专利名称：一种药物组合物在制备改善脑微循环障碍药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及养血清脑颗粒在制备改善微循环障碍药物中的应用。
背景技术：
世界脑血管疾病的平均发病率为140-200/10万人口，平均死亡率为100/10万人口，是发 病率和死亡率较高的病种。改善脑血管损伤对挽救生命和降低医疗财政都有着重要的意义。 缺血再灌注引起的脑血管损伤约占脑血管损伤原因的60%左右。缺血再灌注后产生的过氧化物 降解I-kB，活化NF-kB, NF-kb的亚基进入胞核，激活粘附分子、炎性因子和凋亡相关基因位 点，促进黏附分子的表达，炎性因子的释放和启动凋亡相关蛋白的合成。白细胞的L选择素和 血管内皮的E选择素表达增加引起白细胞沿血管壁的滚动，进而，过表达的白细胞黏附分子 CDllb/CD18与血管内皮细胞黏附分子ICAM-l的结合导致白细胞与血管内皮细胞的黏附。黏附 于血管内皮的白细胞释放大量过氧化物和蛋白酶，损伤血管内皮细胞和基底膜，引起血管通 透性增加和血浆白蛋白漏出，造成血管周围组织的水肿。过氧化物刺激又可引起血管周围的 肥大细胞脱颗粒释放炎性因子和血管活性因子，这些因子从血管外攻击血管加重白细胞与血 管内皮细胞的黏附和白蛋白的外漏。血管周围组织的水肿从血管外压迫血管，血管内皮细胞 的肿胀和白细胞黏附，血小板积聚等都成为阻碍血流的因素，导致再灌注后不复灌的区域形 成。
缺血再灌注引起的脑血管损伤是诸多要素参与的多环节的损伤过程，以往的研究主要集 中于用抗过氧化物，抗黏附分子表达，抗血小板凝聚等作用于脑障碍的某一环节，由于作用 环节单一，不足以综合地改善脑微循环障碍，至今没有取得良好的临床疗效。可作用于脑微 循环障碍的不同病理环节的，由多成分组合的复合制剂有可能起到综合地改善脑微循环障碍 的作用。
养血清脑颗粒是由当归、川芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛为主要成 分构成的中药复方制剂，1996年被中国国家食品与药品监督管理局(SFDA)作为治疗头痛， 眩晕和脑血管疾病的中药复方制剂，批准在中国临床应用。已往的体外研究已经证明该中药 复方制剂中芍药甙，川芎嗪，阿魏酸在体外有抑制过氧化物产生的作用，川芎嗪体外有抑制白细胞和血管内皮黏附因子表达的作用。进而，体内的研究还证明了川芎嗪，芍药武，阿魏 酸单独投入能够减轻缺血再灌注引起的脑梗塞的面积。我们以往的研究已经证实了养血清脑 颗粒可以抑制自发性高血压和脑中风易发性大鼠的血压、延缓脑中风的发病时间、改善脑血 流量。但是，有关养血清脑颗粒对缺血再灌注引起的脑微循环障碍是否具有改善作用未见报
告
发明内容
本发明提供了一种药物组合物在制备改善脑微循环障碍药物中的应用，尤其是提供了该 组合物在制备改善缺血再灌注所导致的脑微循环障碍药物中的应用。 本发明是通过以下方案实施的
本发明的一种药物组合物在制备抑制白蛋白外漏药物中的应用，其中组合物是由以下重 量百分比含量的原料药制成，当归4~9%川芎4 9°/。白芍2~8% 熟地2 8%勾藤 10 15 鸡血藤10~15%夏枯草10 15% 决明子10~15% 珍珠母10 15% 元胡4 9% 细辛0.5 2%。
本发明优选的药物组合物由以下重量百分比含量的原料药制成当归6.75%川芎 6.75% 白芍5.4% 熟地5.4% 勾藤13.5% 鸡血藤13.5% 夏枯草13.5% 决明子 13.5% 珍珠母13.5%元胡6.75% 细辛1.34%。
本发明的药物组合物制成药学上可以接受的制剂，优选颗粒剂。
本发明的药物组合物制剂通过以下步骤制备
按上述比例取药材，加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓缩，加2倍量的乙 醇，静置24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.3~1.4，出膏率为10%,取清膏、 蔗糖和糊精按l: 3: 1的比例制成颗粒。其中，制剂部分还可以按照常规的工艺方法制成其 它药剂学上的任何一种剂型。
经过大量的试验研究，发现药物组合物有明显改善脑微循环障碍的作用，尤其是对由脑 微血管损伤所致的微循环障碍、缺血再灌注损伤所致的微循环障碍、白细胞黏附所导致的微 循环障碍、过氧化物所导致的微循环障碍、白蛋白外漏所导致的微循环障碍效果更佳。
本发明用蒙古沙鼠双侧颈动脉结扎建立的缺血再灌注模型，用可视化动态连续系统观察 蒙古沙鼠双侧颈动脉结扎之后脑微循环动态，包括脑血流量，血流速度，血管径，血管内皮 过氧化物产生，白细胞黏附，血管通透性的变化，并用透射和扫描电镜观察细静脉和毛细血 管超微结构的变化，探讨药物组合物对缺血再灌注引起的脑微循环障碍的改善作用。本发明中蒙古沙鼠的双侧颈动脉结扎再灌注后，蒙古沙鼠脑皮层血流量显著地降低，细 静脉红细胞流速的降低，细静脉黏附白细胞数量、细静脉过氧化物依存性DHR荧光强度和血 浆白蛋白血管外漏显著增加。药物组合物预给药可以显著地抑制缺血再灌注引起的蒙古沙鼠 脑皮层血流量和细静脉红细胞流速的降低，抑制细静脉白细胞的黏附、细静脉过氧化物依存 性D服荧光强度和血浆白蛋白血管外漏的增加。
本发明中蒙古沙鼠缺血再灌注后，血管内皮细胞通过次黄嘌呤和黄嘌呤脱氢酶产生负氧 阴离子，进而，负氧阴离子在SOD的催化下转换成过氧化氢， 一部分过氧化氢通过Haber-Wei ss 反应生成羟基自由基。过氧化氢，羟基自由基等过氧化物既可以脂质过氧化，断裂DNA等损 伤血管内皮细胞和血管基底膜细胞，又可以活化NF-icB，诱导选择素，黏附分子和炎性分子 的释放。抑制过氧化物的产生是改善再灌注后微循环障碍的主要环节。D服与过氧化氢等过 氧化物反应后转化成罗达明，罗达明可进入细胞内，结合在线立体膜上，用荧光显微镜可以 观察到DHR反应后的发光部位和荧光强度。本发明用此方法直接观察到了药物组合物的预给 药可以抑制缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉壁过氧化物的产生。
本发明中蒙古沙鼠缺血再灌注诱导的血管内皮细胞E-selectin和白细胞L-selectin的 表达，血管内皮细胞黏附因子ICAM-1和白细胞黏附因子CDllb/CD18的表达，导致白细胞沿 血管内壁的滚动和黏附。扫描电镜显示缺血再灌注后血管内突起显著增加，可能与白细胞与 血管壁的黏附相关。黏附于血管内皮的白细胞释放的过氧化物和蛋白酶等加重血管内皮细胞 和血管基底膜，导致血管通透性的增加，血浆白蛋白的外漏和血管外水肿。抑制白细胞与血 管内皮的黏附将可改善微循环障碍。本发明用可视化微循环观察方法证明了药物组合物的预 给药可以抑制缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉内白细胞的黏附。
本发明的另一重要发现是药物组合物预给药可以抑制缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉 白蛋白的外漏。缺血再灌注后由血管内皮细胞和黏附白细胞产生过氧化物是血管内皮细胞和 血管基底膜损伤和血浆白蛋白外漏的主要原因之一，本发明用动态观察FITC标记白蛋白细静 脉外漏的方法首次证明了药物组合物预给药可以抑制缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉白蛋 白血管的外漏。本发明扫描电镜观察的结果也表明再灌注1小时后的沙鼠大脑皮层细静脉血 管内皮细胞突起增多，连接间隙增宽，周围出现水肿。药物组合物的预给药抑制了再灌注后 沙鼠大脑皮层细静脉血管内皮细胞连接间隙的增宽，内皮相对变得光滑，其血管周围水肿减 轻。该结果证明了药物组合物预给药减轻缺血再灌注后脑血管内皮细胞的损伤，药物组合物 粒抑制缺血再灌注后脑血管的白蛋白外漏的作用可能与保护血管内皮作用相关，而其保护血 管内皮的作用可能与其抑制白细胞血管内皮的黏附和血管壁过氧化物的产生相关。本发明还用激光多普勒血流灌注成像仪的方法证明了养血清脑颗粒可以抑制缺血再灌注 后脑血流量的降低。参考药物组合物可以加快缺血再灌注后脑细静脉红细胞流速较快，抑制 白细胞与血管壁的粘附，抑制血管壁过氧化物的产生等结果可以认为药物组合物抑制缺血再 灌注后脑血流量降低的作用是其改善脑微循环障碍的结果。同时，本发明扫描电镜观察还观 察到缺血再灌注后脑毛细血管开放数明显减少，这可能是造成缺血再灌注之后脑血流量降低 的另外一个重要环节。而给予养血清脑颗粒后白蛋白渗出减少，脑血管周围水肿减轻，毛细 血管开放数增加，说明药物组合物通过改善微循环减少了再灌注后脑缺血复灌区域，这是可 能是其抑制再灌注后血流量降低的原因之一。
下面的试验例对本发明进一步说明
试验例一 养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉管径的影响
(一)实验方法-1、材料
动物蒙古沙土鼠，雄性，体重65 90g，购于首都医科大学实验动物部，合格证号
SCXK (京)2000-0012。在北京大学医学部动物中心，按北京大学医学部实验动物处理规定， 自由进食饮水，单笼饲养，温度22〔，相对湿度40%， 12小时切换灯源(早晨7点开灯)。
养血清脑颗粒:实施例一的制剂，由天津天士力制药股份有限公司生产，批号Z10960082。 生产过程根据严格的现代生产工艺，药物成分标准化。养血清脑颗粒的主要成分是当归、川 芎、白芍、钩藤、鸡血藤、夏枯草、珍珠母、细辛，实验前配制成80mg/ml和160mg/ml的水溶 液。
化学试剂Dihydrorhodamine 123 (DHR)购买于美国Eugene公司；异硫氰酸荧光素标 记白蛋白(FITC-albumin)购买于美国SIGMA公司;Rhodamine 6G perchlorate购买于美国 FLUKA公司；乌来糖(Urethane)购买于中国上海天莲精细化工有限公司生产。 2、试验组和对照组的动物模型制备 (1)缺血再灌注组
取20%乌拉坦，按2.0g/kg.bw的用量，经腹腔注射麻醉蒙古沙土鼠。在颈部正中切开， 分离气管，连接小动物呼吸机(ALC-V8)，S在整个观察过程保持机械通气。特殊设计的闭合器
(一根细的聚乙烯导管和一根粗的塑料管组成的套索)放置在双侧颈总动脉而不影响血流。 暴露股静脉，插入并留置直径为5mm的聚乙烯导管。切开脑部皮毛，用手提式颅钻在前囟点 前开一3X3謹的颅窗。将37度的人工脑脊液连续滴加在颅窗上以保持大脑表面湿润。用连接于荧光摄像机(C7190, HAMAMATSU， J印an)的正立生物显微镜(DMLFS, LEICA， Germany), 用10倍物镜选择直径在30-50 !i m， 200 u m长没有明显弯曲的细静脉，在监视器上基础观察 (J2118A, TCL， Huizhou， China) 10分后，闭索蒙古沙土鼠双侧颈动脉(缺血)，30分后解 除闭索(再灌注)。连续观察并用连接于荧光摄像机刻录机(DVR-R25, Malata， China)记录 微循环动态60分钟。
(2) 假手术组
即不闭索双侧颈动脉，其它操作同缺血再灌注组。
(3) 养血清脑颗粒给药组
养血清脑颗粒给药组养血清脑颗粒0. 4g/kg +缺血再灌注组，养血清脑颗0. 8g/kg + 缺血再灌注组，在缺血再灌注90分钟前，分别用灌胃管，灌胃给予养血清脑颗粒水溶液 0. 4g/kg. bw和0. 8g/kg. bw，其它操作同缺血再灌注组。 3、测定方法细静脉管径测定
在基础观察前10分钟，将50mg/kg. bw的FITC标记的血浆白蛋白经股静脉缓慢推注。用 波长488nra的氦氖激光束照射在开颅部位，用共聚焦显微镜系统观察并纪录在缺血前，以及再 灌注开始、10分、30分、60分时同一视野内细静脉内外FITC标记荧光图像。用图像分析软 件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)测定各时间点细静脉管径血管内径。 血管径是同一位置三次测量的平均值。管径的变化率是再灌注各个时间点的管径与缺血前管 径的比值。 (二)结果
数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance(ANOVA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p<0. 05为显著性差异。
图l表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0Jg/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血管径的连续变化。假手 术组在本观察期间内没有显著地变化。缺血再灌注组细静脉在再灌注开始时有一过性轻微扩 张，持续到再灌注60分。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再
灌注组的脑细静脉管径在观察期间内没有显著地变化。
试验例二养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠细静脉红细胞流速的影响
(一)试验方法
1、材料同试验例一2、试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组同试验例一。
3、测定方法细静脉红细胞流速测定
用连接于生物显微镜的高速摄影机(FASTCAM-ultima APX， photron， Japan),用1000幅/ 秒的摄影速度记录细静脉的红细胞流速。在25幅/秒的速度回放录像中用图像分析软件 Image-Pro Plus 5. 0 software (Media Cybernetic, USA)测量在缺血前,以及再灌注开始0分、 10分、20分、30分、40分、50分、60分时同一视野内细静脉红细胞流速，流速的变化率定 义为再灌注各个时间点的流速与缺血前流速的比值。 (二)结果
数据是每组6只沙鼠平均值士标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance(ANOVA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p〈0. 05为显著性差异。
图2表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉红细胞流速的连续变化。假 手术组蒙古沙鼠脑细静脉红细胞流速在本观察期间内没有显著地变化。缺血再灌注组在再灌 注开始到再灌注20分期间脑细静脉红细胞血流速度显著地降低。养血清脑颗粒0. 4g/kg给药 组在再灌注io分后，显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉红细胞血流速度的降低。养血 清脑颗粒0. 8组在再灌注开始时就抑制了的脑细静脉红细胞血流速度的降低。
试验例三养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑血流量的影响
(一)试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组同试验例一。
3、测定方法脑血流量测定
取一部分蒙古沙土鼠，用激光多普勒血流灌注成像仪(PeriScanP頂3， PER頂ED， Sweden) 测量脑血流量。头皮正中切口，暴露颅骨'去除粘在颅骨的结缔组织。计算机控制的光学扫描器发出低能量的氦-氖激光照射在暴露的颅骨上。扫描器与颅骨的距离是18.5cm。扫描器 的扫描区域是8X10腿，激光束穿透的深度是0. 5誦。扫描后显示器上显示一幅彩色图像代 表不同区域的灌注水平。记录在缺血前，再灌注开始0分、10分、20分、30分、40分、50 分、60分时脑血流图像。所有图像用LDPIwin软件对图像进行测量。以缺血再灌注前的全脑 灌注量为基础值，计算再灌注后各时间点脑血流量的变化率。 (二)结果
数据是每组6只沙鼠平均值士标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance (ANOVA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p〈0. 05为显著性差异。
图3表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑血流量的连续变化。假手术组的脑 血流量在本观察期间内没有明显的变化，缺血再灌注组在再灌注开始后显著降低，且持续到 再灌注60分。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再 灌注io分后，显著地抑制了缺血再灌注引起的脑血流量的降低。
试验例四养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁黏附白细胞的影响
(一) 试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组同试验例一。
3、测定方法黏附于细静脉壁白细胞测定
在基础观察前10分钟，将荧光标记物Rhodamine 6G按5mg/kg. bw的使用量，经股静脉 缓慢推注。用连接于生物显微镜的共聚焦扫描装置(Bio-Rad Radiance 2100， England)和计 算机处理系统(Dell叩tiplex Gx加0， Germany)进行观察和记录。用波长5们nm的氦氖激光 束照射在开颅部位进行观察，图像经8-bit A/D转换器数字华后，X-t扫描荧光图像 (512X512X8-bit)储存在计算机等待处理。设定30秒扫描的30张图片中部位没有发生变 化的白细胞为黏附白细胞。在直径30-50um， 200um长的小静脉观察并纪录在缺血前，以及 再灌注O分、10分、30分、60分黏附与血管壁的白细胞。
(二) 结果数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance (AN0VA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p<0. 05为显著性差异。
图4表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒O. 8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠细静脉壁黏附白细胞的连续变化。假 手术组在观察结束时，黏附于脑细静脉壁的白细胞在不到3个/200um。缺血再灌注组于蒙古 沙鼠脑细静脉壁的白细胞数在再灌注开始增加，在再灌注结束时，已经达到6个/200ym。养 血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，在再灌注30分后显著地抑制了白细胞与大脑细静脉管 壁粘附。养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组，在再灌注10分后就显著地抑制了白细胞与大脑 细静脉管壁粘附。
试验例五养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁过氧化物产生动态的影响
一、养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠细静脉壁过氧化物产生动态的影响
(一) 试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组养血清脑颗粒0.4g/kg +缺血再灌注组，在缺血再灌注90分 钟前，用灌胃管，灌胃给予养血清脑颗粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操作同试验例一
3、 测定方法过氧化物产生动态测定
在基础观察前10分钟，将10umol/ml浓度的过氧化物荧光探针dihydrorhodamine 123连 续滴加在脑观察部位的表面。当过氧化物与D服相遇时，可以将DHR还原成rhodamine 123， 用连接于生物显微镜的超敏感摄像机(Hamamatsu EB-CCD Camera "190 Japan)观察并纪录 D服的发光部位和强度(激发波长510nm，发射波长534皿)。为了测量血管内皮组织荧光强 度的差别，用图像分析软件Image-Pro plus 5. O测量血管内腔和血管壁的平均荧光强度。测 量每一个血管内腔和血管壁的平均荧光强度，它们的差值(DI)反应了 DHR被氧化的程度。 测量缺血前(Ibase),以及再灌注开始O分、10分、20分、30分、40分、50分、60分时细 静脉壁和血管内荧光强度差值(Ix)，以缺血前的数值为基础值，用各时间的值(Ix)与基础 值(Ibase)的比表示DHR荧光强度的变化，以判定细静脉壁过氧化物的产生动态。
(二) 结果数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance (AN0VA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p〈0. 05为显著性差异。
图5是缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠在缺血再灌注前和再灌注60分时脑细静 脉壁DHR荧光强度变化的图像。缺血再灌注蒙古沙鼠a和养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙 鼠c在缺血前，没有观察到细静脉壁D服荧光发光部位.在再灌注60分时，可以观察到缺血 再灌注蒙古沙鼠沿脑细静脉壁D服荧光强度增强的部位b，而养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙 古沙鼠没有观察到脑细静脉壁DHR荧光强度的增强d.可见养血清脑颗粒的预给药可以抑制 缺血再灌注后沙鼠大脑皮层细静脉壁过氧化物的产生。
二、不同剂量的养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁过氧化物产生动态影响
(一) 试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组同试验例一
3、 测定方法同上述细静脉壁过氧化物产生动态的测定
(二) 结果
数据是每组6只沙鼠平均值士标准误表示。数据分析用单因素方差分析oneiay analisis of variance(ANOVA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p<0. 05为显著性差异。
图6表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁DHR荧光强度的连续变 化。假手术组蒙古沙鼠脑细静脉壁的D服荧光强度比在本观察期间内几乎没有变化。缺血再 灌注组蒙古沙鼠脑静脉壁的DHR荧光强度比在再灌注10分后开始增加，且持续增加。养血清 脑颗粒0. 4g/kg+缺血再灌注组和养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再灌注10分显著地抑制 了缺血再灌注引起的脑细静脉壁的D冊萤光强度的增加。
试验例六养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响
一、养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响 (一)试验方法 1、材料同试验例一2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组养血清脑颗粒0.4g/kg +缺血再灌注组，在缺血再灌注90分钟 前，用灌胃管，灌胃给予养血清脑颗粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操作同试验例一
3、 测定方法血浆白蛋白漏出率的测定
在基础观察前10分钟，将50mg/kg. bw的FITC标记的血浆白蛋白经股静脉缓慢推注。用 波长488nm的氦氖激光束照射在开颅部位，用共聚焦显微镜系统观察并纪录在缺血前，以及再 灌注开始、10分、30分、60分时同一视野内细静脉内外FITC标记荧光图像。用图象分析软 件Image-Pro plus 5.0 (Media Cybemetrics Inc， USA)测定各个时间点细静脉内(Iv)和 血管外(Ii) FITC标记白蛋白的萤光强度。以缺血再灌注前的细静脉血管外的FITC萤光强 度(Ii)与细静脉血管内的FITC萤光强度(Iv)的比值为基础值，用各时间Ii/Iv的比值与 基础值的比表示FITC萤光强度的变化，以判定细静脉内白蛋白向血管外漏出的动态。 (二)结果
数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析oneiay a皿lisis of variance(ANOVA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p<0. 05为显著性差异。
图7是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒组蒙古沙鼠脑细静脉FITC标记白蛋白漏 出的图像。在缺血再灌注前，假手术蒙古沙鼠，缺血再灌注蒙古沙鼠和养血清脑颗粒+缺血再 灌注蒙古沙鼠均没有观察到FITC标记白蛋白漏出细静脉外。在再灌注60分时，假手术蒙古 沙鼠几乎没有观察到脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。缺血再灌注蒙古沙鼠，可以观察到 FITC标记白蛋白的明显漏出。养血清脑颗粒+缺血再灌注蒙古沙鼠，在再灌注后60分时，只 有少量FITC标记白蛋白的漏出于细静脉外。可见养血清脑颗粒能够显著抑制白蛋白外漏。 二、不同剂量的养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁白蛋白渗出的影响 (一)试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组同试验例一
3、 测定方法同上述细静脉白蛋白外漏率的测定(二)结果
数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance (AN0VA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p〈0. 05为显著性差异。
图8表示的是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒0.4g/kg+缺血再灌注组，养血清 脑颗粒0.8+缺血再灌注组在缺血前和再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉FITC标记白蛋白漏出的连 续变化。假手术组在本观察期间，脑细静脉FITC标记白蛋白的仅有少量的漏出。缺血再灌注 组从再灌注开始就可观察到FITC标记白蛋白的漏出，并持续增加。养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺 血再灌注组在再灌注60分显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静脉FITC标记白蛋白的漏出。 养血清脑颗粒0. 8+缺血再灌注组在再灌注30分以后显著地抑制了缺血再灌注引起的脑细静 脉FITC标记白蛋白的漏出。可见高剂量的养血清脑颗粒能够快速地抑制白蛋白外漏。
试验例七养血清脑颗粒对缺血再灌注蒙古沙鼠脑细静脉超微结构的影响
(一)试验方法
1、 材料同试验例一
2、 试验组和对照组动物模型制备
(1) 缺血再灌注组同试验例一
(2) 假手术组同试验例一
(3) 养血清脑颗粒给药组养血清脑颗粒0.4g/kg +缺血再灌注组，在缺血再灌注90分 钟前,用灌胃管，灌胃给予养血清脑颗粒水溶液0.4g/kg.bw，其它操作同试验例一
3、 测定方法
在再灌注60分钟后，经左心室以10ml/分钟灌注生理盐水将血管内的血液冲洗干净后， 以3ml/分钟的速度灌注固定液，固定液成分为4%甲醛，2%戊二醛，0.1M磷酸缓冲液。 灌注40分钟后，然后迅速取下整个大脑，冠状切面切成l-2mm厚组织片，然后转移到3%戊 二醛固定液中4。C固定过夜，然后用0. 1M磷酸缓冲液冲洗三次，再用P/。俄酸固定液4'C固定 2小时。再用系列丙酮脱水，用Epon812树脂包埋剂包埋，6(TC孵育48小时。然后进行修 块，切成60nm厚的组织片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，再用JEM-1230透射电镜观察(JEM 1230, JEOL， Japan)。
扫描电镜标本制备，灌流后迅速取下整个大脑，切成大约几个毫米宽的小方薄片。先用 戊二醛固定2小时，用0. 1M磷酸缓冲液冲洗，再用0. 1M磷酸缓冲液配置的OA固定2小时， 用系列酒精脱水，标本移入醋酸戊酯。样品放在干燥器样品盒，用C02临界点干燥法，使样品干燥而不变形。用导电胶将样品粘在样品托上，然后在离子镀膜仪中镀金3分钟，以使样品 表面导电。最后在扫描电镜JSM-5600LV(JSM-5600LV, JE0L， Japan)下观察。
开放毛细血管计数皮质毛细血管开放数在各组的放大20倍的扫描电镜图像中计数。每 组图像的开放毛细血管数的平均值为各组沙鼠的大脑皮质的平均开放毛细血管密度。
(二)结果
数据是每组6只沙鼠平均值土标准误表示。数据分析用单因素方差分析one-way analisis of variance(AN0VA)处理和Fisher s post Hoc test检验。设p〈0. 05为显著性差异。
图9-A是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒+缺血再灌注组大脑皮质扫描电镜下毛 细血管开放的图像。假手术组可见皮质中有许多毛细血管，且分布较均匀。缺血再灌注组可 以观察到开放的毛细血管显著减少，而且分布不均匀，养血清脑颗粒+缺血再灌注组开放的毛 细血管数量与假手术组相接近。图9-B是假手术组，缺血再灌注组，养血清脑颗粒+缺血再灌 注组毛细血管开放数的结果。毛细血管开放数相对于假手术组(41.33±0.667)在缺血再灌 注后明显下降(30. 33± 1.667 )，养血清脑颗粒显著抑制了毛细血管开放数的减少 (42±0. 577)。
图10是假手术组，缺血再灌注组和养血清脑颗粒+缺血再灌注组蒙古沙鼠再灌注60分后 的大脑皮质毛细血管的透射电镜和扫描电镜的图象。图a， b， c是透射电镜图像，假手术组 (a)可以观察到血管内皮光滑，血管周围组织的无水肿现象。缺血再灌注组(b)可以观察 到血管周围组织出现明显水肿。养血清脑颗粒+缺血再灌注组(c)可以观察到血管周围水肿 明显减轻。图d， e， f是扫描电镜图像，假手术组(d)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮光 滑，内皮细胞间连接紧密。缺血再灌注组(e)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮可以观察到 血管内细胞众多的隆起，内皮细胞连接处，细胞间相互嵌合的指状突起肥大，且内皮表面出 现许多突起的小泡。养血清脑颗粒+缺血再灌注组(f)蒙古沙鼠脑皮质部细静脉血管内皮较光 滑，连接处指状突起和小泡明显减少。
本发明有益效果
本发明的药物组合物的预给药抑制了缺血再灌注后脑血管壁过氧化物的产生，白细胞与 脑血管内皮细胞的黏附，保护了脑血管内皮细胞，进而，抑制了血浆白蛋白的外漏和脑血管 周围水肿，改善脑微循环，抑制了脑血流量的减少。
图1养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉管径的影响。图2养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉红细胞流速的影响。 图3养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑血流量的影响。 图4养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉壁黏附白细胞的影响。 图5养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉DHR荧光强度的影响。 图6不同剂量的养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉DHR荧光强度的影响。 图7养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响。 图8不同剂量的养血清脑颗粒对再灌注后蒙古沙鼠脑细静脉血浆白蛋白渗出的影响。 图9养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠大脑皮质毛细血管开放扫描电镜图象。 图10养血清脑颗粒对缺血再灌注后蒙古沙鼠大脑皮质毛细血管的透射电镜和扫描电镜图象。 其中Sham:假手术组，I/R:缺血再灌注组，CG0.4+I/R:养血清脑颗粒0. 4g/kg+缺血再 灌注组，CG0.8+I/R:养血清脑颗粒0.8+缺血再灌注组。图10中所示图a、 b、 c是投射电
镜图象，图d、 e、 f是扫描电镜图象；CJ:细胞连接；V:小囊泡。
具体实施例
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对发 明的限制。
实施例一 药物组合物制剂
(1) 取当归67.5g，川芎67.5g，白芍54g，熟地54g，勾藤135g，鸡血藤135g，夏枯草135g， 决明子135g，珍珠母135g，元胡67.5g，细辛14.5g;
(2) 将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇，静 置24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.4，出膏率为10%，取清膏、蔗糖和糊 精按1: 3: 1的比例制成颗粒剂125袋。
实施例二药物组合物制剂
(1) 取当归80g，川芎80g，白芍80g，熟地80g，勾藤120g，鸡血藤120g，夏枯草120g， 决明子120g，珍珠母120g,元胡70g，细辛10g;
(2) 将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇，静置 24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.3，出膏率为10%，取清膏、蔗糖和糊精 按l: 3: 1的比例制成片剂200片。
实施例三中药组合物制剂 (1)取当归40g，川芎40g，白芍20g，熟地20g，勾藤歸g，鸡血藤100g，夏枯草100g，决明子100g，珍珠母100g，元胡70g，细辛10g;
(2)将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓縮，加2倍量的乙醇，静 置24小时沉淀，取上清液浓縮成浸膏，相对密度为1.3，出膏率为10%，取清膏、蔗糖和糊 精按1: 3: 1的比例制成胶囊100粒。
权利要求
1、一种药物组合物在制备改善脑微循环障碍药物中的应用，其中该组合物是由以下重量百分比含量的原料药制成当归4～9％川芎4～9％白芍2～8％熟地2～8％勾藤10～15％鸡血藤10～15％夏枯草10～15％决明子10～15％珍珠母10～15％元胡4～9％细辛0.5～2％。
2、 如权利要求l所述的应用，其中所述的组合物是由以下百分比含量的原料药制成 当归6.75% 川芎6.75% 白芍5.4% 熟地5.4% 勾藤13.5% 鸡血藤13.5% 夏枯草13.5% 决明子13.5% 珍珠母13.5% 元胡6.75% 细辛1.34%。
3、 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的脑微循环障碍是脑微血管损伤所致的 微循环障碍。
4、 如权利要求1或2所述的应用，其特张在于所述的脑微循环障碍是缺血再灌注损伤所致 的微循环障碍。
5、 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的脑微循环障碍是白细胞黏附所致的微 循环障碍。
6、 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的脑微循环障碍是过氧化物所致的微循环障碍
7、 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的脑微循环障碍是白蛋白外漏所致的微循环障碍。
8、 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的药物组合物制成药学上可接受的制剂。
9、 如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的药物组合物制成颗粒剂。
全文摘要
本发明提供了一种药物组合物在制备改善脑微循环障碍药物中的应用。本发明用蒙古沙鼠双侧颈动脉结扎建立的缺血再灌注模型，通过可视化动态连续系统观察蒙古沙鼠双侧颈动脉结扎之后脑微循环动态，包括脑血流量、血流速度、血管径、血管内皮过氧化物产生、白细胞黏附、血管通透性的变化，并用投射和扫描电镜观察细静脉和毛细血管超微结构的变化的观察和研究，证明了养血清脑颗粒对缺血再灌注所导致的脑微循环障碍有治疗和改善作用。
文档编号A61K36/185GK101428094SQ20071015007
公开日2009年5月13日 申请日期2007年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者刘育英, 凯 孙, 安丽华, 昕 常, 徐想顺, 芳 王, 王传社, 胡白和, 赵新荣, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司