用于调节超稳定化的c-met的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于调节超稳定化的c-met的方法和组合物的制作方法
技术领域：
概括而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调节的领域。更具体地， 本发明关注HGF/c-met信号传递途径调节剂，以及所述调节剂的应用。
HGF是间质衍生的多效性因子，对许多不同细胞类型具有促有丝分裂、 促运动和促形态发生活性。HGF作用是通过特定的酪氨酸激酶c-met介导 的，而且在多种肺瘤中经常能观察到异常的HGF和c-met表达。例如参见 Maulik 等，Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13: 41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867。在肺瘤 进展(progression)和转移中涉及HGF/c-Met信号途径的调控。例如参见 Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002)， 2: 289-300。
HGF结合Met受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外域并调控多种多样的生物 学过程，诸如细胞分散、增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发 育而言是至关重要的，尤其是在肌肉祖细胞迁移及肝和神经系统发育中 ((Bladt等，Nature (1995), 376, 768-771.; Hamanoue等，Faseb J (2000)， 〃，399-406; Maina等，Cell (1996), 57, 531-542; Schmidt等，Nature (1995), 373, 699-702; Ueham等，Nature (1995), 373, 702-705))。敲除Met 和HGF的小鼠的发育表型非常相似，这表明HGF是Met受体的关联配体 (Schmidt等，1995,同上；Uehara等，1995，同上)。HGF-Met还在肝再生、 血管发生和伤口愈合中发挥作用(Bussolino等，J Cell Biol (1992), 7/9， 629-641; Matsumoto和Nakamura, Exs (1993), 65, 225-249; Nusrat等，JClin Invest (1994) 2056-2065)。 Met受体前体经蛋白水解切割成由二硫 键连接的胞外a亚基和跨膜|3亚基(Tempest等，Br J Cancer (1988), 5S, 3-7)。 卩亚基包含胞质激酶结构域，而且在C末端包含多底物结合位点，在此处使 适配连接蛋白结合并起动信号传导(Bardelli等，Oncogene (1997), /5, 3103-3111; Nguyen等，J Biol Chem (1997), 272, 20811-20819; Pdicci等， Oncogene (1995)， 70， 1631-1638; Ponzetto等，Cell (1994), 77， 261-271; Weidner等，Nature (1996)， 3W， 173-176)。 HGF结合后，Met活化，分别 经由Gabl和Grb2/Sos介导的PI3激酶和Ras/MAPK活化而导致了酪氨酸磷 酸化和下游信号传导，它驱动细胞运动和增殖(Furge等，Oncogene (2000)， ",5582-5589; Hartmann等，J Biol Chem (1994)， 269， 21936-21939; Ponzetto等，J Biol Chem (1996)， 277, 14119-14123; Royal和Park, J Biol Chem (1995)，房，27780-27787)。
据显示，Met可在经致癌原处理的骨肉瘤细胞系中转化(Cooper等， Nature (1984)， J仏29-33; Park等，Cell (1986)， 45， 895-904)。已在多种 人癌症中观察到了 Met的过表达或基因扩增。例如，Met蛋白在结肠直肠 癌中过表达至少5倍，且据报道在肝转移中有基因扩增(Di Renzo等，Clin Cancer Res (1995), 7, 147-154; Liu等，Oncogene (1992), 7, 181-185)。据 报道，Met蛋白还在口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、乳腺癌和肺癌 中过表达(Jin等，Cancer (1997), 79， 749-760; Morello等，J Cell Physiol (2001)， 7卵，285-2卯；Natali等，InU Cancer (1996), 69， 212-217; Olivero 等，Br J Cancer (1996)， 74， 1862-1868; Suzuki等，Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868)。此外，在肝细胞癌、胃癌和结肠直肠癌中观察到过mRNA的 过表达(Boix等，Hepatology (1994), 79, 88-91; Kuniyasu等，Int J Cancer (1993)， 55, 72-75; Liu等，Oncogene (1992), 7， 181-185)。
在肾乳头状癌中发现了 Met激酶结构域中的许多突变，它们导致组成 性受体活化(Olivero等，Int J Cancer (1999)， 640-643; Schmidt等，Nat Genet (1997)，仏68-73; Schmidt等，Oncogene (1999)， 7S， 2343-2350)。 这些活化突变造成组成性Met酪氨酸磷酸化，并导致MAPK激活、病灶形 成和肿瘤发生(Jeffers等，Proc Natl Acad Sci U S A (1997), W， 11445-11450)。 此外，这些突变增强细胞运动和侵入(Giordano等，Faseb J (2000), 3"406; Lorenzato等，Cancer Res (2002)， 62， 7025-7030)。转化细胞中的HGF依赖
性Met活化介导运动、分散和迁移的增加，最终导致侵入性肿瘤生长和转 移(Jeffers等，Mol Cell Biol (1996), 1115-1125; Meiners等，Oncogene (1998)， 9-20)。
Met已显示出能与驱动受体活化、转化和侵入(invasion)的其它蛋白质相 互作用。在肺瘤细胞中，据报道，Met与a6(34整联蛋白(诸如层粘连蛋白 的胞外基质(ECM)组分的受体)相互作用以促进HGF依赖性的侵入生长 (Tmsolino等，Cell (2001)， 7(97, 643-654)。此外，Met胞外域已显示出能 与脑信号蛋白(semaphorin)家族的成员一丛蛋白(plexin) Bl相互作用，以增 强侵入性生长(Giordano等，Nat Cell Biol (2002)， 4， 720-724)。而且，已知 参与肿瘤发生和转移的CD44v6据报道也与Met和HGF形成复合物并导致 Met受体活化(Orian-Rousseau等，Genes Dev (2002), M, 3074-3086)。
Met是受体酪氨酸激酶(RTK )亚家族的成员，包括Ron和Sea (Maulik
等，Cytokine Growth Factor Rev (2002)， 73, 41-59)。 Met胞外域的结构预 测表明它与脑信号蛋白和丛蛋白同源。Met的N末端包含约500个氨基酸 的Sema结构域，其在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和 丛蛋白属于一个分泌的和膜结合的蛋白质大家族，首先因其在神经发育中 的作用而被记叙(VanVactor和Lorenz, Curr Bio (1999), 19， R201-204)。不 过，近来将脑信号蛋白的过表达与肿瘤的侵入和转移联系起来了。在丛蛋 白、脑信号蛋白和整联蛋白中发现的富含半胱氨酸PSI结构域(也称为Met 相关序列结构域)邻近Sema结构域，随后是4个IPT重复片段，其是在丛 蛋白和转录因子中发现的免疫球蛋白样区域。近来的研究表明MetSema结 构域足以使HGF和肝素结合(Gherardi等，Proc Natl Acad Sci U S A (2003)， 100(21):12039-44)。
如上所示，Met受体酪氨酸激酶由其关联配体HGF活化，而且受体磷 酸化激活下游MAPK、 PI-3激酶和PLC-y途径(7， 2)。在激酶结构域内的 Y1234/Y1235磷酸化是Met激酶活化的关键，而多底物结合位点中的Y1349 和Y1356对于结合src同源体(homology)-2 (SH2)、磷酸酪氨酸结合(PTB)、 和Met结合结构域(MBD)蛋白来说是重要的05)，用以介导下游信号传递 途径的活化。其它近膜区的磷酸化位点——Y1003,已被很好地表征了其与 CblE3-连接酶的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域的结合(6， 7)。据报道，Cbl 的结合驱动吞蛋白(endophilin )介导的受体内吞、泛素化(ubiquitination)以
及随后的受体降解(S)。该受体下调的机理以前在也含有相似Cbl结合位点
的EGFR家族中有记存又(9-/7)。
多种肺瘤中据报道有Met和HGF失调。在几种癌中观察到了配体驱动 的Met活化。在肺癌、乳腺癌、和多发性骨髓瘤中观察到升高的血清和肿瘤 内HGF (/2-")。在各种癌中，如结肠直肠癌、肺癌、胃癌和肾癌中，据报 道有Met和/或HGF的过表达、Met扩增或突变，而且这被认为驱使配体非 依赖性的受体活化(2, /6)。另外，在鼠模型肝脏中诱导出的Met的过表达带 来了肝细胞癌，这证实了受体过表达使得配体非依赖性肿瘤发生(77)。 Met 参与癌的最有力的证据据报道是在家族性和零星的肾乳突癌(RPC)患者中。 在Met激酶结构域中的突变造成受体组成性活化，这种突变在RPC中被鉴定 为生殖系和体细胞突变(7S)。将这些突变导入到转基因小鼠模型中会造成肿 瘤发生和转移。(79)。
尽管已经详细地研究了 Met激酶结构域的作用，而且理论上增加 HGF/c-met的表达水平可能是发展成一些癌症的基础，但是缺少c-met非激 酶结构域生物学作用的直接证据。事实上，尽管涉及各种肺瘤病情的病因， 但是HGF/c-met途径是在治疗上难以靶向的途径。在这方面的努力大部分 受以下事实的阻碍，即缺少关于HGF/c-met失调造成肿瘤发生的作用^/L理 的认识。所以清楚的是，极需要进一步了解c-met相关的致瘤作用机理。本 文提供的发明满足了该需求并提供了其它益处。
本文引用的所有文献，包括专利申请和出版物，全部纳入本文参考。

发明内容
本发明至少部分基于新的发现，即某些人肿瘤表达突变的c-met蛋白， 其在细胞内显示出下调率降低，然而能进行细胞信号传递。发现这些"超稳 定化的，，c-met蛋白相对于野生型c-met，具有增加的致瘤活性。如本文所述， 这些肿瘤能被抗c-met抑制剂所抑制。抑制超稳定化的c-met活性带来许多 治疗益处。例如，由于这些c-met突变是特别致瘤的，因此预计靶向它们的 抑制能减少由这些突变体驱动的肿瘤发生。此外，由于在许多细胞类型中 发现了 c-met，包括在正常细胞中，特异靶向肿瘤特异性的c-met突变体的 能力将是特别有益的，例如可用于减少c-met抑制疗法的副作用。基于本 文所述发现，本发明提供了方法和组合物，用于靶向和/或治疗带有超稳定
化的c-met的肿瘤。
在一个方面，本发明提供了能特异结合超稳定化的c-met的物质。在 一个具体实施方式
中，该物质包括抑制活性，其抗御超稳定化的c-met相 关的生物活性。在另一个具体实施方式
中，该物质能够特异结合超稳定化 的c-met。在一个具体实施方式
中，该物质结合超稳定化的c-met并抑制 c-met活性。在一个具体实施方式
中，该物质结合超稳定化的c-met而基 本不抑制c-met活性。在这些物质上能发掘出各种应用，例如作为用于针 对表达超稳定化的c-met的细胞靶向治疗的分子。治疗剂包括任何本文所 述的试剂，如毒素。物质可以是任何合适形式的，包括抗体-药物偶联物和 融合多肽形式。
在一个方面，本发明提供了 c-met拮抗剂，其阻断与超稳定化的c-met 蛋白相关的HGF/c-met信号传递。在一个具体实施方式
中，本发明提供了 拮抗剂，其抑制人超稳定化的c-met多肽的c-met信号传递活性，其中超 稳定化的c-met多肽包含外显子14的至少一部分的缺失，使其细胞内降解 率相对于野生型c-met减少，而且其中超稳定化的c-met多肽具有c-met 信号传递活性。
本发明的拮抗剂可以是任何形式的，其能特异抑制本文所述的超稳定 化的c-met分子活性。在一个具体实施方式
中，本发明的拮抗剂包括抗体。 在一个具体实施方式
中，本发明的抗体特异结合由c—met的外显子13和外
显子15的读框内剪接而形成的表位。在一个具体实施方式
中，至少一部分 外显子14由所述读框内剪接而缺失。在另一方面，本发明的拮抗剂包括适 体。在一个具体实施方式
中，本发明的适体特异结合由c-met的外显子13
和外显子15的读框内剪接而形成的表位。在一个具体实施方式
中，至少一 部分外显子14由所述读框内剪接而造成缺失。在一个方面，本发明的拮抗 剂包括抑制性RNA，其优先/选择性地抑制编码c-met剪接变体的核酸分子 的表达，其中外显子13被剪接到外显子15上。在一个具体实施方式
中， 核酸编码超稳定化的c-met,其中至少一部分外显子14由于变体剪接而缺 失。在一个方面，本发明提供了包括反义寡核苷酸的拮抗剂，其优先/选择 性地抑制编码c-met剪接变体的核酸分子，其中外显子13被剪接到外显子 15上。在一个具体实施方式
中，核酸分子编码超稳定化的c-met,其中至少 一部分外显子14由于变体剪接而缺失。
抑制c-met活性可以由许多现有已知方式之任意来实现，只要在细胞中 的超稳定化的c-met的生物活性减低了。例如，在一个具体实施方式
中， 由本发明的拮抗剂抑制c-met活性包括增强超稳定化的c-met蛋白的细胞降 解。在另一个具体实施方式
中，由本发明的拮抗剂抑制c-met活性包括抑制 超稳定化的c-met蛋白的磷酸化。在又一个具体实施方式
中，由本发明的 拮抗剂抑制c-met活性包括通过超稳定化的c-met来抑制HGF/c-met信号 传递途径成员的磷酸化。由本发明的拮抗剂抑制c-met活性也可通过降低细 胞中超稳定化的c-met多肽水平来实现。因此，例如，在一个具体实施方 式中，由本发明的拮抗剂抑制c-met活性包括抑制超稳定化的c-met蛋白的 表达，例如抑制编码超稳定化的c-met多肽的多核苷酸的转录和/或翻译。 在另一个具体实施方式
中，由本发明的拮抗剂抑制c-met活性包括与细胞毒 素相关的细胞死亡，所述细胞毒素连接于在细胞中能特异结合超稳定化的 c-met的分子(如，抗体-药物偶联物)。
在一个具体实施方式
中，本发明的拮抗剂是单克隆抗体、抗体片段、 嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体或单链抗体。用于本发明 方法中的拮抗剂可任选与生长抑制剂或诸如毒素的细胞毒剂偶联，例如包 括，美登木素生物碱类或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、核酶等。 在本发明方法的一些具体实施方式
中，也向受试者给药化疗剂。
一4殳而言，有效的c-met拮抗剂包括 c-met才卬制齐寸,其干4尤诸^口 HGF 的配体与超稳定化的c-met的结合。例如，c-met抑制剂可结合超稳定化的 c-met,由此抑制HGF与c-met的结合。在一个具体实施方式
中，拮抗剂抗 体是嵌合抗体，例如，包含来自非人供体的抗原结合序列的抗体，所述抗 原结合序列被移植入异源非人、人或人源化序列(如，框架和/或恒定结构 域序列)。在一个具体实施方式
中，非人供体是小鼠。在一个具体实施方式
中，抗原结合序列是合成的，如通过变异获得(例如，噬菌体展示筛选等)。 在一个具体实施方式
中，本发明的嵌合抗体有鼠V区和人C区。在一个具 体实施方式中，鼠轻链V区与人k轻链融合。在一个具体实施方式
中， 鼠重链V区与人IgGl C区融合。在一个具体实施方式
中，抗原结合序列 包含至少一个、至少两个或全部三个轻和/或重链CDR。在一个具体实施方 式中，抗原结合序列包含重链CDR3。在一个具体实施方式
中，抗原结合 序列包含杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的部分或全部CDR和/或可变结
构域序列，所述杂交瘤细胞系以美国典型微生物保藏中心登录号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏。在一个具 体实施方式中，抗原结合序列至少包含杂交瘤细胞系1A3.3.13或5D5.11.6
产生的单克隆抗体重链的CDR3。本发明的人源化抗体包括在FR中具有氨 基酸替换并具有亲和力成熟变体的那些，其中在移植的CDR中出现了变化。 CDR或FR中替换的氨基酸不限于出现在供体或受体抗体中的那些。在其 它具体实施方式
中，本发明的抗体在Fc区中进一步包含氨基酸残基变化， 其能改善效应器功能，包括增强CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤。 本发明的其它抗体包括具有改善稳定性的特定变化的那些。本发明的抗体 还包括具有改善的体内ADCC功能的岩藻糖缺陷型变体。
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体片段包含含重链的抗原结合臂， 所述重链包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的CDR序列 SYWLH (SEQ ID NO: 1)， MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 2)和 YGSYVSPLDY(SEQIDNO: 3)。在一个具体实施方式
中，抗原结合臂所含 的重链CDR-H1具有氨基酸序列SYWLH。在一个具体实施方式
中，抗原 结合臂所含的重链CDR-H2具有氨基酸序列MIDPSNSDTRFNPNFKD。在 一个具体实施方式
中，抗原结合臂所含的重链CDR-H3具有氨基酸序列 YGSYVSPLDY。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体片段包含含轻链的 抗原结合臂，所述轻链包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的CDR 序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQIDNO: 4), WASTRES (SEQ IDNO'-S^p QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 6)。在一个具体实施方式
中，抗原结合臂 所含的重链CDR-L1具有氨基酸序列KSSQSLLYTSSQKNYLA。在一个具 体实施方式中，抗原结合臂所含的重链CDR-L2具有氨基酸序列 WASTRES。在一个具体实施方式
中，抗原结合臂所含的重《连CDR-L3具有 氨基酸序列QQYYAYPWT。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体片段包 含含重链和轻链的抗原结合臂，所述重链包含至少一个、至少两个或全部 三个选自以下的 CDR序歹'J : SYWLH (SEQ ID NO :1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 2)和YGSYVSPLDY (SEQ ID NO: 3)，并且所述轻链包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的CDR序 列KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO: 4)， WASTRES (SEQ ID NO: 5) 和QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 6)。本发明提供了结合人超稳定化的c-met的人源化拮抗剂抗体、或其抗 原结合片段，其中抗体能有效抑制人超稳定化的HGF/c-met体内活性，该 抗体H链可变区(VH)中至少包括杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的CDR3 序列，并包括基本的人共有序列(如，人重链亚型III (VHIII)的基本人共 有框架(FR)残基)，其中所述杂交瘤以美国典型微生物保藏中心登录号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏。在一个具 体实施方式中，抗体进一步包含杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的H链 CDRl序列和/或CDR2序列，所述杂交瘤以美国典型微生物保藏中心登录 号ATCCHB-11894(杂交瘤1 A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏。 在另一个具体实施方式
中，前述抗体包含杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体 的L链CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列，并包括人轻链k亚型I (VkI)的基本人共有框架(FR)残基，其中所述杂交瘤以美国典型微生物保藏 中心登录号ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤 5D5,11.6)保藏。
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体片段包含抗原结合臂，其包含 的重链可变结构域具有序列
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体片段包含抗原结合臂，其包含 的轻链可变结构域具有序列
AYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:8)
而在其它例子中，不干扰配体(如HGF)与c-met结合的c-met拮抗剂 是有利的。因此，在一些具体实施方式
中，本发明的拮抗剂不结合与c-met 位点结合的配体(如HGF)。在另一个具体实施方式
中，本发明的拮抗剂基本 不抑制配体(如，HGF)与c-met结合。在一个具体实施方式
中，本发明的拮 抗剂基本不与配体(如，HGF)竟争结合c-met。在一个实例中，本发明的拮 抗剂可与一种或多种其它拮抗剂联合使用，其中拮抗剂靶向于HGF/c-met 轴内的不同过程和/或功能。因此，在一个具体实施方式
中，本发明的c-met
拮抗剂结合c-met上的表位，该表位不同于另一种c-met拮抗剂所结合的 表位，另一种c-met拮抗剂如杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的Fab片段， 所述杂交瘤以美国典型微生物保藏中心登录号ATCC HB-11894 (杂交瘤 1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏。在另一个具体实施方式
中， 本发明的c-met拮抗剂不同于(即，它不是)杂交瘤细胞系产生的单克隆抗 体的Fab片段，所述杂交瘤以美国典型微生物保藏中心登录号ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏。在一个具 体实施方式中，本发明的c-met拮抗剂不包含杂交瘤细胞系产生的抗体的 c-met结合序列，所述杂交瘤以美国典型微生物保藏中心登录号ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)保藏。在一个具 体实施方式中，本发明的拮抗剂抑制c-met活性，但不结合c-met的野生型 近膜区结构域。
在本发明c-met拮抗剂的一个具体实施方式
中，拮抗剂与c-met的结合 通过HGF来抑制c-met活化。在本发明c-met拮抗剂的一个具体实施方式
中，拮抗剂与细胞内c-met的结合抑制细胞增殖、分散、形态发生和/或运 动。在一个具体实施方式
中，本发明的c-met拮抗剂结合细胞中的超稳定化 的c-met,造成细胞死亡。例如，在一个具体实施方式
中，所述拮抗剂连接 于本文所述的毒素上。
在一些具体实施方式
中，本发明的c-met拮抗剂是或含肽(如，寡肽)、 抗体、抗体片段、适体、寡核苷酸(如，反义寡核苷酸)、抑制性RNA或其 组合。
在一些具体实施方式
中，本发明的c-met拮抗剂通过本文所述的本发明 筛选或鉴定方法来获得。
在另一方面，本发明提供了用于筛选或鉴定c-met拮抗剂的方法。在一 个实例中，所述方法包括将候选物质与含至少一部分超稳定化的c-met的 靶分子接触，由此选出特异结合所述靶分子的物质(作为c-met拮抗剂)。在 一个具体实施方式
中，所述方法进一步包括确定所选的候选物质特异结合 超稳定化的c-met的突变区域。例如，如果靶分子含多肽，所选的候选物 质应当特异结合含超稳定化的c-met的突变位置(或区)的表位。在另一个 实例中，如果草巴分子含编码至少一部分超稳定化的c-met的核酸，所选的 候选物质应当特异抑制由编码超稳定化的c-met的核酸表达的超稳定化的
c-met蛋白。在一些具体实施方式
中，本发明的筛选方法进一步包括将所选 的物质与表达超稳定化的c-met的细胞接触，其中评估对细胞中c-met活性 的抑制(如，其中检测或定量下游c-met信号传递(如，MAPK磷酸化)的程 度)。用现有已知的各种方式，并根据现有已知的各种标准之任意，可评估 对c-met信号传递活性的抑制，其中一些在本文中会更具体地描述。例如， 对c-met信号传递活性的抑制可通过c-met活化量的减少来指示，例如其可 依次通过细胞内c-met相关的细胞信号传递量来指示。通过现有已知的各种 方法并根据各种标准，可评估细胞信号传递，其中一些是本文所述的。例 如，HGF/c-met途径中的细胞信号传递的出现可从生物学上通过信号传递途 径中耙分子磷酸化变化的形式来证明。因此，例如，可测量与HGF/c-met 途径中一种或多种已知磷酸化靶位相关的蛋白质磷酸化量。这些磷酸化靶 位的实例包括c-met本身和促细胞分裂剂活化的蛋白激酶(MAPK)。
在一个方面，本发明提供了组合物，其包含一种或多种本发明的拮抗 剂和载体。在一个具体实施方式
中，载体是药学上可接受的。
在一个方面，本发明提供了编码本发明的c-met拮抗剂的核酸。在一个具体实施方式
中，本发明的核酸编码的是或含多肽(如，寡肽)的c-met拮抗 剂。在一个具体实施方式
中，本发明的核酸编码的是或含抗体或其片段的 c-met拮抗剂。在一个具体实施方式
中，本发明的核酸是适体。在一个具体 实施方式中，本发明的核酸是反义寡核苷酸。在一个具体实施方式
中，本 发明的核酸是抑制性RNA (如，小干扰RNA)。
在一个方面，本发明提供了载体，其包含本发明的核酸。
在一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的核酸或载体。 载体可以是任何类型的，例如，诸如表达载体的重组载体。可使用任意种 宿主细胞。在一个具体实施方式
中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆 菌。在一个具体实施方式
中，宿主细胞是真核细胞，例如，诸如中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞的哺乳动物细胞。
在一个方面，本发明提供了制备本发明拮抗剂的方法。例如，本发明 提供了制备其是或含抗体(或其片段)的c-met拮抗剂的方法，所述方法包括 在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明重组载体，并 回收所述抗体。在另一个实例中，本发明提供了制备其是或含多肽(如寡肽) 的c-met拮抗剂的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述所
述多肽(如寡肽)的本发明重组载体，并回收所述多肽(如寡肽)。
在一个方面，本发明提供了制品，其包括容器；和包含在该容器中的 组合物，其中组合物含一种或多种本发明c-met拮抗剂。在一个具体实施方 式中，所述组合物含本发明的核酸。在一个具体实施方式
中，含拮抗剂的 组合物进一步包含载体，其在一些具体实施方式
中是药学上可接受的。在 一个具体实施方式
中，本发明制品进一步包括用于说明向受试者给药组合
物C如，拮抗剂)的说明书。
在一个方面，本发明提供了试剂盒，其包括第一容器，其包括含一种 或多种本发明c-met拮抗剂的组合物；和第二容器，其包括缓冲液。在一个具体实施方式
中，緩沖液是药学上可接受的。在一个具体实施方式
中，含 拮抗剂的组合物进一步包含载体，其在一些具体实施方式
中是药学上可接 受的。在一个具体实施方式
中，试剂盒进一步包括用于说明向受试者给药 组合物(如，拮抗剂)的说明书。
在一个方面，本发明提供了本发明的c-met拮抗剂在制备治疗和/或预 防疾病的药物中的应用，所述疾病如癌、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(如自 体免疫)病症和/或与血管形成相关的病症。c-met拮抗剂可以是本文所述的 任意形式，包括抗体、抗体片段、多肽(如，寡肽)、核酸(如，寡核苷酸， 如反义寡核苷酸、抑制性RNA)、适体、或其组合。
在 一 个方面，本发明提供了本发明的核酸在制备治疗和/或预防疾病的 药物中的应用，所述疾病如癌、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(如自体免疫) 病症和/或与血管形成相关的病症。
在一个方面，本发明提供了本发明的表达载体在制备治疗和/或预防疾 病的药物中的应用，所述疾病如癌、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(如自体免 疫)病症和/或与血管形成相关的病症。
在一个方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备治疗和/或预防疾 病的药物中的应用，所述疾病如癌、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(如自体免 疫)病症和/或与血管形成相关的病症。
在一个方面，本发明提供了本发明的制品在制备治疗和/或预防疾病的 药物中的应用，所述疾病如癌、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(如自体免疫) 病症和/或与血管形成相关的病症。
在一个方面，本发明提供了本发明的试剂盒在制备治疗和/或预防疾病
的药物中的应用，所述疾病如癌、肿瘤、细胞增殖病症、免疫(如自体免疫) 病症和/或与血管形成相关的病症。
本发明提供了用于调节与HGF/c-met信号传递轴失调相关的疾病状态 的方法和组合物，所述信号传递轴与c-met延迟下调相关。HGF/c-met信号 传递途径涉及多种生物和生理功能，如包括，细胞增殖和血管形成。因此， 在一个方面，本发明提供了方法，其包括向受试者给药靶向于超稳定化的 c-met的拮抗剂，由此调节HGF/c-met信号传递。
在一个方面，本发明提供了治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括 向受试者给药本发明的拮抗剂，由此治疗胂瘤。在一个具体实施方式
中， 确定胂瘤包含超稳定化的c-met。在一个具体实施方式
中，确定肺瘤包含突 变的c-met，所述突变的c-met包含外显子14的至少一部分的缺失。
在本发明方法的一个具体实施方式
中，本发明的c-met抑制剂与诱导和 /或增强受体蛋白质降解的试剂联合给药。
在一个方面，本发明提供了抑制c-met活化的细胞增殖的方法，所述方 法包括将细胞或组织与有效量的本发明的c-met拮抗剂接触，由此抑制与 c-met活化相关的细胞增殖。
在一个方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化失调相关的病理 状况的方法，所述方法包括向受试者给药有效量的本发明的c-met拮抗剂， 由此治疗所述状况。
在一个方面，本发明提供了抑制表达c-met或肝细胞生长因子、或两者 的细胞生长的方法，所述方法包括将所述细胞与本发明的c-met拮抗剂接 触，由此导致抑制所述细胞的生长。在一个具体实施方式
中，所述细胞与 不同细胞(如，通过旁泌作用)表达的HGF接触。
在一个方面，本发明提供了治疗患有癌性肿瘤的哺乳动物的方法，所 述肿瘤包含表达c-met或肝细胞生长因子、或两者的细胞，所述方法包括向 所述哺乳动物给药有效量的本发明的c-met拮抗剂，由此有效治疗所述哺乳 动物。在一个具体实施方式
中，所述细胞与不同细胞(如，通过旁泌作用) 表达的HGF接触。
在一个方面，本发明提供了治疗或预防细胞增殖性病症的方法，所述 病症与c-met或肝细胞生长因子、或两者的表达或活性相关，所述方法包括 向受试者给药有效量的本发明的c-met拮抗剂，由此有效治疗或预防所述细
胞增殖性病症。在一个具体实施方式
中，所述增殖性病症是癌。
在一个方面，本发明提供了抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生
长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子、或两者的生长促进效应，所述 方法包括将所述细胞与有效量的本发明的c-met拮抗剂接触，由此抑制所述 细胞的生长。在一个具体实施方式
中，所述细胞与不同细胞(如，通过旁泌 作用)表达的HGF接触。
在一个方面，本发明提供了治疗哺乳动物肺瘤的方法，其中所述肿瘤 的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子、或两者的生长促进效应， 所述方法包括将所述细胞与有效量的本发明的c-met拮抗剂接触，由此有效 治疗所述肿瘤。在一个具体实施方式
中，所述细胞与不同细胞(如，通过旁 泌作用)表达的HGF接触。
本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态，例如，与HGF/c-met信 号传递途径失调相关的细胞和/或组织。在一个具体实施方式
中，本发明的 方法耙向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是选自下列的细胞乳腺癌 细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(如，曱状腺的)、结肠癌 细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨 源性肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、 胃癌细胞、头和颈部鳞状癌细胞、淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。 在一个具体实施方式
中，本发明的方法靶向的细胞是高度增殖的和/或增生
的细胞。在一个具体实施方式
中，本发明的方法靶向的细胞是发育异常的 细胞。在又一个具体实施方式
中，本发明的方法靶向的细胞是转移细胞。
本发明的方法可进一步包括额外的治疗步骤。例如，在一个具体实施 方式中，所述方法进一步包括这样的步骤，其中耙细胞和/或组织(如，癌 细胞)暴露于放射治疗和/或化疗剂。
如本文所迷，c-met活化是致失调的重要生物学过程，其导致许多病理 状况。因此，在本发明方法的一个具体实施方式
中，所靶向的细胞(如，癌 细胞)是这样的一种细胞，其中相对于相同组织来源的正常细胞，c-met的活 化增强了。在一个具体实施方式
中，本发明的方法造成靶细胞的死亡。例 如，与本发明的拮抗剂接触可使细胞不能通过c-met途径进行细胞传递，造 成细胞死亡或细胞生长的抑制。在另一个实例中，连着毒素的本发明的拮 抗剂靶向表达超稳定化的c-met的细胞。 c-met活化(及由此进行的信号传递)的失调由许多细胞变化造成，例如 包括，过表达HGF (c-met的关联配体)和/或c-met本身(由于延迟下调/降解、 增加表达水平等造成)。因此，在一些具体实施方式
中，本发明的方法包括 靶向细胞，其中相对于相同组织来源的正常细胞，所述细胞(如，癌细胞) 更多地表达c-met或肝纟田月包生长因子、或两者。表达c-met 的细胞可通过各 种来源的HGF调节，即以自分泌或旁分泌方式进行。例如，在本发明方法 的一个具体实施方式
中，不同细胞的/其表达的肝细胞生长因子接触/结合耙 细胞(如，通过旁泌作用)。所述不同细胞相对于靶细胞，可以是相同或不 同组织来源的。在一个具体实施方式
中，耙细胞本身表达的HGF接触/结 合耙细胞(如，通过自分泌作用/环)。C-met活化和/或信号传递也能独立于 配体产生。因此，在本发明方法的一个具体实施方式
中，耙细胞中的c-met 活化独立于配体产生。
在本发明方法的一个具体实施方式
中，所述方法进一步包括(如本文所 述，通过检测多核苷酸或多肽突变)确定肿瘤细胞是否包含超稳定化的 c-met的步骤。
附图简述
图l描述了 Met外显子14侧翼内含子的突变。Met外显子14的示意图， 针对内含子/外显子结构而言，显示了相应核酸(NM一000245)缺失和/或点突 变(浅灰色文本)。(A)H596,肺癌细胞系。(B)pat. 14,患者14的肺肿瘤标 本。(C)pat. 16，患者16的肺肺瘤标本。月中瘤HW6在(A)中标记的+1位上 有从G至T的点突变。肿瘤Pat 14中在(B)中从标记的-27至-6位上有序 列缺失。肿瘤Pat 16在(C)中从标记的3195至+7位上有序列缺失。
图2. 延迟的超稳定化的c-met的下调与Met和MAPK的活化相关。 (A)用Met构建体和Cbl标记共转染的293细胞用V5或Cbl抗体进行免疫 沉淀(IP)，然后用V5、标记、或P-Tyr抗体进行免疫印迹(IB)。用标记或 Cbl抗体探测溶解产物。(B)用Met构建体转染293细胞，然后用内源Cbl 进行IP 。用V5抗体进行的免疫印迹显示，是Met WT而不是MetAExl4 与内源Cbl。剥下膜并再用Y1003、 YY1234/1235、 Y1349、或Y1365磷酸 特异性抗体探测。(C)瞬时转染293细胞的溶解产物与V5抗体免疫沉淀， 并用泛素抗体进行免疫印迹以检测泛素化的Met。剥下膜并用V5抗体检测
Met的存在。用标记或肌动蛋白抗体探测溶解产物以检测等同表达的Cbl 标记或肌动蛋白。(D)293细胞用所示的构建体转染并用10 g/ml放线菌酮 (cydoheximide)处理。用V5抗体或肌动蛋白探测溶解产物。(E)用50ng/ml rhuHGF刺激血清饥饿的肺癌细胞系10分钟，然后清洗并加入无血清培养 基。在所示时间收集溶解产物，并对P-Met (Y1230/Y1234/Y1235)、 Met、 P-MAPK、 MAPK、 P-Akt、或Akt进行免疫印迹。(F)大鼠1A稳定克隆是 血清饥饿的，并用激动性Met单克隆抗体3D6 (5吗/ml)处理10分钟，用 PBS清洗，并加入无血清培养基。在所示的时间，获得溶解产物，并对 P-MAPK、 MAPK、 P-Akt、或Akt进4亍免疫印迹。
图3.含Met近膜缺失的细胞系中增强的配体依赖性增殖潜力。(A)在 存在或缺失50 ng/ml rhuHGF的情况下，在72小时后确定在一组NSCLC细 胞系中的HGF刺激的生长情况。结果表示为刺激指数(SI)，其由最少三个 分别的实验来确定。(B)在棵鼠中，在存在或缺失HGF激动剂抗体(3D6) 的情况下，皮下接种的Rat 1A稳定细胞系表达载体，MetWT， MetAExl4， 的生长曲线。
图4.用抗Met mAb ( OA-5D5 )抑制H596细胞中的配体依赖性Met信 号传递和生长。(A)血清々几饿的H226或H596细胞与所示浓度的OA-5D5 孵育30分钟，然后用100 ng/ml rhuHGF刺激15分钟。收获溶解产物，并 对P-Met(Y1234/Y1235)、 Met、 P-Akt、 Akt、 P-MAPK、或MAPK进行免疫 印迹。(B)在存在或缺失50 ng/ml rhuHGF的情况下，用OA-5D5或对照Ig 以所示浓度处理细胞，并在72小时后确定细胞存活率。
图5.在Rat 1A稳定Met细胞系中定量磷酸激酶与激酶的比率。用 Odyssey红外线扫描仪检测AlexaFluor680和IR Dye800偶联的二级抗体， 由此定量P-MAPK: MAPK (左)和P-Akt: Akt(右)的比率。
图6.在用OA-5D5处理的H596和H226细胞中定量磷酸激酶与激酶的 比率。用Odyssey红外线扫描仪检测AlexaFluor680和IRDye800偶联的二 级抗体，由此定量每种细胞系的P-Met: Me、 P-Akt: Akt、或P-MAPK: MAPK的比率。
图7描述了示例性的顺式作用剪接元件，预期其能调节人c-met外显 子14的剪接。预计这些元件内一个或多个位置上的突变将对外显子14的 野生型剪接有消极影响。
图8描述了基于RefS叫.NM—000245的野生型人c-met蛋白序列。
图9描述了实施例中提及的OA-5D5抗体的轻和重链可变结构域序列。
实施本发明的方式
本发明提供了用于鉴定HGF/c-met信号传递途径抑制剂(尤其是，超稳 定化的c-met的抑制剂)的方法、组合物、试剂盒和制品，以及应用该抑制 剂的方法。
本文提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。 常规技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、 微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域 的技术范围内。这些技术在文献中有充分解禾奪，例如"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第二版 (Sambrook 等，1989); "Oligonucleotide Synthesis", (M. J. Gait,编，1984); "Animal Cell Culture", (R. I. Freshney,编， 1987); "Methods in Enzymology"， (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology", (F. M. Ausubel等，编，1987,及其周期性的更新)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis等,编，1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V,, 1988)。
定义
本文所用的术语"超稳定化的c-met"、及其变体，指天然产生的突变 的人c-met，其以可检测的慢于野生型c-met的速率被降低/下调。比较野 生型c-met和超稳定化的c-met间降低/下调率的方法对于所属领域技术人 员来说是显然的，例如包括以下实施例中所述的。在一方面，根据定量细 胞中受体蛋白水平可评估延迟的降解/下调。在另一方面，根据检测与Cbl 纟吉"^^" c-met 相关的c-met位点中的突变，来确定延迟的降解/下调。在一方 面，c-met位点中的突变与c-met泛素化(例如，在 c-met夕卜显子14中)和受 体蛋白质降解/下调相关。这些突变可产生任何造成突变的c-met蛋白表达 的形式，所述表达以慢于野生型c-met的比率降低/下调，其中突变的c-met 蛋白能够有野生型c-met相关的活性(例如，磷酸化诸如MAPK的下游分 子，刺激细胞增殖和/或诱导肿瘤发生事件)。例如，这些突变包括与功能性 的、读框内的c-met剪接变体相关的那些，所述c-met剪接变体缺少外显
子14的至少一部分，所述外显子14与受体蛋白降解/下调相关。突变的示 例性例子包括

图1和7所示的在剪接元件中发现的那些。在一个具体实施 方式中，相对于细胞中有相似量的野生型c-met蛋白，本发明超稳定化的 c-met蛋白存在于细胞中是与HGF/c-met途径中下游分子延长和/或增加的磷 酸化相关的。
本文所用的术语"载体"意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。 一类载体是"质粒"，指其中可连接另外DNA区段的环状双链DNA环。另 一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外DNA区段 连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(如 具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附 加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从 而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的 基因的表达。此类载体在本文中称为"重组表达载体，，(或筒称为"重组载 体")。 一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式的。 在本说明书中，"质粒，，和"载体"可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
"多核苷酸"或"核酸，，在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合 物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰 的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶、或通 过合成反应整合进聚合物的任何底物。多核普酸可包含修饰的核苷酸，如 曱基化的核苦酸及其类似物。如果存在的话，对核香酸结构的修饰可以在 聚合物装配之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分隔断。多核 芬酸可以在合成后进一步修饰，如通过与标记成分偶联来进行。其它类型 的修饰包括诸如，"帽，，，将一个或多个天然产生的核苷酸用类似物替代，核 苦酸间修饰，如用不带电荷的连接(如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、 氨基曱酸酯等)和带电荷的连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)进行 的那些，包含下垂部分(例如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、 聚L-赖氨酸等))的那些，带有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的那些，含 有螯合剂(如金属、放射活性金属、硼、金属氧化物等)的那些，含有烷 化剂的那些，带有修饰连接(如a异头核酸等)的那些，以及未修饰形式的 多核苷酸。另外通过标准保护基团保护，通常存在于糖中的任何羟基可用 诸如膦酸基团、磷酸基团替换，或被活化以制备与其它连接头来连接其它
核苷酸，或者可偶联到固相或半固相支持物上。5'和3'末端OH可磷酸化或者 用胺或l-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可衍生成标准的保护 基团。多核苷酸还可含有现有通常已知的核糖或脱氧核糖的糖类类似物形 式，如包括2'-氧-甲基-、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物， a-异头糖，差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景 天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物，如曱基核糖核苷。可用可选 的连接基团来替换一个或多个磷酸二酯键。这些可选的连接基团包括但不 限于如下具体实施方案，其中磷酸酯用P(O)S ('^危代酸酯")、P(S)S ("二 硫代酸酯，，)、(0)NR2 ("酰胺酯，，)、P(O)R、 P(O)OR'、 CO或CH2 ("曱缩醛") 替代，其中每个R或R'独立为H或者取代或未取代的烷基(l-20个C),任选 含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中 的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸， 包括RNA和DNA。
本文所用的"寡核苷酸"一般指短的、通常是单链的、通常是合成的多核 苷酸，其长度通常但不是必须小于约200个核苷酸。术语"寡核苷酸"和"多 核香酸"并不互相排斥。以上关于多核苷酸的描述可以等同地并且完全地适 用于寡核苷酸。
除非另外指明，本文所用的术语"肝细胞生长因子"或"HGF，，指任何天 然的或变体(无论是天然的还是合成的)HGF多肽，其能够在允许活化 HGF/c-met信号传递途径发生的条件下活化HGF/c-met信号传递途径。术 语"野生型HGF，通常指这样的多肽，其包含天然产生的HGF蛋白的氨基酸 序列。术语"野生型HGF序列"一般指在天然产生的HGF中发现的氨基酸序 列。C-met(或Met)是已知的HGF受体，通过它可在生物学上实现HGF细胞 内信号传递。基于RefSeq NM—000245的野生型人c-met蛋白序列如图8所示。
本文在哺乳动物(尤其是人)的上下文中所用的术语"剪接位点"、"剪 接连接点"、"分支位点(branch site)"、"多聚嘧啶束(polypyrimidine tract)"指 现有已知的RNA剪接的意义。如参见，Pagani&Baralle, Nature Reviews: Genetics (2004), 5: 389-396,以及该文中引用的参考文献。为了方便参考， c-met RNA剪接元件的 一种具体实施序列在图7中有示例性的说明。
本文所用的术语"宿主细胞"(或"重组宿主细胞")意指基因改造了的细 胞，或能通过导入外源多核苷酸(如重组质粒或载体)而被基因改造的细
胞。应当理解，该术语指的不仅是特定受试者细胞，而且有该细胞的后代。 因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后代中产生，所以实际上，该后 代与亲本细胞可以不完全相同，但仍旧包括在本文所用的术语"宿主细胞"
的范围内。
"抗体，，(Ab)和"免疫球蛋白"(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体显 示出针对特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和通常缺少抗原 特异性的其它抗体样分子。例如，所述后一种多肽是例如淋巴系统以低水 平产生，而骨髓瘤则以高水平产生的多肽。
术语"抗体'，和"免疫球蛋白"以最广义互换使用，包括单克隆抗体(如全 长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体 (如双特异性抗体，只要它们能显示出所希望的生物学活性)，并且还可 包括抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、 人源化的和/或亲和力成熟的。
"抗体片段"只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部 分存在于完整抗体中时正常相关的至少一种、优选大多数或所有功能。在 一个具体实施方式
中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，由此保留
结合抗原的能力。在另一个具体实施方式
中，抗体片段，例如包含Fc区的 抗体片段，保留与所述Fc区在存在于完整抗体中正常相关的至少一种生物 学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个具体实施方式
中，抗体片段是具有与完整抗体基本相似的体内半衰期的单 价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个与能赋予该片段以体内稳定性 的Fc序列相连的抗原结合臂。
术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时，指抗体可变结构域区的 区域，其序列高度可变和/或能形成结构确定的环。术语"HVR"或"HV"前 面的字母"HC"和"LC，，分别指重链和轻链的HVR或HV。通常，抗体包含6 个高变区三个在VH中(Hl、 H2、 H3 ),三个在VL中(Ll、 L2、 L3 )。 可使用许多高变区的描绘，它们都包括在本文中。Kabat互补决定区(CDR) 是以序列可变性为基础描述的，而且是最常用的(Kabat等， /Voto'ra 7/7箭皿o/og/co/ 第5编.Public Health Service, National
Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 Chothia则代之以指结构环的位置 (Chothia and Lesk J. Mo/.196:901-917 (1987))。 AbM高变区代表Kabat
CDR和Chothia结构环之间的折衷，而且它被Oxford Molecular's AbM抗体 建模软件所使用。"接触"高变区是以分析可获得的复杂晶体结构的为基础 的。这些高变区中每一个的残基如下所示。
环Kabat AbM Chothia接触
LIL24-L34 L24-L34L26-L32L30-L36
L2L50-L56 L50-L56L50-L52L46-L55
L89-L97 L89-L97L91-L96L89-L96
HIH31-H35B H26-H35BH26-H32H30-H35B
(Kabat编号)
mH31-H35 H26-H35H26-H32H30-H35
(Chothia编号)
mH50-H65 H50-H58H53-H55H47-H58
H3H95-H102 H95-H102H96-H101H93-H101
"框架，，或"FR"残基是可变区中除了如本文所定义的高变区残基以外的 那些残基。
抗体"可变区"或"可变结构域"指抗体重或轻链的氨基末端结构域。这些 结构域一般是抗体最可变的部分并包含抗原-结合位点。
本文所用的术语"单克隆抗体"指从基本上同质的抗体群中获得的抗体， 即构成所述抗体群的抗体个体除了可能以极小数量存在可能天然产生的突 变之外，都是相同的。单克隆抗体是高度特异的，它们针对单一抗原。此 外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相 反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
单克隆抗体在本文中明确包括"嵌合"抗体以及此类抗体的片段，其中重 链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体 中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另 一物种或属于另一 抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们能显示出所希 望的生物学活性(美国专利4,816,567;及Morrison等，iVoc.淑/. J cad 园81: 6851-6855 (1984))。
非人(如鼠)抗体的"人源化"形式是嵌合抗体，其包含衍生自非人免疫 球蛋白的最少序列。对于大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体 抗体)，其中受体高变区的残基用非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵 长类)(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种的高变区具有所 希望的特异性、亲和力和能力。在有些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR) 残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含没有在受体抗体中 或在供体抗体中发现的残基。这些修饰是为了进一步改善抗体性能的。通 常，人源化抗体将包含至少一个、并且通常两个基本完全的可变结构域， 其中完全的或基本完全的高变环对应于非人免疫球蛋白中的高变环，而且
完全的或基本完全的FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗体任选还 将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的Fc。更多 详情参见Jones等，A^wre 321: 522-525 (1986); Riechmann等，Atowe 332: 323-329 (1988);和Presta， C群.(9p. S^".倫/. 2: 593-596 (1992)。还可参 见下列综述文章及其引用的参考文献Vaswani和Hamilton, j朋.J〃ergy, 爿W/7wa c&/附mwwo/. 1: 105-115 (1998); Harris, S〖oc/zew. 5bc. 7Va"sac"o/z 23: 1035-1038 (1995); Hurle和Gross, O^r. (9/ . A'ofec/z. 5: 428-433 (1994)。
"人抗体，，是这样的抗体，其具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应
"亲和力成熟，，的抗体指这样的抗体，与没有这些改变的亲本抗体相比， 在其一个或多个CDR/HVR中具有导致抗体对抗原的亲和力有所改进的一 处或多处改变。优选的亲和力成熟的抗体对靶抗原将具有纳摩尔或甚至皮 摩尔水平的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过现有已知的过程产生。Marks 等所0/Tec/7w fogy 10: 779-783 (1992)描述了通过VH和VL结构域改组的 亲和力成熟的抗体。下列文献描述了 CDR/HVR和/或框架残基的随机诱变 Barbas等Jcad 5W，固91: 3809-3813 (1994); Schier等G麼169: 147-155 (1995); Yelton等/mmw"o/. 155: 1994-2004(1995);〗ackson等， J. /""柳"o/. 154(7): 3310-9 (1995);和Hawkins等，J M /.肠/. 226: 889-896 (1992)。
术语"FC区"用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，其可通过木瓜蛋
白酶消化完整抗体来产生。Fc区可以是天然序列的Fc区或变体Fc区。尽 管免疫球蛋白重链的Fc区边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被定 义为从Cys226位左右或从Pro230位左右的氨基酸残基延伸至Fc区羧基末 端的片段。免疫球蛋白的Fc区一般包括两个恒定结构域(CH2结构域和 CH3结构域)，并任选包括CH4结构域。本文中的"Fc区链"指Fc区两 条多肽链之一。
本文所用的术语"细胞毒剂"指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破 坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re'88、 Sm153、 Bi212、 P"和Lu的放射性同位素)，化疗剂，和毒素，如小分 子毒素或者细菌、真菌、植物或动物来源的酶活化毒素，包括其片段和/或变体。
"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类 (alkylating agents)， 如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN 环磷酰胺 (cyclophosphamide);,黄酸烷基酉旨类(alkyl sulfonates), 如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)禾口派泊舒凡(piposulfan);氮丙口定类(aziridines)，长口苯佐 替〉派(benzodepa)、 卡;皮酉昆(carboquone)、 美妥替〉派(meturedepa)牙口乌瑞替〉泉 (uredepa); 乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines), 包 括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑石粦酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撑疏代碌酰胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine);番篇#支内酉旨类(acetogenin)(尤其是布 拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone) ); 5力-四氢大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻S^(dronabinol), MARINOL );卩々立帕酉昆 (lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸(betulinic acid); 喜冲对；威(camptothecin)(包4舌合成类4以物4乇泊康(topotecan) (HYCAMTIN )、 CPT-ll (伊立替康(irinotecan)， CAMPTOSAR )、乙酰 喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和 比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸 (podophyllinic acid); 替尼泊脊(teniposide); 隐藻素类(cryptophycins)(特另ll 是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成
类似物，KW-2189和CB1-TM1 );艾榴塞洛素(eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin;〉每纟帛承卩素(spongistatin); 氮芥类(nitrogen mustards), 诸3口苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、 雌莫司汀(estramustine)、 异环磷酰胺(ifosfamide)、 双氯乙基曱胺 (mechlorethamine)、 盐酸氧氮齐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法 仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、 苯芥月旦甾醇(phenesterine)、 泼尼莫司 汀(prednimustine)、 曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracil mustard); 亚硝' 脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福 莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀 (ranimustine); 抗生素类，如烯二炔类(enediyne)抗生素(如力口利车霉素 (calicheamicin)，尤其是加利车霉素yll和力口利车霉素coll (如参见Agnew， Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); dynemicin，包括dynemicin A;埃 斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白 烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素 (actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素 (bleomycin)、放线菌素C (cactinomycin)、 carabicin、洋红霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、》文线菌素D (dactinomycin)、 柔红霉素(daunombicin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、 多柔比星(doxombicin)(包括ADRIAMYCIN 、吗啉代多柔比星、氰基吗啉 代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL ) 和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星 (idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、诸如丝裂霉素C的丝裂霉素类 (mitomycins)、 霉酚酸(mycophenolic acid)、 诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉 素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、 potfiromycin、 口票呤霉素(puromycin)、 三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、 链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他 丁(zinostatin)、佐柔比星(zombicin);抗代谢物类，如曱氨蝶呤、吉西他滨 (gemcitabine ) (GEMZAR⑧)、替加氟(tegafur ) (UFTORAL⑧)、卡培他滨 (capecitabine ) (XELODA⑧)、埃坡霉素(epothilone )和5-氟尿嘧啶(5-FU); 叶酸类似物，如二曱叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、 三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、 6-巯基嘌呤
(mercaptopurine)、硫咪噤呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧咬类似 物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞香(azacitidine)、 6-氮尿苷、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿香 (doxifluridine)、依i若4也滨(enocitabine)、 氟尿普(floxuridine); #:;敫素类,如 卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酉同(dromostanolone propionate)、表石克i,醇 (epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酉旨(testolactone);抗肾上腺类，如 氨鲁米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸 补充剂，如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);輕磷酰胺糖苦 (aldophosphamide glycoside); 氛基乙酰丙酸(aminolevulinic acid); 恩尿嘧口定 (eniluracil); 安吖.咬(amsacrine); bestrabucil; 比生群(bisantrene); 依达曲沙 (edatraxate); i也石舞酰胺(defosfamide);;也美可辛(demecolcine); 土也吖酉昆 (diaziquone); elfornithine;依利醋4妄(elliptinium acetate);依4乇才各鲁(etoglucid); 硝酸镓；轻脲(hydroxyurea);香蒜多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine); 美 登木素生物石咸类(maytansinoids), 如美登素(maytansine)和安丝菌素 (ansamitocin); 米才乇脈月承(mitoguazone); 米才乇蒽酉昆(mitoxantrone); 莫口底达醇 (mopidamol); 二胺硝'吖咬(nitracrine); 喷司他丁 (pentostatin); 蛋氨氮芥 (phenamet);。比柔比星(pirambicin); 洛索蒽醌(losoxantrone); 2-乙基酰肼 (ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine); PSK⑧多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰 (sizofiran);虫茅J走4者(spirogermanium);纟田交4连孑包菌酮酸(tenuazonic acid); 三 亚胺醌(triaziquone); 2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤 其是T-2毒素、疣孑包菌素(vermcarin) A、杆孢菌素(roridin) A和蛇行菌素 (anguidin)); 乌拉坦(urethan); 长春地辛(vindesine) ( ELDISINE , FILDESIN );达卡巴漆(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol); 二溴卫矛醇(mitolactol); 艰泊澳烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside) ("Ara-C");塞替派(thiotepa);类紫杉醇 (taxoids),例如紫杉醇(paclitaxel) ( TAXOL )、清蛋白改造的纳米颗粒剂 型紫杉醇(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxd) (TAXOTERE );苯丁酸 氮芥(chlorambucil); 6-硫鸟。票呤(thioguanine); 巯基噪呤(mercaptopurine); 曱氨虫莱口令(methotrexate); 4白类似物，如顺4自(cisplatin)和卡粕(carboplatin); 长春碱(vinblastine) ( VELBAN );柏；依托泊苦(etoposide) ( VP-16 );异环
磷酰胺(ifosfamide); 米托蒽醌(mitoxantrone); 长春新碱(vincristine)
(ONCOVIN );奥沙利铂(oxaliplatin);亚叶酸(leucovorin);长春瑞滨 (vinorelbine) (NAVELBINE ); 能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate); 道诺霉素(daunomycin); 氨基蝶呤(aminopterin); 伊本膦酸盐(ibandronate); 拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类维A酸 (retinoids),如视黄酸(retinoic acid);任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍 生物；以及两种或多种上述物质的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、 长春新石咸和泼尼龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利柏
(ELOXATIN )联合5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素 效应的抗激素剂，而且它们常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以 是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM),如包 括他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)
(EVISTA )、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、 那洛昔芬(keoxifene) 、 LY117018 、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬 (toremifene) ( FARESTON );抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD);雌 激素受体拮抗剂，如fulvestrant (FASLODEX );功能为抑制或关闭卵巢的 药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，如醋酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)(LUPRON 和ELIGARD )、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酉吏布舍瑞4木(buserelin acetate )和曲普瑞4木(triptorelin);其它4元 雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特 (bicalutamide);及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制 剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate) (MEGASE )、依西美坦(exemestane) (AROMASIN )、福美坦 (formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole) (RIVISOR )、来曲唑 (letrozole) ( FEMARA⑧)和阿那曲唑(anastrozole) ( ARIMIDEX )。另外， 化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates),如氯膦酸盐(clodronate)
(例如BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、依替膦酸钠(etidronate) ( DIDROCAL )、 NE-58095 、 唑来膦酸/哇来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)
(ZOMETA )、阿伦膦酸盐(alendronate) ( FOSAMAX )、帕米膦酸盐 (pamidronate) (AREDIA )、替鲁膦酸盐(tiludronate) ( SKELID )或利塞
膦酸盐(risedronate) ( ACTONEL );以及曲沙他滨(troxacitabine) ( 1 ，3國二
氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与粘着细胞增 殖的信号传递途经中的基因表达的反义寡核苷酸，例如PKC-a、 Raf、 H-Ras 和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，如THERATOPE⑧疫苗和基因疗法疫 苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUYECTIN 疫苗和VAXID 疫苗； LURTOTECAN⑧拓朴异构酶l抑制剂(如，LURTOTECAN ); rmRH (如， ABARELIX ) ; lapatinib ditosylate ( ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子 抑制剂，也称为GW572016 ) ; COX-2抑制剂，如celecoxib (CELEBREX ; 4—(5-(4-甲苯基)-3-(三氟曱基)-lH-吡唑-l-基)苯石黄酰胺；及任何上述物质的 药学可接受盐、酸或衍生物。 .
"阻断性"抗体或"拮抗性"抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学 活性的抗体。这样的阻断能通过任何方式产生，如通过干扰蛋白质-蛋白质 相互作用，如配体与受体的结合。在一个具体实施方式
中，阻断性抗体或 拮抗性抗体基本或完全抑制所述抗原的生物学活性。
术语"癌症"和"癌性，，指或描述哺乳动物中通常表征为细胞生长/增殖不 受调节的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(如，霍奇金氏和 非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。这样的癌症的更具体实 例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状癌、 腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、 肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子 宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、曱状腺癌、肝的癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌。
本文所用的"治疗"指试图改变所治疗的个体或细胞的自然进程的临床 干预，并可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果 包括预防疾病的发生或复发、緩解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理 学后果、防止转移、减緩疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除 或改善预后。在一些具体实施方式
中，本发明的方法和组合物用于试图延 迟疾病或病症的发展。
"有效量，'指在实现期望的治疗或预防效果所必需的剂量和时间周期上 有效的量。治疗剂的"治疗有效量"可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别 和体重及抗体在个体中引发期望应答的能力的因素而变化。治疗有效量还
指治疗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。"预防有效量"指在 实现期望的预防效果所必需的剂量和时间周期上有效的量。通常而非必需 的，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此 预防有效量将低于治疗有效量。
本发明的组合物和方法
A. C-met拮抗剂抗体
在一个具体实施方式
中，本发明提供了 C-met拮抗剂抗体，其可在本文 中找到用作治疗和/或诊断剂的用途。示例性的抗体包括多克隆、单克隆、 人源化、双特异性、和异源偶联抗体。产生、鉴定、表征、修饰和生产抗 体的诸方面是现有很成熟的，如美国专利申请公开文件2005/0042216号的 第522至563、 604至608、以及617至688段所述的。
本文公开的C-met拮抗剂抗体可配制成适于向耙细胞/组织递送的形 式。例如，抗体可配制成免疫脂质体。"脂质体"是包括各类脂质、磷脂和/ 或表面活性剂的小嚢，其可用于将药物递送到哺乳动物。脂质体的成分通 常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列形式相似。含抗体的脂质体可通 过现有已知的方法制备，如下列所述的Epstein等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030(1980); 美国专利4, 485, 045和4, 544， 545;和^>开于1997年10月23日的 W097/38731。带有增强循环周期的脂质体乂>开于美国专利5， 013， 556中。
特別有用的脂质体可通过反相蒸发法用液体组合物来产生，所述组合 物包含卵磷脂、胆固醇和PEG衍生化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂质体通 过确定孔大小的滤膜被挤出以产生所希望直径的脂质体。如Martin等，i Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)所述，本发明抗体的Fab'片段可通过二石克化 物交换反应与脂质体偶联。化疗剂可任选用脂质体包裹。参见Gabizon等， J. National Cancer Inst. 81(19): 1484(1989)。
B. C-met拮抗剂多肽
在一个方面，本发明的c-met拮抗剂包含多肽。在一个具体实施方式
中， 拮抗剂多肽在细胞中结合和/或拮抗超稳定化的c-met蛋白。在一个具体实 施方式中，多肽结合(优选特异)超稳定化的c-met。多肽可用已知的肽合 成方法化学合成，或可用重組技术制备和纯化。在一个具体实施方式
中， C-met拮抗剂多肽长度至少约为5个氨基酸，可选地至少约为6、 7、 8、 9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、 23、 24、 25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、 39、 40、 41、
42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、 55、 56、 57、
58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、 71、 72、 73、
74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、 87、 88、 89、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100个氨基酸或更长，4中该多肽能抑制超稳定化的c-met的活性。这些多肽无需过多实验就可用 公知技术鉴定。在这点上，注意，为获得能特异结合多肽靶位的寡肽而筛 选寡肽文库的技术是现有公知的(如参见，美国专利5， 556, 762、 5， 750， 373、 4, 708, 871、 4, 833， 092、 5， 223, 409、 5, 403, 484、 5, 571, 689、 5， 663, 143; PCT />开文件WO 84/03506和WO84/03564; Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ， 81: 3998-4002 (1984); Geysen等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.， 82: 178-182 (1985); Geysen等，Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen等，J. Immunol. Meth.， 102: 259-274 (1987); Schoofs等，J. Immunol., 140: 611-616(1988)， Cwirla， S. E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87: 6378; Lowman, H.B.等(1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T.等(1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D.等(1991), J. Mol. Biol., 222: 581; Kang， A.S.等"991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8363,和Smith， G. P. 0991) Current Opin. Bioteclmol.， 2: 668)。
噬细菌体(噬菌体)展示是一种公知技术，其能筛选大的寡肽文库以鉴 定出那些文库中能特异结合多肽靶位的成员。噬菌体展示是一种技术，变 体多肽通过它展示为与噬菌体颗粒表面上与包膜蛋白融合的蛋白质(Scott, J.K.和Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386)。噬菌体展示的用处在于能迅 速并有效地挑选随机选择的蛋白质变体(或随机克隆的cDNA)的大文库，选 出那些高亲和力结合靶分子的序列。噬菌体上肽(Cwirla， S. E.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378)或蛋白质(Lowman, H.B.等(1991) Biochemistry, 30: 10832; Clackson, T.等(1991)Nature, 352: 624; Marks, J. D.等(1991), J. Mol. Biol.， 222: 581; Kang, A.S.等(1991) Proc. Natl. Acad,
计的多肽或寡肽(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2: 668)。挑
选随机突变的噬菌体文库需要构建并扩增大量变体的策略、利用靶受体亲
和纯化的过程、和评估结合丰度结果的方法。美国专利5， 223， 409、 5, 403， 484、 5， 571， 689、和5, 663， 143。
尽管大多数噬菌体展示方法使用了丝状噬菌体，但是也知道可用X p苤 菌体展示系统(WO 95/34683; U.S. 5, 627, 024)、 T4噬菌体展示系统(Ren 等，Gene, 215: 439 (1998); Zhu等，Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang等，Infection & Immimitv， 65(11): 4770-4777(1997); Ren等， Gene， 195(2): 303-311 (1997); Ren， Protein Sci.， 5: 1833 (1996); Efimov 等，Vims Genes， 10: 173 (1995》和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5, 766，卯5)。
现在已开发出基于噬菌体展示概念的其它许多改进和变化。这些改进 增强了展示系统筛选结合所选靶分子的肽的文库的能力，并展示出带有筛 选所需性质的这些蛋白质潜力的功能性蛋白质。
已经开发出用于噬菌体展示反应的组合反应设备(W098/14277),并已 用噬菌体展示文库分析和控制双分子的相互作用(WO 98/20169; WO 98/20159)和限制螺旋肽(constrained helical peptide)的性质(WO 98/20036)。 WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中噬菌体展示文库与一种溶 液(其中配体将结合靶分子)和第二种溶液(其中亲和配体将不结合耙分 子)接触，以选择性地分离出结合配体。WO 97/46251描述了生物淘洗带 有亲和纯化抗体的随机噬菌体展示文库的方法，然后分离结合的噬菌体， 然后利用微板孔进行微淘洗过程以分离高亲和性的结合噬菌体。已经有报 道将金黄色葡萄球菌蛋白质A用作亲和标签(Li等(1998) Mol Biotech.， 9: 187)。 WO 97/47314描述了利用可以作为噬菌体展示文库的组合文库，将 底物消减文库(substrate subtraction library)用于区分酶特异性。利用噬菌体展 示选4奪适用于去污剂中的酶的方法在WO 97/09446中有描述。其它选择特 异性结合蛋白的方法在美国专利5， 498, 538、 5, 432, 018、和WO 98/15833 中有描述。
产生肽库并筛选这些库的方法也在美国专利5， 723, 286、 5, 432， 018、 5, 580, 717、 5, 427, 908、 5， 498， 530、 5， 770， 434、 5， 734， 018、 5, 698, 426、 5， 763, 192、和5， 723, 323中有公开。
产生、鉴定、表征、修饰和生产拮抗剂多肽的方法是现有很成熟的，
如美国专利申请公开文件2005/0042216号的第606至608、 614至688段所述的。
在一个具体实施方式
中，拮抗超稳定化的c-met的活性的多肽可根据 超稳定化的c-met蛋白结构来设计，如根据包含突变的c-met近膜序列的靶 抗原来筛选，所述序列含本文所述的外显子14的至少一部分的缺失。例如， 耙抗原可包含多肽，该多肽包括由c-met外显子13和15的读框内剪接而产 生的序列。
C. 免疫偶联物
在另一方面，本发明提供了免疫偶联物、或抗体-药物偶联物(ADC)， 其包括与细胞毒剂偶联的抗体，所述细胞毒剂如化疗剂、药物、生长抑制 剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放 射性同位素(即放射偶联物)。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中应用于局部递送细胞毒或细胞抑制剂 中，即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz和Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172;美国专利4， 975， 278)，这能将药物部分耙向递送至肿瘤， 并在那儿进行细胞内积累，其中全身给药这些未经偶联的药物试剂可能在 试图消除的肿瘤细胞以外导致针对正常细胞的无法接受的毒性水平 (Baldwin等，Lancet 603-05 (1986年5月15日)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review"，在《Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications》中的综述，A. Pinchera等编，第 475-506页，1985 )。由此人们试图寻求获得最大功效及最小毒性。多克隆 抗体和单克隆抗体据报道都可用于这些策略(Rowland等，Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87 (1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素 (daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、曱氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛 (vindesine) ( Rowland等，1986,见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素 包括诸如白喉毒素的细菌毒素、诸如蓖麻毒蛋白的植物毒素、诸如格尔德 霉素(geldanamycin)的小分子毒素(Mandler等,Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581 (2000); Mandler等,Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028 (2000); Mandler等，Bioconjugate Chem. 13: 786-791 (2002))、美登 木素生物碱类(EP 1391213; Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623
(1996))、和加利车霉素(calicheamicin)( Lode等，Cancer Res. 58: 2928 (1998); Hinman等，Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993))。所述毒素可通过包括微管蛋 白结合、DNA结合或拓朴异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒和细胞抑制 的效应。 一些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活 或活性降低。
ZEVALIN (ibritumomabtiuxetan, Biogen/Idec )是由针对在正常和恶 性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgGl k单克隆抗体与通过硫脲 接头-螯合剂所结合的11或9QY放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶 联物(Wiseman等，Eur. Jour. Nucl, Med. 27(7): 766-77 (2000); Wiseman等, Blood 99(12): 4336-42 (2002); Witzig等，J. Clin. Oncol. 20(10): 2453-63 (2002); Witzig等，J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69 (2002))。尽管ZEVALIN具 有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而给药会在大 多H患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG ( gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals)，即由hu CD33抗体与加利车霉素连 接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性髓性白血 病(Drugs of the Future 25(7): 686 (2000);美国专利4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001 ) 。 Cantuzumab mertansine (Immimogen Inc.),即由huC242抗体经二石克化物4妄头SPP与美 登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体药物偶联物，在进行用于治 疗表达CanAg的癌症(如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌)的试验。MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen Inc.), 即由^1前歹'J月泉净寺异 膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物i成药物部分DM1连接而构成的 抗体-药物偶联物，在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的试验。将多拉司他汀 (dolastatin)的合成类似、物 auristatin 月太、 auristatin E (AE)和 monomethylauristatin (MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96 (对癌上的Lewis Y 特异)和cAC10(对恶性血液胂瘤上的CD30特异)偶联(Doronina等，Nature Biotechnology 21(7): 778-784(2003))，且正在进行治疗性开发中。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活 性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素 A纟连(来自4同纟录,i单月包菌尸化M(icwcwas aerwg/wosa )、蓖麻毒蛋白(ricin) A 4连、 相思豆毒蛋白(abrin) A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin) A链、a-帚曲霉素
(sarcin)、油桐(^/ew故es/onf")毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商Pi (尸/z少to/aca amen'co!"a)毒蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S )、苦瓜(AfomoW/ca c/wraw"a)抑制物、麻疯树毒蛋白(curdn)、 巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草 (sopao"arz'a ofc/"a〃力抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、 局'卩艮曲菌素(restrictocin)、 酚霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)牙口单3离 孢菌素(trichothecenes)。如参见，WO 93/21232其公开于1993年10月28 日。多种放射性核素可用于生成放射性偶联抗体。实例包括"Si、 131I、 niIn、 wy和賜Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制
备，如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、 亚氨酸酯(如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚 氨基酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯曱酰基)己 二胺)、双重氮衍生物(如双(对-重氮苯曱酰基)己二胺)、二异氰酸酯(如 曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)的 双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238: 1098 (1987)中所述制备 蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的l-异硫氰酸苯曱基-3-曱基二亚乙基三胺 五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参 见WO 94/11026。
本文还考量了抗体与一种或多种小分子毒素(如加利车霉素 (calicheamicin)、美登木素生物石咸类(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatin)、 aurostatin、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065 )及这些毒素具有毒素活性 的衍生物的偶耳关物。
美登素和美登木素生物碱类
在一些具体实施方式
中，免疫偶联物包括与一种或多种美登木素生物 碱类分子偶联的本发明抗体。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂 抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(7kfa_y/em^化rrato)分离得到 (美国专利3,896,111 )。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，如 美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4， 151,042 )。例如下列美国专利公开了合 成的美登醇及其书f生物和类似物4， 137, 230; 4， 248， 870; 4, 256， 746; 4, 260， 608; 4， 265， 814; 4， 294, 757; 4， 307， 016; 4， 308， 268; 4, 308， 269; 4， 309, 428; 4, 313， 946; 4, 315， 929; 4, 317，
821; 4, 322, 348; 4, 331, 598; 4, 361, 650; 4, 364, 866; 4, 424, 219; 4， 450, 254; 4, 362， 663;和4， 371, 533。
在抗体药物偶联物中，美登木素生物碱类药物部分是引人注目的药物
部分，这是因为它们(i)通过发酵或化学修饰、衍生化发酵产物是相对容 易制备的，(ii)能用适于通过与抗体的非二硫化物接头偶联的功能团衍生， (iii)血浆中稳定，而且(iv)能有效抗各种肿瘤细胞系。
美登木素生物碱类药物部分的示例性的具体实施方式
包括DM1; DM3;和DM4。含美登木素生物-喊类的免疫偶联物、制备它们的方法以及 它们的治疗应用已被公开于诸如美国专利5， 208, 020、 5, 416， 064和欧 洲专利EP 0 425 235 Bl，其公开内容纳入本文参考。Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗 体C242连接的美登木素生物碱(被称为DM1)的免疫偶联物。发现该偶联 物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定 中显示抗肺瘤活性。Chari等.，Cancer Research 52: 127-131 (1992)记载了免 疫偶联物，其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上 抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/,犯w癌基因的另 一种鼠单克隆抗体TA.H禺联。 在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上测试了 TA.l-美登木素生物碱偶联物的 细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3xl()S个HER-2表面抗原。药物偶联物达 到了与游离美登木素生物碱药物相似程度的细胞毒性，这可通过增加每个 抗体分子的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在 小鼠中显示低全身性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学
性。如参见，美国专利5， 208, 020 (其公开内容纳入本文参考)。每个抗体 分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子，这显示出能有效增强针对靶细胞 的细胞毒性效应，而对抗体的功能或溶解度没有负面影响，然而预计即使 一分子的抗体偶联一个分子的毒素也将较之棵抗体的使用增强细胞毒性。 美登木素生物碱类在本领域是现有公知的，而且可通过已知技术合成或从 天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发 表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登 醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，如各种美
登醇酯。
有许多现有已知的连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，
包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 Bl 、 Chari等，Cancer Research 52: 127-131 (1992)、和4是交于2004年10月8日的美国专利申请 10/960， 602中所公开的，其公开内容纳入本文参考。包含接头成分SMCC 的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如提交于2004年10月8日的美国专 利申请10/960， 602中所公开的那样来制备。连接基团包括二硫化物基团、 硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳 定基团，正如上文所述专利中所/>开的，优选二^L化物和為化醚基团。本文 还描述并列举了其它连接基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联 物，如用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨 基_4—(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚 氨酸酯(如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚氨 基酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、 双重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍 生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP) (Carlsson等，Biochem. J. 173: 723-737 (1978))和N-琥珀酰亚氨基 _4—(2-吡。定基硫代)戊酸酯(SPP),由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置上。 例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在 具有羟基的C-3位置、经羟曱基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位 置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的具体实施方案中，在美登醇或 美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
Auri statin和多罗司他汀
在一些具体实施方式
中，免疫偶联物包含与多拉司他汀或多罗司他汀 肽类似物和衍生物，auristatin(美国专利5635483; 5780588)偶联的本发明的 抗体。多拉司他汀和auristatin显示出能干扰微管动力学、GTP水解、以及 斗亥禾口《田月包分裂(Woyke等(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584),并具有抗癌(US 5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)
Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965)。多4立司4也汀或auristadn药物 部分可通过肽药物部分的N (氨基)末端或C (羧基)末端与抗体相连(WO 02/088172)。
示例性的auristatin的具体实施方式
包括 N-末端相连的 monomethylauristatin药物部分DE和DF, 其公开于"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、提交于2004年11月5日的 美国申请10/983， 340,其公开内容纳入本文参考。
示例性的auristatin的具体实施方式
有MMAE和MMAF。其它示例性 的具体实施方式
包括MMAE或MMAF和各种接头成分(本文进一步所述 的)Ab-MC-vc-PAB-MMAF 、 Ab-MC-vc-PAB-MMAE 、 Ab-MC-MMAE和 Ab-MC-MMAF。
典型地，基于肽的药物部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之 间形成肽键来制备。例如，可根据液相合成方法(参见E. Schr6der和K. Liibke, "The Peptides",巻l, pp 76-136, 1965, Academic Press)来制备这 些肽键，这在肽化学领域中是公知的。制备auristatin/多拉司他汀药物部分 可根据以下文献中公开的方法US 5635483; US 5780588; Pettit等(1989) J.Am. Chem. Soc. Ill: 5463-5465; Pettit等(1998)抗Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit， GR.,等Synthesis, 1996, 719-725;和Pettit等(1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863。也可参见Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"，提交于2004年11月5日的美国申请10/983, 340， 其纳入本文参考(其公开了诸如制备单甲基缬氨酸化合物(如与接头偶联的
MMAE和MMAF )的4妾头和方法)。 加利车霉素
在其它具体实施方式
中，免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素偶 联的本发明的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度时产生双 链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备，可参见例如美国专利5， 712， 374、 5， 714, 586、 5, 739, 116、 5， 767， 285、 5, 770， 701、 5, 770, 710、 5, 773， 001、 5, 877， 296 (都4更予美国Cyanamid ^>司)。可 用的加利车霉素结构类似物包括但不限于Yl、 (X21、 a, N-乙酰基-^1、 PSAG 和9、 (Him丽等.，Cancer Research 53: 3336-3342 (1993); Lode等.，Cancer
Research 58: 2925-2928 (1998)和上述授予美国Cyanamid公司的美国专 利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加 利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂 经由抗体介导的内在化的细胞摄取而大大增强了它们的细胞毒效果。 其它细胞毒剂
可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU 、链佐星 (streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、 5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、 5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类 (esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活 性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌/^ez^owomw aerwgz'"o^ )、蓖麻 毒蛋白(ricin) A链、相思豆毒蛋白(abrin) A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin) A 《il 、 a-帚曲霉素(sarcin)、油#1 (J/eM份es/ora^')毒蛋白、香石斗十(dianthin)毒蛋 白、美洲商陆(尸/77to/aca amen,ca"a)毒蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S )、苦瓜
肥皂草Oa/ ao腦n'a q^7c/腦to)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素 (mitogellin)、 局卩艮曲菌素(restrictocin)、 酚霉素(phenomycin)、 依诺霉素 (enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布 的WO 93/21232。
本发明还考量了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或 DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位 素可用于生成放射性偶联抗体。实例包括At211、 I131、 I125、 Y90、 Re186、 Re188、 Sm153、 Bi212、 P32、 Pb^和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时， 可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc"m或I123，或是包含自旋标 记物(spin label)用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri),如 石典-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钇、锰或铁。
可以已知方式将》文射性或其它标记物纳入偶耳关物。例如，可生物合成 肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用合适的氨基酸前体，其 包括例如代替氢的氟-19。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如 Tc"m或I123、 Re186、 Re'M和In川。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。 IODOGEN
:)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、
法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 )可用于整合 减-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal, CRC Press, 1989)详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，如 用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(如 盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛 类(如戊二酪)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮 衍生物(如双(对-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(如曱苯2,6-二异 氰酸酯)、和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。 例如，可如Vitetta等，Science 238: 1098 (1987)中所述来制备蓖麻毒蛋白免 疫毒素。碳-14标记的l-异硫氰酸苯曱基-3-曱基二亚乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见 W094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的"可切割接头"。 例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二曱基接头、 或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52: 127-131 (1992);美国专利 5,208,020 )。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC:商品化 (如购自Pierce Biotechnology Inc., Rockford， IL, U.S.A.)的BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、 sulfo-EMCS、 sulfo-GMBS 、 sulfo-KMUS 、 sulfo-MBS 、 sulfo-SIAB、 sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB (琥珀酰亚胺基-(4-乙烯 基砜)苯曱酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录第467-498页。
抗体药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate)(ADC)中，将抗体 (Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(dmg moiety)(D)偶联，例如每个抗体 偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反 应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括(l)抗体的亲核 基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应； 和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L,随后 与抗体的亲核基团反应。制备ADC的其它方法是本文所述的。<formula>formula see original document page 40</formula>
接头可以由一种或多种接头成分组成。示例性的接头成分包括6-马来 酰亚氨基辛基("MC，,)、马来酰亚氨基丙基(maleimidopropanoyl) ("MP")、缬 氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、 p-氨基苄氧基羰基 ("PAB，，)、 N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯("SPP，，)、 N-琥珀酰 亚氨基4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯("SMCC")、和N-琥珀酰亚 氨基(4-碘代-乙酰基)氨基安息香酸酯("SIAB，，)。其它接头成分是现有已知 的而且一些在本文中有描述。也可参见"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"，提交于2004年ll月5日的美国申请 10/983, 340,其全文纳入本文参考。
在一些具体实施方式
中，接头可以包含氨基酸残基。示例性的氨基酸 接头成分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性的二肽包括缬氨酸-瓜氨 酸(vc或val-cit)，丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性的三肽包括甘 氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包 含氨基酸接头成分的氨基酸残基包括天然产生的那些，以及少数氨基酸和 非天然产生的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可设计并优化氨基酸接头成分对 于特定酶的酶裂解选^f奪性，所述酶例如与肺瘤相关的蛋白酶、组蛋白酶-B、 C和D、或血纤维蛋白溶酶蛋白酶。
示例性的接头成分结构如下所示(其中波浪线表示与ADC其它成分 共价相连的位点)
<formula>formula see original document page 41</formula>
其它示例性的接头成分和缩写包括(其中描述了抗体(Ab)和接头，而<formula>formula see original document page 41</formula>
抗体上的亲核基团包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖 氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。 氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形
成共价键，而接头试剂包括(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代 曱酸酯、和酸性卣化物；(ii)烷基和苯曱基卣化物，诸如面代乙酰胺；(iii)醛 类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键， 即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT (二硫苏糖醇)处理使抗体具有与 接头试剂偶联的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇 亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转 变为硫醇，从而将额外的亲核基团引入抗体。通过导入一、二、三、四、 或更多个半胱氨酸残基(如，制备突变的抗体，其包含一种或多种非天然的 半胱氨酸的氨基酸残基)，反应性硫醇基团可被导入到抗体(或其片段)中。
还可通过修饰抗体，引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的 亲电子部分，来生成本发明的抗体-药物偶联物。可用诸如高碘酸盐氧化剂 来氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应 的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用诸如硼氯化 物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个具体实施方案中，糖基化抗体的 碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰 (醛和S同)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson, Bioconjugate Techniques)。在另一个具体实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基 的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan & Stroh, Bioconjugate Chem. 3: 138-146 (1992); US 5362852 )。此类醛可与药 物部分或4妻头亲核体反应
同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于胺、硫醇、羟基、酰肼、 肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分 上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括(i)活性酯类，诸如 NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性卣化物；(ii)烷基和苯曱基卤化物， 诸如卣代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
可选地，可通过诸如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的 融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，其彼此毗 邻或是由编码接头肽的区域分隔，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个具体实施方案中，可将抗体与"受体"(诸如链霉亲和素)偶联 从而用于肿瘤的预先靶向应用中，其中对患者给药抗体-受体偶联物，接着 使用清除剂从循环中去除未结合的偶联物，然后给药与细胞毒剂(如放射
性核香酸)偶联的"配体，，(例如亲合素(avidin))。
根据如下过程，抗体(Ab)-MC-MMAE可用MC-MMAE偶联本文中的 任何抗体来制备。溶于pH 8.0的500mM硼酸钠和500 mM氯化钠的抗体 用过量的100mM 二;e危苏糖醇(DTT)处理。"。C孵育约SO分钟，通过洗 脱Sephadex G25树脂来交换緩沖液并用含lmM DTPA的PBS洗脱。通过测 溶液280 nm处的吸收来确定还原的抗体浓度和与DTNB (Aldrich， Milwaukee, WI)反应的硫醇浓度，由此检测硫醇/Ab值，并确定412nm处 的吸收。溶于PBS的还原抗体在冰上冷冻。溶于DMSO中的药物接头试剂一 马来酰亚氨基辛基-单曱基auristatinE(MMAE)，即MC-MMAE,用乙腈和 水以已知浓度稀释，并加入到冷冻的溶于PBS的还原抗体2H9中。约一小 时后，加入过量的马来酰亚氨以终止反应并封闭任何未反应的抗体巯基。 通过离心超滤来浓缩反应混合物，并通过用PBS洗脱G25树脂来纯化 2H9-MC-MMAE并脱盐，在无菌条件下通过0.2 pm滤膜过滤，并冷冻储存。
根据制备Ab-MC-MMAE所提供的规程，抗体-MC-MMAF可用 MC-MMAF偶联本文提供的任何抗体来制备。
根据制备Ab-MC-MMAE所提供的规程，抗体-MC-val-cit-PAB-MMAE 可用MC-val-cit-PAB-MMAE偶联本文提供的任何抗体来制备。
根据制备Ab-MC-MMAE所提供的规程，抗体-MC-val-cit-PAB-MMAF 可用MC-val-cit-PAB-MMAF偶联本文提供的任何抗体来制备。
才艮据如下过程，抗体-SMCC-DM1可用SMCC-DM1偶耳关本文中的任何 抗体来制备。用(琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯 (SMCC， Pierce Biotechnology, Inc)衍生纯化的抗体以导入SMCC接头。 具体来说，用pH 6.5的50mM磷酸钾/ 50 mM氯化钠/ 2 mM EDTA和7.5 摩尔当量的SMCC (20 mM,溶于DMSO, 6.7 mg/mL)处理20 mg/mL抗体。 于环境温度氩气条件下搅拌2小时后，通过用pH 6.5的50mM磷酸钾/ 50 mM氯化钠/ 2 mM EDTA平衡的Sephadex G25柱，来过滤反应混合物。收 集并测试含级分的抗体。
由此制备的抗体-SMCC用pH 6.5的50mM磷酸钾/50 mM氯化钠/2 mM EDTA稀释至约10 mg/ml的终浓度，与溶于二甲基乙酰胺的10 mM DM1溶液反应。于环境温度氩气条件下搅拌反应16.5小时。偶联反应混合 物用pH 6.5的1 x PBS通过Sephadex G25凝胶过滤柱(1.5 x 4.9 cm)来过滤。
如才艮据在252 nm和在280 nm处所测得的吸收，DM1药物比抗体的比率(p) 约为2至5。
根据如下过程，Ab-SPP-DMl可用SPP-DM1偶联本文中的任何抗体来 制备。用N-琥珀酰亚氨基4-(2-硫代吡啶)戊酸酯衍生纯化的抗体以导入二 硫吡啶基团。用SPP(5.3摩尔当量，溶于2.3mL乙醇)来处理溶于含NaCl (50 mM)和EDTA(l mM)的44.7mL 50 mM磷酸钾緩沖液(pH 6.5)的抗体(376.0 mg, 8mg/mL)。于环境温度氩气条件下孵育卯分钟后通过用35 mM柠檬 酸钠、154 mM NaCl、 2 mM EDTA平衡的Sephadex G25柱，来凝胶过滤反 应混合物。收集并测试含级分的抗体。如上所述来确定抗体的修饰程度。
抗体-SPP-Py(约10微摩尔可释放的2-硫吡啶基)用以上35mMpH6.5 的杵檬酸钠緩沖液稀释至约2.5 mg/mL的终浓度。然后将溶于3.0 mM 二曱 基乙酰胺(DMA,最终反应混合物中含3% v/v)的DM1 (1.7当量，17微摩 尔)加入到抗体溶液中。反应于环境温度氩气条件下进行约20小时。反应 液上样于Sephacryl S300凝胶过滤柱(5.0 cm x 90.0 cm， 1.77 L),其用pH 6.5 的5 mM柠檬酸钠、154 mMNaCl平衡。流速约为5.0 mL/分钟，并收集65 个级分(每个20.0 mL)。每个抗体分子连接的DM1药物分子数(p，)通过测定 252 nm和280 nm处的吸收来确定，每个2H9抗体可偶联约2至4个DM1 药物部分。
根据如下过程，抗体-BMPEO-DMl可用BMPEO-DM1偶联本文中的任 何抗体来制备。抗体用双马来酰亚氨基试剂BM(PEO)4 (Pierce Chemical)修 饰，使得未反应的马来酰亚氨基留在抗体表面上。这可通过以下步骤实现 将BM(PEO)4溶于50%乙醇/水混合物中，达到10mM浓度，并向溶于磷酸 盐緩沖盐溶液的含约1.6 mg/ml (10微摩尔)浓度的抗体的溶液中加入过量 i0倍的摩尔量，使它反应1小时以形成抗体-接头中间体2H9-BMPEO。通 过凝胶过滤(HiTrap column, Pharmacia)用pH 6的含150 mMNaCl緩冲液的 30 mM柠檬酸盐去除过量的BM(PEO)4。约10倍摩尔过量的DM1溶于二 甲基乙酰胺(DMA)中，并加到2H9-BMPEO中间体中。也可用二甲基曱酰胺 (DMF)溶解药物部分的试剂。让反应混合物反应过夜，然后凝力交过滤或在 PBS中透析以去除未反应的DM1。用PBS中的S200柱进行凝胶过滤可去 除高分子量凝集体，并提供纯化的2H9-BMPE0-DM1。
D.含核酸的C-met拮抗剂
在一个方面，本发明的c-met拮抗剂包含核酸分子。例如，核酸分子可 以包括反义寡核苷酸、抑制性/干扰RNA(如，小抑制性/干扰RNA(siRNA))、 或适体。筛选、鉴定和制备这些核酸调节剂的方法是本领域已知的。
例如，siRNA已证实能调节基因表达，即使在传统的拮抗剂(如小分 子或抗体)不能进行时。(Shi Y., r簡d"" G證"c"9(l): 9-12(2003》。体 外合成的、少于30个核苷酸长度(如，约15至25、 17至20、 18至20、 19至20、或21至23个核苷酸)的双链RNA能用作干扰RNA(iRNA),并 能特异抑制基因表达(如参见，Fire A.， Trends in Genetics (1999)， 391; 806-810;美国专利申请09/821832， 09/215257;美国专利6， 506， 559; PCT/US01/10188;欧洲申请00126325)。据信这些iRNA至少能通过介导它 们的靶RNA降解来起部分作用。可是，由于它们长度不足30个核苷酸， 因此它们不会引发细胞抗病毒防御机制。这种机制包括产生干扰素，并普 遍停止宿主细胞蛋白质的合成。实践中，可合成siRNA，然后克隆进DNA 载体中。可转染这种载体，使之高水平表达siRNA 。高水平的siRNA表达 可用于"敲低(knockdown)，，或显著降低细胞中产生的蛋白质的量，由此它可 用于细胞环境，其中据信过表达的蛋白质与病理病症有联系。
适体是核酸分子，其能结合靶分子，如超稳定化的c-met蛋白。适体 的产生和治疗应用是现有;[艮成熟的。如参见，美国专利5， 475, 096，和用
于治疗与衰老相关的黄斑变性的Macugen (Eyetech， New York)有疗效。 反义技术在本领域是很成熟的。关于该技术的进一步详情在下文中提供。
E.药物配制剂
可通过将具有期望纯度的C-met拮抗剂与任选的生理学可接受载体、赋 形剂或稳定剂混合，来制备根据本发明所用的C-met拮抗剂的治疗用配制 剂，以7JC;)容'液或冻干剂的形式贮存(《Remington's Pharmaceutical Sciences》， 第16版，Osol，A.编，1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的 剂量和浓度对接受者来说是无毒的，而且其包括了缓冲剂，如乙酸、Tris、 磷酸、柠檬酸和其它有机酸的緩沖剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨 酸；防腐剂(如氯化十八烷基二曱基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、 苯索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯曱酸烷基酯，如对羟基苯曱酸曱 酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量
(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白； 亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡 萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA;渗透压调节剂，如海藻糖和氯化 钠；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇 酯；成盐反相离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离 子表面活性剂，如TWEENtm、 PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化 合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的活性化合物。例如，除了 C-met 拮抗剂，可希望在一种配制剂中包括额外的调节剂，如结合超稳定化的 c-met蛋白上不同表位的第二抗体、或针对其它一些靶位的抗体。可选地 或额外地，组合物可进一步包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制 剂、抗激素剂、和/或心脏保护剂。此类分子以对于预定目的有效的量适宜 地出现在上述组合中。
活性成分还可包载于通过诸如凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢 中(例如可以分別是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(甲基丙烯酸曱S旨)微胶 嚢)、包载于胶状药物传递系统中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、 纳米颗粒和纳米胶嚢)、或包载于粗滴乳状液中。此类技术公开于例如 《Remington's Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编,1980。
可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有抗体的 固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或
微胶嚢。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙 烯酸酯)或聚(乙蜂醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、 L-谷氨酸和y-乙基 -L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)的可降解的 乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜 过滤来实现。
F.用本发明的c-met拮抗剂治疗
本发明的C-met拮抗剂具有多种非治疗应用。拮抗剂可用于确定或检测 表达超稳定化的c-met的疾病的阶段(如，用于放射性成像)。抗体、寡肽
和适体也可用于从细胞中纯化或免疫沉淀超稳定化的c-met,用于在体外检 测并定量超稳定化的c-met,如，用于ELISA或免疫印迹的检测，并用于 调节细胞群中的细胞事件中。
当前，根据癌症阶段，癌症治疗包括以下疗法之一或组合外科手术 以去除癌组织，放射疗法，和化疗。包括C-met拮抗剂的疗法对于年老患 者和在转移性疾病中尤其是所希望的，所述患者无法很好地忍受化疗的毒 性和副作用，在所述转移性疾病中放射疗法具有有限的用途。对于治疗应 用，可单独使用C-met拮抗剂，或与诸如激素、抗血管生成剂、或放射性 同位素标记的化合物、或与外科手术、冷冻疗法、和/或放射疗法一起组合 使用。C-met拮抗剂可与其它形式的常规疗法联合给药，或顺序使用、或在 常规疗法之前或之后使用。化疗药物(如TAXOTERE (多西他塞)， TAXOL⑧(紫杉醇)，雌莫司汀和米托蒽醌)可用于治疗癌，尤其用于高危患 者。C-met拮抗剂一般会与治疗有效剂量的化疗剂一起给药。在另一个具体 实施方式中，C-met拮抗剂与化疗 一起施用以减少由诸如紫杉醇的化疗剂造 成的副作用。医生必备参考书(PDR)公开了用于治疗各种癌症的试剂的剂 量。前述这些有治疗效果的药物的给药方案和剂量将取决于要治疗的特定 癌症、疾病的程度和所述领域医生熟悉的其它因素，并可由医生确定。
根据已知方法，可向人患者给药C-met拮抗剂，所述方法如静脉内给药 (如推注(bolus)或在一段时间连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、 皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径。在本发明的一 个具体实施方式
中，优选静脉内或皮下给药所述抗体、寡肽或有机小分子。
其它疗法可与C-met拮抗剂联合施用。联合给药包括同时给药(其利用 分开的制型或单药物制型)和以任一顺序连续给药，其中优选有时间使两 种(或所有)活性试剂同时发挥它们的生物活性的时间段。优选这种疗法 可产生协同治疗效应和/或减少不需要的副作用。
也希望将C-met拮抗剂的给药和针对与特定病理状况相关的其它抗原 的治疗剂的给药组合在 一起。
在另 一个具体实施方式
中，本发明的治疗方法包括组合给药C-met拮抗 剂分子和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括联合给药不同化疗剂的混 合物。化疗剂包括石舞酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、泼尼莫司汀 (prednimustine)、顺柏、5-氟尿嘧啶、美法伦(melphalan)、环磷酰胺、羟基 脲(hydroxyurea)和羟脲紫杉烷(hydroxyureataxane)(如帕利他塞(paclitaxel)禾口 多西他塞(doxetaxel))和/或蒽环类抗生素(anthracydine antibiotic)。可根据制 造商说明书或由熟练技术人员以经验确定化疗剂和给药时间表。准备和给 药这些化疗剂的时间表在Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins， Baltimore, MD (1992)中有描述。
C-met拮抗剂可与抗激素化合物以这些分子的已知剂量组合在一起；所 述抗激素化合物例如，抗雌激素化合物，如它莫西芬(tamoxifen);抗黄体酮， 如onapristone(参见EP616 812);或抗雄性激素，如氟他胺(flutamide)。当 要治疗的癌是雄性激素非依赖性癌症时，患者可能是以前接受过抗雄性激 素疗法，并在癌症成为雄激素非依赖性之后，向患者给药C-met拮抗剂。
有时有益的是，也可向患者联合给药心脏保护剂(以防止或减少与疗法 相关的心肌失调)或一种或多种细胞因子。除了以上治疗方案，在C-met拮 抗剂疗法之前、同时或之后，使患者接受外科手术去除癌细胞和/或接受放 射疗法。以上联合给药剂的合适剂量是当前使用的那些，并由于该试剂和 C-met拮抗剂的共同作用(协同作用)而可降低其剂量。
为了预防或治疗疾病，根据已知标准通过医生来选出给药剂量和模式。 C-met拮抗剂的合适剂量将取决于如上定义的要治疗的疾病类型、疾病严重 性和进程、给药C-met拮抗剂是为预防还是治疗目的、以前的疗法、患者 临床病史和对C-met拮抗剂的反应性、以及参与医生的判断力。可以一次 或以一系列治疗来向患者适宜地给药C-met拮抗剂。在一个具体实施方式
中，通过静脉内输注或通过皮下注射来给药C-met拮抗剂。根据疾病的类 型和严重性，约1 )ig/kg至约50mg/kg体重(例如，约0.1-15mg/kg/剂)抗 体可以是向患者给药的初始候选剂量，而无论通过例如一种或多种分开的 给药方式还是通过持续输注来进行。给药方案包括给药约4 mg/kg的初始 负载剂量，然后每周持续给药约2mg/kgC-met拮抗剂抗体。可是，其它剂 量方案也是可用的。根据上述因素，典型的每日剂量可以是约1吗/kg至100 mg/kg或更多。对于几天或更长期的重复给药，根据病况，持续治疗直至出 现所希望的对疾病症状的抑制。该治疗进程可通过常规方法和测试并根据 医生或其他所属领域技术人员已知的标准而方便地监测。
除了向患者给药多肽调节剂(例如，多肽、抗体等)，本发明考虑了通过 基因疗法来给药调节剂。表述"给药治疗有效量的C-met拮抗剂"涵盖了这
种包含/编码C-met拮抗剂的核酸的给药。如参见，1996年3月14日公开 的WO96/07321,其关于应用基因疗法来产生细胞内抗体。
有两种主要的方法使核酸(任选包含于载体中)进入患者细胞；可体内 (in vivo)和回体(ex vivo)进行。对于体内递送，直接向患者注射核酸，通常 注射在需要C-met拮抗剂的位点上。对于离体治疗，取出患者细胞，将核 酸导入这些分离的细胞并将经修饰的细胞向患者给药，可直接给药，或例 如用多孔膜包裹植入患者中来给药(如参见，美国专利4， 892， 538和5, 283， 187)。有多种技术可用于将核酸导入活细胞。根据核酸是在体外导入 培养的细胞中还是在体内导入所希望宿主的细胞中，所采用的技术可以不 同。适于在体外将核酸导入哺乳动物细胞的技术包括应用脂质体、电穿孔、 显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖酐、磷酸钓沉淀法等。常用于回体递 送基因的载体是反转录病毒载体。
在一个具体实施方式
中，体内核酸转移:技术包括用病毒载体(如腺病毒、
单纯疱渗病毒I、或腺病毒)转染和基于脂质的系统(例如，用于脂质介导的 基因转移的脂质例如DOTMA、 DOPE和DC-Chol)。对于当前已知基因制备 和基因疗法规程的综述，可参见Anderson等，Science 256: 808-813 (1992)。 也可参见WO 93/25673和其中引用的参考文献。
本发明的C-met拮抗剂抗体可以是不同形式的，其涵盖在本文的"抗体" 定义中。因此，所述抗体包括全长或完整抗体、抗体片段、天然序列抗体 或氨基酸变体、人源化、嵌合或融合抗体、及其功能性片段。
本发明提供了组合物，其含C-met拮抗剂、和载体。在另外的具体实施 方式中，组合物可包含C-met拮抗剂以及其它治疗剂，例如细胞毒剂或生 长抑制剂，包括化疗剂。本发明还提供了配制剂，其含C-met拮抗剂、和 载体。在一个具体实施方式
中，配制剂是含药学上可接受的载体的治疗性 配制剂。
G.制品和试剂盒
本发明的另 一具体实施方式
是制品，其含用于利用C-met拮抗剂治疗病 症的材料。制品包括容器和贴在容器上或与其相关的标签或包装插页。合 适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可用各种材料制成， 如玻璃或塑料。容器中装有能有效治疗病症的组合物，而且可具有无菌存 取口 (例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或
药管)。所述组合物中的至少一种活性剂是本发明的c-met拮抗剂。所述标 签或包装插页指示该组合物用于治疗特定病症。标签或包装插页将进一步 包括用于说明向患者给药所述组合物的说明书。此外，所述制品可进一步 包括含药学上可接受的緩沖液的第二容器，所述緩沖液如注射用抑菌水 (BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它还可包括从商业 和用户立场上所需的其它物质，包括其它緩沖剂、稀释剂、滤器、针头和 注射器。
也提供了试剂盒，其用于多种目的。提供的试剂盒可包含用于体外检 测并定量超稳定化的c-met的本发明C-met拮抗剂，如用于ELISA或免疫 印迹中。和制品一样，试剂盒包括容器和贴在容器上或与其相关的标签或 包装插页。容器中装有含至少一种本发明C-met拮抗剂的组合物。还可以 包括其它容器，其中可包含诸如稀释剂和援沖液、对照抗体。标签或包装 插页可提供对組合物的说明以及用于说明体外期望检测应用的说明书。 H.含多肽、核酸和抗体特异性形式的C-met拮抗剂和应用 在一个具体实施方式
中，本发明的核酸包括反义寡核苷酸/多核苷酸，
其含能结合内源超稳定化的c-met编码核酸的单链核酸序列(RNA或 DNA)。根据本发明，反义寡核苷酸至少包含超稳定化的c-metDNA的编码 区片段。该片段一般包括至少约14个核苷酸，优选约14至30个核苷酸。 基于编码给定蛋白质的cDNA序列能得到反义寡核苷酸，例如在Stein和 Cohen (Cancer Res. 48: 2659， 1988)和van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)中所述的。
反义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致形成双链体，其通过几种方式 之一阻断輩巴序列的转录或翻译，所述方式包括增强双链体的降解，转录或 翻译的未成熟终止，或通过其它方式。本发明涵盖了这些方法。因此，可 用反义寡核芬酸阻断超稳定化的c-met蛋白在细胞中表达。反义寡核苷酸 进一步包括寡核苷酸，其具有修饰的糖-磷酸二酯骨架(或其它糖连接键， 如WO 91/06629中所述的那些)，而且其中该糖连4妻《睫抗内源核酸酶。该带 有抗性糖连接键的寡核苷酸是体内稳定(即，能抗酶降解)的，但仍保留能结 合靶核苷酸序列的序列特异性。
用于反义结合的优选基因内位点包括合并入了基因开放阅读框(ORF) 翻译初始Z起始密码子(5'—AUG/ 5'-ATG)或终止/停止密码子(5'-UAA、 5'-UAG
和5-UGA/ 5'-TAA、 5'-TAG和5'-TGA)的区域。这些区域指所述基因或所述 mRNA的一部分，其包括任一个方向(即，5'或3')上从翻译初始或终止密码 子开始的约25至约50个连续的核苦酸。用于反义结合的其它示例性的区 域包括内含子；外显子；内含子-夕卜显子接合处；开放阅读框(ORF)或"编 码区"，其为翻译初始密码子和翻译终止密码子之间的区域；mRNA的5' 帽，其包含与mRNA 5'-末端残基通过5'-5'三磷酸酯键连接的N7-曱基化的 鸟嘌呤核苷残基，而且其包括5'帽结构本身以及与帽相邻的最初50个核 苦酸；5'非翻i奪区(5'UTR)， 5'方向上从翻译初始密码子开始的mRNA部 分，因此包括基因上mRNA或相应核香酸的5'帽位点和翻译初始密码子之 间的核苷酸；和3'非翻译区(3'UTR)， 3'方向上从翻译终止密码子开始的 mRNA部分，因此包括基因上mRNA或相应核苷酸的3'末端和翻译终止密 码子之间的核芬酸。
用于抑制超稳定化的c-met多肽表达的反义化合物的特定实例包括， 含修饰的骨架或非天然核苷间连接键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核 苷酸包括骨架中保留磷原子的那些和骨架中没有磷原子的那些。对于本说 明书的目的，而且如现有技术中有时所参考的，也可将其核苷间骨架中没 有磷原子的修饰的寡核苷酸看作寡核苷酸。示例性的修饰的寡核苷酸骨架 包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨 基烷基磷酸三酯、曱基和其它烷基的膦酸酯(包括3'-烷撑膦酸酯、5'-烷撑 膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和 氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯)、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸 三酯、具有正常3'-5'连接键的硒杂磷酸酯和硼烷基-磷酸酯、这些2'-5'连接 的类似物、和具有反极性的那些，其中一种或多种核苷酸间连接键是3'至 3'、 5'至5'或2'至2'连接。具有反极性的示例性的寡核苷酸在3'-核苷酸间连 接键上包括单3'至3'连接，即无碱基的单反转的核苷残基(核碱基是缺失的 或在其位置上具有轻基)。还可包括各种盐、混合盐和游离酸形式。教导制 备含磷连接键的有代表性的美国专利包括但不限于美国专利3， 687， 808;
4, 469， 863; 4, 476， 301; 5， 023, 243; 5， 177， 196; 5， 188, 897;
5, 264， 423; 5， 276, 019; 5， 278, 302; 5, 286, 717; 5, 321, 131; 5， 399, 676; 5, 405, 939; 5, 453, 496; 5, 455， 233; 5， 466, 677; 5， 476, 925; 5, 519, 126; 5， 536, 821; 5, 541, 306; 5, 550， 111; 5,563， 253; 5, 571, 799; 5, 587, 361; 5， 194, 599; 5, 565, 555; 5, 527， 899; 5, 721， 218; 5， 672, 697和5, 625, 050,其中每一篇都纳 入本文参考。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架的实例有由以下连接#:形成
的骨架短链烷基或环烷基核芬间连接键、混合了杂原子和烷基或环烷基
的核苷间连接键、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间连接键。这些包
括具有以下连接的那些吗啉代连接(部分由核苷糖基部分形成)；硅氧烷骨 架；碌u醚、亚砜和石风骨架；曱酰基(formacetyl)和硫代曱酰基(thioformacetyl) 骨架；亚甲基甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含 烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸和 石黄酰胺骨架；酰胺基骨架；和具有混合的N、 O、 S和CH2成分部分的其它 骨架。教导制备这种寡核苷酸的有代表性的美国专利包括但不限于美国专
利5，034，506;5，166，315;5，185，444; 5,214， 134; 5,216,
l化5，235，033;5，264，562;5，264,564; 5,405, 938; 5，434,
257;5,466,677;5,470,967;5，489,677; 5,541, 307; 5,561,
225;5,596,086;5,602，240;5,610，289; 5，602， 240; 5,608,
046;5，610,289;5,618，704;5，623,070; 5,663， 312; 5,633,
360;5,677,437;5,792，608;5，646,269和5, 677， 439,其中每
一篇都纳入本文参考。
在反义寡核苷酸的其它实例中，糖和核苷间连接(即核苷酸单位的骨 架)用新基团替换。碱基单位保留与合适的核酸靶化合物杂交的能力。一 种这类寡聚化合物——显示出具有极佳杂交性质的寡核苷酸模拟物，被称
作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架用含酰胺基的骨架 替换，尤其用氨基乙基甘氨酸骨架替换。保留核碱基并直接或间接结合到 在骨架酰胺基部分的杂氮原子上。教导制备PNA化合物的有代表性的美国 专利包括但不限于美国专利5, 539, 082; 5, 714, 331;和5， 719, 262， 其中每一篇都纳入本文参考。在Nielsen等，Science, 1991, 254, 1497-1500 中可找到其它PNA化合物的教导。
反义寡核普酸的实例包括硫代磷酸酯骨架和/或杂原子骨架，尤其是以 上参考的美国专利 5 , 489 , 677中所述的 -CHrNH-0-CH2-、 -CH2-N(CH3)-0-CHr [被称为亚曱基(曱基亚氨基)或MMI骨架]、
-CH2-0-N(CH3)-CH2- 、 -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH24。-0-N(CH3)-CH2-CH2-[其 中天然磷酸二酯骨架表示为-0-P-0-CH2-]、和以上参考的美国专利5， 602， 240的酰胺基骨架。其它实例有以上参考的美国专利5, 034， 506中的具有 吗啉代骨架结构的反义寡核苷酸。
修饰的寡核苷酸也可包含一种或多种取代的糖基部分。示例性的寡核 苷酸在2'位上包括以下基团之一OH; F; O-烷基、S-烷基、或N-烷基； O-烯基、S-烯基、或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷
基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或非取代的Ci至C,o烷基或C2至 C,。烯基和炔基。特别优选的有0[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、
0(CH2)nCH3、 0(CH2)nONH2、和0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1 至约10。其它示例性的反义寡核苷酸在2'位上包括以下基团之一C，至C,o 低级烷基，取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或 〇-芳烷基、SH、 SCH3、 OCN、 Cl、 Br、 CN、 CF3、 OCF3、 SOCH3、 S02CH3、 ON02、 N02、 N3、 NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基 氨基，取代的曱硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入基团、增进寡核 苦酸药物动力学性质的基团、或增进寡核苷酸药效性质的基团、和具有相 似性质的其它取代基。 一 种可能的修饰包括2'-曱氧基乙氧基 (2，-0-CH2CH2OCH3,也称为2'-0-(2-曱氧基乙基)或2'-MOE) (Martin等，Helv. Chim. Acta, 1995, 78， 486-504)，即烷氧基烷氧基。进一步优选的修饰包 括2'-二曱基氨基氧乙氧基(即0(CH2)2ON(CH3)2基，也称为2'-DMAOE) 和2'-二曱基氨基乙氧基乙氧基(也是现有已知的，称为2'-0-二曱基氨基乙氧 基乙基或2'-DMAEOE,即2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2))。
其它修饰包括锁定的核酸(LNA)，其中2'-羟基连接于形成双环糖部分 的糖环的3'或4'碳原子。连接可以是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚曱基 (—CH2-)n基团，其中n是1或2。 LNA及其制备在WO 98/39352和WO 99/14226中有描述。
其它修饰包括2'-曱氧基(2'-0-CH3)、 2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2 NH2)、 2'-烯丙基(2'-CH2-CH=CH2)、 2'-0-烯丙基(2'-0-CH2-CH二CH2)和2'-氟 (2'-F)。可在阿拉伯糖基(上)位置或核糖(下)位置中进行2'-修饰。 一种 2'-阿拉伯糖基修饰是2'-F。相似的修饰也可在寡核苷酸其它位置上生成，尤 其在3'末端核香酸上或在2'-5'连接的寡核苷酸中的3'糖基位置上和5'末
端核苷酸的5'位置上制备。寡核苷酸也可有诸如环丁基部分的糖模拟物来替 换呋喃戊糖。教导制备这种修饰的糖基结构的有代表性的美国专利包括但
不限于美国专利4， 981， 957; 5, 118， 800; 5, 319, 080; 5, 359, 044; 5， 393, 878; 5， 446， 137; 5， 466, 786; 5, 514, 785; 5, 519， 134; 5, 567， 811; 5， 576， 427; 5， 591， 722; 5， 597， 909; 5， 610, 300; 5， 627， 053; 5, 639， 873; 5， 646， 265; 5， 658, 873; 5, 670, 633; 5， 792， 747;和5, 700， 920,其中每一篇都纳入本文参考。
寡核苷酸也可包括核碱基(通常在现有技术中被筒称为"碱基")修饰或 取代。如本文所述的"未修饰"或"天然"核碱基包括噪呤碱基腺噤呤(A)和鸟 。票呤(G)、和嘧啶碱基胸腺嘧咬(T)、胞嘧咬(C)和尿嘧咬(U)。修饰的核苷石咸 基包括其它合成的和天然的核碱基，如5-曱基胞嘧啶(5-me-C)、 5-羟曱基 胞嘧啶、黄噪呤、次黄嘌呤、2-氨基腺噤呤、腺噪呤和鸟噪呤的6-曱基和其 它烷基衍生物、腺噤呤和鸟噤呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、 2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C=C-CH3 或-CH2-C^CH)尿嘧啶和胞嘧啶和其它嘧啶碱基的炔基衍生物、6-偶氮尿嘧 啶、胞嘧口定和胸腺嘧咬、5-尿嘧咬(假尿嘧咬)、4-硫尿嘧啶、8-卣代、8-氨 基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺噤呤和鸟噪呤、5-卤代 (尤其是5-溴、5-三氟曱基)和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-曱基鸟嘌 呤和7-曱基腺噤呤、2-F-腺噪呤、2-氨基-腺。票呤、8-氮杂鸟。票呤和8-氮杂腺 噤呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤和3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。其 它修饰的核苷碱基包括三环嘧啶(如吩嗜嗪胞苷(lH-嘧啶基[5, 4-b][l, 4]苯 并喁溱-2(3印-酮)、吩噻溱胞苷(1H-嘧啶基[5， 4-b][1， 4]苯并噻嗪-2(3印-酮))、G-夹结构(G-clamps)(如取代的吩嚅嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶基[5, 4-b][1， 4]苯并嚅嗪J(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶基[4, 5-b]吲 哚基-2-酮)、吡啶吲。呆胞苷(H-吡啶基[3', 2': 4, 5]吡咯基[2, 3-d]嘧啶基 -2-酮)。修饰的核碱基还包括。票呤或嘧啶碱基用其它杂环替代的那些，例如 7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤核苷、2-氨基嘧啶和2-吡啶酮。其它核碱基包 括美国专利3， 687， 808中公开的那些、公开于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, 858-859页，Kroschwitz, J. I编.John Wiley & Sons, 1990的那些、和由Englisch等，Angewandte Chemie,国际片反，1991, 30, 613所公开的那些。这些核碱基中的某些尤其可用于增加本发明寡聚化
合物的结合亲和性。这些包括5-取代嗜啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取 代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。 5-曱基胞嘧啶取代显示出能增加核酸双链体稳定性0.6-1.2摄氏度(Sanghvi 等,Antisense Research and Applications, CRC Press, BocaRaton， 1993， pp, 276-278)，而且如当与2'-0-曱氧基乙基糖修饰组合在一起时，它们是示例 性的碱基取代。教导制备修饰的核碱基的有代表性的美国专利包括但不限
于:美国专利3，687,808、以及美国专利4，845,205;5，130，302;
5，134， 066; 5，175,273;5， 367, 066;5,432,272;5,457,187;
5，459， 255; 5，484，908;5, 502， 177;5,525，711;5，552,540;
5,587， 469; 5，594，121,5, 596, 091;5,614，617;5,645,985;
5,830， 653; 5，763，588;6， 005, 096;5,681，941和5,750，692，
其中每一篇都纳入本文参考。
反义寡核苷酸的另一种修饰包括与寡核苷酸一个或多个部分的化学连 接或偶联物，其能增强寡核苷酸的活性、细胞分配或细胞摄取。本发明的 化合物可包含与诸如第一或第二幾基的功能性基团共价结合的偶联基团。
本发明的偶联基团包括嵌入基团(intercalator)、报告分子、聚胺、聚酰胺、 聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药效性质的基团、和增强寡聚物药物动力学 性质的基团。典型的偶联基团包括胆固醇、脂质、阳离子脂质、磷脂、P曰 离子磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、 香豆素、和染料。在本发明上下文中的增强药效性质的基团包括这样的基 团，其能改善寡聚物摄取，增强寡聚物降解抗性，和/或强化与RNA的序列 特异性杂交。在本发明上下文中的增强药物动力学性质的基团包括基团这 样的，其能改善寡聚物摄取、分配、代谢或排出。偶联部分包括但不限于 诸如胆固醇部分(Letsinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1989, 86， 6553-6556) 的脂质部分、月旦汁酸(Manoharan等，Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060)、诸如己基-S-三苯曱基硫醇(Manoharan等，Ann. N.Y. Acad. Sd.， 1992, 660， 306-309; Manoharan等，Bioorg. Med. Chem. Let.， 1993， 3, 2765-2770)的硫醚、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl. Acids Res., 1992, 20， 533-538)、诸如十二烷二醇或十一烷残基(Saison-Behmoaras等，EMBOJ., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov等，FEBS Lett., 19卯，259, 327-330; Svi證chuk 等，Biochimie， 1993, 75, 49-54)的脂肪链、诸如二-十六烷基-夕卜消旋-甘油
或三乙基铵1，2-二-0-十六烷基-夕卜消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manohamn等， Tetrahedron Lett.， 1995， 36, 3651-3654; Shea等，Nucl. Acids Res.， 1990， 18， 3777-3783)的磷脂、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides & Nucleotides, 1995， 14， 969-973)、或乙酸金刚烷酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett., 1995， 36, 3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237)、或十八烷胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本发 明的寡核苷酸也可与活性药物物质偶联，所述物质如，阿斯匹林、,丙酮 香豆素、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬(suprofen)、 fenbufen、酮洛芬、(S)-(+)-双吡苯丙酸(pranoprofen)、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2, 3, 5-三碘苯曱酸、 氟灭酸、亚叶酸、苯并噻二叠氮化物、氯噻嗪、二氮杂草(diazepine)、异丁 苯丙酸(indomethicin)、巴比妥酸盐(酉旨)、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿 病药物、抗菌素或抗生素。寡核苷酸-药物偶联物及其制备记载于美国专利 申请09/334, 130(提交于1999年6月15日)和美国专利4， 828， 979; 4,
948，882;5，218，105;5,525，465;5,541，313;5，545，730;5，
552，538;5，578，717,5，580,731;5，580,731;5,591，584;5，
109,124;5,118，802;5，138，045;5,414，077;5,486，603;5，
512，439;5,578,718;5，608,046;4，587,044;4，605，735;4，
667,025;4,762,779;4，789，737;4,824，941;4,835,263;4，
876,335;4,904,582;4，958,013;5，082，830;5,112，963;5,
214,136;5，082，830;5，112,963;5,214,136;5，245,022;5,
254，469;5，258，506;5,262,536;5，272，250;5,292，873;5，
317,098;5，371,241，5，391,723;5,416,203,5,451,463;5,
510,475;5,512，667;5,514，785;5,565，552;5,567，810;5，
574,142;5,585，481;5,587，371;5，595，726;5,597,696;5，
599，923;5,599，928牙口 5，688,941，其中每-一篇都纳入本文参考
给定的化合物中不必所有位置一律都需要修饰，事实上在单个化合物 中或甚至在寡核普酸内单个核苷上可纳入超过一个上述修饰。本发明还包 括反义化合物，其是嵌合化合物。在本发明的上下文中，"嵌合"反义化合物 或"嵌合体"是反义化合物，尤其是寡核苷酸，其含两个或更多化学上不同的 区域，每个由至少一个单体单位构成，即在寡核苷酸化合物的例子中是核 苷酸。这些寡核苷酸通常含至少一个区域，其中修饰寡核苷酸使寡核苷酸
增强核酸酶降解抗性，增加细胞摄入，和/或增加对靶核酸的结合亲和力。
寡核苦酸的其它区域可用作裂解RNA: DNA或RNA: RNA杂交分子的酶 的底物。例如，RNaseH是细胞核酸内切酶，其裂解RNA: DNA双链体的 RNA链。所以，活化的RNase H能裂解RNA靶位，由此大大增强寡核苷 酸抑制基因表达的功效。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，相对于杂交相同 靶区域的脱氧寡核苷酸硫代磷酸酯，用较短的寡核苷酸常常可得到相当的 结果。本发明的嵌合反义化合物可形成成为上述两个或更多寡核苷酸、修 饰的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。示例性的嵌合 反义寡核苦酸在3'末端整合了至少一个带来核酸酶抗性的2'修饰的糖(优 选是2'-0-(CH2)2-0-CH3)和带来RNase H活性的具有至少4个连续2'-H糖的
示例性的聚缺口体在3'-末端和在5'末端上具有2'修饰的糖(优选是 2'-0-(CH2)2-0-CH3)区域，其被具有至少4连续2'-H糖的至少一个区域分 隔，并且可整合硫代磷酸酯骨架连接。教导制备这些杂交结构的有代表性 的美国专利包括但不限于美国专利5, 013, 830; 5， 149， 797; 5, 220, 007; 5， 256， 775; 5， 366， 878; 5, 403, 711; 5, 491, 133; 5， 565， 350; 5， 623, 065; 5， 652, 355; 5, 652， 356;和5, 700， 922,其中每 一篇都纳入本文参考。
根据本发明所用的反义化合物可以通过公知的固相合成技术来方便地 并按常规地制造。这些合成设备由多个供应商销售，例如包括，Applied Biosystems (Foster City, Calif.)。可额外地或可选地使用进行这些合成的其 它任何现有技术已知的方法。公知的是，可使用相似的技术来制备寡核苷 酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。本发明的化合物也可以是混合的、装 入胶嚢的、偶联的或另外与其它分子、分子结构或化合物混合物结合的， 例如有，脂质体、受体耙分子、口服、直肠、局部或其它剂型，用以辅助 摄取、分配和/或吸收。教导制备这些摄取、分配和/或吸收辅助剂型的有代 表性的美国专利包括但不限于美国专利5， 108, 921; 5, 354, 844; 5， 416,
016;5,459，127;5，521,291;5，543，158;5,547,932;5，583,
020;5,591，721;4，426，330;4,534,899;5,013,556;5,108,
921;5，213,804;5，227，170;5，264，221;5，356,633;5，395，
619;5,416,016;5,417,978;5，462，854;5，469,854;5，512,295; 5, 527， 528; 5, 534， 259; 5, 543， 152; 5, 556， 948; 5， 580, 575;和5, 595， 756,其中每一篇都纳入本文参考。
反义寡核香酸的其它实例包括与有机部分(如WO 90/10048所述的那 些)和能增加寡核苷酸对靶核酸序列亲和性的其它部分(如聚(L-赖氨酸)) 共价相连的那些寡核苷酸。还有，嵌入试剂(如玫瑰树碱(dlipticine))和烷 基化试剂或金属复合物可与正义或反义寡核苷酸相连，从而修饰反义或正 义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
反义寡核苷酸可通过任何基因转移方法而被导入到含靶核酸序列的细 胞中，所述方法如包括，CaPCV介导的DNA转染、电穿孔、或通过使用基 因转移载体(如Epstein-Barr病毒)。在示例性的过程中，反义或正义寡核 苷酸被插入到合适的反转录病毒载体中。含靶核酸序列的细胞与重组反转 录病毒载体接触，这可在体内或离体进行。合适的反转录病毒载体包括但 不限于，源自鼠反转录病毒M-MuLV的那些、N2 (源自M-MuLV的反转录 病毒)、或被称为DCT5A、 DCT5B和DCT5C的双拷贝载体(参见WO 90/13641)。
如WO 91/04753所述，反义寡核普酸也可通过与配体结合分子形成偶 联物来导入到含耙核苷酸序列的细胞中。合适的配体结合分子包括但不限 于，细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子、或其它结合细胞表面受体 的配体。 一般而言，配体结合分子的偶联优选基本不干扰配体结合分子结 合其相应分子或受体的能力，或不阻断正义或反义寡核苷酸或其偶联物进 入细月包。
可选地，如WO 90/10448所述，反义寡核苦酸可通过形成寡核苷酸-脂 质复合物来导入到含靶核酸序列的细胞中。反义寡核苷酸-脂质复合物优选 通过内源脂酶在细胞内离解。
反义RNA或DNA分子一般至少有约个5核苷酸长，可选地有至少约
6、 7、8、 9、 10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、 20、 21、22、
23、24、 25、 26、27、28、29、30、 35、40、45、50、55、 60、 65、70、
75、80、 85、 90、95、100、105、110、115、120、125、130、 135、140、
145、150、 155、160、165、170、175、180、185、190、195、 200、210、
220、230、 240、250、260、270、280、290、300、310、320、 330、340、
350、360、 370、380、390、400、410、420、430、440、450、 460、470、480、 490、 500、 510、 520、 530、 540、 550、 560、 570、 580、 590、 600、 610、 620、 630、 640、 650、 660、 670、 680、 690、 700、 710、 720、 730、 740、 750、 760、 770、 780、 790、 800、 810、 820、 830、 840、 850、 860、 870、 880、 890、 900、 910、 920、 930、 940、 950、 960、 970、 980、 990, 或1000个核苷酸长，其中在这段文字中，术语"约"指所提及的核苷酸序列 长度加或减所提及的长度的10%。
反义RNA和DNA可用作治疗剂来阻断某些基因在体内表达。已经显 示，可将短反义寡核苷酸输入细胞中，在其中它们起抑制剂作用，然而它 们由细胞膜限制摄入而造成它们低细胞内浓度(Zamecnik等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [ 1986])。可修饰寡核苷酸以增强它们的摄入， 如通过用不带电荷的基团替换它们带负电的磷酸二酯基团。
有许多种技术可用于将核酸导入活细胞中。根据核酸是在体外导入培 养的细胞中还是在体内导入所希望宿主的细胞中，所用技术可变化。适于 在体外将核酸导入哺乳动物细胞的技术包括应用脂质体、电穿孔、显微注 射、细胞融合、DEAE-右旋糖酐、磷酸4丐沉淀法等。常用于离体递送基因 的载体是反转录病毒载体。当前优选的体内基因转移技术包括用病毒(通 常是反转录病毒威体的转染和病毒衣壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等， Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993])。在一些情况下，希望提供核酸 源和靶向靶细胞的试剂，如特异针对细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体、针 对耙细胞上受体的配体等。当使用脂质体时，结合与内吞作用相关的细胞 表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或用于辅助摄入，所述蛋白质例如，如 有特定细胞类型向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中内在化的蛋白质 的抗体、能靶向细胞内位置并增强细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的内 吞作用的技术记载于诸如，Wu等，J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 和Wagner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87， 3410-3414(1990)。对于基因制 备和基因疗法规程的综述，可参见Anderson等，Science 256, 808-813 (1992)。
本发明的C-met拮抗剂多肽和核酸分子可用于诊断组织类型，其中在一 种组织中可相对于在另一种中，差异化表达超稳定化的c-met多肽，优选 是在疾病组织中相对于相同组织类型的正常组织中。
本发明涵盖了筛选化合物的方法以鉴定调节超稳定化的c-met的那 些。设计筛选拮抗剂候选药物的测试来鉴定结合或复合超稳定化的c-met多肽、或干扰超稳定化的c-met多肽与其它细胞蛋白相互作用包括(例如 抑制超稳定化的c-met多肽由细胞表达)的化合物。
可以各种形式进行测试，包括蛋白质-蛋白质结合测试、生化筛选测试、 免疫测试、和基于细胞的测试，它们在现有技术中被很好地描述了。
所有针对拮抗剂的测试的共同点在于它们都要在足以使这两种成分相 互作用的条件和时间条件下将候选药物与超稳定化的c-met多肽接触。
在结合测试中，相互作用是结合作用，而且在反应混合物中可分离或 检测形成的复合物。在特定的具体实施方式
中，超稳定化的c-met多肽或 候选药物通过共价或非共价吸附而被固定于固相上，如在微滴定板上。非 共价吸附一般通过用超稳定化的c-met多肽溶液包被在固体表面上并干燥 来实现。可选地，固定的抗体，例如特异针对超稳定化的c-met多肽的固 定的单克隆抗体，可用于将其锚定在固体表面上。通过向固定成分(如， 含锚定成分的包被的表面)加入非固定成分来进行测试，所述非固定成分 可用可4全测标记物来标记。当反应完成时，通过诸如洗涤来去除未反应的 成分，并检测固体表面上锚定的复合物。当原来未固定的成分带有可检测 标记时，检测到了表面上被固定的标记表明产生了复合。当原来未固定的 成分不带有可检测标记时，可检测复合，例如通过使用特异结合固定的复 合物的标记抗体来进行。
如果候选化合物与超稳定化的c-met多肽相互作用但不结合它，其与 超稳定化的c-met的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的 公知方法来测试。所述的如包括传统的方法，例如交耳关、免疫共沉淀、以 及通过梯度或色谱柱来共纯化。另外，利用基于酵母的遗传系统可监测蛋 白质-蛋白质相互作用，这为Fields及其同事(Fields和Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991 ))记载并乂>开于Chevray和Nathans, Proc. Natl, Acad. Sci. USA， 89: 5789-"93 (l"l)。许多转录活化剂，如酵母GAL4，由两个物 理分离的模块结构域组成， 一个用作DNA结合结构域，另一个用作转录活 化结构域。前述公开文献中所述的酵母表达系统(一般被称为"双杂交系统") 利用了该特性，并使用了两种杂合蛋白，一种是靶向蛋白质与GAL4的DNA 结合结构域融合，另一种是候选活化蛋白质与活化结构域融合。GALl-/acZ 报告基因在GAL4活化的启动子控制下的表达取决于通过蛋白质-蛋白质相 互作用的GAL4活性重建。用(3-半乳糖苷酶的显色底物检测含相互作用多 肽的克隆。利用双杂交技术鉴定两个特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互 作用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可通过商业途径从Clontech获得。该 系统也可扩展用以定位涉及特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域，并查明 对这些相互作用起关键作用的氨基酸残基。
干扰超稳定化的c-met和其它细胞内或外成分相互作用的化合物可如 下进行测试通常在使这两种产物相互作用并结合的条件和时间下制备反 应混合物，其含超稳定化的c-met和细胞内或外成分。为了测试候选化合 物抑制结合的能力，在测试化合物缺失和存在的情况下进行反应。另外， 可将安慰剂加到第三个反应混合物中，以用作阳性对照。如本文所述，监 测混合物中存在的测试化合物和细胞内或外成分之间的结合(复合物形 成)。对照反应中复合物形成了，而在含测试化合物的反应混合物中没有形 成所述复合物，这表明，测试化合物干扰测试化合物及其反应物的相互作 用。
为了测试拮抗剂，要筛选出特定活性的化合物加到表达超稳定化的 c-met的细胞中，而且化合物抑制感兴趣的活性的能力显示出化合物是针对 超稳定化的c-met多肽的拮抗剂。如通过放射性来标记超稳定化的c-met 多肽，由此出现在细胞上的超稳定化的c-met多肽分子的数目可用于确定 潜在的拮抗剂的效力。
潜在的超稳定化的c-met拮抗剂是利用反义技术制备的反义RNA或 DNA构建体，其中，如反义RNA或DNA分子用于通过与耙mRNA杂交 并防止蛋白质翻译来直接阻断mRNA的翻译。可用反义技术来控制基因表 达，其通过三螺旋形式或反义DNA或RNA来进行，这两种方法都基于将 多核苷酸与DNA或RNA结合。例如，编码成熟的超稳定化的c-met蛋白 的多核苷酸序列的5'编码部分可用于设计约10至40个碱基对长度的反义 RNA寡核苦酸。设计的DNA寡核苷酸与涉及转录的基因区域互补(三螺旋-参见Lee等，Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney等，Science， 241: 456 (1988); Dervan等，Science, 251: 1360 (1991))，由此防止超稳定化的 c-met多肽转录和产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断 mRNA分子翻译成超稳定化的c-met多肽(反义-参见Okano , Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxy Ncleotides as Antisense Inhibitors of
Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)。上述寡核苷酸可递送 至细胞，由此使反义RNA或DNA在体内表达，用以抑制超稳定化的c-met 多肽的产生。当使用反义DNA时，优选源自翻译起始位点(如在靶基因核 苷酸序列的约-10和+10位之间)的寡脱氧核糖核苷酸。
核酶是酶活性的RNA分子，其能特异性催化裂解RNA。核酶通过其 序列特异性杂交于互补靶RNA，然后内切裂解核苷酸。潜在RNA靶位内的 特异性核酶裂解位点可通过已知技术鉴定。对于更详细的情况，如参见， Rossi， Current Biology, 4: 469-471 (1994),和PCT 乂>开文件WO 97/33551 (公开于1997年9月18日)。
用于抑制转录的三螺旋形式的核酸分子应是单链的并由脱氧核苷酸组 成。设计这些寡核苷酸的碱基组分，使它通过Hoogsteen碱基配对法则促进 三螺旋形成，其一般需要足够长度地延伸双链体之一条链上的嘌呤或嘧啶。 对于更详细的情况，如参见，PCT公开文件WO 97/33551 (同上)。
通过任何一种或多种本文以上所述的筛选测试和/或通过任何其他所属 领域技术人员公知的筛选技术，可鉴定这些小分子。
在一个具体实施方式
中，优选内在化的抗体。抗体可拥有某些特征， 或被修饰成拥有这些特征，其能增强抗体递送进细胞。实现该目的的技术 是现有已知的。在又一个具体实施方式
中，通过将能表达抗体的核酸导入 到靶细胞中，可在靶细胞中表达抗体。如参见，美国专利6， 703， 019; 6， 329, 173;和PCT公开文件2003/077945。脂质转染(lipofection)或脂质体 可用于将抗体递送至细胞中。当使用抗体片段时，能特异结合靶蛋白结合 结构域的最小抑制片段一般是有利的。例如，根据抗体可变区序列，可设 计肽分子，其保留了结合靶蛋白质序列的能力。这些肽可化学合成和/或通 过重组DNA技术产生。如参见，Marasco等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 巡7889-7893 (1993)。
通过现有已知的方法可增强多肽调节剂进入细胞。例如，某些序列， 如衍生自 HIV Tat或果錄触角蛋白同源结构域蛋白(Antennapedia homeodomain protein)的那些能直接有效使异质蛋白质穿过细胞膜而摄入。 如参见，Chen等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96: 4325-4329。
本发明的C-met拮抗剂抗体可以是任何抗体，其能干扰c-met活性。一 些特定的例子包括抗c-met抗体，其包含
(a)至少一、二、三、四或五个高变区(HVR)序列，其选自
(i) 包含序歹'J A1-A17 的 HVR-L1 , 其中 A1-A17 是 KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQIDNO: 1)
(ii) 包含序列Bl-B7的HVR-L2，其中B1陽B7是WASTRES (SEQ ID NO: 2)
(iii) 包含序列Cl-C9的HVR-L3，其中Cl-C9是QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 3)
(iv )包含序列D1-D10的HVR-Hl,其中D1-D10是GYTFTSYWLH (SEQIDNO: 4)
(v) 包含序歹'J E1-E18 的 HVR-H2 , 其中 E1-E18 是 GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 5)和
(vi) 包含序列F1 -F11的HVR-H3,其中F1 -F11是XYGSYVSPLDY (SEQIDNO: 6)而且X不是R;
以及(b)至少一个变体HVR，其中变体HVR序列包含SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、 5或6所述序列的至少一个残基修饰。在一个具体实施方式
中， 本发明抗体的HVR-L1包含序列SEQIDNO: 1。在一个具体实施方式
中， 本发明抗体的HVR-L2包含序列SEQIDNO: 2。在一个具体实施方式
中， 本发明抗体的HVR-L3包含序列SEQIDNO: 3。在一个具体实施方式
中， 本发明抗体的HVR-Hl包含序列SEQIDNO: 4。在一个具体实施方式
中， 本发明抗体的HVR-H2包含序列SEQIDNO: 5。在一个具体实施方式
中， 本发明抗体的HVR-H3包含序列SEQIDNO: 6。在一个具体实施方式
中， HVR-H3包含TYGSYVSPLDY(SEQIDNO: 7)。在一个具体实施方式
中， HVR-H3包含SYGSYVSPLDY(SEQIDNO: 8)。在一个具体实施方式
中， 包含这些序列(如本文上述序列，以组合方式)的本发明抗体是人源化的 或人的。
在一个方面，本发明提供了抗体，其包含一、二、三、四、五或六个 HVR,其中每个HVR包含、由或基本由选自以下的序列组成SEQIDNO: 1、 2、 3、 4, 5、 6、 7、和8,并且其中SEQ ID NO: 1对应于HVR-Ll, SEQ ID NO: 2对应于HVR-L2, SEQ ID NO: 3对应于HVR-L3 ， SEQ ID NO: 4对应于HVR-Hl ， SEQIDNO: 5对应于HVR-H2，而且SEQIDNO: 6、 7或8对应于HVR-H3。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含
HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-Hl、 HVR-H2、和HVR-H3，其中每个 依次包含SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、 5和7。在一个具体实施方式
中，本发 明的抗体包含HVR-L1 、 HVR-L2 、 HVR-L3 、 HVR-H1 、 HVR-H2 、和HVR-H3, 其中每个依次包含SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、 5和8。
本发明抗体中的变体HVR可具有一个或多个HVR内的残基修饰。在 一个具体实施方式
中，hvr-L2变体在任意组合的以下位置上包括1-5 (1, 2, 3, 4或5)个耳又代B1(M或L), B2 (P, T， G或S)， B3(N, G， R或 T)， B4(I， N或F), B5(P， I, L或G), B6(A, D， T或V)和B7 (R， I, M或G)。在一个具体实施方式
中，HVR-H1变体在任意组合的以下位置上 包括1-5 (1， 2, 3， 4或5)个耳又代D3 ( N， P， L， S， A， 1)， D5 (I, S 或Y), D6(G, D, T， K, R)， D7(F, H, R， S， T或V)和D9 (M或V)。 在一个具体实施方式
中，HVR-H2变体在任意组合的以下位置上包括1-4 (1， 2， 3或4)个替换E7(Y), E9(I), EIO(I)， E14(T或Q)， E15 (D， K， S， T或V)， E16(L)， E17 (E, H, N或D)和E18(Y， E或H)。在一个具 体实施方式中，HVR-H3变体在任意组合的以下位置上包括1-5 (1, 2, 3, 4或5)个取代Fl (T, S)， F3 (R, S, H, T, A, K)， F4(G), F6 (R, F， M， T, E, K, A, L, W), F7(L, I， T, R, K, V), F8(S, A)， F10(Y， N)和F11(Q， S， H, F)。每个位置后括号中的字母表示示例性的取代(即， 替换)氨基酸；对于所属领域技术人员显而易见的是，本文所述上下文中的 其它氨基酸作为替换氨基酸的适宜性可常规地利用现有已知和/或本文所述 的技术来评估。在一个具体实施方式
中，HVR-L1包含序列SEQIDNO: 1。 在一个具体实施方式
中，变体HVR-H3中的Fl是T。在一个具体实施方式
中，变体HVR-H3中的Fl是S。在一个具体实施方式
中，变体HVR-H3中 的F3是R。在一个具体实施方式
中，变体HVR-H3中的F3是S。在一个具体实施方式
中，变体HVR-H3中的F7是T。在一个具体实施方式
中， 本发明的抗体包含变体HVR-H3,其中F1是T或S, F3是R或S，而且 F7是T。
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中Fl是 T， F3是R而且F7是T。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变体 HVR-H3,其中Fl是S。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变体 HVR-H3,其中F1是T,而且F3是R。在一个具体实施方式
中，本发明
的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是S, F3是R而且F7是T。在一个具 体实施方式中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中Fl是T, F3是S, F7是T,而且F8是S。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变体 HVR-H3，其中F1是T, F3是S, F7是T，而且F8是A。在一些具体实 施方式中，所述变体HVR-H3抗体进一步包括HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、 HVR-H1和HVR-H2，其中每个依次包括SEQ ID NO: 1、 2、 3、 4和5中 所述的序列。在一些具体实施方式
中，这些抗体进一步包括人亚型III重 链框架共有序列。在这些抗体的一个具体实施方式
中，所述框架共有序列 在第71、 73和/或78位包含取代(替换)。在这些抗体的一些具体实施方式
中，第71位是A, 73位是T和/或78位是A。在这些抗体的一个具体实
施方式中，这些抗体进一步包含人Kl轻链框架共有序列。
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变体HVR-L2，其中B6是 V。在一些具体实施方式
中，所述变体HVR-L2抗体进一步包含HVR-L1、 HVR-L3、 HVR-Hl、 HVR-H2和HVR-H3,其中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 3、 4、 5和6所述的序列。在一些具体实施方式
中，所述变体HVR-L2抗 体进一步包含HVR-L1、 HVR-L3、 HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3，其中每 个依次包含SEQIDNO: 1、 3、 4、 5和7所述的序列。在一些具体实施方 式中，所述变体HVR-L2抗体进一步包含HVR-L1、 HVR-L3、 HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3 ，其中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 3、 4、 5和8所 述的序列。在一些具体实施方式
中，这些抗体进一步包含人亚型III重链 框架共有序列。在这些抗体的一个具体实施方式
中，所述框架共有序列在 第71、 73和/或78位包含替换。在这些抗体的一些具体实施方式
中，第 71位是A， 73位是T和/或78位是A。在这些抗体的一个具体实施方式
中， 这些抗体进一步包含人Kl轻链框架共有序列。
在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变体HVR-H2，其中E14是 T， E15是K而且E17是E。在一个具体实施方式
中，本发明的抗体包含变 体HVR-H2，其中E17是E。在一些具体实施方式
中，所述变体HVR-H3抗 体进一步包含HVR-Ll、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-Hl、和HVR-H3，其中 每个依次包含SEQ IDNO: 1、 2、 3、 4和6所述的序列。在一些具体实施 方式中，所述变体HVR-H2抗体进一步包含HVR-Ll、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-H1、和HVR-H3，其中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 2、 3、 4、和7
所述的序列。在一些具体实施方式
中，所述变体HVR-H2抗体进一步包含 HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-H1、和HVR-H3,其中每个依次包含 SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、和8所述的序列。在一些具体实施方式
中，这些
抗体进一步包含人亚型m重链框架共有序列。在这些抗体的一个具体实施
方式中，所述框架共有序列在第71、 73和/或78位包含替换。在这些抗体 的一些具体实施方式
中，第71位是A, 73位是T和/或78位是A。在这些 抗体的一个具体实施方式
中，这些抗体进一步包含人kI轻链框架共有序列。 拮抗剂抗体
本文中的配制剂也可包含要治疗特定适应症所需的一种或一种以上的 活性化合物，优选是具有互补活性的那些，其相互之间无不利影响。可选 地或额外地，所述组合物可包含增强其功能的试剂，例如，细胞毒剂、细 胞因子、化疗剂、或生长抑制剂。这些分子可适宜地以有效于所希望目的 的量组合使用。
以下是本发明方法和组合物的实施例。根据以上提供的概述，可以理 解的是，也可以实施各种其它具体实施方式
。实施例仅用于示例目的，其 意不在于以任何方式限制本发明的范围。
实施例 才才津牛禾p方法
从美国典型微生物保藏中心(ATCC)、 .NCI癌症治疗和诊断部门的肿瘤 库、或日本卫生科学基金会获得细胞系。除了 293和Rat 1A之外的所有细 胞系培养于添加了 10% FBS (Sigma)、青霉素/链霉素(GIBCO)、和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中。293和Rat 1A细胞培养于高葡萄糖DMEM中并 ^口 _L戶斤i^ii^亍了 '^力口 。
^"在和遵定^勿/《,秀
以前记载了全长Met WT-V5/His (Kong-Beltran等，2004)。根据厂商说 明，利用前述引物(Peschard等，2001)通过QuikChange定点突变 (QuikChange Site-Directed Mutagenesis) (Stratagene), 4寻Met WT-V5/His用 作模板，以产生Y1003F点突变。通过QuikChange定点突变，利用两套引
物产生新的以Nhel限制性位点为侧翼的Met外显子14 (aa 963-1011),然后 用NheI消化，接着重新连接质粒，由此来缺失外显子14。通过DNA测序 验证突变。为了在Rat 1A细胞中产生Met稳定细胞系，用Kpnl (Qiagen) 消化各10昭的pRK5TKneo、 Met WT-V5/His、 Met Y1003F -V5/His、或 MetAExl4-V5/His DNA并纯化(Qiagen)。根据厂商说明，在6孔板中通过 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，用4从g的每种DNA哞争染Rat 1A纟田月包。 第二天胰蛋白酶酶解细胞并加入到10cm板中。24小时后，加入500叱/ml G418(Sigma)。持续筛选约2周，然后通过FACS,利用3D6抗体(参见美 国专利6， 099， 841)和PE染色，选出Met阳性克隆。每孔滴加一个细胞。 〉容解扩增后的克隆，并通过免疫印迹用V5抗体(Invitrogen)测试Met。
为了在冷冻的组织标本中进行蛋白质表达分析，在200^1细胞裂解緩沖 液(Cell Signaling)中用Polytron 均浆器(Kinematica)对组织( 100 mg)均浆， 所述緩冲液包含蛋白酶抑制剂混合剂(Sigma)、磷酸酶抑制剂混合剂I和II (Sigma)、 50mM氟化钠、和2mM原钒酸钠。在4°C轻摇1小时以进一步 裂解样品，然后预先用蛋白质A Sepharose Fast Flow (Amersham)和蛋白质G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham)的混合物清洗。用Bradford试齐'j(BioRad) 确定蛋白质浓度。然后用SDS-PAGE分离蛋白质(20吗)，转到硝化纤维膜， 并用Met(DL-21， Upstate)或(3-肌动蛋白(1-19, Santa Cmz)抗体进行免疫印 迹。通过增强的化学发光剂(ECLPlus， Amersham)使蛋白质能被看到。为了 进行涉及转染了 Met和Cbl的免疫共沉淀研究，利用FuGENE6 (Roche),将 各3jig的每种Met构建体和3吗 Cbl-标记(flag)转染293细胞。第二天用 100 ng/ml rhuHGF剌激细胞30分钟，然后用1% NP40裂解缓沖液[50 mM Tris (pH 7.45)， 150 mM NaCl，和1%诺乃洗涤剂(Nonidet) 40]收获，所述緩 冲液含完全蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche)和磷酸酶抑制混合剂II 。离心 细胞碎片，并将1 mg溶解产物用1.5^il V5 (Invitrogen)或2吗Cbl (C-15， Santa Cmz)抗体于4。C免疫沉淀摇动过夜，然后与蛋白质G或A珠孵育2 小时。加入2X含20 mM DTT (Sigma)的样品缓沖液(Invitrogen)，并煮沸样 品5分钟。样品上样于4-12。/。Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)中并转到0.45(_im 硝化纤维膜(Invitrogen)上。用5%脱脂牛奶封闭膜1 hr，然后用V5抗体、标
记多克隆抗体(Sigma)、或P-Tyr(4G10， Upstate)抗体进行免疫印迹。对于 结合研究，利用FuGENE6，每10cm平板上用6吗的每种DNA构建体转 染含内源Cbl的293细胞。第二天用100ng/mlrhuHGF刺激细胞30分钟， 然后收获。用2略Cbl或1.5吗V5抗体免疫沉淀样品，然后用V5或Cbl抗 体进行免疫印迹。用回复免疫印迹剥离緩冲液(Pierce)剥离下用V5免疫沉淀 的印迹，并用P-Met Y1003 (Biosource) 、 P-Met Yl 234/Y12345 (Cell Signaling)、 P-Met Y1349 (Cell Signaling)、或P-Met 1365 (Biosource)重新探 测。对于降解研究，利用FuGENE6在6孔板中，用0.25吗 pRK5TKneo、 Met WT-V5/His、 Met Y1003F-V5/His、或MetAExl4-V5/His突变体转染293 细胞。第二天用10吗/ml放线菌酮(Sigma)以所示的时间处理细胞。通过 SDS-PAGE分析溶解产物，并用V5或肌动蛋白抗体对膜进行免疫印迹。
利用FuGENE6，用3吗Met构建体、2叱Cbl-标记、1 pgHA-泛素、 和pRK5TKneo或pFlag5a空载体转染293细胞，必要时每个样品用6 pg总 DNA。第二天用25 ^MMG-132(Calbiochem)处理细胞4小时，然后收获。 细胞溶解于l%NP-40裂解緩冲液，所述緩沖液含抑制剂、25pMMG-132、 和10 mM N-乙基马来酰亚胺。用1.5 pg V5抗体免疫沉淀溶解产物(l mg) 并用泛素(ubiquitin) (P4D1, Santa Cmz)抗体进行免疫印迹，然后剥离并用 V5抗体重新纟笨测。
CW/ ,辨遂W付/被
为了检测在H226、 H596、 H358、或Rat 1A-Met稳定克隆中延长的信 号传递，用PBS洗所述细胞，然后在含0.5。/。BSA、 2mM谷氨酰胺和青霉 素/链霉素的无血清RPMI或DMEM培养剂中放置1小时。将rhuHGF或拮
抗性抗Met单克隆抗体-3D6 (Genentech)加入到无血清培养基中，放置
10分钟。然后用PBS洗单层细胞，并用无血清培养基孵育，直至在所示时 间提取它们。然后用PBS洗细胞一次，用含lXDTT(Invitrogen)的IX SDS 样品缓冲液溶解，筒短超声裂解，并煮沸5分钟。为了分析Met受体抑制 性，血清饥饿后的细胞以所示浓度加入溶于无血清培养基的抗Met 5D5抗 体，放置30分钟。然后用100 ng/ml rhuHGF刺激细胞15 (对于Met活化分
析)或30分钟(对于Akt和MAPK分析)，并用含DTT的IX SDS样品緩冲 液溶解。通过SDS-PAGE分析煮沸的样品，并用P-Met (Y 1230/Y1234/Y1235, BioSource)、 P-Met (Y1234/Y1235)、 Met (DL-21)、 P- MAPK (E10, Cell Signaling)、 P-MAPK (Cell Signaling), P-Akt (587F11, Cell Signaling)、或 Akt (Cell Signaling)进行免疫印迹。所用的第二抗体是抗兔-AlexaFluor680 偶联抗体(Molecular Probes)或抗鼠-IRDye800偶联抗体 (Rockland Immunochemicals)。根据厂商推荐的免疫印迹说明书，用Odyssey (LiCor)通 过红外扫描，检测转到硝化纤维膜上的蛋白质，然后定量。对于细胞存活 性测试，细胞以每孔 lx104个细胞置于含RPMI (测试培养基)的96孔板中， 一式三份辅板，过夜，该RPMI含0.5% FBS,然后用含50 ng/ml rhuHGF 的测试培养基刺激。将不含rhuHGF的测试培养基加入到未刺激的细胞中， 72小时后，用Celltiter-Glo发光细胞存活性测试(Luminescent Cell Viability Assay) (Promega)测定细胞存活性。通过将HGF刺激的培养基中平均细胞存 活单位(viability unit)除以未刺激的培养基中细胞存活性单位，来确定刺激指 数(indices)。平均刺激指数由最少3次分开的实验确定。生长抑制测试以相 似方式进行，其中在HGF刺激时加入OA-5D5或对照Ig。
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用表达MetWT、 MetY1003F、 MetAExl4、或对照载体的RatlA稳定 的细胞系群皮下接种雌性无胸腺棵鼠(Charles River, Hollister) (5百万个细 胞/鼠，n=5)。每周一次腹膜内给药10 mg/kg仅识别人Met的抗Met 3D6 激动性抗体，用于进行Met受体刺激。每周两次用数字测径器测量肿瘤， 并用以下方程计算肿瘤体积肿瘤体积(mm3^(兀/6)(A)(B)(B)。 A二最长的宽 度；B=最短的宽度。
结果和讨论
我们测序了肺和结肠肿瘤标本板中的Met的所有编码外显子，所述标 本代表原发性肿瘤、肿瘤细胞系和原发性肺瘤异种移植模型。在我们的测 序努力中，我们在原发性肺肿瘤标本中鉴定出了以内含子区为侧翼的外显 子14中的体细胞杂合突变(图1)。这些突变是肿瘤特异性的，没有在相同 个体的非肿瘤肺组织中鉴定出来(数据未显示)。在H596 (非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系)中，我们在3p剪接供体位点中鉴定出了纯合的点突变。 在外显子14的二核苷酸剪接位点共有序列和上游多聚嘧啶束 (polypyrimidine tract)内存在突变，并观察到了外显子13和外显子15仍旧在 读框内，这提示了缺少外显子14的潜在Met转录子仍能产生功能性Met蛋 白。为了确定它，我们首先对突变的肿瘤和细胞系来源的Met RNA进行 RT-PCR扩增。所有三个内含子突变造成转录子长度比野生型的短，符合其 缺失了外显子14的情况(数据未显示)。我们还通过测序RT-PCR产物，确 证了缺少外显子14，而且我们的结果显示了去除Met的L964至D1010氨 基酸的读框内缺失。有趣的是，受体的突变形式是最占支配地位的表达形 式，尽管肿瘤样品是杂合型的外显子14缺失(数据未显示)，这显示变体转 录子优先表达。通过免疫印迹进一步确证了这个结i仑，证实了占支配地位 表达的是截短的Met蛋白。对于测序的相应外显子中的K-ras、 B-raf、 EGFR、 和HER2,包含这些内含子突变的标本都是野生型的(数据未显示)。 一起考 虑这些结果，显示出这些Met内含子突变的占优势的性质。有趣的是，以 前有报道说在正常小鼠组织中有缺少外显子14的Met剪接变体，然而涉及 月中瘤发生的功能结果并不清楚(M,")。可是，我们没检测到该剪接变体在 所4全查的任何正常人肺标本中有表达(数据未显示)。如以前所讨论的(")， 还证实了正常人组织中缺少该剪接变体。据净艮道，在原发性人NSCLC标本 中，有包含缺少外显子14的剪接变体的cDNA;可是，没有评估体细胞突 变在介导剪接缺陷中的作用，也没有评估任何可能已经表达的突变c-met 的功能后果(如果有的话)(W)。由于包含剪接变体的核酸在癌细胞中并非罕 见，因此还不知道报道的剪接变体的功能关联性。
Met近膜区结构域内外显子14缺失47个氨基酸(L964-D1010)，去除 了对于Cbl结合和下调活化的受体所必需的Y1003磷酸化位点。以前研究 显示，Y1003F突变消除了 Cbl结合并维持Met活化(6)。我们首先通过免 疫共沉淀研究证实，肿瘤相关突变Met丧失了 Cbl结合。将野生型Met (Met WT)、突变的MetY1003F (Met Y1003F)、和外显子14缺失的Met (Met AExl4) 这些Met构建体与Cbl-标记转染进293细胞中。我们观察到，Cbl与Met AExl4的结合相对于WT Met减少了(图2A)，这证实丧失了 Cbl与Met Y1003F的结合(5)。由Met WT和Met突变体造成的Cbl酪氨酸磷酸化是 相等的，这表明Met突变不改变整体的Cbl磷酸化。我们的数据还表明，Met WT与内源Cbl共免疫沉淀，而不与Met AExl4共沉淀(图2B),这符合 所观察到的Met和Cbl共表达。另外，我们4全查了对于Met受体活化所必 需的酪氨酸磷酸化位点。我们的数据表明，在Met WT和Met AExl4中都保 持有Y1234/Y1235、 Y1349、和Y1365的磷酸化(图2B)。如所预计的，与 MetWT相反，在MetAEx14中观察到了 Y1003磷酸化的丧失(图2B)。由 于据报道CblE3-连接酶活性能辅助泛素介导的受体降解(6, S)，对用Met WT、 Met Y1003F和Met AExl4转染的细胞进行泛素化测试。在Cbl存在 的情况下，Met AEx 14和Met Y1003F都显示出相对于Met WT降低了泛素 化(图2C)。我们证实了 ，在所有Met构建体中都保留有Y1234/Y1235的磷 酸化，而且像以前则在突变体中丧失了磷酸Y1003 (数据未显示)。有趣的是， 相对于突变体或单独表达Met WT,用Cbl共表达^r测到较少的经加工的 Met WT (图2C)。这些观察结果提示了，与Met AExl4相反，结合Cbl的 Met WT是优先泛素化的并降解(6, 24)。为了确定MetAExl4泛素化的降 低是否造成受体下调，用Met构建体转染细胞，并用放线菌酮处理以阻断 新的蛋白质合成。相对于MetWT ， MetAExl4显示出受体随时间下调延迟 了 (图2D)。MetY1003F突变体显示了相似的结果(数据未显示)。明显的是， 相对于患者匹配的、正常邻接肺组织和Met野生型腺癌，含外显子14剪 接变体的原发性肿瘤显示出Met蛋白水平提高了 (数据未显示)，尽管在转 录水平上表达了相等水平的Met。此外，免疫组织化学分析在这些外显子 14缺失的患者肿瘤中的Met表达揭示了 ，在所有肿瘤细胞中有强的膜表达； 相反，在带有Met WT的肿瘤中和在正常邻接组织中观察到了零星的Met 表达(数据未显示)。
为了确定降低下调Met AExl4是否影响由HGF刺激引起的下游细胞信 号传递，在含外显子14缺失(H596)或Met WT (H226和H358)的NSCLC 肿瘤细胞系中检测Met、 Akt、和MAPK磷酸化水平。H596细胞显示HGF 刺激后能保持磷酸Met和磷酸MAPK水平多至3小时，而表达MetWT受 体的H226和H358细胞系随时间显示出稳步丧失磷酸化(图2E)。有趣的是， 尽管最初的活化是响应HGF的，但磷酸Akt水平并不随时间而维持。也检 测了 Stat3和Stat5的磷酸化，但都没显示提高了的活化(数据未显示)。由 于这些肿瘤细胞系源自不同遗传背景，因此我们以含空载体、MetWT、和 Met AExl4的RatlA细胞产生了稳定的细胞系，用以进行比较。相对于用
Met激动剂3D6刺激的Met WT ，所述3D6只活化重组人受体，证实RatlA Met AExl4延长MAPK磷酸化，但不延长Akt活化(25)(图2F， 5)，确证了 得自NSCLC肿瘤细胞系的数据。
在28个其它的NSCLC细胞系板上，对于HGF介导的H596细胞的增 殖，所述细胞含外显子14缺失的Met,检测持续的Met和MAPK信号传 递的后果(图3A)。在该NSCLC细胞系板上，对于HGF刺激，H596细胞一 贯显示出最高的增殖潜力。而且，为了评估Met缺失的体内生长，用Rat 1A Met AExl4稳定细胞系接种小鼠，并与Rat 1A Met WT比较形成肺瘤的能力。 相对于MetWT，在MetAExl4和MetY1003FRatla细胞中都观察到了增 加的细胞增殖(数据未显示)。用3D6进行刺激时，相对于Rat 1A Met WT 的，Rat lAMet AExl4细胞是高度致瘤性的并发展出较大的肿瘤(图3B)。这 些结果符合外显子14缺失的Met所起的增强致瘤的作用。
为了确定Met拮抗剂是否能抑制含Met缺失的肺瘤细胞，用已知的抗 c-met抑制剂(也被称为抗Met OA-5D5 (26))处理H596细胞。抗Met OA-5D5 是含3个免疫球蛋白多肽的抗体，其中完整的轻链和重链含可变结构域序 列(图9所示)，而且N-末端截短的重链含能与全长重链的Fc部分二聚化的 Fc部分。抗Met OA-5D5的构建和产生也记载于PCT专利申请 PCT/US2004/042619 (提交于2004年11月17日)。加入抗MetOA-5D5后， Met和MAPK磷酸化以剂量依赖性的方式降低(图4A ， 6)。另夕卜，用OA_5D5 处理H596细胞以配体依赖性的方式造成剂量依赖地抑制细胞增殖(图4B)。 这些结果支持了治疗方法，其包括用Met拮抗剂靶向表达超稳定化的c-met (如，显示出近膜缺失的突变的c-met)的癌。
尽管有肿瘤细胞中异常剪接的内在性质，但是相当预料不到的是，肿 瘤相关的剪接变体实际上编码突变的受体蛋白，该受体蛋白在细胞内的降 解减慢，而且其显示出增强的致瘤活性。我们的数据强有力地提示了 ，例 如由体细胞突变造成的剪接事件可被肺瘤用来活化致瘤基因产物。在本研
究中，鉴定了多种类型的内含子突变，其不同程度地影响了剪接体的组装 并选择性地排除了外显子14，这突出了Met中突变事件的关联性。有趣的是， 近膜结构域内的缺失和插入，通过改变受体构象并活化激酶结构域，明显 起到活化某些受体酪氨酸激酶的作用(Hubbard, S Nature Rev Mol Cell Bio， 5: 464， 2004)。近膜缺失的KIT(Hirota等Science 279: 577, 1998)和PDGFRoc
(Heinrich, MC.等Science 299: 708, 2003)在胃肠基质肺瘤中被鉴定出来了 ； 在急性髓性白血病中，近膜内部串4关重复序列活化FLT3 (Nakao， M等 Leukemia 10: 1911, 1996)。可是，我们在本文中鉴定的近膜缺失体现了完 全不同的Met活化机制，其延緩受体下调，由此导致突变的c-met蛋白在癌细 胞中显著增强了稳定性。这些数据提示，驱使受体下调的突变可导致致瘤 性活化并促使肿瘤形成。
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权利要求
1.抑制人超稳定化的c-met多肽的c-met信号传递活性的拮抗剂，其中所述超稳定化的c-met多肽包含外显子14的至少一部分的缺失，由此相对于野生型c-met，其降解减少了，而且其中超稳定化的c-met多肽具有c-met信号传递活性。
2. 权利要求1的拮抗剂，其中所述拮抗剂是结合由人c-met的外显子 13和外显子15的读框内剪接而形成的表位的抗体。
3. 权利要求1的拮抗剂，其中所述超稳定化的c-met多肽的外显子14 的至少一部分缺失。
4. 权利要求l的拮抗剂，其中所述拮抗剂是抑制性RNA，其优先抑制 编码c-met剪接变体的核酸分子表达，其中所述外显子13被剪接到外显子 15上。
5. 权利要求1的拮抗剂，其中所述拮抗剂对c-met信号传递活性的抑 制包括增强超稳定化的c-met蛋白的细胞降解。
6. 权利要求l的拮抗剂，其中所述拮抗剂连接到毒素上。
7. 权利要求1的拮抗剂，其中所述拮抗剂不特异性结合野生型c-met 多肽。
8. 权利要求1的拮抗剂，其中所述拮抗剂基本不抑制野生型c-met多 肽的活性。
9. 治疗受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括向受试者给药前述权利 要求之任一项的拮抗剂，由此治疗所述肿瘤。
10. 权利要求9的方法，其中所述肺瘤被确定是包含超稳定化的c-met 的肿瘤。
11. 权利要求10的方法，其中所述肿瘤被确定是包含突变的c-met的肿 瘤，所述突变的c-met包含外显子14的至少一部分的缺失。
12. 权利要求9的方法，其中所述方法包括联合给药拮抗剂和诱导受体 蛋白降解的制剂。
全文摘要
本发明提供了用于调节HGF/c-met信号传递途径的方法和组合物，尤其通过抑制超稳定化的c-met蛋白来进行。
文档编号A61K39/395GK101184506SQ200680018395
公开日2008年5月21日 申请日期2006年3月24日 优先权日2005年3月25日
发明者莫妮卡·康-贝尔特伦, 迪内利·M·威克拉马辛格 申请人:健泰科生物技术公司