专利名称：：用于肺和上呼吸道疾病治疗的吸入用抗氧化剂的脂质体组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物和药理学，特别是涉及生产可用于肺和上呼吸道疾病的脂质体组合物。
背景技术：
：通常，生物膜的磷脂的过氧化緩慢地发生，因为组织中有几个体系保护免于发生氧化，并且所述体系调节氧化过程。这些体系之一为小分子的氧化抑制剂，即，抗氧化剂。在肺中，抗坏血酸、尿酸、硫辛酸、谷胱甘肽及其前体半胱氨酸作为水溶性抗氧化剂起作用，而维生素E、维生素A及其维生素原胡萝卜素作为疏水性抗氧化剂存在[B.C.Schock，I.S.Young,V.Browb，P.S.Fitch,M.D.Shields,M.Ennis，as^迈af/ccA//i/re"，Pediatr.Res.2003.53(3);375-381〗。在各种病理学的形成过程中，抗氧化剂保护被证明是不充分的，并且磷脂的过氧化的进行比正常情况下快得多。这种现象被称为氧化应激，并且其与如下的疾病相关，如慢性心血管疾病(动脉粥样硬化、心脏缺血、高血压)；外周动脉的闭塞性疾病(obliteratingdiseases);静脉系统的疾病(痒、静脉曲张病和其它疾病)；关节炎；抑郁症；肿瘤疾病的预防。在生物的老化过程中、在吸烟者中和在中毒的情况中观察到氧化的加速。研究已经表明，在吸烟者的肺中发生的局部的氧化应激是呼吸系统器官的肿瘤前(pretumor)形成和赘生性进程的基础。一些组织(例如，脑、视网膜、肺的组织)对氧化应激更加敏感。这是由于它们的特殊的化学结构和代谢。氧化应激被认为在肺损伤的形成过程中起到关键作用，其中肺中的小分子抗氧化剂的浓度降低，而过氧化产物的量增加，特别是表面活性物质的一部分的分解产物的量增加，所述表面活性剂主要是磷脂和蛋白质的表面活性物质。因此，现在将抗氧化剂治疗与化学疗法一起处方用于治疗肺疾病(M.Christofidou-Solomidou，V.R.Muzykantov，J/2〃oua/7f"r"eg/es//7res/7/r"or//je"c2'/7e，TreatRespirMed.2006;5(1):47-78)。然而，氧化应激的形成只是反映了体系中的"活性氧代谢物一抗氧化剂"不平衡的病理学状况的主要因素之一。在需氧生物中，其中涉及所谓的活性氧代谢物的反应连续地进行。有许多证据涉及活性氧代谢物的重要作用，其作用涉及炎症性和破坏性进程、血管抑制和血管渗透性降低、细胞膜脂质过氧化(P0L)的活化、动脉粥样硬化的形成、免疫应答、细胞增殖、感染的恶化等。因此，应用单独的已知的氧化应激校正剂(corrector)仍是不够的，所述已知的氧化应激校正剂诸如例如，维生素E、维生素C、或丁甲酚(dibunol)，必须将活性氧代谢物的毒性作用中和掉。此外，在开发用于治疗肺疾病的有效制备物时必需要解决另一个问题，其与维生素作为抗氧化剂的极低生物利用度有关，这是在以前的研究中得到确认的事实。例如，维生素E片剂的生物利用度低到3%[ScottW.Leonard,C.K.Good,E.T.Gugger，M.G.Traber，P7"油6/osm/7s6///0^尸ro迈/"or〃/7ed6re<sir/*<s"ceres/gre"er4f/s/7fAaf尸ro/ze/7cs/^z//<sfei/si7/7p/e迈e/U'2,3，Amer.J.Clin.Nutrition,vol.79，no.1，86-92，2004]。在这方面，必需要考虑到只有3%这么一小部分随血流到达肺中。吸入用于确保药物或致病试剂被更完全地递送到肺中和递送到它们的患处[俄罗斯专利申请93003456]。但是只能借助于超声波吸入器或气动吸入器才能得到到达肺下部的小于l微米大小的粒子，而更大的药滴保留在呼吸道的上部[N.A.Geppe，肠w/，e/T7，//2caseofs^gra7af/oi76ro/2c力/a/asf力/z7a//3cA//dre/7ff，RusskiyMeditsinskiyZhurnalvol.7，no.11，1999，p.505]。在其中可以引入疏水性抗氧化剂的正常的水包油乳剂中，脂肪滴的大小超过lym，并且必需通过添加乳化剂来稳定它们。另一方面，在借助特殊的技术得到磷脂的脂质体时，它们原来是小于lMm大小的粒子。脂质体组合物代表了用于肺病学的最有希望的形式之一。以前，已经通过使用如下物质证明了通过借助超声波吸入器或气动吸入器的吸入所实现的治疗作用-用于治疗支气管津喘和阻塞性支气管炎的蛋的磷脂的脂质体[K.A.Masuev，E.A.Limarenko，A.G.Tchutchalin，jPi/7-節/7o7o^7/Wi;/助/2o7o^7〃人1991，vol.3，p.68-69];-用于治疗应激综合症(distresssyndrome)的得自牛肺的磷脂混合物[俄罗斯专利2149016]已知用于治疗肺结核和绿脓杆菌素炎性疾病(pyoinflammatorydisease)的脂质体组合物，其包括利福平、磷脂、抗坏血酸、ct-生育酚、和等渗的氯化钠溶液(俄罗斯专利2217128)。制问题，即，其提供了某种药物(即，利福平)的有效递送，并且还预防其分解。此外，已经开发了具有两种抗氧化剂的组合物(P.N.Shek，Z.E.Suntres，J.I.Brooks,Z/;^咖es;7z;72Z70力a,/a/7;7"cs〃c>/2S,.a/7〃ojr/^/7"e〃rer/，J".DrugTarget,1994;2(5):431-42,PMID:7704488[PubMed-indexedforMEDLINE])。尤其适用于肺组织损害的用于抑制自由基的脂质体组合物包括选自P-胡萝卜素、维生素E、抗坏血酸、谷胱甘肽、烟酸的至少两种抗氧化剂，和另外的至少一种金属例如Zn、Se、Cr、Cu、Mn，和适合于生成脂质体的天然或合成的磷脂，或者这种磷脂的混合物(美国专利6764693)，可以将所述脂质体组合物作为本发明的最接近的技术方案。然而，所述組合物不是充分有效的。此外，已知其可能出现消极效果(G.W.Comstock，A.J.Alberg，H.Y.Huang,K.N.Wu，A.E.Burke，S.C.Hoffmann,E.P.Norkus，M.Gross,R.G.Cutler,J.S.Morris,V.L.SpateandK.J.Helzlsouer，〃r力er/si:0/deKe/o/7//2g/w2gca"cersssoc/"etf^"力ca/ac/W，CancerEpidemiol.BiomarkersPrev.6:907-916，1997)。
发明内容本发明的目的是要开发用于吸入给药的磷脂的乳剂组合物，其中6粒子(脂质体)即使在长期储存的情况中仍为小于l微米的大小，并且由于各种类型的抗氧化剂的存在而不会被氧化(donotoxidize)。抗氧化剂的組成选择为使得可以以最小的剂量给予单独的维生素，保证抗氧化剂的活性的未被氧化的形式的含量在储存过程中不会降低。为了实现所述目的，提出以下内容1.使用磷脂的混合物来得到乳剂；2.借助于在0.9%氯化钠存在下挤出从乳液得到0.2-0.4jam大小的脂质体，这样确保了脂质体的物理稳定性；3.使用小麦胚油作为以生育酚和类胡萝卜素为代表的疏水性抗氧化剂的来源；4.在制备物中引入黄酮类的抗氧化剂，即二氢槲皮素(dihydroquercetin)55.在通过挤出得到脂质体之前的最初阶段，将疏水性抗氧化剂引入到脂质体中；6.通过将水溶性抗氧化剂(抗坏血酸和N-乙酰半胱氨酸)引入到组合物中确保疏水性抗氧化剂的活性形式的再生；7.借助单独的超声波吸入器或单独的气动吸入器采用制备物的吸入给药。上述所有方案的目的都在于得到具有低剂量抗氧化剂的有效制备物，抗氧化剂不表现出任何副作用(对膜结构的损害)或消极效果(促进氧化)。包封在脂质体中的生物学活性化合物被保护起来免受酶的作用。这样增加了容易在生物学液体中分解的制备物的有效性。化合物逐渐地从脂质体释放，从而实现延长的作用。与常规制备物相比，制备物的脂质体形式的另一个优点包括脂质体与吞噬细胞相互作用并使它们活化的能力(Biomembrany，2000)。这样，局部免疫^皮活化。最后，脂质体是绝对无毒的，因为它们是由代表了天然生物可降解化合物的磷脂组成的。因此，本发明的目的是用于肺和上呼吸道疾病的吸入的抗氧化剂的脂质体组合物，所述组合物提供平均粒度为0.2-0.4|um的脂质体形式的磷脂的乳液，在其膜中引入了类黄酮二氢槲皮素和小麦胚油，其中乳液的水相包含氯化钠和水溶性抗氧化剂抗坏血酸(维生素C)、N-乙酰基-L-半胱氨酸、和苯甲酸钠，各组分的比例如下(重量百分数)磷脂1-20二氢槲皮素0.1-1.1小麦胚油，包含疏水性抗氧化剂生育酚(TP)(维生素E)和类胡萝卜素0.1-1.1抗坏血酸0.04-0.06N-乙酰基-L-半胱氨酸0.1-1，1苯曱酸钠0.12-0.20.9%氯化钠溶液余量pH=6.4±0.5。抗氧化剂的组成。在一种制备物中使用几种抗氧化剂有重要的优点，但是也有缺点。优点在于一些抗氧化剂例如生育酚和抗坏血酸可以互相加强它们的活性。然而，同时，有效性的相互弱化也是可能的，这取决于抗氧化剂的相互作用。这已经表现在模型体系中，例如，对于生育酚和类胡萝卜素[E.B.Burlakova，N.M.Storozhok，N.G.Khrapova，/z^c力e//yea^/〃rao^s/7〃oi:/W"e7/zo^de/"F2'/aw咖7/7Wrc^"/i"力a"〃oh油/^oy//;7ioW^u々f力ea舰.〃Kea/7〃o^油/7"〃入Voprosymedicinskoykhimii1990，vol.36，4thedition,p.72-74]。已知小麦胚油是各种抗氧化剂的来源。根据文献中的证据，已经在小麦胚芽的油中发现以下成分-饱和脂肪酸肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、芥酸、gondonicacid;-单和多不饱和脂肪酸油酸、亚油酸(linolenoicacid)、花生四烯酸；-脂溶性维生素生育酚、类胡萝卜素、麦角钓化醇，生育酚含量最高达1360mg百分率(1360mgpercent);-水溶性维生素叶酸(维生素B9)、泛酸。此外，已经在这种油的组成中发现了卵磷脂、蛋氨酸、和植物甾醇。小麦胚油如此贵重是因为其包含多种生育酚和类胡萝卜素，这些抗氧化剂以一定比例存在，不仅确保了这些成分中每一种的抗氧化作用，而且还强化这种作用。超过945mg百分比的最高量是oc型生育酚。然而，在与自由基相互作用的过程中，oc生育酚被氧化形成为ct-生育酚基自由基并且其抗氧化活性在许多反应的过程中有所降低。与a-生育酚不同，(3-和5-生育酚表现出较小的抗-自由基活性，但是其抗氧化活性较高。将疏水性抗氧化剂引入到脂质体的膜增强了它们的抗氧化活性。对于脂质体来说，生育酚的生物利用度显著更好。再生抗氧化剂活性形式的必要条件。属于多环酚类的抗氧化剂(包含在小麦胚油中的二氢槲皮素和生育酚)阻止脂质通过与过氧化自由基反应而被过氧化和形成苯氧基自由基。因此，制备物中的抗氧化剂的活性形式的浓度降低，但是得到9的氧化形式变为毒性的。另一方面，使用高浓度的脂溶性抗氧化剂例如生育酚是不受欢迎的，因为脂溶性抗氧化剂可以在达到某一浓度时干扰脂质体的结构[R.P.Evstigeeva,I.M.Volkov，V.V.Tchudinova^/o/.肠6層/，1998，vol.15，no.2，p.119-136〗。为了维持脂溶性抗氧化剂的活性形式的浓度，向制剂中添加水溶性抗氧化剂(抗坏血酸和N-乙酰半胱氨酸)来将自由基再生为原始的化合物。抗坏血酸和N-乙酰半胱氨酸(N-乙酰-L-半胱氨酸)的舍量比多环酚的浓度高得多，因此，多环酚的活性形式得到长期保持。在活生物中，由于抗坏血酸的氧化形成的脱氩抗坏血酸被还原为抗坏血酸。N-乙酰基-L-半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的被修饰形式，其是已知的溶粘蛋白剂。乙酰基半胱氨酸的重要的优点在于其抗氧化活性。N-乙酰基半胱氨酸是一种最重要的抗氧化保护组分(即，谷胱甘肽)的前体，谷胱甘肽对于呼吸系统有保护作用并且抑制氧化剂的破坏作用。所述性质对于其中氧化进程显著更强和血浆的抗氧化作用较弱的老年患者尤其重要。然而，直到现在，在单独给药的情况中，需要600-1000mg的相当高的剂量，并且这可能会引起不受欢迎的副作用，特别是对于血管的影响。所述组合物配制为使得在一方面每种单独的组分都只是产生抗氧化活性，而另一方面所有抗氧化剂的活性形式得到保持。优选实施方式以下描述被包含在制备物制剂中的抗氧化剂的化学结构，并且提供了研究结果来支持要求保护的组合物的抗氧化能力。制剂中的几种类型的水溶性和脂溶性抗氧化剂的组合可以具有出乎意料的结果，例如其可以导致脂质的过氧化增加。这与抗氧化剂之间的相互作用可能是协同作用(即，它们互相增强它们的作用)或是竟争作用(即，它们互相抑制其作用)有关。本发明的组合物代表了最有效的混合物，即，最能够抑制脂质体形式的磷脂发生过氧化的混合物。可以通过以下实施例说明本发明用于吸入的脂质体组合物(制备物"Pulmo-aktiv")的制备实施例1.疏水相的制备1.1将25g的天然或合成磷脂的干混合物装入容积为2ml的玻璃杯中。混合物的主要组分必须是磷脂酰胆碱(PCh)。有少量的磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)也是可接受的。中性磷脂和脂肪酸的浓度不能超过5%，溶血组分(lyso-component)的浓度不能超过1%。在本实施例中，4吏用了Lipoid公司(Germany)的大豆磷脂混合物，比例为1:3的S-73型和S-45型，即，6，25g的S-75和18,75g的S-45。1.2.添加25g乙醇。1.3.向磷脂和醇的混合物中添加1g小麦胚油。将玻璃杯置于摇动装置中2-4分钟，以便将油与醇和磷脂混合。1.4.通过将5g醇倾倒在包含1g二氢槲皮素的容积为20ml的玻璃杯中并且通过在5(TC緩慢搅拌得到溶液，来制备二氢槲皮素的醇ii溶液。1.5.将二氢槲皮素的醇溶液添加到在1.3中得到的混合物中。然后将玻璃杯置于摇动装置中，以便混合各组分。2.水相的制备2.l.将0.5g抗坏血酸、1.0gN-乙酰基-L-半胱氨酸和1.5g苯甲酸钠溶解于500g的0.9%氯化钠溶液中。2.2.测量溶液的pH值。然后，向水溶液中添加1g的0.1M氯化钠。然后再次测量pH值；这时应为6，4±0.5。3.粗乳液的制备3.1.将在2.2中得到的水溶液添加到在1.5中得到的混合物中。然后在高速涡轮混合机上实现匀化。3.2.将300g的0.9。/。氯化钠添加到得到的乳液中。3.3.测量乳液的pH值，其应为6.4±0.5。如果pH值是正确的，即，为6.4土0.5,则添加O.9%氯化钠，直到1000g。4.脂质体的制备4.1.将在3.3中得到的粗乳液置于"Donor，，(Russia)或"a-Laval"(Sweden)型匀化器的腔中，并且在(5.4-6.5).107Pa.的压力下进行4-12个处理循环。4.2.测量溶液的pH值，其应为6.4±0.5。5.粒度的测定5.l.在Autosizer111"Malvern"(England)的帮助下通过动态光漫射方法测定在4.1中得到的制备物"Pulmo-aktiv"中的脂质体的大小。5.2.将7ml的制备物"Pulmo-aktiv"置于单个的超声波吸入器"Ingport"("Isomed"，Russia)的容器中超声处理20分钟。然后，再次测定粒度。对具有不同成分組合的制备物基于它们在增加大豆磷脂水分散体中POL产物(丙二醛或对硫代巴比妥酸(TBA)敏感的产物)浓度方面的作用来评价抗氧化活性。对于这种评价，在最初的时刻和在没有或有POL起动剂(即，Fe3+离子和抗坏血酸根)的存在下在37。C培养60分钟之后测量大豆磷脂酰胆碱脂质体的浓度。结果表示在表中。最初，含抗氧化剂的磷脂的2.0%水分散体(其中还存在有小麦胚油)包含可忽略量的对TBA敏感的产物(O.8nmol/ml)。这个量在加热60分钟之后升高到2-2.5倍。在将起动剂添加到原始体系中时，在37。C培养60分钟的过程中，POL产物的浓度升高到"nmol/ml,即，达到80倍那么高。从表中的数据可以看出，5mg/ml的量的小麦胚油显著地抑制P0L，并且如果浓度增加4倍，则POL抑制实际上是完全的。二氢槲皮素的最小有效浓度已经被证明是O.03mg/ml。然而，在添加小麦胚油时，发生令人惊讶的作用二氢槲皮素的抗氧化活性降低。换句话说，在小麦胚油所含的抗氧化剂与二氢槲皮素之间观察到拮抗关系。抗坏血酸的最小抑制浓度被证明是2.5mg/ml。然而，在同时存在有小麦胚油和抗坏血酸时，抗坏血酸的浓度可以降低5倍。13向小麦胚油和二氢槲皮素的混合物中添加抗坏血酸确保了有效的抑制作用，即使使用各成分的最小浓度。因此，只有这个最后一种抗氧化剂组合物满足设定条件。表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的大豆磷脂酰胆碱(PCh)的多层嚢泡中的对TBA敏感的产物的量[nmol/ml]的增加是由于氧化引起的，Pe3+/抗坏血酸根引入到体系中(60分钟，37C)引起的。工业实用性本发明用于治疗肺和上呼吸道疾病的用途确保了包含低剂量抗氧化剂而没有任何副作用或消极效果的制备物的有效性。此外，包括在脂质体中的生物学活性化合物被保护起来免受酶的作用。这样增加了制备物的有效性，因为所述制备物容易在生物学液体中分解。借助药物从脂质体的逐渐释放，实现了长期的作用。权利要求1.用于肺和上呼吸道疾病吸入的抗氧化剂的脂质体组合物，其特征在于其提供平均粒度为0.2-0.4μm的脂质体形式的天然和/或合成磷脂的乳液，在其膜中引入了类黄酮二氢槲皮素和小麦胚油，其中乳液的水相包含0.9％的氯化钠溶液和水溶性抗氧化剂抗坏血酸(维生素C)、N-乙酰基-L-半胱氨酸、和苯甲酸钠，各组分的比例如下(重量百分数)磷脂2.25-2.75二氢槲皮素0.9-1.1小麦胚油，包含疏水性抗氧化剂生育酚(TP)(维生素E)和类胡萝卜素0.9-1.1抗坏血酸0.04-0.06N-乙酰基-L-半胱氨酸0.9-1.1苯甲酸钠0.12-0.1全文摘要本发明涉及药物和药理学，特别是涉及适用于肺和上呼吸道疾病的用于吸入的抗氧化剂的脂质体组合物。本发明的用于肺和上呼吸道疾病的吸入的抗氧化剂组合物提供平均粒度为0.2-0.4μm的脂质体形式的磷脂乳液，在所述颗粒的膜中引入了类黄酮二氢槲皮素和小麦胚油，所述小麦胚油包含疏水性抗氧化剂生育酚(TP)(维生素E)和类胡萝卜素。乳液的水相包含氯化钠、水溶性抗氧化剂抗坏血酸(维生素C)、N-乙酰基-L-半胱氨酸和苯甲酸钠。抗氧化剂的组成选择为使得可能以最小的剂量给予单独的维生素，保证抗氧化剂的活性的、未被氧化的形式的含量在储存过程中不会降低。文档编号A61K9/107GK101511338SQ200780033366公开日2009年8月19日申请日期2007年7月23日优先权日2006年8月2日发明者Aa·谢利谢瓦,Vp·吉洪诺夫申请人:开放股份公司基奥得生态工程生态食品工厂