专利名称：具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的方法。
背景技术：
目前，在全世界范围内，心血管疾病,脑血管疾病及周围动脉疾病仍是弓I起人类死亡的主要原因。当病变血管需要被替换时，临床上最常用的是自体血管，如隐静脉，乳内动脉等，每年大约需要实施600000例血管移植手术，但接近三分之一的病患者因为血管老化，血管病变、损伤或之前手术使用等原因而无法使用自体血管，且此方法往往需要二次手术，对病人机体造成较大损伤。在这种情况下，人工血管成为很好的选择。目前临床上使用的人工血管如ePTFE (GORE )及Dacron (Invista )替代大口径血管(6—IOmm)已经非常成熟，但对于口径小于6mm的血管或者血流速度慢的区域，例如冠状动脉或膝下动脉，人工血管移植的失败率很高。造成人工血管移植失败的主要原因是血液-材料界面血栓形成，因此很有必要研发新型具有较好血液相容性的材料或者提高原有材料的血液相容性来制备小口径人工血管天然血管一般由三层结构组成:外膜层，中膜层和内膜层。原子力显微镜观察结果表明，大鼠血管的内膜层表面分布着沿血管长轴方向的亚微米尺度沟槽，以及沟槽表面纳米级的包状突起。静电纺丝技术(电纺)是近几年兴起的一种制备纳米至微米级纤维的十分有效的方法，因为其设备简易，费用低廉，制备出的材料具有较高的比表面积，可控纤维的直径及孔隙率，以及可制备出接近天然细胞外基质尺度范围的纤维等优点，被广泛用于组织工程支架的制备。大多数情况下，利用静态收集器，静电纺丝制备出的材料是絮状或网状的纤维聚集体，但很多人体组织例血管，骨，神经管，韧带等，具有典型的定向排列微结构，因而利用静电纺丝技术制备取向纤维微结构组织工程支架成为一个热点。很多研究证实具仿生血管中膜周向分布微结构的组织工程血管支架可以调节人工血管的宏观力学特性，并能引导组织再生。目前较少有制备沿血管长轴方向取向微结构的人工血管的报道。专利CN201010117485.4中只公开了使用静电纺丝技术制备无规则内膜结构的人工血管，专利CN200610144252.7中提出了具微纳仿内膜结构的二维材料，所以具微纳仿生内膜结构的三维人工血管的制备是急需解决的问题。
发明内容
针对现有人工血管制备技术存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，以提高人工血管的血液相容性，避免因血栓形成造成人工血管腔狭窄。本发明是这样实现的，一种具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，该制备方法按如下步骤进行:(I)高分子聚合物静电 纺丝原液的配制:将高分子聚合物配制成纺丝效果良好地溶剂，用合适的无机溶剂(水)和/或有机溶剂(如甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或它们的任意混合物等)配制高分子聚合物溶液。(2)将步骤(I)中制备的溶液移入注射器中，然后将注射器固定到垂直支架上，通过针头与高压电源相连，以高速旋转转鼓作为收集装置，转鼓外周覆盖铝箔，并通过导线连接地线或者负高压电源。开启高压电源，电纺制备取向纳米纤维组成的薄膜；(3)将步骤(2)中制备取向纳米纤维膜沿纤维长轴方向拉伸(如图1c所示)，置于高温烘箱中，保持拉伸状态并烘干；(4)具有取向微结构的人工血管的制备；(5)人工血管体外血小板粘附的测定；在本发明的上述技术方案中，所述步骤(I)中的高分子聚合物包括聚氨酯，聚乳酸、聚乙烯醇、涤纶、聚己内酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚烯烃，硅橡胶，医用聚氯乙烯以及它们之间的共聚物等合成高分子聚合物，胶原，壳聚糖，纤维素，明胶，纤维蛋白原，丝素蛋白等天然高分子聚合物；进一步所述步骤(2)中取向电纺纤维膜的制备过程是将该溶液针头与转鼓上端间的距离是25-30cm,开动转鼓,设定速度为3000-6000rpm用于制备取向电纺纤维膜,然后施加10-30KV高压，启动30-60分钟后，获得具取向纤维结构的膜；进一步所述步骤(4)中人工血管的制备，包括:①将具取向微结构的纤维 膜绕不同规格金属模具卷成管状作为人工血管的内膜，其中取向纤维膜的绝大部分纤维方向和磨具长轴方向相同；②将模具连接到可以高速旋转的电机上，通过导线连接地线或负高压电源；③设定电纺装置的工作电压为25_35kv，工作距离25-30cm，高分子聚合物溶液用量3-10ml电纺同种或不同的高分子聚合物溶液制备人工血管外层；④电纺过程结束后，将带有人工血管的模具放入高温烘箱烘干；⑤干燥去除残余溶剂后，将人工血管从模具上取下后得到具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管；⑥将人工血管截成长度1.4cm的片段，用于测试体外血小板粘附特性，人工血管的内膜微结构通过扫描电镜表征。进一步所述步骤(5)中人工血管体外血小板粘附的测定是通过一个自制的血小板体外循环系统来完成，包括:①用PBS溶液灌注，然后将富血小板悬液平均分为三份，分别通过三个注射器加入血小板体外循环系统中，将整个系统置于37°C的水浴下恒温静置I小时；②取下三种不同内膜结构的人工血管，置入4°C戊二醛中固定4小时，随后用30%, 50%, 70%, 85%, 95%和100%乙醇梯度脱水，临界干燥仪干燥后用环境扫描电镜的低真空模式进行观察。与现有的小口径人工血管相比，本发明的优点在于:(I)该发明制备的静电纺丝人工血管具有仿血管内膜取向排列微结构，使得该人工血管的血液相容性达到临床抗凝血性能的要求，提供了制备新型人工血管的一个新途径。(2)本发明不采用抗凝剂，只是通过表面微结构效应提高人工血管的血液相容性，因此不存在抗凝剂会带来的副作用。
图1为具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管制备方法流程图。图2为具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管内膜扫描电镜图(5000X)。图3为具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管内膜扫描电镜图(1000X )。图4为血小板体外循环系统示意图(图4中箭头表示血液循环方向)。图5为体外血小板粘附实验后，人工血管的环境扫描电镜的低真空模式图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。实验材料SD大鼠(400±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准)，聚醚型聚氨酯(PU，Sigma-Aldrich),四氢呋喃(THF，分析纯，北京化工厂)，N，N- 二甲基甲酰胺(DMF,分析纯,北京益利精细化工厂),氯化钠(北京化工厂，分析纯)去离子水(Mill1-Q, Millipore0.22 y m超纯水),磷酸氢二钠(北京化工厂，分析纯)，磷酸二氢钠(北京化工厂，分析纯)，水合氯醛(北京化工厂，分析纯)，柠檬酸三钠(北京化工厂，分析纯)，戊二醛(北京化工厂，分析纯)，硅片(Grinm半导体材料公司，中国)，⑶62P单抗、FITC标记羊抗鼠多抗(Abcom公司)，大鼠组织型纤溶酶原激活剂(t_PA) ELISA检测试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)，大鼠血管性血友病因子(vWF)ELISA检测试剂盒(北京奇松生物科技有限公司)，铝箔(市售)，医用注射器(5ml )，针头(7 12号)。仪器直流高压电源(DW-P303-1AC，(T+30KV，天津东文高压电厂)，微量注射泵(TC1-1I型，北京思路高高科技发展有限公司)，微电子天平(德国Dataphysics公司DCATll动态接触角仪)，离心机(湖南长沙湘仪有限公司H-1650)，恒温水浴槽，场发射扫描电子显微镜(日本电子JEOL JSM-6700)，环境扫描电子显微镜(FEI Corp.Quanta 200FEG)，荧光显微镜(TC-XDS-500C倒置荧光显微镜)，酶标仪(Multiskan FC酶标仪)，1.2mm金属磨具。实施例1:具微纳仿生内膜结构的聚氨酯人工血管的制备1.聚氨酯溶液的配制 将聚氨酯颗粒溶入体积比为7:3的四氢呋喃与N，N- 二甲基甲酰胺混合溶液中，搅拌约3h使之形成一澄清、稳定、均一的溶液。2.取向电纺纤维膜的制备将该溶液移入5ml注射器中，然后将注射器固定到垂直支架上，通过针头与高压电源相连，针头与转鼓上端间的距离是25cm,开动转鼓，设定速度为3000rpm,然后施加10-30KV高压，启动30分钟后，即可获得具取向纤维结构的膜。3.取向电纺纤维膜的拉伸为了获得更好的取向度， 将取向纤维膜沿纤维长轴方向拉伸120%，保持拉伸状态放置于60°C烘箱半小时。4.具有取向微结构的人工血管的制备将具取向微结构的纤维膜绕金属磨具卷成管状(具取向微结构的膜保持其纤维方向与磨具长轴方向一致)作为人工血管的内膜，然后将模具连接到可以高速旋转的电机上，以接地的模具为收集装置，保持工作电压25-35kv，工作距离25cm，电纺制备人工血管外层，每根人工血管使用聚氨酯溶液3ml。电纺过程结束后，将获得的人工血管取下即可得到本发明的具微纳仿生内膜结构的聚氨酯人工血管。通过扫描电镜表征人工血管内膜微结构。从扫描电镜表征结果可见，组成人工血管内膜的取向电纺纤维的直径为298±60iim，纤维间距为390± 170nm，与人工血管长轴夹角在10°以内的纤维数量占总纤维数量的91.7%。5.体外血小板粘附测定血小板体外粘附的测定是通过一个自制的血小板体外循环系统来完成，如图3所示。该系统主要包括:蠕动泵，三通管，医用硅胶管，注射器，待测人工血管，其中蠕动泵用来提供循环动力，流速采用50ml/min，接近大鼠腹主动脉的正常流速。整个系统的管路按照细胞培养的水平清洗、处理。①用PBS溶液灌注，然后将富血小板悬液平均分为三份，分别通过三个注射器加入血小板体外循环系统中，将整个系统置于37°C的水浴下恒温静置I小时；②取下三种不同内膜结构的人工血 管，置入4°C戊二醛中固定4小时，随后用30%, 50%, 70%, 85%, 95%和100%乙醇梯度脱水，临界干燥仪干燥后用环境扫描电镜的低真空模式进行观察；③人工血管内膜表面粘附的血小板数量很少，且绝多数血小板呈现出未激活的圆球形形态，如图4所示实施例2:具微纳仿生内膜结构的聚己内酯人工血管的制备1.聚己内酯溶液的配制将聚己内酯颗粒溶入体积比为5:5的二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺混合溶液中，搅拌约3h使之形成一澄清、稳定、均一的溶液。2.取向电纺纤维膜的制备将该溶液移入5ml注射器中，然后将注射器固定到垂直支架上，通过针头与高压电源相连，针头与转鼓上端间的距离是27cm,开动转鼓，设定速度为4000rpm,然后施加10-30KV高压，启动30分钟后，即可获得具取向纤维结构的膜。3.取向电纺纤维膜的拉伸为了获得更好的取向度，将取向纤维膜沿纤维长轴方向拉伸150%，保持拉伸状态放置于60°C烘箱半小时。4.具有取向微结构的人工血管的制备将具取向微结构的纤维膜绕金属磨具卷成管状(具取向微结构的膜保持其纤维方向与磨具长轴方向一致)作为人工血管的内膜，然后将模具连接到可以高速旋转的电机上，以接地的模具为收集装置，保持工作电压25-35kv，工作距离27cm，电纺制备人工血管外层，每根人工血管使用聚己内酯溶液2.5ml。电纺过程结束后，将获得的人工血管取下即可得到本发明的具微纳仿生内膜结构的聚己内酯人工血管。通过扫描电镜表征人工血管内膜微结构。5.体外血小板粘附测定血小板体外粘附的测定是通过一个自制的血小板体外循环系统来完成，环境扫描电镜的低真空模式的观察结果显示人工血管内膜表面粘附的血小板数量很少，且绝多数血小板呈现出未激活的圆球形形态除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。
除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。
权利要求
1.一种具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，其特征在于该制备方法按如下步骤进行: (1)高分子聚合物静电纺丝原液的配制:将高分子聚合物配制成纺丝效果良好地溶剂，用无机溶剂和/或有机溶剂配制高分子聚合物溶液。
(2)将步骤(I)中制备的溶液移入注射器中，然后将注射器固定到垂直支架上，通过针头与高压电源相连，以高速旋转转鼓作为收集装置，转鼓外周覆盖铝箔，并通过导线连接地线或者负高压电源。开启高压电源，电纺制备取向纳米纤维组成的薄膜； (3)将步骤(2)中制备取向纳米纤维膜沿纤维长轴方向拉伸，置于高温烘箱中，保持拉伸状态并烘干； (4)具有取向微结构的人工血管的制备:①将具取向微结构的纤维膜绕不同规格金属模具卷成管状作为人工血管的内膜，其中取向纤维膜的绝大部分纤维方向和磨具长轴方向相同；②将模具连接到可以高速旋转的电机上，通过导线连接地线或负高压电源；③设定电纺装置的工作电压为25-35kv，工作距离25-30cm，高分子聚合物溶液用量3-10ml电纺同种或不同的高分子聚合物溶液制备人工血管外层；④电纺过程结束后，将带有人工血管的模具放入高温烘箱烘干干燥去除残余溶剂后，将人工血管从模具上取下后得到具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管将人工血管截成长度1.4cm的片段，用于测试体外血小板粘附特性，人工血管的内膜微结构通过扫描电镜表征。
(5)人工血管体外血小板粘附的测定:其通过一个自制的血小板体外循环系统来完成，包括:①用PBS溶液灌注，然后将富血小板悬液平均分为三份，分别通过三个注射器加入血小板体外循环系统中，将整个系统置于37°C的水浴下恒温静置I小时；②取下三种不同内膜结构的人工血管，置入4°C戊二醛中固定4小时，随后用30 %，50 %，70 %，85 %，95 %和100%乙醇梯度脱水，临界干燥仪干燥后用环境扫描电镜的低真空模式进行观察。
2.根据权利要求1所述 的具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，其特征在于步骤(I)中的高分子聚合物包括聚氨酯，聚乳酸、聚乙烯醇、涤纶、聚己内酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯，聚烯烃，硅橡胶，医用聚氯乙烯以及它们之间的共聚物等合成高分子聚合物，胶原，壳聚糖，纤维素，明胶，纤维蛋白原，丝素蛋白等天然高分子聚合物。
3.根据权利要求1所述的具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，其特征在于步骤(2)中取向电纺纤维膜的制备过程是将该溶液针头与转鼓上端间的距离是25-30cm,开动转鼓,设定速度为3000-6000rpm用于制备取向电纺纤维膜,然后施加10-30KV高压，启动30-60分钟后，获得具取向纤维结构的膜。
4.根据权利要求1所述的具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，其特征在于无机溶剂为水。
5.根据权利要求1所述的具微纳仿生内膜结构的静电纺丝人工血管的制备方法，其特征在于有机溶剂为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或它们的任意混合物。
全文摘要
本发明公开了一种利用静电纺丝技术制备的具微纳仿生内膜结构的人工血管的制备方法，其主要步骤包括高分子聚合物溶液的配制；取向电纺纤维膜的制备；拉伸；人工血管的制备；扫描电镜表征；血液相容性的测定。该方法制备的人工血管具有仿血管内膜取向排列微结构，使得该人工血管的血液相容性达到临床抗凝血性能的要求，提供了制备新型人工血管的一个新途径，同时由于不采用抗凝剂，只是通过表面微结构效应提高人工血管的血液相容性，因此减少了抗凝剂会带来的副作用，在医学临床血管移植领域具有良好的应用前景。
文档编号A61F2/06GK103211663SQ201210287469
公开日2013年7月24日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者王深明, 刘瑞明, 赵勇, 胡作军, 秦原森 申请人:王深明, 刘瑞明, 赵勇, 胡作军, 秦原森