专利名称：：大承气汤动物血浆冻干粉及其制备方法
技术领域：
：本发明属于血液制品
技术领域：
，尤其涉及含药血液制品的制备方法。技术背景中药大承气汤是通里攻下法代表方剂，对腹膜炎，胃肠运动功能障碍等有显著疗效。既往学者对其进行大量研究，但或停留于动物模型体内实验的整体药效观察，或以大承气汤的粗提取物等同于体内有效成分进行体外实验，或以某种或几种有效成分单体的体外实验来推测其体内作用机理。由于不能正确反映体内作用有效成分，因此缺乏实验可信度及与体内实际药物作用机制的一致性。显然缺乏合适的研究方法制约了对大承气汤药效及作用机制的研究。而此类药物往往因为无法取得能被承认的药理实验报告而被市场、尤其是国际市场拒绝。中药的血清药理学为中国传统中药的细胞/分子水平的研究提供了很好的思路。血清药理学(PlasmaPharmacology)的研究方法是将单味中药或复方中药制剂灌服动物一定时间后，采集动物血液，分离血清，用此含药血清进行体外实验，通过研究给药动物血清的生物学活性来揭示药物作用机制的一种实验方法，是目前中药体外药理学实验的最佳方法之一。用含药血清代替煎剂或粗提物进行体外实验，排除了传统中药体外实验中中药粗制剂本身的理化性质对实验的干扰，能正确反映药物在体内的生物转化过程及产生的药理效应，具有较好的实验条件可控性和实验结果可信度。不仅反映药物中可吸收部分的直接作用，且能反映药物成分在机体作用下形成的代谢产物和药物诱生的机体内同源物质的间接效果，有利于发现中药复方中真正有效成分和有效部位，为药物的进一步开发提供依据。然而，血清药理学的研究方法仍然存在一些问题。主要的是对体内实际药物作用过程的重复给动物灌服中药后，被胃肠道吸收的中药成分首先进入血液。而血清是血液凝固后去除纤维蛋白与血细胞而留下的液体。在血液凝固过程中，除一系列凝血因子产生级联反应外，同时还伴有抗凝系统、纤溶系统、抗纤溶系统、补体系统以及激肽系统的不同程度的活化或其它变化，这些过程可能造成某些有效成分或中药成分介导体内分泌的生物活性物质(特别是蛋白质与肽类)被降解或丧失活性。故血清不能简单地理解成为去纤维蛋白的血浆。正常人和绝大多数病人体内并不存在血清，因此含药血清不一定重现药物在人体内的真实存在状态。除此之外，含药血清的保存也有一定难度，周明眉等通过进行含药血清抑制小板释放5—HT和阻滞内皮细胞钙离子通道两项实验研究发现，血清经长时间低温保存(一2(TC，2个月)后药效显著降低(PO.Ol)，提示保存血清中药效成分发生了分解等变化，致使药效成分含量显著降低。这与抗菌实验中含药血清一2(TC保存一周后药效降低约7^相符，提示含药血清进行低温冰冻保存仍影响其药效，进行血清药理学实验以使用新鲜血清或保存时间较短的含药血清为宜。这就限制了实验的持续进展及稳定性、均一性。因此，急需一种易于保存、便于使用且能反映大承气汤进入体内后真实状态的生物制品。
发明内容本发明的目的在于提供一种Wistar大鼠大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法。本发明在测定大承气汤服药Wistar大鼠含药血浆药物浓度及药代动力学过程的基础上，建立了如下的Wistar大鼠大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法。该方法包括如下步骤①给Waist大鼠灌服大承气汤药液，连续给药3天；②末次给药后3045分钟动脉穿刺取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌容器；③一20。C预冻30min后，一8(TC快速冻固；含药血浆冻固2h后，经过冷冻干燥制成冻干粉。其中，所述的步骤①的具体操作方法为将大承气颗粒冲剂配制为100%等效药液，按lml/(100g体重)的剂量给Waist大鼠灌服，每日两次，连续给药3天。上述大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法，无论以哪种具体的方式进行操作，所述的步骤②的取血时间优选末次给药后45分钟。更加优选地，上述大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法的步骤②可以按照下述具体操作方案进行末次给药后45分钟水合氯醛3ml/Kg腹腔注射麻醉下，经股动脉穿剌取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌容器。更具体地，本发明的大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法具体包括如下步骤①将大承气颗粒冲剂配制为100%等效药液，按lml/100g剂量给Waist大鼠灌服，每日两次，连续给药3天；②末次给药后45分钟水合氯醛3ml/Kg腹腔注射麻醉下，经股动脉穿剌取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌的EP;③一2(TC预冻30min后，一8(TC快速冻固；含药血浆样品冻固2h后用于制备冻干粉启动冷冻干燥机，真空泵预热30min，冷却温度降到最低；将冻固的血浆样品放入外挂瓶，上机于一5(TC下开始主冻干工作；关闭冻干腔体冷凝器之间的阀门之后，冻干腔体内的压力没有明显的升高，则可以结束冻干；关闭真空泵，充入无菌干燥氮气，取出血浆冻干粉于一2(TC密闭干燥保存。本发明的内容还包括通过上述方法中任意一个方法制备得到的大承气汤动物血浆冻干粉。本发明所述的大承气汤动物血浆冻干粉及其制备方法是基于对大承气汤服药Wistar大鼠含药血桨药物浓度及药代动力学过程数据采集分析的基础上的。首先需要确定给药方案及采血时间，本发明中所采用的具体方法是取Wistar大鼠(300士20g)50只，以15min为间隔，分为八组，每组5只。灌服大承气冲剂溶液，每日两次，连续给药3天。末次给药后各组动物分别于15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min动脉取血，分离血浆。以RP-HPLC检测血浆中大黄素、厚朴酚浓度，绘制血药浓度曲线，找出血药最高浓度时间，作为服药血桨样本采集时间。本发明还检测了通过上述方法制得的大承气汤动物血浆冻干粉对细胞的影响以及经长期保存后有效成分含量的变化。本发明所述的大承气汤含药血浆冻干粉的制备方法，选用广泛运用的Wistar大鼠，有易获得、饲养容易、取血方便、与人类生物学特性近似的优点。以含药血浆代替含药血清，更接近中药有效成分在体内的真实过程。避免凝血过程造成的药物有效成分的损失，排除了凝血过程可能造成某些中药有效成分或中药成分介导体内分泌生物活性物质(特别是蛋白质与肽类)受到降解而降低或丧失药效；同时也避免凝血过程伴有纤溶、补体、激肽等系统活化及凝血酶剌激血小板与白细胞释放大量生物活性物质对实验结果的干扰。采用冷冻干燥技术制备含药血浆冻干粉，排除温度、空气氧化、自身代谢分解等因素的影响，可最大限度保存含药血浆内药物有效成分及激活机体产生的内源性生物活性物质；并可使体外反应系统中的药物浓度同体内血药浓度相等，解决了困扰体外药理实验中有效成分的分离保存及等效添加的难题，进一步提高了体外中药药理实验与体内实际药物作用机制的一致性及实验可信度，实现体外中药药理实验的稳定化、连续化。本发明附图6幅图1是大黄素、厚朴酚混合标准品的HPLC图谱；图2是含药血浆样品的HPLC图谱；图3Wistar大鼠血浆中大黄素含量一血样采集时间曲线；图4Wistar大鼠血浆中厚朴酚含量一血样采集时间曲线；图5是分别以冻干粉和低温冷冻保存形式保存的含药血浆样品中大黄素的相对含量曲线；图6是分别以冻干粉和低温冷冻保存形式保存的含药血浆样品中厚朴酚的相对含量曲线。其中图5中-園一是含药血浆冻干粉中大黄素相对含量；-口-是低温冷冻的含药血浆中大黄素相对含量；图6中-固-是含药血浆冻干粉中厚朴酚相对含量；-口-是低温冷冻的含药血浆中厚朴酚相对含量。具体实施方式本实施例对本发明所述的大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法进行进一步的说明，该实施例不以任何方式对本发明的内容加以限制。1.检测方法如无特殊说明，本发明中对含药血浆样品中活性成分，大黄素、厚朴酚的含量检测均采用RP-HPLC方法，检测条件为检测设备Waters高效液相色谱仪色i普柱Nava-pakC1860A，4，3.9x150mm检测波长检测波长294nm柱温30°C进样量20^1流速流速lml/min流动相乙腈水(0.125%乙酸、0.4%乙酸钠)60:40此条件下大黄素、厚朴酚的tR分别为3.829min和4.861min，二者及生物性杂质分离良好。大黄素、厚朴酚混合标准品及含药血浆样品的HPLC分离结果分别如附图l、附图2所示。2.给药方案及采血时间确定取Wistar大鼠(300士20g)50只，分为八组，每组5只。取天津南开医院生产的大承气颗粒冲剂商品，配制为100%等效生药液，按lml/100g剂量灌服Wistar大鼠，每日两次，连续给药3天。末次给药后各组动物分别于15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min水合氯醛3ml/Kg腹腔注射麻醉下经股动脉穿刺取血，肝素抗凝，4°C、4000r/min离心10min，分离血浆。取血浆0.5ml，力叫.5ml乙醚涡漩振荡混匀lmin，12000r/min离心10min，取有机层，连续萃取三次，合并有机相，4(TC水浴挥干，0.06ml乙腈超声振荡溶解，20pl进样。以RP-HPLC检测血浆中大黄素、厚朴酚浓度，绘制血药浓度曲线，找出血药最高浓度时间，作为服药血浆样本采集时间。对大黄素和厚朴酚的分析结果分别如附图3及附图4所示附图3中各时间点的血药浓度经SPSS13统计软件分析(户<0.01):各时间点血药浓度有显著差别，血浆中大黄素浓度最高点在末次给药后45min获得。附图4中各时间点的血药浓度经SPSS13统计软件分析(/><0.01):30min及45min组与其他各时间点血药浓度相比(尸<0.01)，有显著差别；30min与45min组(P>0.05)无差别，血样采集时间可在末次给药后3045min。综合上述结果，血浆采集时间确定于末次给药后45min。3.含药血浆样品采集、处理以及大承气汤动物血浆冻干粉的制备取天津南开医院生产的大承气颗粒冲剂商品，配制为100%等效生药液，按lml/100g剂量灌服Wistar大鼠，每日两次，连续给药3天。末次给药45min后经股动脉取血，肝素抗凝，4°C、4000r/min离心10min分离血浆。等量分装于干净无菌的EP管或试管中。一20°C预冻3Omin后_80°C快速冻固。含药血浆样品冻固2h后即可用于制备冻干粉。启动仪器，真空泵预热30min，冷阱温度降到最低。将冻固样品放入外挂瓶，上机于一5(TC下开始主冻干工作12h。关闭冻干腔体冷凝器之间的阀门之后，冻干腔体内的压力没有明显的升高，则说明干燥已基本完成，可以结束冻干。关闭真空泵，充入无菌干燥氮气，取出于一20。C密闭干燥保存。4.MTT检测不同含药血浆添加量对细胞的影响MTT检测不同含药血浆添加量对细胞增殖的影响取生长状态良好，处于对数生长期的23代的Waist大鼠小肠ICC细胞，加入适量O.25%胰酶消化。血细胞计数板计数，用DMEM/F-12全成分培养液(含20^胎牛血清)配成lxl()S个/ml单细胞悬液。以1><104个/孔密度接种于96孔培养板中，每孔体积0.2ml。板周边的孔不加细胞，防止边缘效应。留空白孔一列调零，以只加培养液不加细胞作空白对照。用平板摇床5min低转速摇匀使细胞均匀分布。在37"C、5%C02的培养箱内贴壁培养lh后，换含5。/。胎牛血清DMEM/F-12全成分培养液培养24h，使细胞同步化。无血清DMEM/F-12培养基等体积溶解Waist大鼠大承气服药血浆冻干粉，设服药血浆培养0.5小时、l小时、24小时三组，每组均以冻干血浆粉配制的5%、10%、20%、50%、75%、100%含药血浆浓度加入，每组三复孔，每孔0.2ml。阴性对照组加入无胎牛血清DMEM/F-12培养基。分别于培养0.5小时、l小时、24小时后弃孔内培养上清液，无血清DMEM/F-12培养基配制5mg/mlMTT溶液，每孔加入0.02ml，37。C继续孵育4小时使MTT还原为Formazan。终止培养，弃孔内上清液。每孔加入0.15mlDMSO，振荡10分钟，使Formazan充分溶解，在570nm波长下，用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值(OD)，按下列公式求出细胞存活率，即细胞存活率=(实验组OD值—空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值一空白对照组OD值)xlOO%。结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据上述结果来看，含药血浆冻干粉具有满意的药理活性。5.长期保存对大承气汤动物血浆冻干粉中主要有效成分(大黄素、厚朴酚)含量的影响以及与低温冷冻保存方法的比较。取等量含药血浆分别以冻干粉及低温冷冻方式保存，定期以RP-HPLC监测含药血浆内有效成分含量变化，以第0天的含量为100%计算取样时间点的有效成分含量占保存初始时含量的百分比，并以此绘制曲线，其结果如图5和图6所示。根据图5可见，以本发明的冻干粉的形式保存大承气汤含药血浆，在较长时间内，样品中有效成分大黄素的含量几乎保持不变；与此相比较，以低温冷冻方式进行保存的含药血桨中大黄素的含量随保存时间延长呈较大幅度下降的趋势，因此冻干粉保存比低温冷冻保存更有效。同样，根据图6可见，以本发明的冻干粉的形式保存大承气汤含药血浆，在较长时间内，样品中有效成分厚朴酚的含量几乎保持不变；与此相比较，以低温冷冻方式进行保存的含药血浆中厚朴酚的含量随保存时间延长呈较大幅度下降的趋势，因此冻干粉保存比低温冷冻保存更有效。权利要求1.大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法，其特征在于它包括如下步骤①给Waist大鼠灌服大承气汤药液，连续给药3天；②末次给药后30～45分钟动脉穿刺取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌容器；③-20℃预冻30min后，-80℃快速冻固；④含药血浆冻固2h后，经过冷冻干燥制成冻干粉。2.根据权利要求l所述的大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法，其特征在于所述的步骤①的具体操作方法为将大承气颗粒冲剂配制为100%等效药液，按lml/(100g体重)的剂量给Waist大鼠灌服，每日两次，连续给药3天。3.根据权利要求1或2所述的大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法，其特征在于所述的步骤②的取血时间为末次给药后45分钟。4.根据权利要求1或2所述的大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法，其特征在于所述的步骤②具体操作方法为末次给药后45分钟水合氯醛3ml/Kg腹腔注射麻醉下，经股动脉穿刺取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌容器。5.根据权利要求l所述的大承气汤动物血浆冻干粉的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤包括①将大承气颗粒冲剂配制为100%等效药液，按lml/100g剂量给Waist大鼠灌服，每日两次，连续给药3天；②末次给药后45分钟水合氯醛3ml/Kg腹腔注射麻醉下，经股动脉穿刺取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌的EP;③一20。C预冻30min后，一80。C快速冻固；含药血浆样品冻固2h后用于制备冻干粉启动冷冻干燥机，真空泵预热30min，冷却温度降到最低；将冻固的血桨样品放入外挂瓶，上机于—50。C下开始主冻干工作；关闭冻干腔体冷凝器之间的阀门之后，冻干腔体内的压力没有明显的升高，则可以结束冻干；关闭真空泵，充入无菌干燥氮气，取出血浆冻干粉于一2(TC密闭干燥保存。6.通过权利要求l、2、3、或5所述的方法制备的大承气汤动物血浆冻干粉。全文摘要本发明提供一种大承气汤动物血浆冻干粉及其制备方法，该方法包括如下步骤①给Waist大鼠灌服大承气汤药液，连续给药3天；②末次给药后30～45分钟动脉穿刺取血，肝素抗凝，分离血浆，然后等量分装于洁净无菌容器；③-20℃预冻30min后，-80℃快速冻固；④含药血浆冻固2h后，经过冷冻干燥制成冻干粉。该方法解决了困扰体外药理实验中有效成分的分离保存及等效添加的难题，进一步提高了体外中药药理实验与体内实际药物作用机制的一致性及实验可信度。文档编号A61K35/16GK101152211SQ20071001299公开日2008年4月2日申请日期2007年9月28日优先权日2007年9月28日发明者张栋梁,毅李,梁国刚,齐清会申请人:大连医科大学附属第一医院