专利名称：一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物药物技术领域,尤其涉及一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物 制剂，具体而言，本发明是采用现代药剂学技术制备生物毒素蓖麻毒蛋白和眼镜蛇毒细胞 毒素缓释剂，使其能应用于制备治疗肿瘤药物，具体为通过影像学技术引导注射到肿瘤组 织内，达到彻底灭活肿瘤而全身毒副作用低，安全高效的目的。
背景技术：
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去了对其生长的 正常调控，异常增生而形成的新生物，是一类常见病，多发病。根据肿瘤生物学特性及其 对机体危害性的不同， 一般分为良性和恶性肿瘤两大类，其中恶性肿瘤是目前危害人类健 康最严重的一类疾病。
目前对恶性肿瘤的治疗主要方法有外^"手术切除、化学治疗、放射治疗等，其中外科 手术切除是肿瘤的根治性治疗手段。但很大部分新发现的肿瘤患者已经处于疾病中晚期阶 段，手术切除率较低。传统化疗由于全身给药后肿瘤局部药物浓度低，且全身不良反应明 显，对一些实体瘤如肝癌等的疗效较差。近年来随着高分子材料在医药学领域的应用，脂 质体、微球、凝胶等药物缓控释新制剂不断涌现，不但提高了包裹药物的稳定性，维持药 物稳定缓慢释放，还可降低全身毒副作用，并且通过局部注射可达到肿瘤靶向治疗目的。
美国Matrix Pharmaceutical公司研发的顺钼肾上腺素(CDDP-EPI)水凝胶IntraDose 是第一个用于临床试验治疗肝癌的缓释制剂，临床II期研究结果表明其在超声或CT引导 下肿瘤内注射安全有效，且操作简便，患者容易接受。Zentner等制备了可生物降解的聚 乳酸羟基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羟基乙酸(以下简称PLGA-PEG-PLGA)温度敏感型凝胶包 载化疗药物紫杉醇，可达到持续稳定释放药物达5-6周，肿瘤内注射可显著延长荷人乳腺 癌裸鼠的生存时间。以上研究表明抗肿瘤药物缓释制剂局部注射是一种很有前途的肿瘤治 疗方法。
蓖麻毒蛋白是迄今为止抗肿瘤活性最强的药物之一，通过抑制细胞蛋白质合成产生细 胞毒作用。应用蓖麻毒蛋白制备的免疫毒素具有一定的抗肿瘤作用，部分已经进入了临床 I期或II期研究，但血管渗漏综合征等毒副作用影响了其临床应用。眼镜蛇毒细胞毒素也 是一种细胞毒作用很强的生物毒素，主要通过溶解细胞膜产生细胞毒作用。如同青霉素和 链霉素联合应用产生协同抗细菌作用一样，眼镜蛇毒细胞毒素与蓖麻毒蛋白分别通过破坏 细胞膜和抑制蛋白质合成协同产生抗肿瘤作用。但蓖麻毒蛋白和眼镜蛇毒细胞毒素的细胞 毒作用选择性低，全身用药常导致严重的毒副作用。因此，寻找生物毒素的合适载体和给 药途径是解决其应用于临床抗肿瘤的关键点。
目前国内外尚未见蓖麻毒蛋白和眼镜蛇毒细胞毒素联合应用抗肿瘤的报道，本发明采 用温敏型凝胶和PLGA微球制备其缓释制剂，将眼镜蛇毒细胞毒素包裹在缓释周期较长的 PLGA微球中，然后再和蓖麻毒蛋白一起包埋在温敏型凝胶中，提供了一种肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，通过影像学技术引导准确注射到肿瘤组织内，操作简便、费用低
且安全高效、患者无痛苦，容易接受。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，以及该生物 制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用；该制剂以温敏型凝胶包载去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白 及眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球，可通过影像学技术如超声或CT引导注射到肿瘤组织内产 生双重缓释、多重抗肿瘤疗效，最终彻底灭活肿瘤而又无明显全身毒副作用，达到安全高 效的目的。
本发明的温度敏感型凝胶可以采用聚乙二醇(PEG) /聚(D， L-乳酸一CO-乙醇酸)(PLGA) 共聚物体系制备，包括聚乙二醇一聚乳酸羟基乙酸一聚乙二醇(PEG-PLGA-PEG)、聚乙二 醇一聚乳酸一聚乙二醇(PEG-PLLA-PEG)、聚乳酸羟基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羟基乙酸 (PLGA-PEG-PLGA)或聚乙二醇Z聚乳酸羟基乙酸(PEG/PLGA)接枝聚合物等，其中以 PLGA-PEG-PLGA温敏型凝胶最为优选。PLGA-PEG-PLGA温敏型凝胶主要采用开环共聚的方 法合成，通过调节合成材料如聚乙二醇的分子量和质量百分数、丙交酯和乙交酯的摩尔比， 以及凝胶的浓度，可以调整凝胶的临界胶凝温度和降解周期。凝胶平均分子量为 4000-6000dal ，组成为聚乳酸羟基乙酸质量百分比50-75%，聚乙二醇分子量介于 1000-2000dal，质量百分比为25-50%，聚乳酸羟基乙酸链段丙交酯摩尔百分比为60-80%, 乙交酯的摩尔百分比为20-40%。温度低于临界胶凝温度时，聚合物呈流动的液态；当温度 高于临界胶凝温度时，形成固态的凝胶。聚合物在水溶液中的浓度为15-45%,药物可以和 聚合物溶液简单混合，给药后在恒温动物体内形成凝胶，缓慢释放。本温度敏感型凝胶的 优点在于可以把药物简单混合在凝胶内，操作简便；不使用有机溶剂，不影响药物尤其是 蛋白质药物的活性；不存在包封率问题，不会造成制备制剂时药物的损失；给药方便，在 影像学方法引导下，注射到肿瘤组织内，穿剌针稍加停留后拔出，载药聚合物水溶液即成 固态凝胶，不会造成药物沿针道流失造成的正常组织损伤。
眼镜蛇毒细胞毒素分子量约6600dal，仅为蓖麻毒蛋白的1/10，如果直接包载在温敏 型凝胶中会通过物理扩散较快释放，不能维持局部较长时间的抗肿瘤药物浓度。因此，我 们选择聚乳酸羟基乙酸(PLGA)缓释微球来包载眼镜蛇毒细胞毒素，然后再与蓖麻毒蛋白 一起包载在温敏型凝胶中达到双重缓释作用。载眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球以聚乳酸羟基 乙酸(PLGA)为基质材料，通过W/0/W—复乳溶剂挥发法或喷雾干燥法来制备。聚乳酸羟 基乙酸(PLGA)分子量为5000-50000dal，乳酸(lactic acid，U) /羟基乙酸(glycolic acid，GA)质量百分比为75:25—50:50，有机溶剂采用二氯甲烷，乳化可采用电动匀浆器、 超声乳化仪或电动搅拌器等方法。水相分散介质采用聚乙烯醇PVA1788，浓度为1-6%。眼 镜蛇毒细胞毒素性质稳定，耐高温和有机溶剂，选用二氯甲烷作有机相，高速匀浆等机械 操作不会影响其肽链完整性和生物学活性。我们优选分子量10000dal， LA/GA=50:50的 PLGA为基质材料，二氯甲垸为有机相，机械匀浆10000rpra， 2rain制备初乳，注入浓度为 3W的PVA1788，再次机械匀浆5000rpm， 2min，然后加入蒸馏水磁力搅拌4hr，挥尽有机溶 剂，洗涤3次后冷冻千燥。结果制备的微球粒径分布为1-8Mm，大小尚均匀，表面光滑、 无粘连，包封率达70%以上，可持续释放药物约4周时间。将PLGA缓释微球包埋在 PLGA-PEG-PLGA温敏型凝胶中，由于材料成分一致，不会影响理化性质。双重缓释作用可以明显减少PLGA微球的突释问题，使所包裹药物释放更加平稳。随着凝胶的降解，微球 也逐渐降解，但速度较慢，可在凝胶完全释放蓖麻毒蛋白后约1周时间继续释放眼镜蛇毒 细胞毒素以维持局部有效的抗肿瘤药物浓度。
本发明所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，根据体积不同的肿瘤 局部注射需要的药物量和温敏型凝胶量不同，我们优选了该生物制剂的配方。温敏型凝胶 采用的基质材料为PLGA-PEG-PLGA,浓度为15-45%，体外释放药物周期2-3周。蓖麻毒蛋 白系从蓖麻籽通过亲和层析等方法提取纯化，纯度达95%以上，溶解于pH7. 2的磷酸盐缓 冲液中，去甲肾上腺素为临床上使用的重酒石酸去甲肾上腺素，眼镜蛇毒细胞毒素采用离 子交换、分子筛层析和反相疏水高效液相色谱方法纯化，W/0/W复乳一溶剂挥发法制备PLGA 缓释微球，配方以微球中所实际包裹的细胞毒素的量计算。
本发明的双重缓释生物制剂的配方为温敏型凝胶、去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白、载 眼镜蛇毒细胞毒素微球，以温敏型凝胶包载去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白、载眼镜蛇毒细胞 毒素微球制成的，所述的温敏型凝胶浓度为15-45%，每毫升浓度为15-45%的温敏型凝胶 中含有去甲肾上腺素10-100Pg、蓖麻毒蛋白0. 1-lPg、眼镜蛇毒细胞毒素2-20Pg。最优选 的温敏型凝胶的浓度为25%，每毫升浓度为25%的温敏型凝胶中含有去甲肾上腺素5(Hig、 蓖麻毒蛋白0.5jxg、眼镜蛇毒细胞毒素l(￥g。
本发明有益效果本发明的双重缓释生物制剂使用时，通过影像学技术引导注射到肿 瘤组织后，首先分子量较小的去甲肾上腺素通过物理扩散的方法释放，导致肿瘤组织内血 管持续强烈收縮，局部血液循环障碍，并且在一定程度上造成肿瘤的缺血坏死。去甲肾上 腺素的强烈缩血管作用，可以极大程度减少通过物理扩散和凝胶生物降解逐步释放的蓖麻 毒蛋白吸收到全身，避免其产生明显毒副作用。释放的蓖麻毒蛋白凭借其结合肿瘤细胞膜 表面糖蛋白受体的特性，通过受体内吞作用进入细胞内产生抗肿瘤作用。蓖麻毒蛋白在杀 伤肿瘤细胞的同时也杀死了肿瘤组织的血管细胞，进一步永久性破坏了肿瘤的血液供应， 杜绝蓖麻毒蛋白和眼镜蛇毒细胞毒素释放后吸收到全身导致的毒副作用。随着温敏型凝胶 的降解，去甲肾上腺素和蓖麻毒蛋白的完全释放，包载在微球中的眼镜蛇毒细胞毒素进一 步起作用，通过溶解少部分对蓖麻毒蛋白敏感性低而残留的肿瘤细胞膜产生抗肿瘤作用， 彻底的消融灭活肿瘤，杜绝今后局部复发。本发明提供的这种双重缓释生物制剂，通过一 次肿瘤局部注射，可得到持续约4周时间的抗肿瘤作用。这种生物制剂一次注射可产生类 似临床上抗肿瘤的序贯治疗作用，操作非常方便，极大的减轻了患者的痛苦，并且费用低， 无明显全身毒副作用。本发明的双重缓释生物制剂适用于机体绝大部分实体瘤的局部消融 治疗，包括肝、肾、胰、脾、前列腺、子宫、卵巢、腹膜后、甲状腺、乳腺以及颈部和浅 表软组织肿瘤，包括良性和恶性肿瘤。
本发明通过对不同药物作用时间和作用机制上的优化组合，选用温敏型凝胶和PLGA 微球包载眼镜蛇毒细胞毒素、蓖麻毒蛋白和去甲肾上腺素制备双重缓释、多重作用的肿瘤 局部消融的生物制剂。在作用时间上，直接包埋在温敏型凝胶的去甲肾上腺素由于分子量 小而最先释放，同时蓖麻毒蛋白也通过物理扩散和生物降解逐歩释放达2-3周时间，而包 载在温敏型凝胶的眼镜蛇毒细胞毒素PLGA微球的降解周期较长，可持续释放药物约4周 时间。这样，不同的药物通过我们设计的双重缓释剂型可以在时间上达到持续而有序的局 部抗肿瘤作用。在作用机制上，蓖麻毒蛋白主要抑制细胞蛋白质合成，眼镜蛇毒细胞毒素主要通过溶解细胞膜产生细胞毒作用，两种药物分别通过不同的机制共同彻底杀灭肿瘤细 胞，而去甲肾上腺素主要通过收縮肿瘤血管，减少肿瘤血液供应，减少生物毒素的全身吸 收起作用。本发明的双重缓释生物制剂各个组分通过药物释放速度和释放持续时间的差 异，作用机制的不同产生协同抗肿瘤作用，最终达到彻底消融灭活肿瘤效果。
本发明的双重缓释生物制剂尤其在注射到小鼠宫颈癌、黑色素瘤、S180肉瘤组织、荷 人肝癌、乳腺癌、前列腺癌的裸鼠肿瘤组织内，或在超声引导下注入兔原位肝肿瘤VX2内 时，通过病理组织学检査肿瘤坏死情况，观察动物生存时间，结果表明双重缓释生物制剂 在肿瘤组织内单次注射可彻底的消融灭活肿瘤，显著延长了动物生存时间，并且极大的减 少药物全身毒副作用，是一种极具临床应用前景的肿瘤局部消融新方法。
图1为本发明的眼镜蛇毒细胞毒素一聚乳酸羟基乙酸微球的扫描电子显微镜图。
图2为本发明的PLGA-PEG-PLGA温敏型凝胶在低于胶凝临界温度时呈流动的液体状态图。
图3为本发明的蓖麻毒蛋白温敏型凝胶体外释放曲线图。 图4为本发明所用的荷人肝癌H印G2的裸鼠动物模型图。
图5为本发明所用的裸鼠肝癌经双重缓释生物制剂局部消融治疗后肿瘤坏死图。
具体实施例方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明 实施例
1.蓖麻毒蛋白的提取纯化和理化性质
取去壳蓖麻籽50g，先用石油醚、乙醚脱脂，再用磷酸盐缓冲液抽提蛋白，过滤后滤 液加入70%饱和度硫酸铵盐析，沉淀物溶解后上S印harose4B凝胶柱亲和层析，用含 0. 15mol/L D-半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱蛋白溶液进一步行S印hacryl S-200柱纯 化，收集第2峰为蓖麻毒蛋白，对蒸馏水透析24h，真空冷冻干燥后4i:保存。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白的分子量和纯度，配制5%浓缩胶，12%分离胶，100V 稳压电泳，考马斯亮兰R250染色，脱色后见非还原条件下蓖麻毒蛋白为单一明显条带， 分子量约66000dal， fi-巯基乙醇还原条件下见2条相邻的明显条带，为蓖麻毒蛋白的2个 亚基，分子量分别约32000、 34000dal。
蓖麻毒蛋白细胞毒性测定人肝癌HepG2细胞接种于96孔细胞培养板，12h后加入蓖 麻毒蛋白，终浓度分别为5X10一8、 1X1(T8、 2X10—9、 4X10—'o、 8X10—"mol/L， MTT法测 定细胞生长抑制率，作用24、 48h半数抑制浓度IC5。分别为3.9X10—9、 5. 3X 10—"W)1/L。
2.眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化
广东产眼镜蛇毒粗毒lg溶于5ml 0. 02mol/L p朋.0磷酸盐缓冲液PBS，上S印hadex G-100 柱(3X80cm)分子筛层析，PBS洗脱共得到5个蛋白峰；收集第5峰上CM-S印harose FF(16/20) 阳离子交换，用含0 0.5mol/L NaCl的PBS进行直线梯度洗脱，共洗脱出4个蛋白峰，行大 鼠离体心脏毒性试验，其中第3峰心脏毒性最强，收集第3峰蛋白，上S印hasilP印tideC18 柱(4.6 mmX250 mm )精细纯化，由100WA (0. 129&三氟乙酸TFA于去离子水)到100呢B (0. 10MTFA于乙腈)直线梯度洗脱，收集主峰，真空冷冻干燥后4'C保存。 3.眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球的制备采用复乳一溶剂挥发法制备缓释微球，0.2mL眼镜蛇毒细胞毒素(5mg/mL去离子水) 加入lmLPLGA (100mg/mL二氯甲烷)溶液，冰浴下10000rpm匀浆lmin;将乳化液迅速注 入3%聚乙烯醇溶液lOmL， 5000rpm，匀桨2min;加入去离子水30mL， 400rpm磁力搅拌4hr， 使二氯甲烷完全挥发；去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥。4'C保存半年，稳定性好，保 持完整的生物学活性，外观、药物含量及释放度均未见明显变化。
4. 眼镜蛇毒细胞毒素缓释微球的理化性质
取适量微球冻干粉，置双面胶带上，均匀涂布，离子镀膜仪溅金后扫描电子显微镜观 察微球圆球形，表面光滑，分散良好，无粘连，大小尚均匀(见图1)。取适量微球粉末 分散于去离子水中，激光粒度分析仪测定微球粒径分布在l-8Mm。
称取载药微球10mg，加入装有lmL 5%SDS (十二烷基磺酸钠)-0. lmol/L NaOH的青霉 素瓶中，37°C ， 220rpm振荡30h， 10000rpm离心3min，取上清液0. 5mL加0. 5mL 0. lmol/L HCL中和后，BCA法测蛋白浓度，计算微球载药率和包封率分别为(0. 71 ±0. 12) %和(74. 1 ±13. 92) %。体外释放试验表明眼镜蛇毒细胞毒素微球在37'C磷酸盐缓冲液可持续释放药 物达27天，但2h内药物释放了 21.9%,存在一定的突释现象。
5. PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶的合成
在三口瓶中放入15g(质量百分比40%) Mw为1500的聚乙二醇，150'C氮气保护条件下 搅拌3h，加入3. 2g乙交酯，19. 3g丙交酯(摩尔比1:4)以及0. 04g催化剂辛酸亚锡，反 应8hr。将产物溶于5-8'C水中，加热到80'C,静置一段时间，烧杯底部出现固态物质， 倾倒上层清液，再加入冷水，重复2-3次去除未反应的乙交酯、丙交酯和低分子量共聚物， 收集未溶于水的固体，常温干燥至恒重，-10'C保存。使用时将-l(TC保存的温敏型凝胶复 温后加入一定量的去离子水，室温下涡漩振荡lmin后放4'C溶解，重复数次直至温敏型凝 胶完全溶解。
6. PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶的理化性质
采用高效凝胶渗透色谱分析仪测定共聚物的重均分子量为5880dal，傅立叶红外光谱、 'H NMR谱显示为典型的PLGA-PEG-PLGA结构。翻转试管法测定浓度25%胶凝临界温度为28 'C，低于28'C呈流动的液体(见图2)，高于28'C呈固态的凝胶。
蓖麻毒蛋白温敏型凝胶体外释放试验将蓖麻毒蛋白溶液和温敏型凝胶在凝胶的临界 胶凝温度条件下混合，涡漩振荡器混匀lmin，体外释放试验表明浓度为25%温敏型凝胶在 37'C磷酸盐缓冲液可持续释放蓖麻毒蛋白达20天(见图3)。
7. 双重缓释生物制剂制备
本发明的双重缓释生物制剂的各个成分各按以上所述方法制备后分别保存，临用时在 低于凝胶的临界胶凝温度条件下将温敏型凝胶、去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白、载眼镜蛇毒 细胞毒微球通过简单混合方法混匀即可注射使用，下述实施例采用此法制备。 实施例1
本实施例的双重缓释生物制剂作下述注射抗荷人肝癌、乳腺癌、前列腺癌裸鼠或抗小 鼠宫颈癌、黑色素瘤、S180肉瘤或治疗兔原位肝VX2肿瘤或治疗其它肿瘤用，此配方总量 为7毫升，所选的温敏型凝胶的浓度为20%，此组分取自上述的"5"点所制备的，每毫升 浓度为20%的温敏型凝胶中含有去甲肾上腺素25^、蓖麻毒蛋白0.25Pg、眼镜蛇毒细胞毒 素5Pg。实施例2
本实施例的双重缓释生物制剂作下述注射抗荷人肝癌、乳腺癌、前列腺癌裸鼠或抗小 鼠宫颈癌、黑色素瘤、S180肉瘤或治疗兔原位肝VX2肿瘤或治疗其它肿瘤用，此配方总量 为6毫升，所选的温敏型凝胶的浓度为25%，此组分取自上述的"5"点所制备的，每毫升 浓度为25%的温敏型凝胶中含有去甲肾上腺素50Pg、蓖麻毒蛋白0.5Pg、眼镜蛇毒细胞毒 素l(Mg。
实施例3
本实施例的双重缓释生物制剂作下述注射抗荷人肝癌、乳腺癌、前列腺癌裸鼠或抗小 鼠宫颈癌、黑色素瘤、S180肉瘤或治疗兔原位肝VX2肿瘤或治疗其它肿瘤用，此配方总量 为10毫升，所选的温敏型凝胶的浓度为30%，此组分制备方法同上述的"5"点的制备方 法，每毫升浓度为30%的温敏型凝胶中含有去甲肾上腺素75^、蓖麻毒蛋白0.75Pg、眼镜 蛇毒细胞毒素15Hg。
上述的实施例的双重缓释生物制剂配方总量可以按需任意取，即按注射抗荷人肝癌裸 鼠或治疗兔原位肝VX2肿瘤或治疗其它肿瘤用的所需量来配制。
8. 双重缓释生物制剂小鼠急性毒性试验
采用小鼠S180肉瘤局部注射方法测定药物半数致死量LD50。取皮下移植S180肉瘤肿 瘤直径约1. 5cin小鼠25只，随机分为5个剂量组，每组5只，肿瘤内直接注射蓖麻毒蛋 白和眼镜蛇毒细胞毒素混合水溶液(二者质量比为1:20)，注射体积为lmL。结果，蓖麻 毒蛋白和眼镜蛇毒细胞毒素混合水溶液肿瘤内直接注射的LD50为47. 6Pg/kg (以蓖麻毒蛋 白剂量计算)，而采用双重缓释生物制剂(去甲肾上腺素/蓖麻毒蛋白/眼镜蛇毒细胞毒素 质量比为100:l:20)肿瘤内注射LD50为239.7Pg/kg (以蓖麻毒蛋白剂量计算)，毒性显著 降低。
9. 双重缓释生物制剂局部注射对荷人肝癌裸鼠抗肿瘤作用
人肝癌H印G2细胞体外培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，细胞融合生长至 90%后，收集细胞制备5X 107cells/mL的单细胞悬液。取雄性BALB/c-nu裸小鼠30只，每 只右腋下接种0.2mL， 10天后选取肿瘤直径至0.7-1.0cra的25只，随机分成5组，为模 型对照组、PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶对照组、眼镜蛇毒细胞毒素微球组、蓖麻毒蛋 白凝胶组、双重缓释生物制剂治疗组，每组5只，分别于肿瘤内注射相应以上所述方法制 得的药物，双重缓释生物制剂取上述实施例2,注射药物体积为lmL。结果，模型组裸鼠的 肿瘤持续生长(其中一只见图4)，而各给药组都表现出一定的抗肿瘤作用，其中眼镜蛇 毒细胞毒素微球组抑瘤率为59.56%，而双重缓释生物制剂抗肿瘤作用最显著，注射后第 3天肿瘤开始坏死，并逐步加重，至14天时整个肿瘤完全坏死固缩(见图5)， 28天时肿瘤 消退。
10. 双重缓释生物制剂局部注射对荷人乳腺癌裸鼠抗肿瘤作用
人乳腺癌MCF-7细胞体外培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，细胞融合生长 至90%后，收集细胞制备5X10、ells/mL的单细胞悬液。取雌性BALB/c-nu裸小鼠20只， 每只右腋下接种0. 2mL， 14天后选取肿瘤直径约0.7-l.Ocm小鼠15只，随机分成3组， 为模型对照组、PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶对照组、双重缓释生物制剂治疗组，每组 5只，分别于肿瘤内注射相应以上所述方法制得的药物，双重缓释生物制剂取上述实施例2，注射药物体积为lmL。结果双重缓释生物制剂抗乳腺癌作用同肝癌，注射后14天时整个 肿瘤坏死固縮，28天时肿瘤消退。
11. 双重缓释生物制剂局部注射对荷人前列腺癌裸鼠抗肿瘤作用 人前列腺癌细胞PC-3体外培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，细胞融合生长
至90%后，收集细胞制备5X 107cellS/mL的单细胞悬液。取雄性BALB/c-nu裸小鼠20只， 每只右腋下接种0. 2mL， 20天后选取肿瘤直径约0. 7-1. 0cm小鼠15只，随机分成3组， 为模型对照组、PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶对照组、双重缓释生物制剂治疗组，每组 5只，分别于肿瘤内注射相应以上所述方法制得的药物，双重缓释生物制剂取上述实施例 2，注射药物体积为lmL。结果双重缓释生物制剂抗前列腺癌作用同肝癌，注射后14天时整 个肿瘤坏死固縮，28天时肿瘤消退。
12. 双重缓释生物制剂局部注射抗小鼠宫颈癌作用
取皮下接种小鼠宫颈癌的BALB/c小鼠36只，肿瘤直径约0. 7-1. 0cm，随机分为3组， 为模型对照组、PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶对照组、双重缓释生物制剂治疗组，每组 12只，分别于肿瘤内注射相应以上所述方法制得的药物，双重缓释生物制剂取上述实施例 2,注射药物体积为lmL，观察荷瘤小鼠生存时间。结果，模型组小鼠注射后平均生存时间 为17.8土3.9天，单纯凝胶注射组为18.6土4. l天，而双重缓释生物制剂组小鼠存活时间 均〉60天。
13. 双重缓释生物制剂局部注射抗小鼠S180肉瘤作用
取皮下接种小鼠肉瘤S180的BALB/c小鼠36只，肿瘤直径约0. 7-1. Ocm，随机分为3 组，为模型对照组、PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶对照组、双重缓释生物制剂治疗组，每 组12只，分别于肿瘤内注射相应以上所述方法制得的药物，双重缓释生物制剂取上述实 施例2，注射药物体积为lmL，观察荷瘤小鼠生存时间。结果，模型组小鼠注射后平均生存 时间为16. 3±4. 9天，单纯凝胶注射组为17. 5士5. 3天，而双重缓释生物制剂组小鼠存活 时间均>60天。
14. 双重缓释生物制剂局部注射抗小鼠黑色素瘤作用
取皮下接种小鼠黑色素瘤B16小鼠24只，肿瘤直径约0. 7-1. Ocm，随机分为3组，为 模型对照组、PLGA-PEG-PLGA温度敏感型凝胶对照组、双重缓释生物制剂治疗组，每组8 只，分别于肿瘤内注射相应以上所述方法制得的药物，双重缓释生物制剂取上述实施例2， 注射药物体积为lmL。结果双重缓释生物制剂小鼠肿瘤第3天开始萎缩，至第7天整个肿 瘤基本消退，未见皮肤溃烂等毒副作用。
15. 双重缓释生物制剂超声介入治疗兔原位肝VX2肿瘤作用
超声引导下将兔VX2细胞悬液接种到雄性新西兰兔肝实质内，14天后超声测量肿瘤体 积，选取肿瘤直径约lcm的荷瘤兔18只，随机分为3组，为模型对照组、PLGA-PEG-PLGA 温度敏感型凝胶对照组、双重缓释生物制剂治疗组，每组6只，分别于超声引导下肿瘤内 注射生理盐水、温敏型凝胶、双重缓释生物制剂，每个肿瘤注射药物体积为lmL，每周超 声观察肿瘤体积、回声及血流情况。结果，模型组模型组兔肝肿瘤持续增大，至28天时 平均体积达48. 3cm3，注射温敏型凝胶组肿瘤体积平均为43. 5cm3，而双重缓释生物制剂组 肿瘤停止生长，超声引导穿刺活检做病理检査见肿瘤组织完全凝固坏死。
权利要求
1、一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，包括温敏型凝胶、去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白和载眼镜蛇毒细胞毒素微球，以温敏型凝胶包载去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白、载眼镜蛇毒细胞毒素微球制成，所述的温敏型凝胶浓度为15-45％，每毫升浓度为15-45％的温敏型凝胶中含有去甲肾上腺素10-100μg、蓖麻毒蛋白0.1-1μg、眼镜蛇毒细胞毒素2-20μg。
2、 根据权利要求1所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，其特征 在于其中最优选的温敏型凝胶的浓度为25%,每毫升浓度为25%的温敏型凝胶中含有去甲 肾上腺素50Pg、蓖麻毒蛋白0.5Pg、眼镜蛇毒细胞毒素l(Htg。
3、 根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，其 特征在于温敏型凝胶选自聚乙二醇一聚乳酸羟基乙酸一聚乙二醇、聚乙二醇一聚乳酸一聚 乙二醇、聚乳酸羟基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羟基乙酸或聚乙二醇/聚乳酸羟基乙酸接枝聚合物之一种。
4、 根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，其 特征在于所述的载眼镜蛇毒细胞毒素微球采用眼镜蛇毒细胞毒素以聚乳酸羟基乙酸为基质材料，通过w/o/w—复乳溶剂挥发法或喷雾干燥法制备而成的。
5、 根据权利要求3所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，其特征 在于所述的聚乳酸羟基乙酸一聚乙二醇一聚乳酸羟基乙酸温敏型凝胶平均分子量为 4000-6000dal ，组成为聚乳酸羟基乙酸质量百分比50-75%,聚乙二醇分子量为 1000-2000dal，质量百分比为25-50%，聚乳酸羟基乙酸链段丙交酯摩尔百分比为60-80%， 乙交酯的摩尔百分比为20-40%。
6、 权利要求1所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂在制备治疗肿 瘤药物中的应用。
7、 根据权利要求6所述的一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂在制备治 疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的双重缓释生物制剂在制备能通过影像学技术如超 声或CT引导下，注射到如肝、肾、胰、脾、前列腺、子宫、卵巢、腹膜后、颈部、甲状 腺、乳腺以及浅表软组织肿瘤中进行局部消融治疗如肝、肾、胰、脾、前列腺、子宫、卵 巢、腹膜后、颈部、甲状腺、乳腺以及浅表软组织肿瘤的药物中应用。
全文摘要
本发明公开一种用于肿瘤局部消融治疗的双重缓释生物制剂，包括温敏型凝胶、蓖麻毒蛋白、去甲肾上腺素和载眼镜蛇毒细胞毒素微球，以温敏型凝胶包载去甲肾上腺素、蓖麻毒蛋白、载眼镜蛇毒细胞毒素微球制成。温敏型凝胶浓度为15-45％，每毫升浓度为15-45％的温敏型凝胶中含去甲肾上腺素10-100μg、蓖麻毒蛋白0.1-1μg、眼镜蛇毒细胞毒素2-20μg。本发明在实验中注射到荷人肝癌的裸鼠肿瘤组织，或在超声引导下注入兔原位肝肿瘤VX2时，具有显著的抗肿瘤作用。本发明可应用于超声或CT引导下，人肝、肾、胰、脾、前列腺、子宫、卵巢、腹膜后以及浅表软组织肿瘤的局部消融治疗。
文档编号A61K9/00GK101450035SQ20071000994
公开日2009年6月10日 申请日期2007年12月7日 优先权日2007年12月7日
发明者何以敉, 杨发端, 林晓东, 林礼务, 薛恩生, 陈志奎, 高上达 申请人:福建医科大学附属协和医院