专利名称：：疾病治疗方法疾病治疗方法
技术领域：
：本发明涉及医学领域，尤其涉及包括施用含遗传材料的制剂的治疗方法，并可用于治疗与染色体缺陷相关的血细胞生成受损以及由使用细胞生长抑制剂或高剂量辐射的疗法所引起的后续血液干细胞(bsc)死亡；用于治疗与bsc朝向特定造血元件分化而不分裂的基本机制损伤相关的疾病，所述疾病在由造血细胞恶性转化所导致的成血细胞增多(hemoblastoses)中发生，所述转化使得它们不能正常分化，并引起其失控的分化；和用于治疗由干细胞(sc)中染色体缺陷所引起的疾病，其治疗需要在体内出现遗传上、表型上和生理上健康的SC。已知一种基于细胞中点突变修复的治疗方法[1998年8月18日的美国专利no.5,795,972。该方法显示相对低的治疗效力并且施用范围有限，因为其要求在开始治疗前精确地确定突变。因为仍然缺乏特定突变是癌症起因的可靠证据，所以开发上述方法需要仔细和长期的研究来检测需要修正的特定突变，从而使得必须开发这样的方法，所述方法可应用于对癌症起因已经有所了解、但不强调基因组中诱导恶性化的具体改变的情形之下。还已知涉及局部施用DNA片段用于治疗患者皮肤癌前状态的方法[1999年9月21日的美国no.5,955,059;1995年11月28日的美国no.5,470,577。这些方法的可应用性是有限的，因为相应专利中既未指明具体的DNA序列也未指明DNA来源。它们提出使用来自"任何适当来源"的天然和合成的DNA，例如长度为200bp下至单核苷酸和核普的鲑鱼DNA，包括二聚体，根据该作者进行的测试所述二聚体是最为有效的。然而，对人类机体施用外源DNA的效用和后果仍待详细研究，这就预先决定了应用这些方法的某些危险。本质上与所提出方法最接近的是基于施用Polydan制剂的方法，所述Polydan制剂是产自鲟鱼精的DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)衍生物与多氯水合物(polychlorohydrate)钠盐的高度纯化的标准化混合物，其作为制剂的緩慢(持续1.5-2分钟)的皮下或肌内注射剂施用，所述制剂在手中的管里预先加热至患者的体温[注册号no.95/292.8;注册号000552/01-2001。这一最接近设计的缺点是应用领域有限，因为该制剂的活性物质从异种(xenogeneic)生物的组织中分离并含有DNA和RNA两种分子。尽管制剂Polydan的活性物质以与人DNA类似的方式作用于BSC基因组(即，由于递送至核的DNA片段双链断裂的存在而模拟染色体断裂的存在，从而激活BCS进行终末分化，并且由于Polydan制剂的DNA和人染色体DNA之间的部分同源性而为同源重组事件和保持染色体物理长度和结构足以进行连续的有丝分裂链创造条件)，但是Polydan制剂的物质还是向受体基因组中引入外源序列。制剂Polydan的这种作用通过恢复和保持BSC染色体的功能性大小而修复BSC的造血功能，并且推测其不影响分化血细胞总体而言高度特化的特性，同时通过其模拟作用激活所述血细胞分化；尽管如此，不能认为这样修复的BSC完全恢复成其初始遗传状态，因为涉及受与外源遗传材料的重组影响的染色体基因座的任何其他分化方向会必然导致该BSC发育途径中的缺陷。在这些重组期间内部染色体结构变为完全不可预测的，并且尚未研究用外源DNA制剂刺激白细胞的长期后果。待解决的问题在于将片段化DNA的应用范围扩展至以下用途治疗与染色体缺陷相关的血细胞生成受损和随后的BSC死亡(例如在使用细胞生长抑制剂或高辐射剂量的疗法中)；治疗与涉及BSC向特定造血元件分化而不分裂的基本机制受损相关的疾病，这在由造血细胞恶性转化导致的成血细胞增多中发生，所述转化使得这些细胞不能正常分化并引起其失控的增殖；以及用于治疗由干细胞(SC)染色体缺陷引起的疾病，所述疾病的治疗依赖于在体内出现遗传上、表型上和生理上健康的sc。需要的结果通过将片段化DNA引入患者体内来实现；另外，所述片段化DNA是同种异体的(allogeneic)并由下述片段组成，所述片段具有1-10个核小体单元的长度并与核基质蛋白相组合组成患者的完整基因组；该片段化DNA以等于或高于患者血浆和组织液中含有的DNA量但是不高于1500ng/mL的用量施用。所述方法是基于BSC应答片段化DNA制剂作用的能力。递送进BSC核空间的DNA片段通过同源重组的天然机制替换基因中的突变区或恢复染色体的初始物理长度(这是BSC丧失其活力的原因)，从而使得无活力或突变的BSC重新有活力。在该过程中，BSC染色体获得了允许该BSC进行一系列连续有丝分裂的物理参数，并且在最优的改变形式中，接受处理的BSC的基因组被完全修正，并与最初的健康BSC的基因组相同。同时，递送至核空间中的胞外DNA片段以其双链末端模拟BSC染色体中功能性断裂的出现，这是起始BSC终末分化的具体诱导物。存在于BSC核内的胞外DNA片段的这种模拟效应触发细胞分化机制，并将BSC激活和维持在定向分裂(committeddivision)的持续活性状态。附图包括图1、图2和图3:在致死剂量照射之前和之后对小鼠腹膜内施用小鼠及人DNA对于小鼠存活的影响；图4:来自暴露于亚致死照射的小鼠的脾，(a)用外源DNA处理的和(b)未用外源DNA处理。箭头表示用来自人胎盘的胞外DNA处理经照射小鼠后出现的脾集落。所提出的疾病治疗方法按以下实现。将从遗传和生理健康的供体中分离的片段化DNA引入患者体内(通过静脉内、肌内或皮内注射；皮下；腹膜内；通过冲洗或贴敷至粘膜和/或皮肤；通过口服给药，之前中和或不中和酸性胃介质，或使用在胃中不可溶的专用胶嚢；直肠内；阴道内；眼内；鼻内；通过眼内注射；或通过吸入)。所施用制剂的量应当使得患者血和组织液中片段化DNA的浓度不超过1500ng/mL的最大允许剂量。5在离体处理BSC以用于进一步自体移植的情况下，应当用不超过30照/mL浓度的片段化DNA制剂处理BSC。在引入患者体内后，片段化DNA通过天然递送机制(血流和位于活跃分裂细胞表面上的特异性受体)递送至机体的活跃分裂细胞，包括BSC。然后，递送至胞内空间的片段化胞外DNA在核的染色体间区室内沉积，并进行核内加工。在这种情况下，在核的染色体间区室中沉积的DNA片段通过同源重组的天然机制替换使得BSC无活力的染色体突变区。作为上述事件的结果，发生了BSC功能的完全或部分修复，以及有丝分裂过程的激活和BSC分化的触发。在外源片段化DNA对BSC的这种作用中，非常重要的是BSC(和若干其他SC类型，包括胚胎SC)能在若干(一到三)次第一有丝分裂中完全再造(remodel)其基因组，使其进入定向状态。在这一过程中，BSC基因组中发生大量断裂，这是基因组再造的一个内在部分。如果在这一特定时刻，SC核中存在与核基质蛋白相关联的适当大小的DNA片段，则它们可通过同源重组机制整合进基因组中；另外，由于染色质中出现大量的生理学功能性断裂，因此这一过程的活性大大提高。另外，DNA片段对BSC分化的激活效应与其模拟作用有关。递送至核空间的胞外DNA片段用大量双链断裂补充核，所述断裂被细胞识别为在BSC终末分化期间形成并快速修复的其自身功能性染色体断裂。位于BSC核内的胞外DNA片段的这种模拟效应触发细胞分化机制，激活定向的BSC分裂并将其保持在持续活跃状态中。因此，引入体内的从生理学和遗传上健康的供体中分离的片段化同送机制(受体介导的胞饮作用)吸收。递送至核区室、染色体间空间的片段化DNA在那里沉积，并在BSC基因组再造时参与与相应染色体基因座的同源交换，相应地在染色质中形成大量染色体断裂。由于同源重组的天然机制，在染色体间空间沉积的DNA片段替换突变的染色质区(其中的突变可导致BSC无活力)，并可取代SC基因中的任何突变基因座，使其无突变。相应地，BSC基因组被部分或完全修正，从而恢复BSC的有丝分裂能力或甚至完全恢复受损的BSC基因组。同时，递送至核空间的胞外DNA片段用大量双链末端补充核，所述双链末端被细胞识别为BSC终末分化期间形成并被快速修复的其自身的功能性染色体断裂。位于BSC核内的胞外DNA片段的这种模拟作用触发细胞分化机制，激活BSC分裂并将其维持在活性的定向状态。通过使用本发明实现的效果可以通过以下的理论数据来体现。根据现代分类，干细胞包括全能桑椹胚细胞、多能胚泡细胞(形成所有身体组织)和多能局部生发细胞[OrkinSH，MorrisonSJ.Stem-sellcompetition.Nature.2002.V.418.no.6893.P.25-27。局部或组织特异性SC在生物中终生保留，是可自身维持的，并对损失的细胞群提供恒定的置换。组织特异性sc有助于再生和维护大量(如果不是所有的话)哺乳动物组织，包括血、肝、肠、骨骼肌和中枢神经系统。直到最近仍认为组织特异性sc被确定为某种细胞类型，并分布在其起源组织中。尽管如此，最近出现了大量文献证明局部sc具有更显著的可塑性。所提出的疾病治疗方法与基于中介体(mediator)集落刺激分子作用的方法根本不同，所述中介体集落刺激分子是刺激SC活性的生长因子。BSC活性被认为是BSC增殖能力的提高以及分化与发育成特定细胞类型的能力的保持；生长因子控制这些特定的BSC特性。所述生长因子包括集落刺激因子(CSF)、白介素和抑制因子。所有这些物质都是具有约20kDa分子量的糖蛋白，并作为控制血细胞生成和特定细胞类型分化的循环激素和局部中介体二者发挥作用。生长因子的效应扩展至BSC、集落形成单位(CFU)、定向细胞和成熟细胞。特别地，红细胞计数的降低和氧分压(P02)的相应降低是产生红细胞生成素的信号。红细胞生成素作用于敏感细胞CFU-E,从而刺激其增殖和分化。白介素作用于多能SC、大部分CFU，并且有时作用于终末分化的细胞。抑制因子则有相反的效果，它们减緩血细胞生成。这些因子的缺乏可能是白血病的起因，所述白血病的特征是血白细胞计数的可观增加。分离抑制白血病的因子；该因子减緩单核细胞、巨噬细胞的增殖和分化。所有这些作用都是调节性的事件，并可由生长因子的中介体分子决定，所述中介程，所述蛋白质介导增殖和分化的BSC的代谢。在这些过程中，使用生长因子来恢复血液造血功能。当使用这种治疗方法时，受损的sc染色质被修复，从而使得sc能够进行正常的有丝分裂并应答生长因子的作用。简言之，如果不存在待刺激的对象，则生长因子没有作用。另一方面，递送进核空间的胞外DNA片段通过其双链末端模拟BSC染色体中功能性断裂的存在，所述功能性断裂是BSC分化的诱导物。位于BSC核内的胞外DNA片段的这种模拟作用触发细胞分化机制，激活并维持定向的BSC分裂。可以看出，SC中由诱变剂诱导的或与年龄依赖性过程相关的突变的发生和维持的机制如下。任何生物的基因组DNA都处于环境因素(例如电离辐射和化学诱变剂)和多种内部因素(包括细胞修复系统的错误)的诱变作用下。已知的修复机制修正DNA损伤或不正确的核苷酸替换，并在突变事件后共价连接单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB)[HoeijmakersJH.Genomemaintenancemechanismsforpreventingcancer.Nature.2001.第411巻.366-374页。当损伤同时涉及两条DNA链并具有可观的长度时，这些区域的修复存在某些问题，并且相应的损伤常导致突变。DSB代表了几乎无法被修复机制修正的损伤的一个实例，因为它们既影响染色体完整性又影响DNA分子的直接完整性。已知一种DSB修复的快速机制；其涉及蛋白质KU70/KU-86和核DNA依赖性的蛋白激酶，所述蛋白激酶连接DNA末端并恢复基因组完整性[PfeifferP.ThemutagenicpotentialofDNAdouble-strandbreakrepair.Toxicol.Lett.1998.第96-97巻.119-129页。不可能恢复由于DNA分子中同时多处断裂而损失的短DNA片段的核苷酸。作为这些损失的结果，在恢复染色体完整性后出现染色体畸变；在这一过程中，DSB是突变的来源。化学细胞生长抑制剂和硬Y-辐射被广泛用于治疗癌症；这些药剂干扰双链DNA的完整性，在前一情况下是由于烷化效应，在后一情况下是由于X射线的直接作用和电离产生的自由基。在这些接触的情况下在DNA中形成的多重DSB导致核中合成过程停止和细胞周期受损。最终，自毁程序被引发，细胞进入凋亡或者获得重大的遗传改变。在身体所有细胞中(特别是在活跃增殖细胞中)产生的这些特定的遗传改变导致细胞死亡，或者导致突变后代的出现。遗憾的是，这些治疗不仅引起癌细胞死亡，而且引起身体其他活跃分裂细胞(如上皮细胞、白细胞、白细胞和红细胞镨系的sc、毛嚢细胞及其他)的死亡。最危险的副作用是破坏提供活性免疫应答的血细胞。若干位研究人员推测，多细胞生物中存在利用来自生物学流体的胞外基因组DNA作为外部基因组标准品的能影响细胞遗传组分的天然机制[YakubovLA，PetrovaNA,PopovaKA,SemenovDV,NikolinVP,OskinaIN.RoleofextracellularDNAinmaintainingofstabilityandvariabilityofcellulargenomes.DokladyBiochemistryandBiophysics.2002.第382巻.31-34页；YakubovLA,PopovaNA,NikolinVP,SemenovDV,BogachevSS,Os'kinaIN.ExtracellulargenomicDNAprotectsmiceagainstradiationandchemicalmutagens.GenomBiol.2003.第5巻.第3页。根据所提出的机制，位于细胞表面的DNA结合受体将来自周围介质的基因组DNA片段递送至核，在那里这些片段通过同源重组机制替换细胞基因组DNA中相应的同源片段。然后，我们会考虑来自接触诱变效应的细胞的突变DNA片段如何参与体内突变改变的进行性发展。体内DNA更新的要素(如血流的胞外DNA、DNA转运至核以及体细胞同源重组)可能是下述机制的根本，所述机制能够从基因组中去除任何固有或新形成的突变。该过程的效率显著地取决于外部DNA标准的品质和特性。一方面，该机制能够通过用外源非突变序列进行替换而去除突变，另一方面，该机制能够通过用突变的外源同源片段替换细胞的健康序列而向细胞中引入突变。后一种改变形式特别适用于接触强诱变剂之后立即在体内发生的情况。已知化学诱变剂以及硬辐射诱导凋亡；因此，带有大量多种缺陷(包括致死突变)的DNA片段释放进血中[LeonSA,ShapiroB，SklaroffDM,YarosMJ.FreeDNAintheserumofcancerpatientsandtheeffectoftherapy.CancerRes.1977.第37巻.646-650页；NikolinVP,KaledinVI,MatienkoNA，GruntenkoEV.Cis國Diamminedichloroplatinum(II)asapotentialchemotherapeuticagentagainstneoplasticlesionsintheliver.J.ClinicalHemat.Oncol.1979.第9巻.198-207页]。DNA转运机制将所有这些片段递送至细胞，同源重组将这些片段整合进细胞基因组中。然后，接受带有致死突变的DNA片段的细胞死亡，并继而将其带有突变序列的遗传DNA释放进环境中。接受缺乏致死突变的DNA分子的细胞存活，然后可形成用于选择(例如选择癌症克隆)的起始群(startpopulation),凋亡DNA片段库可含有通过修复形成而不考虑同源性的片段。这样的片段会含有来自相同或不同染色体中不同基因组区域的相连DNA片段。考虑到片段末端区域的同源性，这样的嵌合片段会整合进受体细胞的基因组中。因为这些末端可来自不同染色体区域或不同的染色体，所以重组事件可导致多种染色体畸变。我们推测来自接触强诱变剂的细胞的突变DNA片段会反复地从死亡细胞中递送至活细胞中。这些片段会在活细胞中诱导相同的突变和染色体畸变；相应地，这些片段在许多轮细胞死亡中会传播由原始诱变剂接触引起的缺陷。根据目前的理论和实验数据，我们推断，如果暴露于强诱变剂或高辐射剂量的生物的血流中含有健康的DNA片段(所述DNA片段一起组成与受体基因组同源的完整基因组)，则它们会在DNA更新系统中与接触诱变剂后由于上述事件而释放到血中的DNA片段竟争。健康的DNA片段会是核中发生的修复同源重组的底物，并且它们参与修复过程会导致突变基因座的修正，并且因此导致产生健康的相应细胞群。所述片段化DNA的制剂含有专门处理的人DNA的健康片段库，所述片段参与对损伤的SC基因组的直接作用，最终导致恢复染色体完整性和BSC进行一系列连续有丝分裂和后续分化的能力。所提出的疾病治疗方法(其涉及对BSC的作用)可通过将其在BSC库中修正而用于任何遗传异常情况，所述BSC随后被移植进同一生物体中。使用本发明实现的效果可基于以下的理论数据。身体的每个细胞都含有基因组DNA，其编码关于身体中所有细胞中所有蛋白质的信息和基因在核内空间排列的信息，所述信息对于这些蛋白质的正确空间和时间表达模式是必需的。因此，基因组DNA是生物的生命模板，其包含关于整个生物体及其发育的信息。最初，在生物的所有细胞中基因组DNA都是相同的。然而，随着生物的生长，各个细胞的基因组DNA被暴露于由环境因素以及细胞复制和修复期间发生的错误所引起的突变影响之下。已知在突变事件后，修复机制立即改变不正确的或缺陷的DNA碱基，在链中SSB和DSB后将DNA分子的末端再次连接。就该目的而言，修复机制可利用第二条DNA链。在被修复的区域非常长并同时涉及两条DNA链的情况下，修复变得有问题并可发生突变。因此，环境诱变因素和细胞修复与复制的错误是细胞中体细胞突变的来源。多能SC对身体的恢复能力而言是最重要的。这些细胞中基因组结构的缺陷总是伴随着缺陷组织和病理情况的发生。唯一被病理遗传学(pathogenetically)证明的治疗遗传异常(包括SC基因组中的异常)相关疾病的方法是改变个体中这些细胞的基因组，所述改变可通过会恢复健康细胞特征性的遗传稳态的任何方法来实现。在现代实验医学中已开发了大量基因疗法(基因靶向)；然而，所有这些方法都具有严重的缺陷，并且对复杂的真核生物来说效力相当低。经典的基因靶向方法涉及使用病毒构建体来修正染色体突变，所述病毒构建体能够有效地向细胞基因组中引入工作基因拷贝。尽管如此，由于基因和调节区的随机插入，这些方法不能避免一些问题，包括基因表达对整合位点的依赖性、整合的病毒基因组的沉默，以及与致癌作用相关的插入"i秀变[KhonDB，SadelainM，GloriosoJC.OccurrenceofleukaemiafollowinggenetherapyofX-linkedSCID.NatureRev.Cancer.2003.477-488页；PersonsDA,NienhuisAW.Genetherapyofhemoglobindisorders.Hematol.Rep.2003.第2巻，348-355页。这些方法的一种吸引人的替代方案可能是通过天然同源重组用递送至细胞的无相应突变的DNA模板来修正或置换染色体中的突变基因；然而，使用该方法的早期尝试证明，其效力非常低[YanezRJ，PorterAC.Therapeuticgenetargeting.Genetherapy.1998.V.5，P.149-159;RothsteinRJ.One-stepgenedisruptioninyeast.MethodsEnzymol.1983.第101巻.202-211页。历史上，在酵母中和随后在哺乳动物细胞中开发的用于克服插入诱变问题的基因替换策略着眼于使用线性重组DNA,其末端与靶基因侧翼的区域同源且基因自身被替换为选择标记物[ThomasKR,CapecchiMR.Site-directedmutagenesisbygenetargetinginmouseembryo-derivedstemcells.Cell.1987.第51巻.no.3.503-512页。这种类型的基因靶向被称作"末端-夕卜部(ends-out)"，因为构建体的末端对应于位于靶基因外部的两段染色体DNA序列。该末端-外部基因靶向构建体的末端是可产生重组，并增强局限在末端同源性之间的基因序列替换。最近已证明，用异源序列替换完整的酵母基因时，或通过该方法取代单个碱基对时，该过程通过两个独立的链侵入开始，这意味着由治疗构建体的两条末端区段进行同源性搜索和重组事件。HR的主要条件是作为双链末端来源而递送的线性形式治疗性DNA。环形形式的治疗性质粒基本不参与同源交换。DSB的产生和DNA分子双链末端的形成局部激活并加强染色体及染色体外重组以及基因乾向[KucherlapatiRS，EvesEM，SongKY,MorseBS，SmithiesO.HomologousrecombinationbetweenplasmidsinmammaliancellscanbeenhancedbytreatmentofinputDNA.ProcNatlAcadSciUSA.1984.第81巻，3153-3157页。《自然》中最近的公开内容[UrnovFD，MillerJC，LeeYL，BeausejourCM,RockJM，AugustusS，JamiesonAC,ProteusMH,GregoryPD,HolmesMC.Highlyefficientendogenoushumangenecorrectionusingdesignedzinc-fingernucleases.Nature.2005.第435巻.646-651巻报道了使用这一原则来诱导IL2R基因的修正，该基因中外显子5中的点突变引起与X染色体连锁的致死性遗传病——重症联合免疫缺陷(SCID)。该作者通过用遗传构建体和质粒转染细胞而证明了高(高至20。/。)水平的基因修正，所述遗传构建体表达合成的锌指核酸酶，所述锌指核酸酶能够特异性切割基因组DNA中IL2R基因突变附近的序列，所述质粒带有覆盖SCID突变区域的相同基因的非突变片段。据推测，HR极高效地进行基因修正的根本能力与从核空间内游离双链DNA末端出现开始的过程相关，这与这些末端的来源无关——无论它们是由于DSB而形成的断裂染色体的末端，还是递送至核并具有型末端-外部结构的DNA片段双链末端。任何这样的未经修饰的基因组DNA片段都是典型的末端-外部构建体所述基因组DNA片段的两端与染色体DNA的两段序列同源，且中间部分能够取代相应的基因组片段并修正突变。这意味着片段末端会开始搜索同源性并与基因组DNA进行HR，这会导致基因组DNA片段被替换为从外部空间递送至细胞的片段的中间部分。使用遗传修正的外源DNA时，这些事件会导致遗传缺陷的《务正[YakubovL，PopovaN，NikolinV，SemenovD，BogachevS,OskinaI.ExtracellulargenomicDNAprotectsmiceagainstradiationandchemicalmutagens.GenomeBiology.2003.第5巻.3页。可能影响HR效率和修护缺陷的染色体基因座的另一重要时刻是当SC和其他分化细胞进入分化途径时在其中观察到的基因组打开现象；这一现象被若干研究小组发现，但尚未得到足够的重视[FarzanehF，ZalinR,BrillD,ShallS.DNAstrandbreaksandADP-ribosyltranferaseactivationduringcelldifferentiation.Nature.第300巻.362-366巻；JohnstoneAP，WilliamsGT.RoleofDNAbreaksandADP-ribosyltransferaseactivityineukaryoticdifferentiationdemonstratedinhumanlymphocytes.Nature.第300巻.368-370巻；VatolinAY,OkhapkinaEV,Matveeva匪，ShilovAG，BaiborodinSI，PhilimonenkoVV，ZhdanovaNS,SerovOLScheduledperturbationinDNAduringinvivodifferentiationofmouseembryo-derivedcells.Mol.Reprod.Develop.1997.第47巻.1-10页。在研究核糖基转移酶活性时，在分化细胞的染色质中观察到大量SSB的产生，提示遗传材料与再造相关，所述再造是分化和随后基因表达改变中必要和内在的部分。在相同个体的不同组织中，观察到染色质再造后由产生的SSB或DSB所引起的遗传材料的不同组织化(organization)。分化细胞每个单倍体基因组中的断裂数在多篇文献中被评估为数百个(每个单倍体基因组中100-300个断裂)。还证明了该现象不是修复系统的缺陷；更确切地，这是细胞终末分化中必需和必备的步骤。例如，当细胞具有最大固有断裂时通过硬辐射在细胞中引入约600个额外的断裂时，这600个断裂的修复率与非分化细胞中相同。然而，断裂数降至最初水平。对本发明的本质来说重要的是，在终末分化和产15生染色质断裂时基因组中的重排数显著增加。具体地，已经证明在前植入周期中(即染色质再造时)姐妹染色单体断裂率高出5-6倍，并观察到功能性染色质断裂。在最初三次有丝分裂中，当观察到可观的基因组再造时也发生其他重组事件，特别是小卫星序列(minisatellite)的重排和简单重复链的伸展。基因组中这些改变的推定机制是同源重组。尽管如此，所有这些事件中的第一步是染色质DNA中功能性断裂的产生。据推测，在最初三次SC有丝分裂的基因组再造期间，核空间内存在治疗性片段化DNA时，治疗性DNA的胞外外源片段与可进入的SC染色质区域之间发生HR，该HR导致缺陷基因座的修复。这就是挽救SC免于死亡的事件。在该过程中，恢复了SC发生一系列连续有丝分裂并确定终末分化方向的能力。另一方面，递送至核空间的胞外DNA片段其DSB模拟了BSC染色体中功能性断裂的产生，所述断裂是BSC终末分化的诱导物。位于BSC细胞内的胞外DNA片段的这种模拟作用触发细胞分化机制，并激活和维持定向的BSC分裂。所述的技术问题已被解决，因为其基于胞外DNA在体内更新的先进理论概念，这已被大量实验验证。下文中我们阐明了真核生物中胞外DNA更新概念的主要原理。率含有突变序列)由于程序性细胞死亡或凋亡而形成，并总是存在于细胞间隙和血浆中[AnkerP,MulcahyH,ChenXQ，StrounM.DetectionofcirculatingturnoverDNAintheblood(plasma/serum)ofcancerpatients.CancerMetastasisRev.1999.V.18.P.65-73;GiaconaMB,RubenGC，IczkowskiK，RootsT，PorterD，SorensonG.Cell-freeDNAinhumanbloodplasma:lengthmeasurementsinpatientswithpancreaticcancerandhealthycontrols.Pancreas.1998.第17巻.89-97巻]。细胞能够通过受体介导的机制吞噬所形成的DNA或染色质片段并将这些片段转运至细胞核[YakubovLA,DeevaEA,ZarytovaVF，IvanovaEM,RyteAS,YurchenkoLY,VlassovVV.Mechanismsofoligonucleotideuptakebycells:InvolvementofspecificreceptorsProcNatlAcadSciUSA.1989.V.86，P.6454-6458;ShestovaOE,AndreevaAY，VlasovVV，YakubovLA.Transportofcomplexesofoligonucleotideswithcell-surfaceproteinstotheceiinucleus.DoklAkadNauk.1999.第368巻.264-267页.俄文。所递送的片段在核中通过HR机制与基因组DNA重组，并能够自身起始该过程。据推测，这三种过程的组合构成了能够通过在细胞中修正突变或诱导遗传改变而在整个生物水平上控制体细胞遗传状况的机制，其中包括组织液和血浆的细胞外DNA作为外部基因组标准。该机制能够形成生物细胞基因组完整性的背景。在细胞外DNA标准的突变序列的帮助下，该机制能够消除出现的和固有的突变以及插入突变。如果该机制能够使用几乎不含有害突变的DNA标准，则其唯一功能将是从体细胞中消除突变。因为等位基因通常是高度同源的并且经常在改变序列的相对小区域中存在差异，所以该推定机制功能的另一方面可能是用替代性序列替换染色体中等位基因的序列，与用非突变序列取代突变变体相似。所述技术问题还通过以下方式解决将个体的完整基因组作为一组多核苷酸分子(其为基因组DNA的片段)引入生物中，在生物中循环、被SC吞噬并到达核，在核中沉积并在BSC基因组再造期间参与与细胞基因组DNA的HR,所述再造伴随着生理学SSB的产生。因此，通过将完整基因组作为一组多核苷酸分子引入生物中来提高修正SC中所存在遗传缺陷的可能性，所述多核苷酸分子是不含遗传缺陷的基因组DNA片段。所提出的方法意味着使用基因组DNA片段，所述片段包含与核基质蛋白相关联的生理学和遗传健康的个体的完整基因组。外源片段的大小符合受治生物血浆中由于凋亡的核溶解而出现的循环片段的大小(1-30个核小体单位)。在原型方法中，使用与RNA分子组合的异种DNA。这种DNA不是密切相关的，不与核基质蛋白相关联，并且不符合生物的天然细胞凋亡DNA的大小(1-30个核小体单位)。在使用实验室小鼠品系的实验中研究了所提出的疾病治疗方法的这些独特特征(体内)，所述治疗是基于BSC应答于片段化DNA制剂的能力。在使用分离的人SC的实验中研究了所提出疾病治疗方法(体外)，所述治疗是基于BSC应答于片段化DNA制剂的能力。在使用小鼠(体内系统)的实验中研究了致死接触硬辐射后血细胞生成的恢复、BSC修护和因此导致的小鼠免于死亡。我们实施了一组实验来研究不同照射剂量下片段化DNA制剂的保护效应。存在早期的经典实验，其中被致死照射的小鼠(该小鼠丧失其自身的造血细胞)接受骨髓悬浮液或富含BSC的级分。在该注射后，由供体BSC后代形成的细胞集落在脾中发育。脾中的每个BSC形成一个集落，称作脾CFU。增殖活性受集落刺激因子和白介素调控。集落计数使得有可能评价通过输注递送至血流的CS数量。因此，已发现，每105个骨髓细胞中存在50个SC;每105个脾细胞中存在3.5个SC;每105个血液白细胞中存在1.4个SC。用电子显微镜对纯化BSC的研究证明，其超微结构中的BSC与小暗淋巴细胞(smalldarklymphocyte)类似。对脾集落细胞组成的研究检测到了所研究SC的两种分化谱系。一种镨系产生多能细胞，其为粒细胞、红细胞、单核细胞和巨核细胞造血谱系的祖先(CFI-GEMM)。第二种镨系产生多能细胞，它是淋巴细胞形成的祖先(CFU-L)。根据本文提出的理论概念，这些实验的结果也可能是由于存在于所引入BSC样本中的胞外DNA的效果，和由于活SC整合进淋巴器官中以及脾中的集落形成。该DNA遗传上对应于健康BSC的基因组，其对受损的内在小鼠SC的作用可导致通过本发明所述的HR机制恢复SC的活力。我们使用分离自小鼠的DNA(同种异体的)或分离自人胎盘的片段化DNA制剂作为治疗剂，在类似的条件下验证了这种假说。材料和方法在实验中使用在细胞学和遗传学研究所的动物育种中心维持和繁殖的三月龄CBA/Lac雌性小鼠；将9-10只小鼠维持在独立的塑料笼中。水和饲料可随意获得。小鼠用标准造粒的PK120-1(Laboratorsnab,Moscow,Russia)喂养并用IGUR-1(Russia,137Cs)y-辐射单位照射。进行了四个实验。在前三个实验中，测试了不同剂量和不同来源的DNA。在照射之前和之后对小鼠腹膜内施用来自CBA小鼠器官的DNA或人胎盘DNA。记录各组中小鼠的寿命。在实验4中，在暴露于亚致死辐射剂量的小鼠中评价人胎盘DNA18对BSC的效果。这些小鼠在照射前腹膜内接受人胎盘DNA。在第10天处死小鼠以计数脾造血集落数。骨髓是一种对辐射敏感的组织，因此暴露于，辐射的BSC死亡。推测外源DNA通过进入细胞并参与^f务正而允许BSC存活。被修复的BSC迁移至淋巴器官(如淋巴结、脾和胸腺)中定居。这进一步促进血细胞生成恢复和小鼠存活。实验l以9.6GR(1.4GR/min)的剂量照射小鼠。在照射前30分钟，10只小鼠(带标签的)腹膜内接受1mg从CBA小鼠器官中分离的DNA(第2组)。剩余的小鼠在照射后被随机分为三组。第1组小鼠在照射后30分钟和接下来的2天中腹膜内接受生理盐水溶液(0.2mL)。第3组的小鼠在照射后30分钟接受CBA小鼠的DNA(1mg,在0.2mL生理盐水溶液中)，并在接下来的2天中每天额外接受0.5mgDNA第4组的小鼠根据相同的时间表接受从人胎盘分离的DNA。图1显示暴露于致死剂量的Y-辐射后，小鼠和人DNA制剂对小鼠存活率的作用的数据。实验2以9.5GR(1.3GR/分钟)的剂量在Y-单位(""Cs)中照射小鼠。一组小鼠(n-10)腹膜内接受分离自CBA小鼠的DNA:暴露前20分钟l-2mg,暴露后30分钟、24h和48h为初始剂量的1/2。对照组根据DNA施用的时间表以0.2mL的剂量腹膜内接受生理盐水溶液。图2显示在暴露于致死"辐射剂量之前和之后腹膜内施用给小鼠的同种异体DNA的防辐射作用的特征。实验3以9.5GR(1.3GR/min)的剂量在Y-单位(i"Cs)中照射小鼠。对照小鼠(n=IO)在暴露前10分钟和暴露后30分钟、24h和48h腹膜内接受0.2mL生理盐水溶液。在照射前20分钟(lmg)和照射后30分钟、24h和48h(0.5mg)施用人胎盘DNA制剂。分离自小鼠的DNA才艮据类似的流程施用。图3显示在致死，辐射之前和之后腹膜内施用给小鼠的同种异体DNA的防辐射作用。实验4CBA小鼠(n=20)以800R(8.21Gy)的剂量暴露于y-辐射。对照小鼠(n=IO)在辐射前腹膜内接受1mg人胎盘DNA,并在暴露后30分钟额外地接受0.5mgDNA,在暴露后第2天接受0.25mg，第3天接受0.17mg。对照小鼠(n=IO)根据相同的流程接受生理盐水溶液(0.2mL)。第10天，处死动物以测定脾造血集落的数量(表l)。表1.与未处理的对照相比，暴露于与亚致死辐射剂量组合的外源DNA疗法的小鼠中形成的脾集落数量。对照小鼠00000111120.6±0.22处理小鼠001345924303310.9±4.09尽管处理组中样品尺寸小并且脾集落数量广泛变化，但是样品之间的差异在p>0.95水平上是显著的。与对照相比，腹膜内DNA施用后脾集落平均数提高18倍。所施用DNA的效果是特异性的，因为其在具体的个体中发生或不发生。令人鼓舞的是，50%的处理小鼠对处理呈阳性应答(图4)。因此，对小鼠施用同种异体DNA和异种人胎盘DNA允许动物在致死剂量照射后存活；即特殊处理的片段化DNA与核基质蛋白组合显示了显著的防辐射作用。观察到的实验动物存活与DNA制剂作用提供的BSC活力保留和随后小鼠脾中内源集落的形成相关。实验中个体敏感性(关于活力和CFU-S计数)的变化很可能与治疗性DNA是否在产生功能性断裂时递送至BSC有关，所述功能性断裂表示CS转换进入终末分化。在实验分离的人sc(离体)中研究了所提出的疾病治疗方法中所述对BSC应答片段化DNA制剂能力的利用。成血细胞增多(hemoblastosis)患者的骨髓SC是研究片段化DNA制剂的治疗和再生特性的非常便利的对象，所述骨髓SC由于骨髓的白血病化(leukemization)和暴露于高剂量常规的使用细胞生长抑制剂的化学疗法而受损。这是根据以下原因确定的SC—方面能够产生所有造血谱系，另一方面能够维持其定量和定型的组成稳定性而无任何外部流入。另外，SC自我再生和分化的机制同时也是控制造血细胞总体库中动态平衡的机制。在成血细胞增多中，SC内稳态的基本机制被破坏，其内在原因由原发性遗传缺陷(引起恶性成血细胞增多的发生)及其遗传机器的次发损伤(与使用的高剂量细胞生长抑制剂治疗相关)的同时存在来具体确定。基于上文概述的信息，本研究的目的是确定常规的化学疗法后，成血细胞增多患者中片段化人DNA制剂对单核细胞增殖活性和骨髄造血干细胞分化的调控效用。这一工作阶段的主要目标是离体评价人外源DNA对以常规综合化学疗法治疗的成血细胞增多患者中骨髓细胞的多种功能参数的影响。这一研究阶段的内容包括通过造血SC来研究片段化DNA制剂对骨髓单核细胞增殖活性和造血集落生成的作用。结果本研究的对象是骨髓的单核细胞(MNC)。通过使用Ficoll-Verografin密度梯度(p二1.078g/cm3)从骨髓抽吸物中分离MNC级分。实验组由lO名第二列(second-line)常规化学疗法后的成血细胞增多患者组成。在使用细胞生长抑制剂的常规高剂量疗法后，在患者的计划诊断检查期间通过进行环钻活检对骨髓取样。骨髓的环钻活检在俄罗斯医学科学院西伯利亚分院临床免疫学研究所免疫学诊所的血液学和移植专科进行(表2)。表2.骨髓MNC的表征患者MNC产量(106/mL)CD34+(%)V画kin2.43.16G画k2.83.24L隱v5.14.35P國na2.84.26Sh-ra4.82.60D画va2.045.63K-n2.163.44K画ch8.04.94K-va3.81.71Kol画va1.73.87供体M画va9.752.52S誦va2.662.47P-va8.92.58Ch-va4.662.09Sh-ko20.05.99Z國i15.03.47S-v16.83.02在活检后，将骨髓样品悬浮于含5。/。胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中。为了获得MNC级分，将该悬液在Ficoll-Verografin密度梯度上分层并以400xg离心30分钟。收集含MNC的界面条带并用含5%FBS的RPMI-1640培养基通过以200xg离心10分钟来洗涤三次。第三次离心后，用含20%FBS的RPMI-1640培养基代替上清液。将最终的MNC浓度调节为每1mL营养培养基中1x105个有活力的细胞。在冷冻稳定剂(二甲基亚砜)存在下使用常规细胞冷却将从部分患者中分离的骨髓MNC冷冻至-80'C。将冷冻的细胞储存于-80'C直到使用，但是不长于2个月。在实验前解冻细胞并用含5%FBS的RPMI-1640培养基洗涤三次。重悬沉淀物后，对于天然骨髓细胞的情况，将有活力的MNC的浓度调节至每1mL完全营养培养基中1x105个细胞。22评价了片段化人外源DNA制剂对骨髓MNC增殖活性的影响。用于评价外源DNA对MNC有丝分裂活性影响的模型是其增殖强度。在使用标准技术测试自发和诱导增殖活性测试中评价骨髓MNC的增殖活性。使用抗CD3单克隆抗体诱导骨髓MNC的增殖。以一式三份对与片段化DNA赙育(实验)和未孵育(对照)的MNC进行测试。在培养的第3天在96孔免疫平板中测试增殖活性。根据掺入增殖细胞DNA的3H-胸苷来评价细胞增殖强度。增殖活性表达为每分钟的计数(countsperminute,cpm)。表3和4中证实了显示片段化外源DNA对自发及(使用抗CD3单克隆抗体)诱导增殖影响的结果。明显地，在与DNA预孵育1小时后，骨髓MNC的有丝分裂活性明显降低(p<0.05)。注意不仅在以抗CD3单克隆抗体进行额外增殖刺激的情况下中记录到这一现象，对于富含造血前体的MNC的自发有丝分裂活性也是如此.基于算出的影响指数(II)(其表征实验中细胞增殖强度相对于对照的改变)，用外源DNA处理后骨髓MNC的有丝分裂活性水平降低了约4倍，不高于成血细胞增多患者中其最初水平的30%(14-35%),所述影响指数。表3.片段化外源DNA对骨髓MNC自发增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注MM,多发性骨髓瘤；FI，新鲜分离的细胞；TF，解冻的冷冻细胞；II，DNA影响指数。表4.片段化外源DNA对骨髓MNC刺激增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注MM,多发性骨髓瘤；FI,新鲜分离的细胞；TF，解冻的冷冻细胞；II,DNA影响指数。因此，得到的结果证明了外源DNA对骨髓MNC(包括造血干细胞)增殖状态的活跃的独特影响。现在讨论获得的结果，我们从SC库自持续的公知机制开始继续，所述机制在每个单位时间中诱导一定数量的静息SC分化而不分裂成特定的造血元件——红细胞、粒细胞-巨噬细胞和其他造血镨系的定向前体。分化继而在相同数量(每单位时间)的休眠细胞中引起"兴奋"。"兴奋，，的细胞从GQ期开始进入有丝分裂循环，并且不能分化直到完成分裂。分裂后，子细胞再次回到G。期，补充可能既能够分化又能够回到有丝分裂周期的细胞组。这些基本机制在成血细胞增殖期间被破坏；因此观察到恶性转化造血细胞的失控增殖，不能正常分化。另一方面，掺入细胞的标记胸苷的量表征了给定时刻的分裂细胞分数，即实际上它反映了活跃的、"兴奋的"、处于有丝分裂状态并且不能分化的SC的量。因此，在用外源DNA处理后骨髓MNC有丝分裂活性的明显降低提示处于静息状态(Go期)的SC分数发生改变(提高)；静息的SC变得能够分化形成定向的特定造血元件。SC的这种失活是由制剂Panagen对已发生恶性转化的细胞中染色体遗传基因座的影响引起的。在该过程中，如我们的另一个发明中所证明的[2006年1月16日的俄罗斯专利no.2313349，其内在机制可以与非突变染色体基因座对突变染色体基因座的取代相关；相应地，恶性转化的细胞部分或完全丧失其恶性状态。可以通过评价骨髓单核级分中含有的造血干细胞的分化改变来检验这一假说。下文是人片段化外源DNA对骨髓造血干细胞分化的影响的评估。半液体培养基上红细胞和粒细胞-巨噬细胞集落形成的方法是研究造血SC分化的模型[PluzniikDH，SachsL.Thecloningofnormal"mast,，cellintissueculture.J.cell.Comp.Physiol.1965.V.66.P.319;BradleyTR，MetcalfD.Thegrowthofmousebonemarrowcellinvitro.AustJExpBiolMedSci.1966.第44巻.287-299页。已经使用染色体标记证明了，一个集落的细胞是从单个祖细胞发育而来。另外，通过将原代红细胞或粒细胞-巨噬细胞集落转移到新的培养基上获得相同类型次代集落的可能性证明，体外集落生长的来源是定向的造血干细胞[MetcalfD,FoesterR.Behaviorontransferofserumstimulatedbonemarrowcolonies.ProcSocExpBiol.1967.第126巻.758页。因此，在半液体培养基中生长的集落数一方面表征了能够定向成为特定造血元件的SC总数，另一方面表征了该分化的方向，如可通过不同类型的造血集落的比例来评价。由片段化DNA制剂诱导的有丝分裂活性改变能够以不同的方式影响SC定向成为红细胞和粒细胞-巨噬细胞造血镨系的能力。具体地，这通过以下事实来确定定向生成红细胞的前体的天然有丝分裂活性与其他定向前体显著不同。在整体前体库中，仅10%的SC合成DNA，而75。/。的定向的红细胞生成素敏感性元件合成DNA。因为红细胞生成素敏感细胞中的大部分处于有丝分裂周期中，这提示由外源DNA引起的骨髓MNC增殖活性改变可能首先和最主要地改变定向为红细胞生成的SC数量[LajthaLG,SchofieldR.Proliferativecapacityofhemopoieticstemcells.In:Sympos.onNormalandMalignantCellGrowth:NewYork.1969.10页。下文是人片段化外源DNA对红细胞集落形成的影响的评估。使用含曱基纤维素的半液体培养基来培养和计数定向为红细胞生成的功能性活性造血SC,所述培养基补充了红细胞生成素、重组白介素-3以及红细胞增殖和分化的若干其他诱导剂[Gol，dbergED，DygaiAM,ShakhovVM.Cellculturemethodsinhematology.TomskUniversityPress,Tomsk,1992.272页.俄文。在这一研究阶段，我们仅使用冷冻的骨髓MNC。将MNC解冻、如上所述洗涤，并分为两个等分试样。在实验系列中，将骨髓MNC在37。C与外源DNA预孵育1小时，所述外源DNA以100jtg/mL的剂量添加进孵育混合物中。在对照中，以相同的量添加细胞孵育培养基。预孵育完成时，以lxl()5个有活力CD34+细胞的量将MNC不经洗涤地转移至半液体培养基，并以0.25mL/孔(0.25xl()S个细胞/mL)的剂量倒入24孔平板中。用片段化DNA孵育(实验)和未用片段化DNA孵育(对照)的细胞在四个重复(4个孔)中测试，总计含有lxl()S个骨髓MNC。将平板在37'。和100%湿度的<:02培养箱中培养8-14天。在第8和14天动态评价红细胞集落数并记录。将这样的细胞聚集体视为红细胞集落(红细胞增强集落形成单位，BFU-E):在培养期间形成，含有超过IOO个处于不同成熟程度或组(高达50个细胞)的小相邻细胞(smallneighboringcell),并具有红细胞元件特有的形态学性状。对于每个被研究的患者，将第8天和第14天的红细胞集落计数结果作为四个孔中生长的集落数范围在表5和表6中列出。表5.人片段化外源DNA对骨髓MNC培养的第8天时红细胞集落数的影响患^"诊断集落数(每0.25x105个细胞)，对照集落数(每0.25x105个细胞)，实验V國kin淋巴20^080-100G-ik淋巴庙2545卯一IIOLrshev飛LGM*无30—50P國inaLGM*20—3565-90Sh-era无32-54*LGM，淋巴肉芽肺病。表6.人片段化外源DNA对骨髓MNC培养的第14天时红细胞集落数的影响患者诊断集落数(每0.25x105个细胞)，对照集落数(每0.25x105个细胞)，实验V-kin淋巴60-85>150G-ik淋巴癌65-80>150L國shev/田Absent80-100P-inaLGM*52—60>150Sh画eraLGM*2-562-64LGM,淋巴肉芽肺病。从表5和表6中所列定量特征中可以看出，在用外源DNA预孵育MNC后，产生的红细胞集落数以统计学显著(p〈0.001)的方式提高。另外，用片段化DNA制剂处理所诱导的形成红细胞集落数的增加在早期时间点(培养的第8天)最具说明性，此时实验中形成的红细胞集落数的增加超出对照组中数目的三到四倍和更多。因此，这些数据确定地证实了所推测的外源DNA对BSC定向为红细胞分化的能力的刺激效应。另一方面，考虑到高剂量化学疗法后患者中红细胞集落数的强烈增加在培养的早期时间点发生，我们可以推测外源DNA的作用不局限于为对有丝分裂周期的影响，而是也涉及其他机制。27推测的机制之一是外源DNA参与被细胞生长抑制剂损伤的CS遗传机器的修复。根据本研究的结果，可在五个检查的骨髓MNC样品的-丄、jn人,jAA/、山掩.w'laL、、広n、丁▲类f^7。p盆ixiAci/夂智甘士A鹏cb玉7T(4uyo)T禪观'J7i，鄉ial、a夢巧j。l丞pj-且修及，头T杜可照甲完全不能观察到红细胞集落发育的背景下观察到用片段化DNA孵育后SC分化为红细胞前体的能力的恢复。因此，在红细胞集落形成的模型中，在40。/。的情况下人片段化DNA制剂对受损的造血前体的作用具有定性而不是定量的特征，这很可能由外源DNA整合进CS遗传机器中来介导。提示外源DNA整合进CS基因组的其他间接数据是在与人片段化DNA预孵育后形成的红细胞集落的特定形态生理学特征。具体地，注意到与对照孔相比，实验孔中不成熟的BFU-E集落占优势(70-90%)。BFU-E的形成是在常规细胞生长抑制化学疗法后从成血细胞增多患者中分离的原始干细胞前体中不典型的年轻高活性SC特征(<5-10%)。红细胞集落形成模型的缺点在于不能够分析不同造血镨系之间的复杂竟争性相互作用，其中骨髓SC不仅能够显著地改变其分化模式，而且能够显著地改变对多种调节和恢复因子应答的程度。考虑到这一点，在研究片段化DNA制剂效应的下一阶段，我们使用了更复杂的模型来评价SC的功能状态，即红细胞和粒细胞-巨噬细胞集落共同培养的模型。下文是人片段化外源DNA对红细胞和粒细胞-巨噬细胞集落共形成的影响的评估。为了同时研究红细胞和粒细胞-巨噬细胞定向干细胞的分化，我们使用了完全MethoCultH4434(StemCellTechnology,Canada,目录号04434)甲基纤维素培养基。完全甲基纤维素培养基H4434含有广泛的生长因子组。除了含有红细胞生成素和白介素-3以外，该完全培养基还含有干细胞生长因子(SCF)、粒细胞-巨噬细胞生长因子(GM-CSF)以及维持定向干细胞增殖和分化的其他生物学活性组分。在四组实验中使用从常规细胞生长抑制剂疗法后的成血细胞增多患者的骨髓中分离的MNC进行研究。实验方案和实验(即用人片段化DNA制剂预孵育MNC1小时后)及对照中骨髓MNC的浓度与研究定向前体的红细胞分化时使用的(见前一部分)相同。唯一的区别是研究红细胞和粒细胞-巨噬细胞集落形成时不仅使用冷冻的MNC，而且使用新分离的MNC。在37'C的温度下含5%C02的潮湿气氛中完成14天的孵育后，使用显微镜鉴别并计数粒细胞-巨噬细胞(CFU-GM)、红细胞(BFU-E)和混合集落(即含有两种类型细胞元件的集落(CFU-GEMM))。表7中展示了对形成多种类型集落的定向SC进行计数的结果。用外源DNA处理MNC后形成的造血集落数量中的显著差异分别用(+)和(-)标记，表示实验中特征相对于对照的提高或降低。表7.人片段化外源DNA对骨髓MNC分化为红细胞和粒细胞-巨噬细胞集落的影响诊断*细胞*系列集落数(每1.0x105个细胞)总数BFU-ECFU画GMCFU-GEMM淋巴瘤TFDNA-3311210DNA+78+38+40+0MMFIDNA-5430240DNA+5412_42+0ALLFIDNA-220116968DNA+20082_8830+MMFIDNA-8232500DNA+643028_6+注MM，多发性骨髓瘤；ALL,急性淋巴细胞性白血病(lympholeukemia);FI，新分离的细胞；TF，解冻的冷冻细胞。29这些结果证明，只有当使用解冻的冷冻骨髓细胞时，才观察到在外源DNA存在下形成的两种红细胞和粒细胞-巨噬细胞类型集落总数统计学显著的2-3倍增加，所述解冻的冷冻骨髓细胞最初显示低集落形成细胞数。这证实了之前对外源DNA可能参与缺陷恢复的推测，所述缺陷不仅由常规的化学疗法引起，而且也由骨髓干细胞前体的冷冻引起。考虑到冻存的干细胞在治疗血液疾病和许多其他疾病中的广泛应用，后一事实不仅具有纯粹的科学意义，而且也具有可观的应用价值。从这种观点看来，与核基质蛋白复合的人片段化外源DNA可以视为提高冻存后具有功能活性的SC数的有前途的新制剂，具有明显的授予专利的潜力。人片段化DNA制剂对新分离SC的影响更难于判读。然而，从我们的研究结果可以看出，所研究的DNA毫无疑问地影响SC分化。这表现为定向发育成红细胞(BFU-E)或粒细胞-巨噬细胞(CFU-GM)集落的前体的选择性竟争性增加/减少，以及形成混合性造血集落(CFU-GEMM)的不成熟干细胞前体数量的增加。任何细胞分化都是整个细胞基因组的重大再造，这时多能细胞选择其特定的特异性发育途径。所发现的现象可以视为胞外外源DNA活跃参与BSC起源的直接证据。为了实现所提出的疾病治疗方法，我们给出计算在人血浆和间质流体中创建等于或高于自身血浆DNA浓度(但是不高于1500ng/mL)的DNA浓度范围所需的DNA制剂用量的一个实例。已知主要的自由循环体液量由5-6L(人体重的1/10-1/12)的血体积和1-2L的淋巴体积组成。因此，成人体内自由循环的流体总量为6-8L。能够施用于患者而对其机体无明显和隐含损伤的片段化DNA制剂的最大量为约9mg;注意DNA制剂的最小治疗量为0.06mg。权利要求1.基于将片段化DNA引入患者体内来治疗疾病的方法，其特征为所述片段化DNA是同种异体的，得自在遗传和生理上健康的供体，并由长度对应于1-10个核小体单位的片段组成，所述片段与核基质蛋白组合组成患者全基因组，所述片段化DNA以在患者血浆中的浓度等于或高于自身血浆DNA浓度但不高于1500ng/mL浓度的量施用。全文摘要本发明涉及医学领域，尤其涉及使用含遗传材料的制剂对患者进行治疗的方法，其可用于治疗与染色体缺陷相关的血细胞生成受损以及与由使用细胞生长抑制剂或高剂量辐射的疗法所引起的后续血液干细胞(BSC)死亡相关的血细胞生成受损；该细胞生长抑制剂或高剂量辐射施用于治疗与血液干细胞朝向特定造血元件分化而不分裂的基本机制受损相关的疾病，所述损伤在由造血细胞恶性转化所导致的成血细胞增多(hemoblastoses)中发生，所述转化使得造血细胞不能正常分化，并引起其失控的增殖；以及用于治疗与干细胞(SC)中染色体异常相关的疾病，其治愈需要在机体内出现遗传上、表型上和生理上健康的干细胞。本发明方法使得有可能扩展应用领域，其包括将片段化DNA注射进患者机体内，其中所述片段化DNA是同种异体的，并且由长度对应于1-10个核小体的片段组成，该片段与核基质蛋白组合构成患者的整个基因组，其中所述片段化DNA的量选择等于或高于患者血浆和组织液DNA的量，但不高于1500ng/ml。文档编号A61K48/00GK101495157SQ200780028304公开日2009年7月29日申请日期2007年1月11日优先权日2006年7月27日发明者亚历山大·根纳迪维奇·希洛夫,内莉·亚历山德罗芙娜·波波娃,列昂尼德·阿纳托列维奇·雅库博夫,叶夫根尼·利沃维奇·格尔夫加特,叶连娜·雷莫夫娜·切尔内赫,塔玛拉·叶戈罗夫娜·塞贝莱娃,奥克萨娜·维亚切斯拉沃夫娜·夫拉茨基赫,弗拉基米尔·阿莱克谢耶维奇·罗加乔夫,柳德米拉·瓦西里耶芙娜·梅凯蒂娜,瓦列里·彼得罗维奇·尼科林,米哈伊尔·阿尔卡迪维奇·舒尔多夫,纳塔利娅·谢尔盖耶夫娜·日丹诺娃,谢尔盖·尼古拉耶维奇·谢廖金,谢尔盖·斯坦尼斯拉沃维奇·博加乔夫,阿纳斯塔西娅·谢尔盖耶夫娜·利哈乔娃申请人:米哈伊尔·阿尔卡迪维奇·舒尔多夫