成 ATG以外的密码子。置换的密码子应适宜地选"^奪对包装效率没有影响的。 具有依此构建的包装信号的基因转移载体DNA,通过导入到适当的包装细 胞中，就可以进行病毒载体生产了。产生的病毒载体比如可以从包装细胞 的培养上清中进行回收。进而，在基因转移载体DNA中，最好进行以提高PEDF基因以及FGF2 基因的导入效率以及表达效率的改造。比如进行提高导入效率的改造例子， 可以列举cPPT序列的导入。cPPT原本是存在于SIV基因组的一个序列。 在HIV病毒中很久以前就有报道(P.Charneau et al. : J.Virol 65: 2415-2431, 1991),报道指出，在HIV载体中导入cPPT后，载体基因组向细胞核的移 动加快，基因导入效率提高(A.Sirvenetal. : Blood 96:4103-4110, 2000)。在 本实施例中使用的cPPT碱基序列用序列号14来表示。另外作为提高表达 效率的改造例子，可以列举WPRE序列的导入。WPRE是具有提高基因表 达步支率功能的因子(US Patent 6284469 : RNA export element and methods of use)。有报道指出在其它的慢病毒载体中，同时导入cPPT和WPRE两个 因子，最终可以进一步提高各自的效果(SC. Barry etal. : Hum. Gene Ther. 12: 1103-1108,2001)。在本实施例中使用的WPRE碱基序列用序列号15来表 示。带有SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的本发明的PEDF基因和/ 或FGF2基因的SIV载体中，cPPT可以采用与常见的慢病毒载体的定位一 样的定位。例如、cPPT可以定位在启动子与外源基因之间，或者定位在RRE 序列的上游，最好是定位在驱动PEDF转录的上述非LTR启动子的上游。 WPRE可以定位在PEDF或者FGF2基因的下游。作为这种基因转移载体最 好的具体实例，可以例举出使用包含在序列号l中记述的碱基序列中插入 PEDF基因的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体，使用包含在序列号 1中记述的碱基序列中插入FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备的 SIV载体，以及使用包含在序列号1中记述的碱基序列上插入PEDF基因 和FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体；更好的例子为， 使用包含序列号2中记迷的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体，使 用包含序列号3中记述的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体。
在本发明中，包装载体可以使用删除了对PEDF基因和/或FGF2基因 的导入非必需序列的载体。作为非必需序列，可以列举出被称作修饰基因 的vif,vpr和调控基因的tat,rev。有报道指出修饰基因产物在载体中是非必 需的(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998),近年来，为了提高安全性，经 常使用删除了修饰基因的载体。另外，tat也可删除，rev可用其它质粒移走， 使安全性进一步提高，是开发中的所谓第三代载体。从包装载体中去除掉 rev的情况下，可以另外构建rev表达载体，在SIV-PEDF载体和SIV-FGF2 载体等的带有本发明的PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体制备中可以 使用该rev表达载体。SIVagm TYO-1抹的rev碱基序列用序列号16来表 示。按上述方法构建的包装载体，例如，可以进行包括启动子序列、病毒 核心蛋白质序列(gag)、逆转录酶序列(pol) 、 polyA序列在内的构建， 如实施例所示，上述构建也可以再加上RRE序列。另外rev表达载体可以 将调控该序列的启动子放置在rev序列的上游、将polyA序列放置在rev序 列的下游进行构建。作为用于包装细胞的细胞来说，通常来讲只要是用于病毒生产的细胞 抹都可以。考虑到应用于人类的基因治疗，细胞来源以人类的或者猴子的 较为适宜。可以用作包装细胞使用的人类细胞抹，例如包括293细胞，293T 细月包，293EBNA细胞，SW480细胞，u87MG细胞，HOS细胞，C8166细 胞，MT-4细胞，Molt-4细胞,HeLa细胞，HT1080细胞，TE671细胞等。来源于猴子的细胞抹，例如，COS1细胞，COS7细胞，CV-1细胞，BMT10细胞等。SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等本发明的带有PEDF基因和/或 FGF2基因的SIV载体实质上可以进行完全纯化。纯化方法包括过滤器过滤， 离心分离，以及柱层析纯化等已知的纯化/分离方法来进行。例如将载体悬 液通过0.45)am的过滤器进行过滤后，42500xg、 90分钟，4。C下进行离心， 可以对载体进4亍沉淀和浓缩。另外如上所述，本发明的药品可以利用PEDF蛋白质和FGF2蛋白质进 行制备，PEDF蛋白质和FGF2蛋白质其cDNA用有关人员常用的方法进行 制备，可以将该cDNA插入到适当的表达载体，导入进宿主细胞进行表达。 这些cDNA可以分别由不同的载体带有，也可以同时由 一个载体带有。cDNA 的制备如上述所示。表达载体可以选择适宜的宿主细胞进行。本发明的药品可以用于伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗以及预 防。例如可以用于视网膜色素变性，青光眼，视网膜脱落，视网膜缺血性 疾患的治疗及预防，特别是适用于视网膜色素变性的治疗及预防。上述SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的带有PEDF基因和/或FGF2基因 的SIV载体根据需要与药学可使用的所希望的载体材料或者介质进行适当 的组合，可以作为上述疾患的药品。"药学可使用的介质"是指可以与载 体共同给药，所述介质对基因的导入没有统计学意义上的抑制的材料。具 体来讲，例如可以考虑使用灭菌水，生理盐水、培养基，血清，生理盐水 的磷酸盐緩沖液(PBS)等适当的组合。此外，其它的还可以含有稳定剂、 杀菌剂等。本发明的药品的形态为PEDF蛋白以及FGF2蛋白或者为存在于 同 一介质中的SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体的混合物，可以作为 一种 药品使用。将SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体作为一个混合物时，可以 将各个载体在确保如下所述的给药量的范围内进行配合。或者分别将 SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体作为混合物进行制备，也可以作为含有 两种混合物的治疗用试剂盒使用。PEDF以及FGF2的基因、蛋白质都可以 作为同样的试剂盒使用。将PEDF蛋白以及FGF2蛋白作为本发明的药品时 的介质材料以及形态与使用载体时的情况是相同的。将含有本发明的SIV-PEDF以及SIV-FGF2的治疗药品进行给药的情况 下，只要能获得抑制视网膜凋亡变性的效果，对给药途径没有特别要求， 最好是视网膜下腔给药，玻璃体内给药，前房内给药，更优选的是视网膜 下腔给药。包含本发明的SIV-PEDF和SIV-FGF2的药品的给药量(每一个 眼球用量)，例如可以是2.5xl05TU-2.5xl08TU , 最优选用量是 5.0xl05TU-5.0xl07TU。另外，在本说明书中引用的全部前期技术文献都作为参考编入本说明 书中。实施例以下依据实施例对本发明进行更具体的说明。最重要的是，本发明并 不局限于以下的实施例。 实施例1VSV-G假型SIV载体的构建载体的构建使用了如图1中所示的4种质粒(基因转移载体，包装载 体，rev表达载体，VSV-G表达载体)。关于其中基因转移载体，包装载体， 及rev表达载体这3种，它们是通过改造原始型载体质粒(PCT/JP00/03955 ) 而制备的。关于VSV-G表达载体使用没有经过改造的原有型载体。在质粒制备时，使用了市场上出售的各种试剂盒。限制性内切酶使用 New England Biolabs公司的产品，质粒DNA的提耳又，纯化，回收使用 QIAGEN的试剂盒(QIAquick PCR purification kit, QIAquick Nucleotide Removal kit, QIAquick Gel extraction kit, Plasmid Maxi kit )。 PCRl吏用TaKaRa 的EX Taq酶，使用的引物对外委托厂商(SIGMA GENOSYS JAPAN )合成。 DNA末端的脱磷酸化使用Takara的碱性磷酸酶(来自E.coli C75)。连接时使 用Takara的DNA Ligation kit ver.2,转化使用TOYOBO的DH5a COMPETENT high感受态纟田月包。1-1.基因转移载体的改造向原始型基因转移载体中导入cPTT(中心多嘌呤管道，central polypurine tract)以及WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控因子，woodchuck hepatitis vims posttranscriptional regulatory element), 以改造基因4争一多载体的'性能(图 2A,B)。使用的原始型基因转移载体为非病原性的非洲绿猴免疫缺陷病毒 的克隆抹SIVagm作为基本载体，顺次具有5，LTR区域，RRE, CMV (巨 细胞病毒，cytomegalovirus )启动子，EGFP(增强型绿色荧光蛋白，enhanced green fluorescent protein )基因，3 ，LTR。该原始型基因转移载体是由本发明 人构建出来的载体，并已对构建方法等进行了报道(专利文献2)。该原始 型基因转移载体的碱基序列用序列号17来表示。具体的载体改造方法如下。首先，用限制性内切酶SacII酶切原始型的 基因转移载体，样品进行电泳，去除CMV启动子和EGFP基因后，进行自 我连接。其次，为了消除质粒的Not I位点，用NotI酶切上述载体，将酶 切末端用T4DNA聚合酶进行平滑化处理，并进行自我连接。接下来，将上述载体用限制性内切酶SacII酶切，进行BAP处理，将 酶切末端脱磷酸化处理。以原始型的基因转移载体作为模板，用引物1F(序 列号18)和1R(序列号19)进行PCR反应，将PCR产物用SacII酶 切，制备在CMV启动子(序列号13)的末端添加上SacII位点的片断。 将该CMV启动子片断连"t妄到BAP处理的上述载体的Sac II位点。将载体依次用Notl、 BamHI进行酶切，在其酶切位点将两种合成的寡 聚DNA2F (序列号20)和2R (序列号21 )进行退火制备好的接头连接 上，以改变限制性内切酶的位点。将载体用限制性内切酶SacII酶切，进行 BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处理。为了得到导入用的cPTT片断(序列号14),以含有SIVagmTYOl 基因组(序列号12)的质粒pSA212作为模板，用引物3F(序列号22) 和3R(序列号23)进行PCR反应。将该PCR扩增片断的末端用SAC II 酶切，制备成在cPPT的两端添加有SACII位点的片断。将cPPT片断连接 到BAP处理的上述载体的Sac II位点上。将载体用BamHI酶切，进行BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处理。 为了得到导入的WPRE片断，以装有WPRE cDNA (序列号15 )的质粒 作为模板，用引物4F(序列号24)和4R(序列号25)进行PCR反应。 将得到的PCR扩増产物的末端用BamH I和Bgl II酶切，制备成在WPRE 的末端添加有限制性内切酶位点的片断。将上述WPRE片断连接在载体的 BamHI位点上，最终得到无携带基因的改造型基因转移载体(序列号1)。制备携带基因片断，并加入到上述的改造型基因转移载体Notl部点上。 EGFP片断以装有EGFPcDNA (序列号26)的质粒作为模板，用引物5F (序列号27)和5R(序列号28)进行PCR反应，用Not I酶切进行制 备。FGF2片断以装有hFGF2cDNA (序列号8)的质粒作为模板，用引 物6F(序列号29)和6R(序列号30)进行PCR反应，用NotI酶切进 行制备。PEDF片断以装有hPEDF cDNA (序列号7 )的质粒作为模板， 用引物7F (序列号31 )和7R (序列号32 )进行PCR反应，进行pGEM-T Easy vector载体(Promega公司)的TA克隆，用Notl酶切进行制备。另外，在构建含有cPPT,WPRE的质粒的同时，为了确认cPPT,WPRE 的效果，分别制备了单独加入有cPPT或者单独加入有WPRE的基因转移载 体。1-2.包装载体的改造在原始型包装载体中除了 gag,pol之外，还包括所谓的修饰基因vif,vpr
和调控基因tat，rev。然而，已知修饰基因产物在载体中是非必须的(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998),近年来，为了提高安全性，使用删除了修饰基 因的载体。另外，tat也被删除，rev通过其它的质粒移去，而更加安全了， 开发了被称作第三代的载体，目前，载体的第三代化成为当务之急。因此 即使在本发明中，从原始型包装载体(序列号33)中去除辅助的基因 (vif，vpr,tat),将rev转移至別的质粒，提高了安全性(图3)。方法基本 上为以前所报道的HIV载体的方法(T. Dull, et al.: J. Virol 72:8463-8471, 1998)。具体来讲，首先，将包装载体的质粒用限制性内切酶NotI酶切，接着 用EcoT221酶切。样品进行电泳，除去EcoT22I-Not I片断，回收片断较大 的载体片断和作为pol基因一部分的EcoT22I-EcoT221片断。将这两种合成寡聚DNA1F (序列号34)和1R(序列号35 )进行退 火而制备的接头连接于上述载体的EcoT22I-Not I位点。接下来将载体用 EcoT22I酶切，进行BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处理，在BAP处理的 EcoT221位点加入回收好的pol基因的EcoT221片断。将上述载体进行NotI酶切，进行BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处 理。为了得到RRE片断，将原始型的包装载体(序列号33)作为模板， 用引物8F(序列号36)和8R(序列号37)进行PCR反应，进行pGEM-T Easy vector载体(Promega公司)的TA克隆。用Not I将RRE片断切出。 连接RRE片断于脱磷酸化处理的载体Not I位点，最终得到改造型包装载 体(序列号4)。1-3. rev表达载体的构建rev蛋白目前为止依靠原始型的包装载体供给，随着上述包装载体改造， 将rev蛋白以其它的表达质粒的形式进行供给，并重新构建了表达载体。Rev 在基因组上的内含子被分成为两部分，将它们连接在一起加入到表达质粒 中(图4A,B )。首先，以原始的包装载体作为模板，通过PCR制备成两条片断。5'端 的片断使用引物1F(序列号38)和1R(序列号39) ， 3，端的片断使 用引物2F(序列号40)和2R(序列号41 )进行扩增。回收两种PCR 片断，混合，作为PCR的模板，使用引物1F和2R进行扩增，得到以连接
两个片断为目的的rev基因断片(序列号16)。将PCR扩增的rev片断 TA克隆到pGEM-T Easy vector载体。接下来，将该载体用EcoRI酶切，回 收添加有EcoRI位点的rev片断。另 一方面，将蛋白表达pCI载体(Promega 公司)用EcoRI酶切，对酶切位点进行BAP处理。将回收的rev片断和pCI 表达载体连接起来，作为rev表达载体备用。实施例2 对携带有cPPT,WPRE的SIV载体的功能评价 为了调查cPPT和WPRE的导入效果，除了 cPPT和WPRE同时携带外， 还生产出cPPT单独携带，WPRE单独携带的载体，与原始型的对照进行比 较。所使用的全部基因转移载体都携带EGFP。包装载体使用原始型(序列 号33)。2-1. SIV载体的制备将来自人类胎儿肾细胞的细胞抹293T细胞按照每一个15cm塑料培养 皿大约lxl07 (次日密度为70-80% )进行接种，在20ml含10%胎牛血清 的D-MEM培养基(Gibco BRL )中进行24小时培养。24小时培养后，将 培养基用10ml的OPTI-MEM培养基进行置换(Gibco BRL ),作为转染细 胞备用。按照每一个培养皿基因转移载体为6吗、包装载体3 jig、 VSV-G表达 载体l吗溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基后，加入40jil的PLUS Reagent 试剂(Invitrogen公司)进行搅拌，在室温下放置15分钟。基因转移载体使 用cPPT和WPRE同时携带、cPPT单独携带、WPRE单独携带或者原始型 (cPPT和WPRE都不携带)的载体。在其中加入1.5ml的OPTI-MEM培养 基稀释的60[il的LIPOFECTAMINE Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅 拌，在室温下放置15分钟。将上述的DNA复合物滴加到15cm培养皿的细胞上，小心振荡混匀， 在37°C, 5 %C02的孵育器中进行3小时的孵育。孵育后，在培养亚中加入 13ml的含20 %胎牛血清的D-MEM培养基进行培养。转染的次日，用新鲜 的含10 %胎牛血清的D-MEM培养基30ml换液后进行培养。转染2天后， 回收上清，用0.45pm的过滤器过滤，作为载体悬液备用。2-2. SIV载体的滴度测定SIV载体滴度包括由表达所携带基因的蛋白的细胞数目计算出的功能滴度(Functional titer : TU/ml)和由载体粒子数目计算出的数值(Particle titer 颗粒滴度颗粒/ml)。因为cPPT和WPRE的性能评价要在一致的颗粒滴 度条件下对细胞进行感染和评价，因此，如下所示用斑点印迹法对颗粒滴 度进行了测定。首先，用市场上出售的试剂盒(QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA mini kit )从上述生产的载体悬液抽取RNA。其次，利用狭隙杂交装置在HybondN十 滤膜(Amersham公司)上对RNA加样。同时通过定量曲线计算出所用质 粒DNA的摩尔数量。另外，RNA的处理方法按照滤膜产品附带提供的实 验步骤进行。将DNA加热并迅速冷却。将滤膜用碱固定后，进行杂交。杂 交使用罗氏公司DIG标记的信号检测系统。探针利用DIG标记的NTP进行 制备，杂交后的操作使用DIG Easy Hyb, DIG Wash and Block Buffer Set试剂 盒(罗氏公司)。利用anti-DIG AP conjugate antibody抗体(罗氏公司)以 及CSPD (罗氏公司)，进行化学发光，用鲁米诺图像分析仪(富士写真胶 巻LAS-1000)对信号进行检测定量。2-3.SIV载体对细胞的基因导入及评价测定好颗粒滴度的4种载体如下所示通过变化MOI(感染复数， multiplicity of infection)对细胞进行感染，进行FACS分析。将293T细胞按 照每1孔为lxl()S个接种到6孔塑料培养板上，在37。C、 5。/。C02下培养过 夜。次日，用血球计数板计算培养板每1孔的细胞数量，除去培养板的培 养基，分别加入用新鲜的含10%胎牛血清的D-MEM培养基2ml稀释的载 体，使MOI(颗粒/细胞)为0.3、 1.5、 7.5、 15。感染l天后，将细胞的培养 基用2ml的新鲜培养基进行交换。感染2天后，在荧光显微镜下观察通过 载体进行基因导入的EGFP,测定EGFP阳性细胞的比例，并测定荧光强度 (作为EGFP蛋白量水平的数值)。2-4.载体功能评价的结果以原始型基因转移载体作为对照，生产了 cPPT单独携带、WPRE单独 携带、cPPT和WPRE同时携带的4种载体。载体设计的模式图如图5-(a)所示。在测定生产出来的载体颗粒滴度的时候，未发现4种载体粒子产量的 差异。用载体粒子数对MOI (每一个细胞所感染的载体粒子数)进行统一，对293T细胞进行基因导入，在焚光显^t镜下进行观察，MOI:15的情况下， 如图5-(b)所示，不含cPPT和WPRE的原始型的对照(-cPPT,-WPRE)中， EGFP阳性细胞的数量少，荧光弱。cPPT单独携带(+cPPT,-WPRE )时EGFP 阳性细胞的数量增加。WPRE单独携带(-cPPT,十WPRE )时EGFP阳性细胞 的数量与对照相比仅稍有增加，但EGFP蛋白的荧光增强。cPPT和WPRE 同时携带(+cPPT，+WPRE)时，两个因子发挥了协同效果，细胞数量、荧 光强度二者都比cPPT、 WPRE单独携带时有大幅度的増加，得到了超出预 期的结果。在用FACS调查EGFP阳性细胞比例时(图6),所有的基因插入比例 均呈MOI依赖性的増加，而且cPPT和WPRE同时携带与对照相比，导入 效率大约上升了 10倍。也就是说，实际上的功能滴度(产量)上升了 10倍。另夕卜，在调查EGFP阳性细胞的平均荧光强度时，(图7),表明cPPT 和WPRE同时携带的比WPRE单独携带的要高出很多，细胞基础的蛋白表 达量也大幅度增加。实施例3携带治疗基因的SIV载体的大量制备及浓缩 如图l所示，以改造型基因转移载体、包装载体、rev表达载体、以及 VSV-G表达载体4种质粒为基础，如下制备SIV载体。携带PEDF和FGF2 的治疗基因的载体以每20个15cm培养皿为单位进行生产。按照每一个15cm的塑料培养皿大约1><107(次日密度为70-80% )接种 293T细胞，在20ml的含10 %胎牛血清的D-MEM培养基中进行24小时培 养。24小时培养后，将培养基用10ml的OPTI-MEM培养基进行置换，用 于转染。按照每一个培养皿基因转移载体为IO昭，包装载体5昭、rev表达 载体2吗，VSV-G表达载体2吗溶解在ljml的OPTI-MEM培养基后，加 入40^1的PLUS Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌，在室温下放置 15分钟。在其中加入用1.5ml的OPTI-MEM培养基稀释的60jil的 LIPOFECTAMINE Reagent进行搅拌，在室温下放置15分钟。将该DNA复
合物滴加到上述的15cm培养皿的细胞中，小心振荡混匀，在37°C， 5%C02 的孵育器中进行3小时的孵育。在上述培养皿中加入13ml含20。/。胎牛血清 的D-MEM培养基进行培养。转染后的次日，用新鲜的30ml含10%胎牛血清的D-MEM培养基进行 交换培养。转染两天后，回收上清，加入20ml新鲜培养基。回收的上清用 0.45jim的过滤器进行过滤，在4。C下保存。转染三天后，回收上清，用0.45pm 的过滤器进行过滤，与前一天回收的载体混合，利用高速离心机进行浓缩 操作。将回收的载体悬液加入到经过灭菌处理的试管中分装，在42500G,4 X:下进行1小时的离心。这种离心操作重复二次，将载体悬液浓缩成500 倍-1000倍。载体作为沉淀物进行沉淀，沉淀物在含5%胎牛血清的PBS 中进行溶解。浓缩后的载体进行小量分装后，在-80。C下进行保存， 一部分 -波用来进行颗粒滴度测定。颗粒滴度的测定如前述方法同样进行。实施例4 SIV-hPEDF, SIV-hFGF2同时给药时的视细胞变性抑制效果 的探讨视网膜色素变性是治疗困难的遗传性疾患，目前尚无有效的治疗方法。 本发明人进行了 SIV载体对小动物视网膜的导入特性和长期毒性试验、以 及以疾病模型动物(RCS大鼠)为対象的SIV-PEDF给药的效果判定试验 (Gene therapy 10, 1503-1511， 2003 )并得到了良好的结果。由于考虑到神经 营养因子PEDF, FGF2的耙细胞不同。因此对这两种神经营养因子的同时给 药的神经保护效果进行了探讨。SIV-hFGF2以及SIV-hPEDF为利用上述方法所构建的。将SIV-hPEDF， SIV-hFGF2， SIV-EGFP (对照)的各载体悬液按照载 体浓度total 2.5xl07TU/ml进行制备。将3周龄的RCS大鼠分成SIV-hPEDF 单独给药组，SIV-hFGF2单独给药组，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2同时给 药组，SIV-EGFP给药组四个组，进行视网膜下腔给药。通过上述载体的视 网膜下给药，PEDF以及FGF2基因被导入到视网膜色素上皮细胞，并在此 分泌出神经保护因子，作用于神经细胞。载体导入4周后，观察各动物组，探讨载体给药的影响。PEDF以及FGF2 作用的视细胞、内颗粒层等神经细胞层以及视网膜色素上皮细胞位于视网 膜内。但是，单独摘^^视网膜较为困难。因此，摘取了大鼠的后眼部分。 后眼部分包含视网膜、脉络膜和巩膜三层膜。通过ELISA法分别对摘取的
后眼部分的hPEDF,hFGF2蛋白量进行了测定。载体导入4周后的眼球后眼 部分，表现出hPEDF的表达在SIV-hPEDF给药组中有增高的趋势。另夕卜， hFGF2的表达在SIV-hFGF2单独给药组以及同时给药组中有增高的趋势， 并证实了 SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2载体给药所引起的hPEDF以及hFGF2基 因表达(图8)。接下来，在载体导入4周后，S周后以及12周后，制备了最大切片面 积标本，对视网膜的10个位置(A1-A10)上每lOOpm范围内的视细胞的 细胞核数目进行了计数。SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2各单独组，以及同时给药 组中，载体注射部位附近的3个位置的(Al-A3)视网膜组织中，残存视细 胞具有统计学意义，在同时给药组中，证实比单独组有更高的神经保护效 果(图9)。另夕卜，载体导入8周后以及12周后，SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2 的同时给药引起显著的神经保护效果也得到证实(图IO以及图11)。进而，进行了作为功能性评价的电生理学的探讨(视网膜电图ERG)。 视网膜电图是记录对光刺激的视网膜电位变化的检查方法，视网膜发挥功 能的情况下，会得到高的振幅。a波来自视细胞，b波主要来自米勒细胞和 双极细胞。SIV-hPEDF, SIV-hFGF2的两个单独给药组中，与SIV-EGFP组 相比，a，b波两者都得到了有显著统计学意义的高振幅结果。而且，在同时 给药组中，得到了高振幅的a,b波，证实同时给药组可以获得更好的神经保 护效果。(图12以及图13)。另外，追加实验组中进行了组织学探讨，未能观察到SIV-hPEDF、 SIV-hFGF2的同时给药有明显的炎症、增殖、以及新生血管的结果(无数 据表示)。工业化利用的可能性通过本发明，提供了一种新的治疗视网膜色素变性的方法。本发明的 PEDF以及FGF2的同时给药与以前的^L网膜色素变性治疗方法相比，可以 预期有更显著的好效果。特别是利用SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体的 给药方法能使患者细胞内的PEDF以及FGF2得以持续提供，在减少患者的 侵害频率，经济成本等方面上，已经证明是一种非常有效的治疗方法。
权利要求
1、一种伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患治疗用药品，其特征在于与药学可使用的介质一起，包含下述(a)到(d)的任意一种。(a)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)基因以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)基因(b)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)蛋白质以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)蛋白质(c)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)基因以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)蛋白质(d)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factorPEDF)蛋白质以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2FGF2)基因
2、 权利要求1中记述的药品，其特征是包含带有PEDF基因以及FGF2 基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的药品，该PEDF基因以及FGF2基因分别 由不同的重组猴免疫缺陷病毒载体带有，或者由一个重组猴免疫缺陷病毒 载体带有。
3、 权利要求2中记述的药品，其特征是包含带有PEDF基因的重组 猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体。
4、 权利要求2中记述的药品，其特征是包含带有PEDF基因以及FGF2 基因的重组猴免疫缺陷病毒载体。
5、 权利要求2到4的任意一项中记述的药品，其中，猴免疫缺陷病毒 载体包含cPPT序列和/或WPRE序列。
6、 权利要求2到5的任意一项中记述的药品，其中，猴免疫缺陷病毒 载体用VSV-G进行假型化。
7、 权利要求2到6的任意一项中记述的药品，其中，猴免疫缺陷病毒 载体来源于agm4朱。
8、 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用试剂盒，其特征是包含 带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物、以及包含带有FGF2 基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物。
9、 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用试剂盒，其特征是内含 包含带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物。
10、 权利要求1到7的任意一项中记述的药品或者权利要求8或者9 中记述的试剂盒，其特征是伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患是指^L网膜 色素变性，青光眼、视网膜脱落、视网膜缺血性疾病中的任意一种。
11、 伴随眼组织细胞凋亡的变性疾患的治疗方法，其特征是用PEDF 以及FGF2或者编码它们的基因进行给药。
12、 权利要求11中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因的 重组猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体 进行给药。
13、 权利要求12中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因的 重组猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体 进行视网膜下腔给药。
14、 权利要求11中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因以 及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行给药。
15、 权利要求14中记述的治疗方法，其特征是用带有PEDF基因以 及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行视网膜下腔给药。
16、 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法，其特 征是包括利用包含在序列号1所记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱 基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的 工艺。
17、 权利要求16中记述的方法，其特征是包括利用包含序列号2 所记述的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷 病毒载体的工艺。
18、 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法，其特 征是包括利用包含在序列号1所记述的碱基序列中插入FGF2基因碱基 序列的基因转移载体制备带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺
19、 权利要求18中记述的方法，其特征是包括利用包含序列号3 所记述的碱基序列的基因转移载体制备带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷 病毒载体的工艺。
20、 伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法，其特 征是包括利用包含在序列号1所记述的碱基序列中插入PEDF基因以及FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因以及FGF2基因 的重组猴免疫缺陷病毒栽体的工艺。
21、权利要求16到20中的任意一项中记述的方法，其特征是包括 向导入有包含序列号4所记述的碱基序列的包装载体的包装细胞中导入该 基因转移载体的工艺。
全文摘要
本发明提供了一种新的治疗视网膜色素变性等的伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的方法。主要涉及两种神经营养因子色素上皮衍生因子(PEDF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的同时给药。考虑到PEDF和FGF2的作用部位不同。构建了SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体，上述载体给药于视网膜色素变性疾病模型的RCS大鼠的视网膜下腔，并探讨了其效果。载体给药4周后，8周后以及12周后，发现同时给药组比单独给药组具有明显的视细胞保护效果。进而，通过视网膜电图对视网膜功能进行了评价，表明同时给药组的效果要比单独给药组具有更显著的效果。通过上述结果初次发现，PEDF以及FGF2的同时给药对于视网膜色素变性的治疗，具有比以前更高的疗效。
文档编号A61K48/00GK101160139SQ20068001288
公开日2008年4月9日 申请日期2006年2月21日 优先权日2005年2月23日
发明者上田泰次, 宫崎胜德, 居石克夫, 池田康博, 田畑寿晃, 米满吉和, 长谷川护, 饭田章博 申请人:生物载体株式会社