专利名称：在影响呼吸道的炎症病状中气道施用活化的蛋白c的制作方法
在影响呼吸道的炎症病状中气道施用活化的蛋白c在申请中或在当前申请中引用的所有专利和非专利文献也通过整体引 用而将它们在此引入。发明领域本发明提供了阻止儿童和成年人与血纤蛋白沉积相关的任何疾病中呼 吸道(特别是肺泡和/或细支气管)空隙中急性、复发性和慢性血纤蛋白沉积的方法。这些疾病包括炎症性肺部疾病(例如急性肺损伤(acute lung injury, ALI)),其可与直接或间接的肺部创伤有关，例如，在呼吸器治 疗之后(呼吸器i秀导的月市损伤(ventilatory Induced Lung Injury, VILI)); 炎症病况，例如自体免疫疾病、胰腺炎、吸入性肺炎；有毒烟雾的吸入； 急性呼吸窘迫综合征(ARDS),其是急性肺损伤的更严重的表现；感染， 如败血症、严重的败血症和脓毒性休克；任何原因的肺炎；急性和慢性支 气管肺泡疾病，纤维化性肺泡炎，细支气管炎，嚢性纤维化以及具有严重 气道高反应性的疾病，例如支气管哮喘和药物诱发的肺功能不全，例如， 在化疗如博来霉素化疗之后。在本发明的方法中，抗凝血剂例如活化的蛋 白C通过气道施用向气管内、支气管内或肺泡腔施用，无论这些抗凝血剂 是源自血浆还是通过重组DNA技术制备的。这些方法在临床医学、特别是 危重或重症监护医学和呼吸医学中是有用的。发明背景血纤蛋白在呼吸道的空隙、特别是肺泡和细支气管空隙中的沉积是以 下病况的常见并发症例如由创伤引起的全身性炎症病状，败血症，严重 败血症和脓毒性休克，药物(例如，由于氨曱喋呤、博来霉素或西罗莫司) 诱发的ALI、 ARDS或肺炎(Amigues L, Klouche K， Massanet P, Gaillard N, Garrigue V, Beraud JJ， Mourad G. Sirolimus-associated acute respiratory distress syndrome in a renal transplant recipient. Transplant Proc. 2005;37:2830-1.),呼 p及器i秀导的月市损伤(VILI) ( Maclntyre NR. Current issues in mechanicalventilation for respiratory failure. Chest. 2005;128:561S-567S )和继发于机械通 气的肺部损伤(VILI (The Acute Respiratory Distress Syndrome Network: Ventilation with lower tidal volumes as compared with traditional tidal volumes for acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 2000;342:1301-1308 )。这些病况引起凝结的全身激活，最终^I起血纤蛋白在血管内和血管外 间隙(即肺泡和支气管区室中)沉积。同时，炎症性活化引起致炎细胞因 子，例如肺瘤坏死因子a ( 丁NF-a)、白细胞介素l-卩(IL-1 |3)、白细月包介 素6 (IL-6)和白细胞介素8 (IL-8)从活化的炎性细胞释放。血管内血纤 蛋白沉积和肺部空隙中致炎细胞因子的释放引起组织损伤，所述组织损伤 的特征是肺泡毛细血管膜的通透性提高，伴有弥散性肺泡损伤以及富含血 浆蛋白(包括凝血系统成分)的水肿液体在肺泡中累积，以及降低表面活 性剂的产生。结果，在肺泡管和空隙中形成富含血纤蛋白的透明膜。在后 期，发生嗜中性粒细胞和其他炎性细胞的大量浸润，随后是渗出物的结构 化和纤维化。Bellingan GJ, 2002: "The pathogenesis of ALI/ARDS", Thorax 57:540-546已经描述和综述了这种病理顺序。对应于这种病理的临床病况被 称为ALI或ARDS,不同之处仅在于ARDS更严重、并且特征是更严重的 低氧血症，使得动脉Po2与吸入氧气分率的比例(Pa02/FI02) S200 mmHg。 ALI和ARDS作为全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的一部分发生，其可以由于感染性或非感染性原因引起， 例如胰腺炎或直接或间接肺部创伤；当SIRS的原因是感染性的时，它称为 败血症；当与器官功能障碍相关联时败血症净皮定义为严重败血症；当与显 著低血压相关时败血症被定义为脓毒性休克。相似顺序的病理事件也在由于各种原因(包括病毒、细菌和真菌4某介 物)导致的月巿炎(例如月市孢子虫性月市炎(Pneumocystis carinii pneumonia, PCP))、细支气管炎(例如继发于病毒性肺炎和/或肺移植物抗宿主疾病 (GVHD))中发生。在受炎性过程影响的那些肺区域中也引起肺泡渗出物 和血纤蛋白沉积。已经指出的是(例如，Levi M et al.， 2003: "Bronchoalveolar coagulation and fibrinolysis in endotoxemia and pneumonia", Crit Care Med 31:S238-S242)，肺部对于败血症的血纤蛋白沉积特别敏感，比其他器官显示出更大的程度的这一现象。广泛局部血纤蛋白沉积提示可能涉及凝结的 局部活化或局部生理调节系统被扰动。在支气管肺泡区室中，在肺泡巨噬细胞和在上皮细胞中局部表达的组织因子(TF)似乎在凝结起始中起到关 键作用，而抗凝血酶和蛋白c系统导致的生理性抗凝作用不起作用。已经 记载，在患有由于败血病性和非败血病性原因导致的ALI/ARDS的患者中， 蛋白C系统^皮显著地破坏，并有在ALI/ARDS中存在蛋白C途径的循环和 月t泡内护L舌L的"i正才居(Ware LB et al., 2003: "Protein C and thrombomodulin in human acute lung injury", Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 285丄514-L521 )。同时，局部纤维蛋白溶解作用显著抑制，即，在受损伤的肺中凝结被 局部上调，而纤维蛋白溶解作用活性被显著降低。发明概述本发明的目的是通过向气道内局部施用来应用相关抗凝剂或能够阻断 凝结的局部起始的试剂，通过解决凝结系统的局部肺部活化和抗凝机制的 局部缺陷，来改进ALI、 ARDS、肺炎和炎症性肺部疾病的治疗。通过这种 方式，可以在受影响的气道中达到这些试剂的高局部浓度，从而与同一试 剂的全身性(静脉内)施用相比，血管外血纤蛋白沉积可以被更有效地抑 制，但同时避免或降低了全身性副作用。这些试剂的气道施用可以单独给 予，或作为对同一试剂或其他试剂的静脉内施用的补充来给予。由于凝结 和炎症之间的"串音，，，这些试剂的气道施用预期也通过降低局部凝血酶活化本发明的 一个方面涉及在患有引起这种血纤蛋白沉积的炎症性和/或传 染性肺部状况的人受试者中降低气道中、特别是在肺泡或支气管肺泡间隙 中血管外血纤蛋白沉积的方法，所述方法包括经由气道施用无论是从血浆 纯化的还是通过DNA重组技术获得的抗凝剂。发明的详细"i兌明本发明涉及通过任何适合的方法，向包括成年人和儿童的人受试者气 道施用，无论怎样制备的纯化或浓缩的人活化的蛋白C( activated protein C， APC)或其衍生物，包括但不限于，气管内的、支气管内的或肺泡内的施用，5来防止或降低气道、特别是肺泡或支气管肺泡空隙中的血管外血纤蛋白沉 积。这种血纤蛋白沉积可能由急性状况、复发性状况或慢性状况引起，可 以由于各种原因引起，包括但不限于直接或间接的创伤、炎症或感染，由 于药物诱发的气道和肺间质中血纤蛋白沉积、先天疾病如嚢性纤维化，或由于这些可能的原因的组合。例如，据信本发明的方法在治疗以ALI或 ARDS为特征的肺泡血纤蛋白沉积中是有用的，所述ALI或ARDS在大部 分患有不同程度的败血症的患者中、在患有严重的肺炎、梗阻性细支气管 炎和纤维化肺泡炎的患者中出现。定义亲和性在受体和它们的配体之间，例如抗体和它的抗原之间的结合 强度。氨基酸残基存在于多肽链中的氨基酸的部分，在所述多肽链中氨基 酸与其他氨基酸通过肽(酰胺)键连接。在此描述的氨基酸残基优选的是"L" 同分异构形式。然而，氨基酸涵盖每种氨基酸，例如L-氨基酸、D-氨基酸、 a-氨基酸、(3-氨基、i氨基酸、天然氨基酸和合成氨基酸等等，只要多肽保 持了期望的功能性质。进一步包括的是已经被修饰的天然或合成氨基酸。 NH2是指存在于多肽的氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧 基末端的游离羧基。在此使用氨基酸残基的标准多肽缩写。要注意的是，在此通过公式表示的所有氨基酸残基序列在常规的氨基 末端到羧基末端的方向上具有从左到右的方向。此外，要注意的是，在氨 基酸残基序列开始或末端的破折号代表与具有一个或多个氨基酸残基的其 它序列之间的肽键，或与氨基末端基团如NH2或乙酰基、或与羧基末端基 团如COOH之间的共价键。修饰的氨基酸其中其任意基团被化学修饰的氨基酸。特别是，在a-氨基酸中a-碳原子处被化学修饰的修饰氨基酸是优选的。多肽用语多肽是指包含氨基酸残基的分子，所述氨基酸残基在邻近 氨基酸残基之间不含有酰胺键之外的键。术语"肽"也相应地被使用。APC分子本发明涉及一个或多个APC分子在制备用于局部治疗急性和血管外肺部血纤蛋白沉积的药物中的用途。在此使用术语"APC分子，，是指任何能够结合于凝血因子Va和Villa并对它们进行蛋白水解破坏、并能够结合和中 和PAI-1 、和/或特异性结合蛋白C受体(内皮蛋白C受体(endothelial protein C receptor), EPCR)的分子。分析用于本发明的APC分子的功能活性的方 》去包4舌由Gmber A, Griffin JH. Direct detection of activated protein C in blood from human subjects. Blood. 1992 May 1;79 (9) :2340-8和Strandberg K， Kjellberg M, Knebel R, Lilja H, Stenflo J. A sensitive immunochemical assay for measuring the concentration of the activated protein C-protein C inhibitor complex in plasma: use of a catcher antibody specific for the complexed/cleaved form of the inhibitor. Thromb Ha画st. 2001 ;86 ( 2 ) :604-10.描述的那些。要理解的是，本发明中使用的APC分子的活性与天然APC相比其效力 可以较低或较高。APC是维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，是蛋白C的活化形式。APC具 有抗凝血剂和纤溶酶原(profibrinolytic )性质。人蛋白C是461个氨基酸 的多肽，其经历若干翻译后修饰，产生活化的蛋白C。这些修饰包括1) 42个氨基酸的信号序列的裂解；2)赖氨酸和精氨酸残基(位置156和157) 的裂解来产生2-链的无活性酶原(155氨基酸残基的轻链经由二疏键与262 氨基酸残基的重链连接)；3 )位于氨基末端45个残基(g/a-结构域)内的9 个谷氨酸残基的维生素K依赖性羧化作用；以及4)在四个位点(一个在 轻链中，三个在重链中)上碳水化合物的附着。最后，2-链的酶原可以通过 除去重链N-末端处的十二肽来活化。本发明进一步包括重组的或合成地或转基因产生的人APC多肽的用 途。因而在一个实施方式中，所述APC分子是APC的同源物。意图根据本发明施用的人活化的蛋白C包括天然发生的人活化的蛋白 C，或其生物学活性类似物，无论是从血浆制备的还是重组地或转基因地或 合成地产生的。重组的活化的蛋白C可以包括修饰(例如，氨基酸取代和/ 或缺失和/或异源氨基酸序列的添加)，其可以产生具有增强的生物活性的 类似物。例如，APC可以使用真核细胞培养系统(例如，人肾脏293、HEPG-2、 LLC-MK2、 CHO或AV12细胞)、转基因动物、转基因植物或体外系统来 产生。在这些系统中，蛋白可以作为无活性的前体产生，其在纯化之后通 过凝血酶裂解来活化，并被配制用于施用。^:为选择，APC可以通过蛋白C的活化形式的直接分泌来产生。产生、纯化、活化和配制APC的细节是本领域已知的，例如，在美国专利NO. 6,156,734中描述了，通过完全引用将其合并在此。并且，在美国 专利NO. 4,981,952; 4,775,624和4,992,373中描述了可以用于这些方法的 APC基因和质粒，通过引用将其合并在此。活化的蛋白C也可以从商业来 源获得。例如，可以用于本发明的APC的特定实例是由Eli Lilly and Company, 以XIGRIS (TM)(活化的重组人蛋白C)的名称生产的。在本发明的一个优选的实施方式中，所述APC分子是APC类似物。 "APC类似物"被定义为相对于APC具有一个或多个(例如，20个或更少， 例如17个或更少，例如15个或更少，例如13个或更少，例如11个或更 少，例如9个或更少，例如7个或更少，例如5个或更少，例如3个或更 少，例如2个或更少，例如1个或更少)的氨基酸取代、缺失、倒位或添 加的分子，并且可以包括D-氨基酸形式。WO 01/57193中也描述了 APC类似物，包括从在SEQ ID NO: 1中含 有以下氨基酸取代中至少两种的蛋白C类似物产生的APC类似物以及其药 学上可接受的盐位置10的His用Gln取代；位置11的Ser用Gly取代； 位置12的Ser用Lys取代；位置32的Gin用Glu取代；位置33的Asn用 Asp或Phe耳又代；以及位置194、 195、 228、 249、 254、 302、或316的氨 基酉臾用选自Ser、 Ala、 Thr、 His、 Lys、 Leu、 Arg、 Asn、 Asp、 Glu、 Gly牙口 Gin的氨基酸或其酰胺形式取代。本发明中使用的优选的APC分子还包括APC的类似物和其衍生物，在 所述APC类似物中，在原始序列中不存在的一个或多个氨基酸被添加或缺 失。这些类似物是，例如，在EP 0 946 715中描述的，其中蛋白CGla结构 域被其他维生素K依赖性多肽，例如因子VII、因子X和凝血酶原的Gla 结构域替代。在本发明的一个实施方式中，APC类似物与野生型蛋白相比展现了增 强的抗凝血剂活性。在优选的实施方式中，所述类似物具有比野生型蛋白 更高的对其底物的结合亲和性，所述底物例如FVa和FVIIIa。在又一个实 施方式中，与野生型蛋白相比，所述APC类似物对其抑制物具有更低的结 合亲和性，所述抑制物例如蛋白C抑制物、a-抗胰蛋白酶或纤溶酶原激活 物抑制物-1。在本发明的一个实施方式中，APC类似物展现了与野生型蛋白相比增强的纤溶酶原活性。在优选的实施方式中，与野生型蛋白相比， 所述类似物具有对PAI-1的更高的结合亲和性。在另一个实施方式中，所述APC类似物能够抑制PAI-1。在进一步的实施方式中，所迷修饰引起APC 类似物的稳定化。这种类似物例如在专利申请WO 99/20767和WO 03/073980中描述的，通过完全引用将它们合并在此。APC类似物可以根据 本发明单独地使用、或与其他APC类似物和/或同源物和/或衍生物和/或共 辄物组合地1"吏用。例如，具有对FVa和/或FVIIIa更高结合亲和性的APC 类似物可以与能够选择性结合并抑制PAI-1的APC同源物组合使用。在本发明的另 一个优选的实施方式中，所述APC分子是APC衍生物。 "APC衍生物"被定义为具有APC或APC的类似物的氨基酸序列、但另外包 含一个或多个其氨基酸侧链基团、a-碳原子、末端氨基或末端羧基的化学修 饰的分子。化学修饰包括但不限于，添加化学部分、产生新的键、以及除 去化学部分。氨基酸侧链上的修饰包括，无限制地，赖氨酸s-氨基的酰化 作用、精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨酸羧基基团 的烷基化、以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺作用。末端氨基的修饰包括， 但不限于，脱氨基、N-低级烷基、N-二低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基 的修饰包括，但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯 修饰。低级烷基是C1-C4烷基。此外， 一个或多个侧链基团，或末端基团， 可以由普通的熟练蛋白质化学家已知的保护性基团来保护。氨基酸的a-碳 可以被单曱基化或二甲基化。APC分子的同源物在此指定的一种或多种序列的同源物可以与限定的序列相比在一个或 多个氨基酸上改变，但能够行使相同的功能，即，同源物可以被视为预先 确定的序列的功能等效物。因而，在本发明的一个优选的实施方式中，所述APC分子是任何在此 公开的分子的同源物，例如选自由以下组成的组的任何分子的同源物 APC XIGRIS 活4匕的Drotrecogin-a因而，在本发明的一个优选的实施方式中，所述APC分子是与在此公开的任何分子相比含有一个或多个氨基酸取代、倒位、添加或缺失的肽，例如选自由以下组成的组的分子<formula>formula see original document page 10</formula>
在一个实施方式中，所述取代、缺失或添加的数目是20个氨基酸或更 少，例如15个氨基或更少、例如10个氨基或更少、例如9个氨基或更少、 例如8个氨基或更少、例如7个氨基或更少、例如6个氨基或更少、例如5 个氨基或更少、例如4个氨基或更少、例如3个氨基或更少、例如2个氨 基或更少(例如l)、或这些数量之间的任何整数。在本发明的一个方面， 所述:f又代包括一个或多个保守性取代，例如20个或更少的保守性取代、例 如18个或更少、例如16个或更少、例如14个或更少、例如12个或更少、 例如10个或更少、例如8个或更少、例如6个或更少、例如4个或更少、 例如3个或更少、例如2个或更少的保守性取代。"保守的"取代表示氨基酸 残基被另一个属于同一氨基酸组的相关氨基酸残基取代，例如，具有疏水 性侧<随的那些、具有芳香族侧链的那些、具有4^性侧链的那些、具有酸性 侧链的那些、具有轻基侧链的那些以及具有非电离极性侧链的那些。保守 性取代的实例包括一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或曱硫 氨酸对另一个的取代，或一个碱性残基对另一个的取代，例如精氨酸对赖 氨酸的取代，或一个酸性残基对另一个的取代，例如谷氨酸对天冬氨酸的 取代，或一个非电离极性残基对另一个的取代，例如谷氨酰胺对天冬酰胺 的取代，等等。以下的表格列出了说明性的、但非限制性的保守性氨基酸 取代。初始残基示范性的替换AlaSer, Thr, Val, GlyArgLysAsnHis, SerAspGlu, AsnCysSerGinAsn, HisGluAsp, GluGIyAla, SerHisAsn, GinHeLeu, Val, ThrLeulie, ValLysArg， Gin, Glu, ThrMetLeu, He, ValPheLeu， TyrSerThr, Ala, AsnThrSer, AlaTrpArg, SerTyrPheVallie, Leu, AlaProAa适合于本发明的用途和方法的其他APC同源物是与在此公开的任何分 子具有大于百分之50的序列同一性、优选的大于百分之90的序列同一性 (例如，大于91。/。的序列同一性，例如大于92。/。的序列同一性，例如大于 93%的序列同一性，例如大于94%的序列同一性，例如大于95。/。的序列同 一性，例如大于96%的序列同 一性，例如大于97%的序列同 一性，例如大 于98%的序列同一性，例如大于99%的序列同一性，例如大于99.5%的序 列同一性)的肽序列，所述在此公开的任何分子例如选自以下构成的组的 分子■ APC-XIGRIS.Drotrecogin-a如在此使用的，序列同一性是指使用本领域公知的标准算法在两个分 子之间进行的比较。对于本发明用于计算序列同 一 性的优选的算法是同一性百分比。对于匹配、错配以及插入和缺失的参数值选择是任意的，尽管某些参数值已经被发现与其他值相比产生生物学上更现实的结果。对于Smith-Waterman算法的一个优选的参数值组在"最大相似性片段，，方法中 阐述，其使用了 l的值用于匹配的残基，-1/3的值用于错配的残基(残基是 单个核香酸或单个氨基酸)(Waterman, Bull. Math. Biol. 46, 473-500 (1984))。插入和缺失(indels) ， x,被加权为其中k是给定的插入或缺失中残基的数目(同上)。例如，与42个氨基酸残基序列除了 18个氨基酸取代和3个氨基酸的 插入之外其余都相同的序列，将由以下给出同 一性百分比[(1 x42匹配)-(1/3 xl8错配)-(1+3/3 indels ) ]/42=81%同一性在本发明的 一个优选的实施方式中，当计算序列同 一性时分子末端的 截断不被考虑(即，如果一个分子比另一个长，仅分子的重叠段被用于序 列同一性分析)；在本发明的另一个优选的实施方式中，截断被算作缺失。APC同源物可以包括D-氨基酸形式，可以是相对于在此公开的任何分 子具有一个或多个氨基酸取代、缺失、倒位或添加的分子，所述在此公开 的分子例如选自由以下组成的组的分子 APC-XIGRIS-Drotrecogin- oc在本发明的一个优选的实施方式中，APC分子是与APC相比含有一个 或多个氨基酸取代、倒位、添加或缺失的肽。在一个实施方式中，所述取 代、缺失或添加的数目是20个氨基酸或更少，例如15个氨基或更少、例 如10个氨基或更少、例如9个氨基或更少、例如8个氨基或更少、例如7 个氨基或更少、例如6个氨基或更少、例如5个氨基或更少、例如4个氨 基或更少、例如3个氨基或更少、例如2个氨基或更少(例如1 )、或这些 数量之间的任何整数。在本发明的一个方面，所述取代包括一个或多个保 守性取代。以上给出了适合的保守性取代的实例。适合于本发明的用途和方法的其他APC同源物是来自蛋白C序列的肽 序列，与(1) SEQ ID NO: 1和/或与(2)其截短的序列具有大于百分之 50的序列同一性、和优选的大于百分之90的序列同一性(例如，大于91% 的序列同一性，例如大于92%的序列同一性，例如大于93%的序列同一性， 例如大于94%的序列同一性，例如大于95。/。的序列同一性，例如大于96%12的序列同一性，例如大于97%的序列同一性，例如大于98%的序列同一性， 例如大于99。/。的序列同一性，例如大于99.5°/。的序列同一性)。如在此^f吏用 的，序列同 一性是指使用本领域公知的标准算法在两个分子之间进行的比 较。对于本发明计算序列同一性的优选的算法是如上所述的Smith-Waterman算法。APC同源物也可以是相对于人APC具有 一个或多个氨基酸取代、缺失、 倒位或添加的分子，并可以包括D-氨基酸形式。在本发明的另 一个实施方式中，在此的任何预定序列例如SEQ ID NO: l的所述同源物，可以定义为i) 包含能选择性结合凝血因子Va和Villa的氨基酸序列的同源物，和/或ii) 具有与人APC相比基本上相似的或更高的对凝血因子Va和Villa 的结合亲和性的同源物，和/或iii) 包含能选择性结合并抑制PAI-1的氨基酸序列的同源物，和/或iv) 具有对PAI-1基本上相似的或更高的结合亲和性的同源物，和/或v) 具有对内皮蛋白C受体(ECPCR)基本上相似的或更高的结合亲 和性的同源物，和/或vi) 具有在气道中沉积之后基本上相似的、更高的或更低的半衰期的 同源物。化学衍生的APC分子进一步理解的是，适合用于本发明的APC分子可以是化学上衍生的或 改变的肽，例如，具有非天然氨基酸残基(如，氨基乙磺酸残基、P-和 氨基酸残基和D-氨基酸残基)、C-末端功能基团修饰，例如酰胺、酯和C-末端酮修饰，以及N-末端功能基团修饰，例如酰化的胺、席夫碱、或环化， 例如存在于氨基酸焦谷氨酸中的环化。APC分子共轭物本发明的APC分子还可以用非多肽部分^f',饰，例如，PEG或糖类部分， 来产生具有对通过如人血浆和al-抗胰蛋白酶造成的钝化抗性提高的APC 化合物，因而展现了提高的体内半衰期。优选的实例包括蛋白C共轭物，其中引入了至少一个额外的体内N-糖基化位点。在美国专利NO. 6,933,367 ("蛋白C或活化的蛋白C样分子，，)中描述 了适合的实例，通过引用将其内容合并在此。因而，在本发明的一个实施方式中，使用的APC分子是N-糖基化的 APC多肽或其类似物。在本发明的另一个实施方式中，使用的APC分子是O-糖基化的APC 多肽或其类似物。在进一步的实施方式中，所述APC分子，其中已经引入至少一个额外 的N-糖基化位点。在本发明的另一个实施方式中，使用的APC分子是进一步含有N-连接 的或O-连接的脂肪酸的APC多肽或其类似物。APC片段在一个实施方式中，所述APC分子可以是APC片段。所述片段是APC、 APC同源物或APC衍生物的一部分。片段的实例包括EGF样结构域1或2、 或丝氨酸蛋白酶结构域、或天然APC肽的N-末端或C-末端或两者的缺失。 APC的片段包含来自SEQIDNO. 1的至少20个连续氨基酸。例如，片段 长度可以是20个氨基酸或更多，例如25个氨基酸或更多，例如30个氨基 酸或更多，例如50个氨基酸或或更多，例如100个氨基酸或更多，例如150 个氨基酸或更多，例如200个氨基酸或更多，例如250个氨基酸或更多， 例如300个氨基酸或更多，例如350个氨基酸或更多，例如400个氨基酸 或更多，例如450个氨基酸或更多，例如460个氨基酸，或这些数量之间 的任何整数。气管内、支气管内或肺泡内施用施用的方法包括但不限于，喷雾、灌洗、吸入、沖洗或滴注，使用其 中已经溶解了 一种或多种血液凝结因子的作为液体的生理学可接受的组合 物。当在此使用时，术语"气管内、支气管内或肺泡内的施用"包括这些施用 的所有形式，借此凝结因子被分别施用到气管、支气管或肺泡中，无论是 通过因子溶液的滴注、通过以粉末形式应用因子、或通过作为烟雾或喷雾 的溶液或粉末或凝胶吸入因子来容许因子到达气道的相关部分，其中添加或者没有添加稳定剂或其他赋形剂。在另一个实施方式中，气管内、支气管内或肺泡内的施用不包括产物 的吸入，但包括滴注或应用因子的溶液或含有因子的粉末或凝胶到气管或 低位气道中。支气管内/肺泡内施用的方法，包括但不限于，根据本领域技术人员公知的方法的支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar labage， BAL )施用，使用其 中溶解了 APC和/或APC同源物和/或衍生物和/或共轭物的生理学可接受的包括使用干燥形式的含有抗凝剂的喷雾粉末(有或者没有赋形剂)，或在 支气管镜检期间在溶液或粉末或凝胶形式中直接施用抗凝血剂。气管内施 用的方法包括但不限于，用溶解的活化的蛋白C的类似溶液进行盲端气管 洗涤，或吸入含有溶解的活化的蛋白C的喷雾化的液滴，这种液滴通过使 用适合于这种目的的任何喷雾设备获得。本发明为治疗ALI、 ARDS、肺炎和与支气管肺泡血纤蛋白沉积相关的 其他状况的方法提供了有用的新补充。此外，抗凝血剂经由气道的施用预 计避免了抗凝血剂例如APC的全身性施用的不希望的出血副作用，抗凝血 剂例如APC的静脉内使用与包括脑出血在内的内出血的高发生率相关。同 时，当与全身性施用相比时，抗凝血剂经由气道的应用预计强化了它们对 肺中的血管外血纤蛋白沉积的作用。预计的是，抗凝血剂和抗炎症试剂例 如APC的总剂量可以在空隙内局部地单独使用，或可以在常规的静脉途径 和本发明的气道途径之间分配以获得治疗的全身性和局部肺部效果之间的 最佳平衡以及降低药物副作用的发生率，例如，在患有严重败血症、脓毒 性休克和ARDS的患者中。此外，时间间隔("机会窗口")(在这种时间 间隔中静脉内使用APC可能是有益的)是有限的。当试剂被用在败血症后 阶段(post-septic phase)或甚至肺泡血纤蛋白沉积占优势的晚期ARDS阶 段(例如在ALI和ARDS中所见的)，可能期望药物反应的更长时间间隔。本发明的优选的实施方式包括通过用其中已经溶解了适合剂量(例如， 2 mg到5 mg或更多)的APC的灌洗液体(例如，25 ml到100 ml等渗盐 水)进行支气管肺泡灌洗的方式向患有ARDS的人患者局部支气管内施用 APC。取决于ALI或ARDS的早期或晚期阶段的持续时间，在一天或多天 期间以 一 定间隔重复这种施用。在满足APC静脉内施用指标的患者中作为补充性或组合性的治疗，APC也可以通过静脉内输注来给予。其他优选的施用方法可以包括使用以下设备1. 使用压缩空气/氧气混合物的加压喷雾器2. 超声喷雾器3. 电子微泵喷雾器(例如Aeroneb Professional Nebulizer)4. 压力定量气雾剂(metered dose inhaler, MDI)5. 干粉吸入器系统(DPI),气雾剂可以经由a)面具递送，或b)在插管的患者中在机械通气期间 经由气管内导管来递送(设备1、 2和3)。只要患者能够自己激活气雾剂 设备，设备4和5也可以由患者不需协助地使用。包含APC和/或APC同源物和/或衍生物溶液的优选浓度在每ml溶液 0.1吗到10000吗活性成分的范围内。使用化合物的单体形式，适合的浓 度通常在每ml溶液0.1 (ig到5000 (ig的范围内，例如每ml溶液约O.l吗 到3000吗的范围内，特别是在每ml溶液约0.1吗到1000吗的范围内， 例如在每ml溶液约0.1吗到250吗的范围内。优选的浓度将是约0.1到约 5.0 mg,优选的从约0.3 mg到约3.0 mg，例如从约0.5到约1.5 mg，特别是 在每ml溶液0.8到l.Omg的范围内。使用多聚体形式的化合物，适合的浓 度通常是在每ml溶液0.1吗到1000吗的范围内，例如每ml溶液约0.1吗 到750 (ig的范围内，特别是在每ml溶液约0.1吗到500 |ig的范围内，例 如在每ml溶液约0.1吗到250 |ug的范围内。优选的浓度将是每ml溶液约 0.1到约5.0 mg，优选的从约0.3 mg到约3.0 mg，例如/人约0.5到约1.5 mg， 特别是在0.8到l.Omg的范围内。适应症本发明的一个方面涉及治疗或预防气道中血管外血纤蛋白沉积的方 法。因而，本发明涉及治疗患有由炎症性肺部疾病引起的血管外血纤蛋白 沉积、或存在患有由炎症性肺部疾病引起的血管外血纤蛋白沉积风险的个体。在优选的方面，所述炎症性肺部疾病选自由以下组成的组 ALI .ARDS 急性支气管肺泡疾病 慢性支气管肺泡疾病 纤维4匕肺泡炎(fibrosing alveolitis )或 支气管哮喘 肺泡炎 细支气管炎 梗阻性纟田支气管机化性月巿炎(Bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia, BOP A ) 移植物抗宿主疾病(GVHD) 肺孢子虫性肺炎(PCP) 肺炎，例如吸入性肺炎 药物诱导的肺炎(例如，由于曱氨蝶呤、博来霉素或西罗莫司)-纤维化肺泡炎，急性或慢性的-嚢性纤维化.特发性肺纤维化在另一个实施方式中，所述炎症性肺部疾病与选自由以下组成的组的 状况相关-直接或间接的肺部创伤-胰腺炎.吸入性肺炎 败血症.严重败血症，和/或 ■脓毒性休克 肺孢子虫性肺炎(PCP),作为辅助预防性的或优先的治疗，或作为 PCP诱导的PCP明显的ARDS的治疗，即，在PCP阶段之前或早期，或在 伴随使用抗肺孢子虫抗生素疗法(例如磺胺曱嘈、唑与曱氧苄啶)的明显的 ARDS中。药物组合物本发明中使用的药物组合物或制剂包括组合于、优选的溶于药学上可17接受的载体、优选的含水载体或稀释剂的APC制品。所述药物组合物可以是固体、液体、凝胶或气雾剂。可以使用各种含水载体，例如0.9%盐水、 緩冲盐水、生理学相容的缓沖液，等等。这些组合物可以通过本领域技术 人员公知的常规技术来灭菌。产生的水溶液可以包装使用、或在无菌条件 下过滤并冻干，冻干的制品可以在施用之前溶于无菌水溶液。所述组合物可以含有药学上可接受的辅助物质或佐剂，包括，但不限 于，pH调节和緩冲试剂和/或紧张性调节试剂，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯 化钠、氯化钾、氯化4丐，等等。所述制剂可以含有药学上可接受的栽体和 赋形剂，包括微球体、脂质体、微嚢、纳米颗粒等等。常规的脂质体一般 由磷脂(中性的或带负电的)和/或胆固醇组成。脂质体是基于脂双分子层 的嚢泡结构，所述脂双分子层围绕含水区室。它们可以在它们的物理化学 性质如大小、脂质组成、表面电荷和磷脂双分子层的数量和流动性方面不 同。对于脂质体形成最常用的脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC) , 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆石咸(DMPC ) , 1，2-二棕榈酰 基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC ) , 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC), 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC), 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油—3-磷酸乙醇胺(DMPE ), 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE ), 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE) , 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DMPA )， 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DPPA )， 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DOPA) , 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘 油—3-[磷酸-rac- ( 1-甘油)](钠盐)(DMPG ) ， 1，2-二椋榈酰基-sn-甘油-3-[磷 酸-rac- ( 1-甘油)](钠盐)(DPPG ) , 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac- ( 1-甘油)](钠盐)(DOPG), 1》二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DMPS) ， 1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸)(钠盐)(DPPS ) , 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DOPS )，1,2-二油酰基-31>甘油-3-磷酸乙醇胺"-(戊二酰基)(钠盐)和1,1'，2，2'-四肉豆 蔻酰基心磷脂(铵盐)。由与其他脂质或脂质体的修饰物组合的DPPC组 成的制剂是优选的，例如，与胆固醇和/或磷脂酰胆碱组合。长循环脂质体特征在于它们在血管壁透过性提高的身体位置上渗出的 能力上。产生长循环脂质体的最普通的途径是将亲水聚合物聚乙二醇(PEG ) 共价连接到脂质体的外表面。 一些优选的脂质是 1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[曱氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)，1，2-二椋榈酰基-sn-甘油—3-磷酸乙醇胺-N-[曱氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯盐)(DOTAP)。Avanti， Polar Lipids, Inc, Alabaster, AL提供了可应用于脂质体的可能的 脂质。此外，脂质体悬浮液可以包括脂质保护剂，其保护脂质在贮存时对 抗自由基和脂质过氧化损伤。亲脂性自由基猝灭剂，例如a-生育酚和水溶 性铁特异性螯合剂，例如ferrioxianine，是优选的。可以获得各种方法用于制备脂质体，如在Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 ( 1980 ),美国专利NO. 4,235,871 4,501,728和4,837,028中描 述的，通过引用将它们所有的合并在此。另一种方法产生不同大小的多层 泡嚢。在这种方法中，形成泡嚢的脂质溶解在适合的有机溶剂或溶剂系统 中，并在真空下或惰性气体中干燥来形成薄的脂质膜。如果期望，所述膜 可以再溶解在适合的溶剂，例如叔丁醇中，然后冻干来形成更均质的脂质 混合物，其处于更容易水化的粉末样形式。用靶药和靶成分的水溶液覆盖 这种膜，并使其水化， 一般搅动15-60分钟。通过在更剧烈的搅动条件下水 化所述脂质，或通过添加增溶洗涤剂例如脱氧胆酸盐，产生的多层泡囊的 大小分布可以朝较小的尺寸移动。通过表面活性物质在水溶液中形成微团(含有疏水部分和一个或多个 离子基团或者强亲水性基团的分子)。本领域技术人员已知的常见表面活性剂可以用于本发明的微团。适合 的表面活性剂包括月桂酸钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、八氧乙二醇单十 二烷基醚(octaoxyethylene glycol monododecylether )、 辛苯聚醇 9 和 PLURONIC F-127 ( Wyandotte Chemicals Corp.)。优选的表面活性剂是与静 脉内注射相容的非离子聚氧乙烯和聚氧丙烯洗涤剂，例如TWEEN-80、 PLURONIC F-68、 N-辛基-卩-D-他喃葡萄糖苷，等等。此外，磷脂，例如用 于脂质体的生产中所描述的那些，也可以用于胶团形成。在某些情况下，有益的是包括促进活性物质向其靶点递送的化合物。给药方案以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量来施用制品。施用的量取决 于要治疗的受试者，包括，受试者的体重和年龄、要治疗的疾病和疾病的状态。适合的剂量范围是每次施用每公斤体重通常数百微克活性成分的数量级，优选的范围是每公斤体重约0.1吗到IOOOO吗。使用化合物的单体形 式，适合的剂量通常在每公斤体重0,1吗到5000 pg的范围内，例如每公斤 体重约O.l pg到3000 iag的范围内，特别是在每公斤体重约O.l iag到1000吗 的范围内。使用化合物的多聚形式，适合的剂量通常在每公斤体重0.1吗 到1000 pg的范围内，例如每7>斤体重约0.1 pg到750 pg的范围内，特别 是在每公斤体重约0.1吗到500吗的范围内，例如每公斤体重约0.1 pg到 250昭的范围内。优选的剂量将是每次施用约0.1到约5.0 mg、优选的约 0.3 mg到约3.0 mg,例如约0.5到约1.5 mg,特别是0.8到1.0 mg的范围内。 施用可以进行一次，或可以随后继续施用。剂量还将取决于给药途径，并 将随要治疗的受试者的年龄、性别和体重改变。多聚体形式的优选的剂量 将在每70公斤体重1 mg到70 mg之间。适合的每日剂量范围是每公斤体重每天通常数百微克活性成分的数量 级，优选的范围每公斤体重每天约0.1吗到10000吗。使用化合物的单体 形式，适合的剂量通常在每公斤体重每天0.1略到5000吗的范围内，例如 每公斤体重每天约0.1 (ig到3000 [ig的范围内，特别是在每公斤体重每天约 0.1 jiig到1000吗的范围内。使用化合物的多聚形式，适合的剂量通常在每 公斤体重每天0.1吗到1000 (ig的范围内，例如每公斤体重每天约0.1吗到 750吗的范围内，特别是在每公斤体重每天约0.1吗到500吗的范围内， 例如每公斤体重每天约0.1吗到250吗的范围内。优选的剂量将是每公斤 体重每天约0.1到约100 (ig，优选的约0,1 iig到约50吗，例如约0.3到约 30)ag,特别是1.0到10pg的范围内。施用可以进4亍一次，或可以随后继续 施用。剂量还将取决于给药途径，并将随要治疗的受试者的年龄、性别和 体重改变。多聚体形式的优选的剂量将在每70公斤体重每天1 mg到70 mg 之间。药物包装本发明中使用的化合物可以以单剂或多剂、单独或与药学上可接受的 载体或赋形剂组合施用。根据本领域技术人员已知的方法，所述制剂可以 方便地以单位剂量的形式现。优选的是根据本发明的化合物在试剂盒中提供。这种试剂盒一般含有剂量形式的活性化合物用于施用。剂量形式含有足够数量的活性化合物， 从而当施用给受试者时可以获得期望的效果。因而，优选的是，药物包装包含与相关的剂量方案相应的一定数量的 剂量单位。因而，在一个实施方式中，所述药物包装包含药物组合物，所 述药物组合物包含以上定义的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接 受的载体、运载体和/或赋形剂，所述包装包含1到7个剂量单位，从而具有用于一天或多天的剂量单位，或包含7到21个剂量单位，或其倍数，从而具有用于一周的施用或几周的施用的剂量单位。所述剂量单位可以是如上述定义的。药物包装可以是用于气管内、支 气管内或肺泡内施用的任何适合的形式。在优选的实施方式中，所述包装 是小瓶、安瓿、管、.泡罩包装、盒或胶嚢的形式。当所述药物包装包含超过一个剂量单位时，优选的是所述药物包装具 有一种能将每次施用调整到仅一个剂量单位的机制。优选的，试剂盒含有说明书，其标明剂量形式实现希望的效果的用途， 以及在指定的时间阶段内服用的剂型数量。因而，在一个实施方式中，所 述药物包装包含用于施用所述药物组合物的说明书。实施例实施例160岁的患者患有严重的ARDS,根据胸放射照相术判断不透明区主要 集中在右肺。使用溶于20 ml生理盐水中的单次剂量5 mg活化的 drotrecogin-a (Xigris)经由支气管镜在右下肺叶支气管中进行支气管肺泡 灌洗(BAL)。没有观察到明显的副作用以及气道出血。第二天，在用BAL 治疗的右下肺叶中浑浊在某种程度上得到澄清。另一方面，如Pa02/Fi02比 率所监测的，单次剂量APC没有改善气体交换。实施例2患Mb何杰金氏淋巴瘤(Mb. Hodgkin)的11岁男孩于2003年首先用 化疗治疗。在2005年记录到复发，此时他用放射治疗和自体骨髓移植(BMT ) 治疗。在收入ICU前进行的肺部活检显示没有肺部移植物抗宿主疾病 (GvHD)的迹象。没有淋巴瘤浸润的病征。BMT后9天，因急性肺功能不全(ALI)和连续高烧伴有败血症被收入ICU。首先使用广谱的经验性抗 生素治疗。在第4天，氧容量进一步降低，尽管有高的PEEP, Pa02/Fi02 比率仍< 200。胸片显示位于肺野所有4个象限的双侧弥散性浸润。超声心 动图显示没有心脏旁路或瓣膜功能不全，心肌功能正常。没有检测到其他 器官功能障碍。患者患有单器官功能障碍，伴有严重ARDS。支气管肺泡灌 洗(BAL)没有假丝酵母属的种、曲霉属、病毒或细菌。根据机构审查委 员会(IRB)的决定，经由喷雾器(Aeroneb )以5 mgx3的剂量开始使用 活化的蛋白C (活化的Drotrecogin-a )的吸入疗法。在12小时后3个剂量 之后，胸片上的浸润被明显地降低；伴随地，动脉血氧饱和度从85%提高 到95%,而Fi02二1.0。在任何时候没有严重的副作用，例如，APC吸入期 间或之后的气道出血。在APC的吸入治疗开始后24小时，患者由于右心室 衰竭，即急性的肺原性心脏病死于循环衰竭。
权利要求
1. 一种治疗或预防人受试者中气道中、特别是肺泡或支气管肺泡间隙中血管外血纤蛋白沉积的方法，包括通过气管内、支气管内或肺泡内施用的方式经由气道向所述受试者施用人活化的蛋白C或其生物学活性衍生物。
2. 权利要求1的方法，其中所述血纤蛋白沉积由炎症性肺部疾病引起。
3. 权利要求2的方法，其中所述炎症性肺部疾病选自以下组成的组 ALI、 ARDS、肺炎、急性支气管肺泡疾病、慢性支气管肺泡疾病、纤维化 肺泡炎或支气管哮喘。
4. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述炎症性肺部疾病与选自由 以下组成的组的病况相关直接或间接的肺部创伤、胰腺炎、吸入性肺炎、 败血症、严重败血症和/或脓毒性休克和/或药物诱发的急性肺功能不全。
5. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述活化的蛋白C通过活化的 蛋白C溶液的支气管肺泡灌洗来施用。
6. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述活化的蛋白C通过使用活 化的蛋白C溶液的盲端气管洗涂来施用。
7. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述活化的蛋白C通过引起活 化的蛋白C喷雾溶液的吸入来施用。
8. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述活化的蛋白C通过引起喷 雾粉末形式的活化的蛋白C的吸入来施用。
9. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述活化的蛋白C通过在支气 管镜检期间直接应用活化的蛋白C来施用。
10. 权利要求1到9的任一项的方法，其中所述人是成年人。
11. 权利要求1到9的任一项的方法，其中所述人是儿童。
12. 前述权利要求的任一项的方法，其中所述APC以每天O.l吗/kg-约 10mg/kg体重的量施用。
13. 权利要求1到9的任一项的方法，进一步包括向所述人受试者全身 地施用抗凝血剂作为辅助治疗。
14. 权利要求13的方法，其中所述人是成年人。
15. 权利要求13的方法，其中所述人是儿童。
全文摘要
本发明提供了通过气管内、支气管内、或肺泡内的途径经由气道向受试者施用人活化的蛋白C或其生物学活性衍生物，局部治疗急性和慢性血管外肺部血纤蛋白沉积和/或降低与抗凝血剂的全身性施用相关的对受试者的不希望的影响的方法。
文档编号A61P11/00GK101262879SQ200680031062
公开日2008年9月10日 申请日期2006年6月23日 优先权日2005年6月24日
发明者拉斯·O·厄滕塔尔 申请人:德拉格雷丘尔公司