专利名称：用于处理受伤组织的固体敷料的制作方法
专利说明用于处理受伤组织的固体敷料 发明领域
本发明涉及用于处理哺乳动物患者例如人的受伤组织的固体敷料。
背景技术：
可用于在就医前护理的材料和方法(纱布敷料、定向压力、和止血器)令人遗憾地在过去2000年没有显著的变化。参见L.Zimmerman等人，Great Ideas in the History of Surgery(SanFrancisco，Calif.Norman Publishing；1993)，31。即使对于经过训练的人来说，他们也不是同样有效的，可达到的位置发生大量出血或致命失血并不罕见。参见J.M.Rocko等人，J.Trauma22635(1982)。
得自越南的死亡率数据显示，10％的战争死亡是由于未受控制的极度失血。参见SAS/STAT Users Guide，4th ed.(Cary，N.C.SASInstitute Inc；1990)。在越南战争(Vietnam War)期间由于出血所致死亡中有最多三分之一可以使用有效的野外失血控制方法来阻止。参见SAS/STAT Users Guide，4th ed.(Cary，N.C.SAS InstituteInc；1990)。
尽管平民创伤死亡率统计没有提供由于极端失血而致就医前死亡的确切数字，但是案例和轶事报告显示为同样的情况。参见J.M.Rocko等人。这些数据显示，可以通过在就医前使用简单的和有效的失血控制方法实现存活的大幅度增加。
现在正在使用许多已经开发用于克服常规的纱布绷带的缺陷的较新的止血剂。这些止血剂包括以下 ·微孔性聚糖粒子(
Medafor Inc.，Minneapolis，MN)； ·沸石(
Z-Medica Corp，Wallington，CT)； ·乙酰化的聚N-乙酰基氨基葡萄糖(Rapid DeploymentHemostatTM(RDH)，Marine Polymer Technologies，Danvers，MA)； ·脱乙酰壳多糖(
bandage，HemCon MedicalTechnologies inc.，Portland OR)； ·液体血纤蛋白密封剂(Tisseel VH，Baxter，Deerfield，EL) ·人纤维蛋白原和马属胶原上的凝血酶(TachoComb-S，HafslundNycomed Pharma，Linz，Austria)； ·微分散的氧化纤维素(m·docTM，Alltracel Group，Dublin，Ireland)； ·培酸丙酯(HemostatinTM，Analytical Control Systems Inc.，Fishers，EN)； ·ε-氨基己酸和凝血酶(HemarrestTM patch，ClarionPharmaceuticals，Inc)； 纯化牛真皮胶原(
片材(无纺织物幅片或AviteneMicrofibrillar Collagen Hemostat(MCH)，DavoL，Inc.，Cranston，RI)； ·再生纤维素的受控氧化(
Ediicon Inc.，Somerville，NJ)； ·具有乙基纤维素涂层的硫酸铝(Sorbastace Microcaps，Hemostace，LLC，New Orleans，LA)； ·微孔性的形成水凝胶的聚丙烯酰胺(BioHemostat，Hemodyne，Inc.，Richmond VA)；和 ·重组的活化因子VII(
NovoNordisk Inc.，Princeton，NJ)。
这些试剂在用于外伤损伤的动物模型中和/或用于野外时取得了不同程度的成功。
这种试剂之一是以商品名TraumaDEXTM销售的基于淀粉的止血剂。这种产品包括被直接倾倒在伤口中或伤口上的微孔性聚糖粒子。所述粒子似乎是通过从伤口中的血液和血浆吸收水而引起凝血因子和血小板积聚和富集来发挥其止血作用。然而，在致命的腹股沟伤口模型的两项研究中，这种试剂没有表现出有意义的优于标准纱布敷料的益处。参见McManus等人，Business BriefingEmergencyMedical Review 2005，pp.76-79(目前可以在www.touchbriefings.com/pdf/1334/Wedmore.pdf的网址在线得到)。
另一种基于粒子的试剂是QuickClotTM粉末，用于直接倾倒在伤口中或伤口上的沸石颗粒状止血剂。沸石粒子似乎也是通过液体吸收引起凝血因子和血小板的积聚和富集来发挥其止血作用。尽管这种试剂已经成功地用于某些动物研究，但是仍有关于由粒子吸收液体时放热过程的担心。一些研究表明，这种反应在体外产生超过143℃的温度和在体内产生超过50℃温度，这足以引起三度烧伤。参见McManus等人，Business BriefingEmergency Medical Review 2005，at 77。还已经观察到QuikClotTM的放热反应引起临床重要性未知的肉眼的和组织学的改变。Acheson等人，J.Trauma 59865-874(2005)。
与这些基于粒子的试剂不同，Rapid Deployment HemostatTM看起来似乎是通过红细胞聚集、血小板活化、凝血级联活化和局部血管收缩来发挥其止血作用。Rapid Deployment HemostatTM是由聚N-乙酰氨基葡萄糖组成的来源于藻类的敷料。尽管原始的敷料设计是有效减少小的出血，但是为了在主动脉和肝脏损伤的猪模型中减少失血需要增加纱布衬垫。参见McManus等人，Business BriefingEmergency Medical Review 2005，at 78。
另一种衍生自聚N-乙酰基氨基葡萄糖的敷料是HemConTMChitosan Bandage，其据称是设计用于优化脱乙酰壳多糖在伤口位置的粘膜粘着剂表面密度和结构完整性的冷冻干燥的脱乙酰壳多糖敷料。HemConTM Chitosan Bandage显然是主要通过对伤口的粘着来发挥其止血作用，尽管有证据建议其还可以增强血小板作用以及将红细胞并入到在伤口上形成的凝块中。这种绷带在几个动脉出血的动物模型中表现出改善的止血和较少失血，但是在不同绷带之间观察到显著的变化性，包括由于不充分粘着于伤口而失败的一些。参见McManus等人，Business BriefingEmergency Medical Review 2005，at 79。
液体血纤蛋白密封剂，例如Tisseel VH，数年来被用作用于失血控制的手术室附属设备。参见J.L.Garza等人，J.Trauma30512-513(1990)；H.B.Kram等人，J.Trauma 3097-101(1990)；M.G.Ochsner等人，J.Trauma 30884-887(1990)；T.L.Matthew等人，Ann.Thorac.Surg.5040-44(1990)；H.Jakob等人，J.Vase.Surg.，1171-180(1984)。用于止血的组织胶水的第一次出现回溯到1909。参见Current Trends in Surgical Tissue AdhesivesProceedings of the First International Symposium on SurgicalAdhesives，M.J.MacPhee等人，eds.(Lancaster，Pa.TechnomicPublishing Co；1995)。液体血纤蛋白密封剂典型地由纤维蛋白原和凝血酶组成，但是还可以包含因子XIII/XIIIa，作为纤维蛋白原纯化的副产物或作为添加的组分(因此在某些应用中，不必需在血纤蛋白密封剂中存在有因子XIII/因子XIIIa，因为内源性地存在有足够的因子XIII/XIIIa或其它转氨酶来诱导纤维蛋白形成)。然而，作为液体，这些血纤蛋白密封剂尚未被证明可用于在野外处理创伤性损伤。
具有胶原载体的干燥纤维蛋白原-凝血酶敷料(例如TachoCombTM，TachoCombTM H and TachoSil available from HafslundNycomed Pharma，Linz，Austria)也在许多欧洲国家中用于手术室应用。参见U.Schiele等人，Clin.Materials 9169-177(1992)。尽管这些纤维蛋白原-凝血酶敷料不需要液体血纤蛋白密封剂所需的预先混合，但是它们用于野外应用的实用性受到4℃的储存条件和需要在应用于伤口之前用盐水溶液预润湿的限制。这些敷料对于高压、大量出血不是很有效。参见Sondeen等人，J.Trauma54280-285(2003)。
用于处理受伤组织的干燥纤维蛋白原/凝血酶敷料还可以得自美国红十字会(American Red Cross，ARC)如美国专利6,762,336中公开的，这种特定的敷料由衬垫材料和多个层组成，所述多个层的最外侧的两个层包含纤维蛋白原(但是不含凝血酶)，而内层包含凝血酶和氯化钙(但是不含纤维蛋白原)。尽管这种敷料已经能够在几个失血的动物模型中表现出巨大的成功，但是该绷带是脆弱的、不可弯曲的，并且在处理时有分裂的倾向。参见McManus等人，BusinessBriefingEmergency Medical Review 2005，at 78.；Kheirabadi等人，J.Trauma 5925-35(2005)。
还提出了其它基于纤维蛋白原/凝血酶的敷料。例如，美国专利4,683,142公开了用于封闭和修复伤口的再吸收性片材，其由包含凝血蛋白(例如纤维蛋白素原和凝血酶)的糖蛋白基质(例如胶原)组成。美国专利5,702,715公开了由纤维蛋白原和凝血酶的单独的层组成的增强的生物学密封剂，所述纤维蛋白原和凝血酶的单独的层中的至少之一还包含增强填料，例如PEG、PVP、BSA、甘露糖醇、FICOLL、右旋糖酐、肌醇或氯酸钠。美国专利6,056,970公开了由生物可吸收的聚合物(例如透明质酸或羧甲基纤维素)组成的敷料和由粉末的凝血酶和/或粉末的纤维蛋白原组成的止血组合物。美国专利7,189,410公开了由衬垫材料组成的绷带，在所述衬垫材料上具有(i)纤维蛋白原粒子；(ii)凝血酶粒子；和(iii)氯化钙。美国专利申请公布US2006/0155234A1公开了由衬垫材料和多个纤维蛋白原层组成的敷料，所述多个纤维蛋白原层在它们之间具有离散的凝血酶区域。到目前为止，这些敷料中没有一种被批准使用或者可购得。
另外，制备纤维蛋白原/凝血酶固体敷料的过去的努力总是受到恰好是使它们成为用于处理伤口的合乎需要的成分的性质的阻碍，所述性质即它们在含水条件下迅速地反应以形成纤维蛋白的固有的能力。因子XIII的存在导致混合物引起纤维蛋白Ia进一步转化为交联的纤维蛋白II。
对于人的总的凝血过程如
图1中所示。如其中所述的，纤维蛋白原到纤维蛋白I的转化包括分别从纤维蛋白原的α和β链裂解两个小的肽(A和B)。这些小的肽难以直接检测和监控；然而，可以通过凝胶电泳监测由这种裂解产生的α和β链的分子量的减小。同样地，纤维蛋白I到交联的纤维蛋白II的转化可以通过在凝胶上的纤维蛋白原的γ链单体消失(其随着在因子XIII对γ链单体的作用下转化为γ-γ二聚物)来跟踪。
为了避免过早的反应，生产纤维蛋白原/凝血酶固体敷料的先前的努力强调尽可能地将纤维蛋白原和凝血酶组分分开，以免它们在使用敷料之前形成太多的纤维蛋白。例如，得自Hafslund NycomedPharma具有胶原载体的纤维蛋白原-凝血酶敷料(例如TachoCombTM、TachoCombTMH和TachoSil)是通过将纤维蛋白原和凝血酶粒子悬浮在非水液体中、然后将悬浮液喷涂在胶原基质上制备的。与含水环境相反，使用非水环境意在阻止纤维蛋白原和凝血酶之间的过度的相互作用。
已经提出了这一过程的替代方案，其每一个都是设计用于尽可能单独地保持纤维蛋白原和凝血酶。例如，在美国专利7,189,410中公开的纤维蛋白原/凝血酶固体敷料是如下制备的将粉末的纤维蛋白原和粉末的凝血酶在没有任何溶剂的情况下混合，然后将干燥的粉末混合物施用于衬垫材料的粘性侧面。在美国专利6,762,336和美国专利申请公布US 2006/0155234A1中公开的纤维蛋白原/凝血酶固体敷料包含单独的和离散的纤维蛋白原或凝血酶层，各自为基本上不含另一组分。然而，这些方法尚未完全成功。
为了适当地起作用，基于纤维蛋白原/凝血酶的固体敷料必须满足几个标准。首先，纤维蛋白原和凝血酶必须成功地相互作用，以形成凝块，并且这种凝块越能粘附于伤口，则敷料的效果越好。大体上，敷料必需具有高度的完整性，因为由于裂缝、剥落等引起的活性成分损失最终会导致性能降低并且得到差的使用者接受性。已有报道说，已知的纤维蛋白原/凝血酶固体敷料缺乏这些特征中的一种或多种。
此外，敷料必须是同质的，因为敷料的所有区域必须同样起作用，以便保证其成功应用。敷料还必须迅速地水合而无需显著的或者专门的努力。相对平整的敷料通常是优选的，如有可能要避免卷曲或不规则的非平面的结构(这些倾向于与有效的应用相抵触，并且在有些情况下可以导致差的性能)。柔韧性是非常优选的另一个特征，既能改善性能又能增加实际上可以处理的伤口的几何形状和位置的数目。尽管已知的纤维蛋白原/凝血酶固体敷料在水合时可能是柔软的，但是它们在水合之前没有足够的水分含量以便为柔软的。参见例如，Sondeen等人，J.Trauma 54280-285(2003))；Holcomb等人，J.Trauma，55518-526；McManus&Wedmore，Emergency Medicine Review，pp76-79，2005。
在使用前存在于敷料中的纤维蛋白(特别是不溶性的交联的纤维蛋白II)的量必须是相对小的。这个后一特征由于几个原因而是重要的。首先，在生产过程中不溶性血纤维蛋白的存在通常产生质量差的敷料，其可能表现出降低的完整性、缺乏均质性和难以水合/水合缓慢。这些结果通常可以由本领域技术人员视觉上检测。
例如，在基于纤维蛋白原/凝血酶的固体敷料中的预先形成的纤维蛋白的存在可以通过不符合同质表面外观而被视觉上检测到。特别地，粗糙的或凹凸不平的外观经常暗示在生产过程中形成了显著量的纤维蛋白并且有可能妨碍未来的性能。在固体敷料表面上的坚固的、光滑的&有光泽的“片状物”也是纤维蛋白倾向于在使用过程中缓慢(甚至阻断)水合的迹象。固体敷料的过度的向上卷曲是在生产过程中形成了显著量的纤维蛋白的另一个迹象。在添加水或水溶液时，具有过度的纤维蛋白含量的敷料缓慢水合并且经常需要液体的强力的施用，有时需要对表面进行机械穿透，以便引发水合。此外，在水合之后，具有大量预先形成的纤维蛋白的敷料通常具有混色斑纹和明显非均质的外观。
还可以通过各种生物化学试验来评价预先形成的纤维蛋白的量，例如在美国专利申请公布US 2006/0155234A1中描述的方法。根据这个试验，纤维蛋白原γ链到交联的γ-γ二聚物的转化用作纤维蛋白存在的指示(转化为γ-γ二聚物的γ链的比例是产生的纤维蛋白的量的量度)。
其它试验可以评价纤维蛋白原的其它组分链的变化，例如Aα链转化为游离的α链和纤维蛋白肽A，或者Bβ链转化为游离的β链和血纤维蛋白肽B。这些改变可以如美国专利申请公布US2006/0155234A1中描述的γ转化为γ-γ的类似方式通过凝胶电泳来监控。有趣的是，在美国专利申请公布US 2006/0155234A1中报告了较高水平的γ-γ二聚化(最高10％)，显示这些敷料在使用前包括显著量的纤维蛋白。这个观察结果可以解释在这些敷料中的一些中观察到的分层和/或裂缝问题。
对于适当地起作用的基于纤维蛋白原/凝血酶的固体敷料，水合通常在几秒内完成，并且只需要将水(或某些水溶液)施加在敷料上。这种溶液可以是血液或来自使用该敷料的损伤位置的另一种体液，或者其可以来自某些外部来源，例如在敷料处于待处理伤口上时对其施加的盐水或其它生理学可接受的含水溶液。较长的水合时间，即通常大于5秒时，会妨碍敷料的性能，因为敷料可能会流失或脱落到液体中，所述溶液在形成充分交联的纤维蛋白之前持续为自由流动的。已知持续出血的可能致命的后果，在使用过程中敷料水合的任何延迟都是非常不合乎需要的。另外，具有过多纤维蛋白含量的敷料的性能通常是差的，如在本文中描述的EVPA和粘着试验以及在体内试验和临床应用期间中的评分降低所反映的。
因此，本领域中仍需要可用于处置受伤组织的固体敷料，特别是用于在野外由于创伤性损伤所致的受伤组织。
发明内容
因此，本发明的目的是提供可以处置受伤的哺乳动物组织的固体敷料，特别是用于处理由于创伤性损伤所致的受伤组织。本发明的另一个目的是提供可以处置受伤的哺乳动物组织(特别是人的组织)的方法。本发明的其它目的、特征和优点可以在随后的发明详述中阐述，并且部分是从该说明书显而易见的和/或可以通过实践本发明来学习。这些目的和优点通过本说明书中描述的组合物和方法来实现和达到，并且特别地在随后的权利要求中指出。
根据这些和其它目的，本发明的第一实施方案涉及用于处理哺乳动物的受伤组织的固体敷料，其包括至少一个实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层是由包含纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂的单一的水溶液浇铸或形成的。
另一个实施方案涉及用于处理哺乳动物的受伤组织的固体敷料，其包括至少一个实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中止血层被浇铸或形成为整体。
另一个实施方案涉及使用固体敷料处理受伤组织的方法，所述固体敷料包括至少一个实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层是由包含纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂的单一的水溶液浇铸或形成的。
另一个实施方案涉及使用固体敷料处理受伤组织的方法，所述固体敷料包括至少一个实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层浇铸或形成为整体。
另一个实施方案涉及实质上由纤维蛋白原组分、纤维蛋白原活化剂和水的混合物组成的组合物，其中组合物是冻结的并且在降低的温度下稳定至少24小时。
应该理解，前述的一般说明和随后的发明详述只是示例性的和说明性的，并且意在提供对本文要求保护的本发明的进一步说明，而非限制。
附图简述
图1是由ERL网址(www.enzymeresearch.co.uk/coag.htm)提供的人凝血级联的综述。
图2是用于本文中所述的离体猪动脉切开术试验的装备的简图。
图3A-3C是表示实施例1得到的结果的图。
图4A和图4B是描述对在实施例6-12中制备的敷料进行EVPA和粘着试验的结果的图。
图5A和5B是表示实施例13表现出的在-80℃储存的冻结组合物的性能特征的图。
发明详述
除非另有说明，本文中所用的所有技术和科学名词具有与本发明所属技术领域技术人员通常理解的相同的含义。本文中提及的所有专利和出版物都被并入作为参考。
如本文中使用的，使用单数的冠词例如“一”、“一个”、和“该”意在不排除该冠词的客体的复数形式，除非上下文明显地和清楚地限定不是这样。
本文中使用的“患者”是指需要医疗护理和/或治疗的人或动物个体。
本文中使用的“创伤”是指导致从循环系统损失血液和/或从患者身体损失任何其它液体的对患者的任何组织的任何损害。组织可以是内部组织例如器官或血管，或者是外部组织例如皮肤。血液的损失可以是来自内部例如来自破裂的器官，或者来自外部例如来自撕裂。创伤可以在软组织例如器官中，或者在硬组织例如骨中。损坏可以是由任何试剂或来源引起的，包括创伤性损伤、感染或外科手术。
本文中使用的“可吸收材料”是指这样的材料，其自然分解和/或通过哺乳动物身体分解为被消耗或清除的组分，使得不显著地干扰创伤愈合和/或组织再生，并且不引起任何显著的代谢紊乱。
本文中使用的“稳定性”是指决定材料活性和/或功能的那些特征的保持。
本文中使用的“适合的”是指不会不利地影响敷料或其任何组分的稳定性的材料。
本文中使用的“密封剂”是指改善敷料的止血层的组分的粘着和/或内聚的化合物或化合物的混合物。
本文中使用的“增溶剂”是指改善一种或多种蛋白质在含水溶剂中的溶出的化合物或化合物的混合物。
本文中使用的“填料”是指为敷料的止血层提供容积(bulk)和/或多孔性的化合物或化合物的混合物。
本文中使用的“脱模剂”是指促进敷料从生产模具取出的化合物或化合物的混合物。
本文中使用的“发泡剂”是指在适合的条件下水合时产生气体的化合物或化合物的混合物。
本文中使用的“固体”是指在将敷料置于刚性表面上、创伤面朝下、然后室温静置24小时时，敷料的形状或形式不会显著改变。
本文中使用的“冻结”意思是指该组合物在被置于刚性表面、朝向创伤的面向下、然后在-40℃静置24小时时组合物的形状或形式基本上不会改变，但是在被置于刚性表面、创伤面向下、然后在室温静置24小时时该组合物的形状或形式会显著变化。因此，在本发明的上下文中，“固体”敷料不同于“冻结”的，并且“冻结”的组合物不同于“固体”的。
本发明的第一优选实施方案涉及用于处理患者的受伤组织的固体敷料，其包括至少一个由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层是由包含纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂的单一的水溶液浇铸或形成的。
本发明的另一个实施方案涉及用于处理患者的受伤组织的固体敷料，其包括至少一个由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层浇铸或形成为整体的。
如本文中使用的，“实质上由...组成”是指在打算使用固体敷料处理受伤组织时，纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂是固体敷料的止血层的必需和必要的成分。因此，对于特定的应用，止血层可以根据需要包含除纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂之外的其它成分，但是这些其它成分对于在正常情况下的预定的功能不是需要的，即，将敷料在预定应用条件下应用于组织时，这些其它成分对于纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂反应和形成足够的纤维蛋白以减少血液和/或液体从正常的受伤组织流出不是必需的。然而，如果在特定的情况中的使用条件不是正常的，例如患者是患有因子XIII缺陷的血友病患者，则可以向止血层添加适当的另外组分例如因子XIII/XIIIa或一些其它的转氨酶，而不背离本发明的精神实质。同样地，本发明的固体敷料可以包含一个或多个这些止血层以及一个或多个其它层例如一个或多个支撑层(例如衬垫材料或内部支撑材料)和防粘层。
本发明的其它优选实施方案涉及处理哺乳动物的受伤组织的方法，包括为受伤组织放置本发明的固体敷料并且对敷料施加充分的压力，其持续时间足以形成足够的纤维蛋白以减少血液和/或其它液体从伤口的损失。
其它优选实施方案涉及实质上由纤维蛋白原组分、纤维蛋白原活化剂和水的混合物组成的组合物，其中这些组合物是冻结的并且在降低的温度下稳定至少24小时。这种组合物特别地可用于制备本发明固体敷料的止血层。
根据本发明的某些实施方案，固体敷料的止血层形成或浇铸为整体的。根据本发明的某些其它实施方案，止血层制造或形成为单一来源，或者从单一来源形成，所述单一来源例如包含纤维蛋白原和纤维蛋白原活化剂的混合物的水溶液。在本发明的这些实施方案中的每一个，全部止血层优选是基本上均质的。
根据某些优选实施方案，固体敷料的止血层还可以包含粘合剂，以便促进或改善各层之间和/或层对任何支撑层的粘着。适合的粘合剂说明性实例包括但不限于蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、明胶、透明质酸酶及其衍生物例如透明质酸、麦芽糖、聚维酮、淀粉、脱乙酰壳多糖及其衍生物、和纤维素衍生物例如羧甲基纤维素，以及其两种或更多种的混合物。
固体敷料的止血层还可以任选地包含一种或多种适合的填料，例如蔗糖、乳糖、麦芽糖、丝制品、纤维蛋白、胶原、白蛋白、聚山梨酯(TweenTM)、壳多糖、脱乙酰壳多糖及其衍生物(例如NOCC-脱乙酰壳多糖)、海藻酸及其盐、纤维素及其衍生物、蛋白多糖、透明质酸酶及其衍生物例如透明质酸、羟基乙酸聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸/乳酸共聚物、及其两种和更多种的混合物。
固体敷料的止血层还可以任选地包含一种或多种适合的增溶剂，例如蔗糖、右旋糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、白蛋白、透明质酸酶及其衍生物例如透明质酸、山梨酸酯、聚山梨酯(TweenTM)、山梨聚糖(SPANTM)、及其两种或更多种的混合物。
固体敷料的止血层还可以任选地包含一种或多种适合的发泡剂，例如生理学可接受的酸(例如柠檬酸或乙酸)和生理学适合的碱(例如碳酸氢钠或碳酸钙)的混合物。其它适合的发泡剂包括但不限于包含加压气体的干燥粒子，例如包含二氧化碳(参见，例如，美国专利3,012,893)或其它生理学可接受的气体(例如氮气或氩气)、和药理学可接受的过氧化物的糖粒子。这种发泡剂可以被引入到纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂的含水混合物中，或者可以被引入到混合之前的纤维蛋白原组分的水溶液中和/或纤维蛋白原活化剂的水溶液中。
固体敷料的止血层还可以任选地包含适合的钙离子来源，例如氯化钙，和/或纤维蛋白交联剂例如转氨酶(例如因子VIII/XIIIa)或戊二醛。
固体敷料的止血层优选如下制备，将纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂的水溶液在使由纤维蛋白原活化剂引起的纤维蛋白原组分活化最小化的条件下混合。然后可以使水溶液的混合物经过例如冷冻干燥或自由干燥(free-drying)，以使水分含量降低到期望的水平，即降低到其中敷料是固体的并且因此在创伤面向下、在室温下静置24小时时形状或形式不会显著改变的水平。还可以采用实现相同结果的类似方法，例如干燥、喷涂干燥、真空干燥和玻璃化。
如本文中使用的，“水分含量”是指敷料中可自由利用的水分的量。“可自由利用的”是指水没有与敷料的一种或多种非液体组分结合或络合。本文中所述的水分含量是指通过实质上与FDA批准的改进的卡尔费希尔法类似的方法测定的水平(Meyer and Boyd，Analytical Chem.，31215-219，1959；May等人，J.Biol.Standardization，10249-259，1982；Centers for BiologiesEvaluation and Research，FDA，Docket No.89D-0140，83-93；1990)或者通过近红外光谱法测定的水平。特定的固体敷料的适合的水分含量可以由本领域技术人员根据其预定的应用凭经验决定。
例如，在本发明的某些实施方案中，较高的水分含量与更柔软的固体敷料相关。因此，在设计用于肢端的伤口的固体敷料中，优选水分含量最低为6％，甚至更优选是6％-44％的范围。
同样地，在本发明的其它些实施方案中，较低的水分含量与更刚性的固体敷料相关。因此，在设计用于平整伤口(例如腹部或胸部的伤口)的固体敷料中，优选水分含量为低于6％，甚至更优选为1％-6％的范围。
因此，固体敷料的适合的水分含量的说明性实例包括但不限于以下(每个数值为±0.9％)低于53％；低于44％；低于28％；低于24％；低于16％；低于12％；低于6％；低于5％；低于4％；低于3％；低于2.5％；低于2％；低于1.4％；0-12％(不含端值)；0-6％；0-4％；0-3％；0-2％；0-1％；1-16％；1-11％；1-8％；1-6％；1-4％；1-3％；1-2％；和2-4％。
固体敷料的止血层中的纤维蛋白原组分可以是已知的和本领域技术人员可得到的任何适合的纤维蛋白原。纤维蛋白原组分还可以是纤维蛋白原的功能衍生物或代谢物，例如纤维蛋白原α、β和/或γ链、可溶性纤维蛋白I或纤维蛋白II、或其两种或更多种的混合物。对于特定应用的具体的纤维蛋白原(或功能衍生物或代谢物)可以由本领域技术人员凭经验选择。如本文中使用的，术语“纤维蛋白原”意在包括纤维蛋白原和少量因子XIII/因子XIIIa的混合物、或某些其它这种转氨酶。本领域技术人员通常认为这种少量是在根据目前已知的和本领域中可利用的方法和技术纯化之后在哺乳动物纤维蛋白原中发现的量，典型地为0.1-20单位/mL。
优选地，作为固体敷料的纤维蛋白原组分使用的纤维蛋白原是适合于引入到哺乳动物中的纯化的纤维蛋白原。典型地，这种纤维蛋白原是包括因子XIII/XIIIa并且已经被纯化到适当水平并且病毒灭活的人血浆蛋白的混合物的一部分。用于制备固体敷料的优选的纤维蛋白原水溶液包含约37.5mg/mL的纤维蛋白原，pH为约7.4±0.1。作为纤维蛋白原组分使用的适合的纤维蛋白原已经在本领域中有所描述，例如美国专利5,716,645，并且类似的材料是市售的，例如得自例如Sigma-Aldrich、Enzyme Research Laboratories、Haematologic Technologies和Aniara。
优选地，纤维蛋白原组分以每平方厘米固体敷料为约1.5-约13.0mg(±0.9mg)纤维蛋白原的量存在，更优选为约3.0-约13.0mg/cm2。然而，取决于固体敷料的特定应用，可以采用更大或更小的量。例如，根据其中需要增加粘着的某些实施方案中，纤维蛋白原组分以每平方厘米固体敷料为约11.0-约13.0mg(±0.9mg)的量存在。同样地，根据设计用于处理包含低压血管的某些实施方案中，可以使用纤维蛋白原组分的较低水平。
在固体敷料的止血层中使用的纤维蛋白原活化剂可以是本领域技术人员已知将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的任何物质或物质的混合物。适合的纤维蛋白原活化剂的说明性实例包括但不限于以下凝血酶，例如人凝血酶或牛凝血酶，和凝血酶原，例如人凝血酶原或凝血酶原复合物浓缩物(凝血因子II、VII、IX和X的混合物)；蛇毒，例如巴曲酶、爬虫凝血酶(巴曲酶和因子XIIIa的混合物)、巴西矛头腹蛇酶(bothrombin)、蛇毒类凝血酶(calobin)、fibrozyme、和从巴西矛头蝮(Bothrops jararacussu)的毒液分离的酶；和这些中的任何两种或更多种的混合物。参见例如，Dascombe等人，Thromb.Haemost.78947-51(1997)；Hahn等人，J.Biochem.(Tokyo)119835-43(1996)；Fortova等人，J.Chromatogr.S.Biomed.Appl.69449-53(1997)；和Andriao-Escarso等人，Toxicon.351043-52(1997)。
优选地，纤维蛋白原活化剂是凝血酶。更优选地，纤维蛋白原活化剂是哺乳动物凝血酶，尽管在适当的情况中也可使用鸟和/或鱼的凝血酶。尽管可以在固体敷料中使用任何适合的哺乳动物凝血酶，但是优选用于止血层的凝血酶对于固体敷料的预定使用来说是已经充分纯化的并且病毒灭活的人血浆蛋白质的冻干混合物。适合的凝血酶可以得自商业来源例如Sigma-Aldrich、Enzyme ResearchLaboratories、Haematologic Technologies和BiomolInternational。用于制备固体敷料的特别优选的凝血酶水溶液包含效价为约10-2000±50国际单位/mL的凝血酶，更优选效价为约25±2.5国际单位/mL。其它组分可以包括白蛋白(通常为约0.1mg/mL)和甘氨酸(通常为约100mM±0.1mM)。这个特别优选的凝血酶水溶液的pH通常为6.5-7.8，优选为7.4±0.1，尽管5.5-8.5的pH范围也是可以接受的。
除了止血层之外，固体敷料可以任选地另外包括一个或多个支撑层。如本文中使用的，“支撑层”是指维持或改善固体敷料的结构完整性和/或在将这种敷料应用于受伤组织时维持或改善形成的纤维蛋白凝块的结构完整性的材料。
根据本发明的某些优选实施方案，所述支撑层在与被应用于受伤组织的侧面的相对侧面上包括衬垫材料。这种衬垫材料可以借助生理学可接受的密封剂附着，或者可以是自粘着的(例如通过具有足够的表面静电荷)。衬垫材料可以包括一种或多种可再吸收材料或一种或多种不可再吸收材料或其混合物。优选地，衬垫材料是单纯的可再吸收材料。
可以将本领域技术人员已知和可得到的任何适合的可再吸收材料用于本发明。例如，可再吸收材料可以是蛋白质物质，例如丝制品、纤维蛋白、角蛋白、胶原和/或明胶。或者，可再吸收材料可以是碳水化合物物质，例如藻酸盐、壳多糖、纤维素、蛋白多糖(例如聚N-乙酰基氨基葡萄糖)、羟基乙酸聚合物、乳酸聚合物、或羟基乙酸/乳酸共聚物。可再吸收材料还可以包括蛋白质物质的混合物或碳水化合物物质的混合物或蛋白质物质与碳水化合物物质的混合物。具体的可再吸收材料可以由本领域技术人员根据固体敷料的预定应用凭经验选择。
根据本发明的某些优选实施方案，可再吸收材料是碳水化合物物质。特别优选的可再吸收材料的说明性实例包括但不限于在商品名VICRYLTM(一种羟基乙酸/乳酸共聚物)和DEXONTM(一种羟基乙酸聚合物)下销售的材料。
可以使用本领域技术人员已知和可得到的任何适合的不可再吸收材料作为衬垫材料。适合的不可再吸收材料的说明性实例包括但不限于塑料、硅氧烷聚合物、纸和纸制品、乳胶、纱布等等。
根据其它优选实施方案，支撑层包括内部的支撑材料。这种内部的支撑材料优选被完全地包含在固体敷料的止血层内，尽管在某些实施方案中其可以位于两个相邻的止血层之间。与衬垫材料中的情况一样，内部的支撑材料可以是可再吸收材料或不可再吸收材料，或其混合物，例如两种或更多种可再吸收材料的混合物或两种或更多种不可再吸收材料的混合物或者可再吸收材料和不可再吸收材料的混合物。
根据其它优选实施方案，支撑层可以包括在敷料的面向伤口的侧面(即，要被应用于受伤组织的侧面)上的正面支撑材料。与衬垫材料和内部的支撑材料中的情况一样，正面支撑材料可以是可再吸收材料或不可再吸收材料，或其混合物，例如两种或更多种可再吸收材料的混合物或两种或更多种不可再吸收材料的混合物可能是可再吸收材料和不可再吸收材料的混合物。
根据其它优选实施方案，固体敷料在止血层之外还包括衬垫材料和内部的支撑材料其二者，也就是说，固体敷料包括除止血层之外的两个支撑层。根据其它优选实施方案，固体敷料包括除止血层之外的正面支撑材料和内部的支撑材料其二者。根据其它优选实施方案，固体敷料包括除止血层之外的衬垫材料、正面支撑材料和内部的支撑材料。
根据本发明的某些实施方案，特别是其中使用模具生产固体敷料的情况中，固体敷料还可以任选地另外包括除止血层和支撑层之外的防粘层。如本文中使用的，“防粘层”是指包含一种或多种试剂(“脱模剂)”的层，所述试剂促进或有助于固体敷料从已经在其中生产固体敷料的模具中取出。优选的这种试剂是蔗糖，但是其它适合的脱模剂包括明胶、透明质酸酶及其衍生物(包括透明质酸)、甘露糖醇、山梨糖醇和葡萄糖。或者，这种一种或多种脱模剂可以包含在止血层中。
本发明的敷料的各个层可以借助本领域技术人员已知的和可以使用的任何适合的方法彼此附着。例如，可以对衬垫材料(在存在时)施加生理学可接受的密封剂，并且随后将止血层附着于其上面。
在本发明的某些实施方案中，生理学可接受的密封剂的剪切强度和/或结构使得衬垫材料可以从在将敷料施用于受伤组织之后由止血层形成的纤维蛋白凝块分离。在其它实施方案中，生理学可接受的密封剂的剪切强度和/或结构使得在将绷带应用于受伤组织之后衬垫材料不可以从纤维蛋白凝块分离。
用于固体敷料的止血层的适合的纤维蛋白原和适合的纤维蛋白原活化剂可以得自本领域技术人员已知的和可得到的任何适当的来源，包括但不限于以下得自商业的供应商，例如Sigma-Aldrich和Enzyme Research Laboratories；通过本领域技术人员已知的和可得到的任何方法从人或哺乳动物血浆提取和纯化；得自由包含根据标准重组DNA技术引入的表达人或哺乳动物血浆蛋白质的基因的血浆或重组的组织培养物、病毒、酵母菌、细菌等衍生的上层清液或糊状物；和/或得自包含已经根据标准转基因技术引入的并且表达所需纤维蛋白原和/或所需纤维蛋白原活化剂的基因的转基因哺乳动物(例如山羊、绵羊、牛)的体液(例如血液、奶、淋巴、尿等)。
根据本发明的某些优选实施方案，纤维蛋白原是哺乳动物纤维蛋白原，例如牛族动物的纤维蛋白原、猪科动物的纤维蛋白原、绵羊的纤维蛋白原、马属的纤维蛋白原、山羊的纤维蛋白原、猫科动物的纤维蛋白原、犬科动物的纤维蛋白原、鼠科动物的纤维蛋白原或者人类的纤维蛋白原。根据其它实施方案，纤维蛋白原是鸟的纤维蛋白原或鱼的纤维蛋白原。根据任何这些实施方案，纤维蛋白原可以是重组生产的纤维蛋白原或转基因的纤维蛋白原。
根据本发明的某些优选实施方案，纤维蛋白原活化剂是哺乳动物的凝血酶，例如，牛族动物的凝血酶、猪科动物的凝血酶、绵羊的凝血酶、马属的凝血酶、山羊的凝血酶、猫科动物的凝血酶、犬科动物的凝血酶、鼠科动物的凝血酶和人类的凝血酶。根据其它实施方案，凝血酶是鸟的凝血酶或鱼的凝血酶。根据任何这些实施方案，凝血酶可以是重组生产的凝血酶或转基因的凝血酶。
作为一般的建议，在固体敷料中使用的纤维蛋白原和/或纤维蛋白原活化剂的纯度应该是相关技术领域技术人员已知产生蛋白质的最佳效力和稳定性的纯度。优选地，纤维蛋白原和/或纤维蛋白原活化剂已经经过多重的纯化步骤，例如沉淀、浓集、渗滤和亲和色谱法(优选免疫亲和色谱法)，以便除去在固体敷料的生产、储存和/或使用过程中引起纤维蛋白原和/或纤维蛋白原活化剂破碎、活化和/或降解的物质。优选通过纯化除去的这种物质的说明性实例包括蛋白质污染物，例如间-α胰蛋白酶抑制物和前-α胰蛋白酶抑制剂；非蛋白质污染物，例如脂质；和蛋白质和非蛋白质污染物的混合物，例如脂蛋白。
优选对在固体敷料中使用的纤维蛋白原活化剂的量进行选择，以便优化其效力和稳定性。同样地，对于固体敷料的特定应用的适合的浓度可以由相关领域技术人员凭经验决定。根据本发明的某些优选实施方案，在纤维蛋白原活化剂是人类的凝血酶时，采用的人凝血酶的量为2.50单位/mg纤维蛋白原组分和0.025单位/mg纤维蛋白原之间(所有数值都是±0.009)。其它优选实施方案涉及其中凝血酶的量为0.250单位/mg纤维蛋白原到0.062单位/mg纤维蛋白原的类似的固体敷料，以及其中凝血酶的量为0.125单位/mg纤维蛋白原到0.080单位/mg纤维蛋白原的固体敷料。
在使用固体敷料过程中，优选纤维蛋白原和纤维蛋白原活化剂在将敷料应用于受伤组织时被从出血性伤口流出的患者的内源流体活化。或者，在其中从受伤组织流出的流体不足以提供蛋白质层的充分水合的情况中，纤维蛋白原组分和/或凝血酶可以在将敷料应用于受伤组织之前或过程中通过适合的、生理学可接受的液体活化，所述液体任选地包含任何必需的辅因子和/或酶。
在本发明的一些实施方案中，止血层还可以包含一种或多种增补剂(supplements)，例如生长因子、药物、多克隆和单克隆抗体和其它化合物。这种增补剂的说明性实例包括但不限于以下纤维蛋白溶解抑制剂，例如抑肽酶(aprotonin)、氨甲环酸和ε-氨基己酸；抗生素，例如四环素和环丙沙星、阿莫西林、和甲硝唑；抗凝血剂，例如活化的蛋白C、肝素、前列环素、前列腺素(特别是(PGI2)、白细胞三烯、抗凝血酶III、ADP酶、和血纤维蛋白溶解酶原活化剂；甾体类，例如地塞米松和用于抑制炎症的前列环素、前列腺素、白细胞三烯和/或细胞分裂素的抑制剂；心血管药物，例如钙通道阻断剂、血管扩张剂和血管收缩剂；趋化物；局部麻醉剂，例如布比卡因；和抗增殖药/抗瘤药例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉酚和/或泰索帝；抗病毒药，例如丙氧鸟苷(gangcyclovir)、齐多夫定、金刚烷胺、阿糖腺苷、利巴韦林(ribaravin)、曲氟尿苷、阿昔洛韦、二脱氧尿苷、和病毒组分或基因产物的抗体；细胞因子，例如α-或β-或γ-干扰素、α-或β-肿瘤坏死因子、和白细胞介素；集落刺激因子；红细胞生成素；抗真菌剂，例如大扶康、酮康唑和制霉菌素；驱寄生虫剂，例如喷他脒；抗炎剂，例如α-1-抗-胰蛋白酶和α-1-抗凝乳蛋白酶；麻醉剂，例如布比卡因；镇痛药；防腐剂；激素；维生素和其它营养增补剂；糖蛋白；粘连蛋白；肽和蛋白质；碳水化合物(简单的和/或复杂的碳水化合物)；蛋白多糖；抗血管生成素；抗原；脂质或脂质体；寡核苷酸(有义和/或反义DNA和/或RNA)；和基因治疗剂。在本发明的其它实施方案中，如果存在，衬垫层和/或内部的支撑层可以包含一种或多种增补剂。根据本发明的某些优选实施方案，治疗性增补剂以大于其在纤维蛋白中的溶解度极限的量存在。
以下实施例只是说明性的，并不打算正如随后的权利要求定义的本发明的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本发明的方法进行各种修饰和改变而不脱离本发明的精神实质和范围。因此，本发明意在涵盖本发明的修饰和变体，条件是它们落入随后的权利要求及其等价物范围内。
具体实施方案 实施例
通过离体的猪动脉切开术(EVPA)性能试验测定敷料密封受损血管的能力，所述性能试验第一次描述在美国专利6,762,336中。EVPA性能试验评价敷料阻止流体流过猪动脉中的孔的能力。尽管在美国专利6,762,336中描述的方法已经被证明可用于评价止血敷料，但是它没能精确地复制体内成功所需的条件。更具体地，在美国专利6,762,336中公开的方法需要在37℃进行试验，而在实际情况中，伤口温度典型地低于该温度。这个降低的温度可以显著地减少纤维蛋白形成的速率及其在创伤患者中的止血效力。参见，例如，Acheson等人，J.Trauma 59865-874(2005)。美国专利6,762,336中的试验还没有要求敷料对损伤组织的高度粘着。因此，通过这种试验不能检测其中形成了纤维蛋白但是敷料没能紧紧地附着于组织的失败模式。另外，在治疗某些创伤患者的情况中，可能超过在该方法中所用的压力(200mHg)。总的说来，其结果是，必须进行典型地涉及小动物(例如大鼠和兔)的许多的动物试验，以便在大的动物、现实的创伤研究和在临床环境中正确地预测敷料性能。
为了使开发本发明所需的时间量和动物研究数最小化，开发了改进的离体试验方法。为此，对进行敷料试验的基础条件进行改变，并且试验参数的严重程度增加到包括在较低温度(即29-33℃对37℃，代表了现实的伤口温度的实际生理学攻击(Acheson等人，J.Trauma 59865-874(2005))、更高的压力(即250mmHg对200mmHg)、更长的试验时间(3分钟对2分钟)和更大尺寸的动脉损伤(美国专利6,762,336使用18号针刺扎，而修正的方法使用2.8mm到4mmx6mm的刺孔)的试验。
另外，开发新的试验来直接测量敷料对损伤组织的粘着。这两个试验都表现出改进的严格性，因此能够优于先前的离体试验并且效力上可以代替许多体内试验。
以下是用于以下实施例中的缩写的列表 CFB完全纤维蛋白原缓冲液(100mM氯化钠，1.1mM氯化钙，10mMTris，10mM柠檬酸钠，1.5％蔗糖，人血清白蛋白(80mg/g的总蛋白)和TweenTM80(动物来源的)15mg/g总蛋白) CTB完全凝血酶缓冲液(150mM氯化钠、40mM氯化钙、10mM Tris和100mM L-赖氨酸，外加100μg/ml的HSA) ERLEnzyme Research Laboratories EVPA离体猪动脉切开术 FD本发明的止血敷料 HSA人血清白蛋白 HD在美国专利6,762,336中公开的“夹层”血纤蛋白密封剂止血敷料 IFB不完全纤维蛋白原缓冲液。；不含HSA和Tween的CFB PETG乙二醇改性的对苯二甲酸乙二醇酯 PPG聚丙烯 PVC聚氯乙烯 TRIS三羟甲基氨基甲烷(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇) 实施例1
切取衬垫材料(DEXONTM)并且置于每个PETG 2.4X2.4cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。在CFB中配制纤维蛋白原(Enzyme Research LaboratoriesTM)。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5、31.7、25.9、20.16、14.4、8.64、和4.3mg/ml。在将2ml的纤维蛋白原递送到模具中时，这会产生13、11、9、7、5、3或1.5mg/cm2的纤维蛋白原剂量。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。调节凝血酶的浓度使得在如下所述与纤维蛋白原溶液混合时，组合物会产生包含0.1单位/mg纤维蛋白原的溶液。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于铜板上，铜板位于干冰的上面。为重复移液器填充纤维蛋白原，为第二重复移液器填充凝血酶。同时将2ml的纤维蛋白原和300微升的凝血酶分配到每个模具中。在为模具填充试剂之后，将它们冻结，然后返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时。然后将冻结的敷料置于预先冷却的GenesisTM冷冻干燥器(Virus，Gardiner，NY)中。将小室密封并且使温度平衡。然后将小室抽空并将敷料通过一级和二级的干燥周期冻干。
将敷料从冷冻干燥器取出，密封在箔袋中并且在试验前在室温下储存。随后，对敷料进行EVPA、粘着和重量试验的评价。
结果在以下表中给出并且用图表表示在图3A-3C中。
实施例2
如下生产单块的敷料切取衬垫材料并且置于每个PETG2.4X2.4cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。
对于所有的敷料，在CFB中配制ERL纤维蛋白原，批号3114。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。将凝血酶调节为递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于铜板上，铜板位于干冰的上面。为重复移液器填充纤维蛋白原，第二重复移液器填充凝血酶。同时将2ml的纤维蛋白原和300微升的凝血酶分配到每个模具中。在为模具填充试剂之后，将它们返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时，然后置于冷冻干燥器中。然后如上所述将敷料冻干。在完成之后，将敷料储存在包含5克干燥剂的低水分传递箔袋中。
如前所述使用与上述相同的材料生产三层的敷料。随后将敷料在100％相对湿度和37℃条件下放置不同的时间，以便使其相对的水分含量增加到期望的水平。对敷料进行视觉上的评价并且评价其手感和其它物理性质。在这种评价之后，对每个敷料的样本进行试验，以测定它们的水分含量。对其余的敷料进行EVPA、粘着和重量保持试验的性能试验。
结果
试验的结果在以下表中给出 表1本发明的固体敷料的性能数据 表2三层敷料的性能数据 表3本发明的固体敷料的完整性和手感特征
表4三层敷料的完整性和手感特征
结论
该单块敷料在非常高的水分水平能够充分地起作用。发现差不多28％的水分保持完全的功能性。在水分含量升高到44％时，敷料仍能起作用，然而它们的一些活性有所降低。更高的水分水平也可以保持一些功能。原始的敷料在2.5％的水分含量时不是柔软的，但是在水合之后具有其它所有所需性质，包括外观、平整表面、完整性、快速和不复杂的水合和光滑的外观。一旦水分含量增加到5.8％，单块敷料变得柔软，但是仍保持其功能性和合乎需要的特征。它们保持其柔软性，没有卷曲或损失其完整性或者看起来在水合之前形成过多的纤维蛋白。
这与三层敷料形成对照，所述三层敷料在添加水分时开始丧失其合乎需要的特征，并且在水分增加到33％时完全地丧失。
实施例3
对于使用衬垫的敷料，切取衬垫材料并且置于每个PETG2.4X2.4cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。对于没有衬垫材料的敷料，将PETG 2.4X2.4cm模具置于-80℃冷却器中至少60分钟。
对于所有的敷料，在CFB中配制ERL纤维蛋白原，批号3114。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。将凝血酶调节为递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于铜板上，铜板位于干冰的上面。为重复移液器填充纤维蛋白原，第二重复移液器填充凝血酶。同时将2ml的纤维蛋白原和300微升的凝血酶分配到每个模具中。在为模具填充试剂之后，将它们返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时，然后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将敷料冻干。
在EVPA试验中对两个组进行性能试验。另外，还在粘着和重量保持试验中试验具有衬垫的组。
结果 结论
用衬垫材料配制的敷料很好地起作用，所有的敷料都通过了EVPA试验，并且具有高的粘着和重量保持数值。没有衬垫材料的敷料在EVPA试验中不那么十分有效，然而令人惊讶的是它们的75％通过了EVPA试验。没有衬垫，未能进行其它试验。不使用衬垫制成的敷料成功地通过EVPA试验显示，这些敷料在处理动脉损伤方面是有效的，在处理静脉和小血管损伤方面甚至更有效。
实施例4
对于所有的敷料，在CFB中配制ERL纤维蛋白原，批号3130。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。将凝血酶调节为递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。对于内部分散有撕碎的VICRYL网状物的组，将这种支撑材料切割为大约1mmx1mm的碎片并且在填充模具之前分散在凝血酶溶液内。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。使用Luer锁紧套口终止端被去掉的由10或3mL聚丙烯注射器(Becton Dickinson)制成的圆柱状模具。将活塞分别抽出到6mL和2mL标记处。对于利用衬垫的敷料，切取支撑材料并且置于每个模具中并且向下按压，直到其与活塞邻接。在制备之后，将模具直立放置并用干冰包围，在顶部留有暴露的开口。将1ml纤维蛋白原和0.15mL凝血酶(内部分散有或没有衬垫材料)分配到10mL模具中，将1ml纤维蛋白原和0.15mL凝血酶(内部分散有或没有衬垫材料)分配到3mL模具中，使其冻结5分钟。然后将模具置于-80℃冷却器中，维持至少2小时，之后置于冷冻干燥器中并且如上所述低压干燥。
在从冷冻干燥器取出之后，将两个组都在改进的EVPA试验中进行性能试验。简而言之，塑料泡沫模型在动脉上滑动。这个覆盖物其中具有一个孔，与动脉和周围组织中的孔相对应。向敷料的表面添加温热的盐水并且将模具立即穿过泡沫中的孔传递到动脉表面。然后按下活塞并且用手保持3分钟，之后将模具撤回并继续按压活塞。这时，为动脉加压并且继续如前所述进行试验。
结果 结论
不包括衬垫或DEXONTM网状物衬垫的敷料很好地起作用，全部都通过250mmHg的EVPA试验。在整个组合物中分散有支撑材料时，敷料也很好地起作用，大尺寸(10mL模具)敷料保持完整的250mmHg压力，而较小的敷料保持150mmHg的压力。这表明支撑材料的使用是可选的，并且其位置可以随意地在敷料的‘衬垫’上，或者是分散在整个组合物中。
实施例5
如下生产在敷料的“背面”(即，不朝向伤口的侧面)上有支撑材料的敷料首先切取网状物支撑材料并将其放置在每个PETG 10X10cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。
对于在敷料的“正面”(即，朝向伤口的侧面)上有支撑材料的敷料，在模具中没有任何支撑材料的情况下生产这些敷料。在将纤维蛋白原和凝血酶分配在模具(参见以下)之后立即将支撑网状物置于敷料的顶上，并且在其冻结之前将其轻轻地按压到表面中。在所有其它方面，敷料的生产如下所述。
对于所有的敷料，在CFB中配制ERL纤维蛋白原，批号3114。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。将凝血酶调节为递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。将凝血酶调节为递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于铝板上，铝板位于干冰的上面。铝板具有在中间钻成的0.25英寸孔，并且连接有接头，以便一段管子可以连接于真空源。将模具在铝板中的孔上方居中并且打开真空。真空有两个作用阻止模具移动和保持其相对于铝板为平整的。将35毫升的纤维蛋白原和5.25毫升的凝血酶置于50ml试管中，反转三次并且倾倒在模具中。在如上所述填充模具并且施加支撑材料之后，将它们返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时，然后置于冷冻干燥器中。然后如前所述将敷料冻干。
在EVPA试验中对两个组进行性能试验。另外，还在粘着和重量保持试验中试验具有衬垫的组。
结果 结论
使用任何取向的衬垫材料配制的敷料都很好地起作用，所有的敷料都通过了EVPA试验，并且具有高的粘着和重量保持数值。这表明支撑材料可以随意地在敷料的‘背面’上，或者是在组合物的‘正面’。
实施例6
将衬垫材料(DEXONTM)置于PETG 2.4X2.4cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。
在CFB中配制纤维蛋白原(Enzyme ResearchLaboratoriesTM(ERL)，批号3114)。使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。在制备之后，在使用之前将纤维蛋白原置于冰上。
在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。用CFB调节凝血酶浓度以产生12.5单位/mg的纤维蛋白原(在混合时)，其相当于混合前的3120单位/ml的凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。
在分配之前的纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器取出并且置于在干冰上预冷的铜板上。为重复移液器填充纤维蛋白原，第二重复移液器填充凝血酶。同时将2ml的纤维蛋白原和300微升的凝血酶分配到每个模具中。在为模具填充试剂之后，将它们返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时，然后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。结果表示在图4A和4B中。
实施例7
将衬垫材料置于每个1.5X1.5cm PVC模具中。将15微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。将第二片PETG塑料配合在1.5X1.5模具的顶部并且固定就位。这样形成了封闭式模具。然后将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。在CFB中配制纤维蛋白原(ERL，批号3100)。使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。在制备之后，在使用之前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。使用CTB调节凝血酶浓度，以便递送以下量2.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.016、0.0125和0.01单位/mg的纤维蛋白原(在混合时)，其相当于在混合前的624、62.4、25、12.5、6.24、3.99、3.12、和2.5单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。然后将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。使用18号针在模具的顶部打3个孔。一个孔用于注射纤维蛋白原，第二个用于注射凝血酶，第三个孔用作通风孔，以便释放从模具内部置换出来的空气。然后为移液管填充纤维蛋白原，为第二移液管填充凝血酶。通过这些移液管将0.78ml纤维蛋白原和0.17ml的凝血酶同时注射到每个模具中。在填充之后，将模具置于液氮池的顶部30秒，然后返回到-80℃冷却器中至少2小时，之后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。
实施例8
将衬垫材料置于2.4X2.4cm PVC模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。在CFB中配制纤维蛋白原(ERL，批号3100)。使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。在制备之后，在使用之前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。使用CTB调节凝血酶浓度，以便递送以下量0.125、0.025、0.0125、0.00625和0.0031单位/mg的纤维蛋白原(在混合时)，其相当于在混合前的31.2、6.24、3.12、1.56和0.78单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为装配有18号针的3ml注射器填充2ml的纤维蛋白原，和为配有22号针的1ml的第二注射器填充0.3ml凝血酶。将两个注射器的内容物同时分配到每个模具中。在填充之后，将模具在液氮的顶部放置30秒，然后返回到-80℃冷却器中至少2小时，之后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。
实施例9
将衬垫材料置于2.4X2.4cm PVC模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。将包含3克纤维蛋白原(SigmaTMLot#F-3879)的小瓶从-20℃冷却器中取出并且在4℃放置18小时。然后将瓶子从冷却器取出并且使其回温到室温，维持60分钟。向瓶子中加入60ml的37℃的水并且将其在37℃混合15分钟。在处于溶液中之后，将纤维蛋白原在室温下相对于不完全纤维蛋白原缓冲液(IFB，为不含HSA和TweenTM的CFB)透析4小时。在四小时结束时，加入HSA到80mg/g总蛋白的浓度，和加入TweenTM80(动物来源的)到15mg/g总蛋白的浓度。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。然后使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/m。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。使用CTB调节凝血酶浓度以便递送以下量2.5、0.25、0.125、0.083和0.0625单位/mg的纤维蛋白原(在混合时)，其相当于在混合前的624、62.4、31.2、20.8和15.6单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为装配有18号针的3ml注射器填充2ml的纤维蛋白原，和为配有22号针的1ml的第二注射器填充0.3ml凝血酶。将两个注射器的内容物同时分配到每个模具中。在填充之后，将模具在液氮的顶部放置30秒，然后返回到-80℃冷却器中至少2小时，之后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。
实施例10
将衬垫材料置于2.4X2.4cm PVC模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。切取第二片的PETG塑料，以便安装在模具的顶部并且通过位于模具的每个端部的夹子固定就位，产生封闭式模具。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。在CFB中配制纤维蛋白原(ERL，批号3060)。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。使用CTB调节凝血酶浓度以便递送以下量2.5、0.25、0.125、0.083和0.062单位/mg的纤维蛋白原(在混合之后)，其相当于在混合之前的624、62.4、31.2、20.8和15.6单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为装配有18号针的3ml注射器填充2ml的纤维蛋白原，和为配有22号针的1ml的第二注射器填充0.3ml凝血酶。将两个注射器的内容物同时分配到每个模具中。在填充之后，将模具在液氮的顶部放置30秒，然后返回到-80℃冷却器中至少2小时，之后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。
实施例11
将衬垫材料置于2.4X2.4cm PVC模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。切取第二片的PETG塑料，以便安装在2.4X2.4模具的顶部并且通过利用位于模具的每个端部的夹子固定就位，产生封闭式模具。然后将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。将包含3克纤维蛋白原(SigmaTMLot#F-3879)的小瓶从-20℃冷却器中取出并且在4℃放置18小时。然后将瓶子从冷却器取出并且使其回温到室温，维持60分钟。向瓶子中加入60ml的37℃的水并且将其在37℃混合15分钟。在处于溶液中之后，将纤维蛋白原相对于IFB透析。在四小时结束时，加入HSA到80mg/g总蛋白的浓度，和加入TweenTM80(动物来源的)到15mg/g总蛋白的浓度。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。调节凝血酶浓度以便递送以下量2.5、0.25、0.125、0.1和0.083单位/mg的纤维蛋白原(在混合时)，其相当于在混合之前的624、62.4、31.2、24.96和20.79单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。然后将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为装配有18号针的3ml注射器填充2ml的纤维蛋白原，和为配有22号针的1ml的第二注射器填充0.3ml凝血酶。将两个注射器的内容物同时分配到每个模具中。在填充之后，将模具在液氮的顶部放置30秒，然后返回到-80℃冷却器中至少2小时，之后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。
实施例12
将衬垫材料置于2.4X2.4cm PVC模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。切取第二片的PETG塑料，以便安装在模具的顶部并且通过利用位于模具的每个端部的夹子固定就位，产生封闭式模具。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。
将包含3克纤维蛋白原(SigmaTMLot#F-3879)的小瓶从-20℃冷却器中取出并且在4℃放置18小时。然后使瓶子回温到室温，维持60分钟。向瓶子中加入60ml的37℃的水并且将其在37℃混合20分钟。在处于溶液中之后，将纤维蛋白原相对于IFB透析。在四小时结束时，加入人血清白蛋白(HSA)到80mg/g总蛋白的浓度，和加入TweenTM80(动物来源的)到15mg/g总蛋白的浓度。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。使用CFB将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。
在CTB中配制凝血酶。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。调节凝血酶浓度以便递送以下量2.5、0.25、0.125、0.08和0.06单位/mg的纤维蛋白原(在混合之后))，其相当于在混合之前的624、62.4、31.2、20.8和15.6单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为装配有18号针的3ml注射器填充2ml的纤维蛋白原，和为配有22号针的1ml的第二注射器填充0.3ml凝血酶。将两个注射器的内容物同时分配到每个模具中。在填充之后，将模具在液氮的顶部放置30秒，然后返回到-80℃冷却器中至少2小时，之后置于冷冻干燥器中。然后如下所述将它们冻干并且如下所述使用EVPA和粘着试验进行性能试验。
三层(夹层)敷料
使用在美国专利6,762,336中所述的方法，使用与生产上述单块敷料的纤维蛋白原和凝血酶的相同来源生产三层敷料。
结果
EVPA和粘着试验的结果分别表示在图4A和4B中。
结论(实施例6-12)
使用2.5到0.025凝血酶单位/mg纤维蛋白原生产的敷料在两个试验中都是有效的，而具有更大或更小的凝血酶与纤维蛋白原比例的那些无效。在2.5到0.05凝血酶单位/mg纤维蛋白原的范围观察到显著更大的活性。在0.25到0.062凝血酶单位/mg纤维蛋白原的范围内观察到大大改善的性能，而在0.125到0.08凝血酶单位/mg纤维蛋白原的范围内观察到最佳的性能。这与使用美国专利6,762,336中所述方法生产的敷料形成对比，所述使用美国专利6,762,336中所述方法生产的敷料在12.5凝血酶单位/mg纤维蛋白原时得到全部的性能，在凝血酶浓度降低到低于12.5凝血酶单位/mg纤维蛋白原时产生不可接受的性能，在1.4凝血酶单位/mg纤维蛋白原时实质上没有保留任何活性。在性能的极限和最佳水平的两方面的这种差异在已知如下的情况下是更加深刻的，即，美国专利6,762,336的三层敷料的性能随使用降低量的凝血酶而降低而本文中所述的敷料在这个范围内表现出增加的活性。
实施例13
切取衬垫材料并且置于每个PETG 2.4X2.4cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。在CFB中配制Enzyme Research Laboratories(ERL)纤维蛋白原，批号3114。另外，加入HSA到80mg/g总蛋白和加入Tween 80(动物来源的)到15mg/g总蛋白。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。在制备之后，在使用前将纤维蛋白原置于冰上。在150mM氯化钠、40mM氯化钙、10mM Tris和100mM L-赖氨酸中配制凝血酶，加入100ug/mL的人血清白蛋白。凝血酶的最终的pH为7.4+/-0.1。调节凝血酶以便递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。在制备之后，在使用前将凝血酶置于冰上。在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为重复移液器填充纤维蛋白原，第二重复移液器填充凝血酶。同时将2ml的纤维蛋白原和300微升的凝血酶分配到每个模具中。在为模具填充试剂之后，将它们返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时，然后置于冷冻干燥器中。将一组敷料在第0天冷冻干燥，而其余的敷料在-80℃冻结保存。将第二组敷料在第7天冷冻干燥并将第三组敷料在第十四天冷冻干燥。
在所有的敷料已经冷冻干燥之后，使用本文中所述的EVPA、粘着、和重量试验对它们进行试验。
结果 结论
充分混合的冻结的纤维蛋白原和凝血酶的组合物在7和14天保持稳定和有作用，性能没有明显的退化。预期更长的储存时间产生类似的结果。这些结果在图5A和5B中图解表示。
实施例14
切取衬垫材料并且置于每个PETG 2.4X2.4cm模具中。将25微升的2％蔗糖移液到衬垫材料的四个角中的每一个的顶部。在完成之后，将模具置于-80℃的冷却器中至少60分钟。
第1组敷料(不含白蛋白，不含Tween80)在100mM氯化钠、1.1mM氯化钙、10mM Tris、10mM柠檬酸钠、和1.5％蔗糖中配制Enzyme Research Laboratories(ERL)纤维蛋白原，批号3130。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。
第2组敷料(不含白蛋白，含Tween80)在100mM氯化钠、1.1mM氯化钙、10mM Tris、10mM柠檬酸钠、和1.5％蔗糖中配制ERL纤维蛋白原。加入Tween80(动物来源的)到15mg/g总蛋白。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。
第3组敷料(含白蛋白，不含Tween80)在100mM氯化钠、1.1mM氯化钙、10mM Tris、10mM柠檬酸钠、和1.5％蔗糖中配制ERL纤维蛋白原。加入HSA到80mg/g总蛋白。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。
第4组敷料(含白蛋白，含Tween80)在100mM氯化钠、1.1mM氯化钙、10mM Tris、10mM柠檬酸钠、和1.5％蔗糖(纤维蛋白原完全缓冲液)中配制ERL纤维蛋白原。另外，加入HSA到80mg/g总蛋白和加入Tween 80(动物来源的)到15mg/g总蛋白。纤维蛋白原的最终的pH为7.4±0.1。将纤维蛋白原浓度调节到37.5mg/ml。
在制备之后，在使用前将纤维蛋白原溶液置于冰上。
在150mM氯化钠、40mM氯化钙、10mM Tris和100mM L-赖氨酸中配制凝血酶，外加100ug/ml的HSA。凝血酶的最终的pH为7.4±0.1。将凝血酶调节为递送0.1单位/mg的纤维蛋白原或25单位/ml凝血酶。
在制备之后，在使用前将凝血酶溶液置于冰上。
在分配之前，纤维蛋白原和凝血酶的温度为4℃±2℃。将模具从-80℃冷却器中取出并且置于在干冰上预冷却的铝板上。为重复移液器填充纤维蛋白原溶液，第二重复移液器填充凝血酶溶液。同时将2ml的纤维蛋白原溶液和300微升的凝血酶溶液分配到每个模具中。在为模具填充试剂之后，将它们返回到-80℃冷却器中，维持至少2小时，然后置于冷冻干燥器中。
结果 结论
结果表明，加入白蛋白改善了敷料性能。加入Tween甚至进一步改善性能。二者的组合产生最好的性能。
EVPA性能试验
设备和备件 ·联机高压传感器(Ashcroft DuralifeTM或等效物) ·蠕动泵(Pharmacia BiotechTM，Model P-I或等效物) ·伏特计(CraftsmanTM Professional Model 82324或等效物) ·装备有用于记录压力或电压信息的软件的电脑 ·具有附着物的TygonTM管(各种尺寸) ·水浴(Baxter DurabathTM或等效物)，预设为37℃ ·保温室(VWRTM，Model 1400G或等效物)，预设为37℃ ·用于监控水浴和烘箱温度的温度计 ·各种镊子、止血钳、和剪刀 ·10cc.和20cc.注射器，在中心钻成大约0.6cm的孔和通过注射器和活塞两者的较小钻孔。钻入到注射器的末端中的这个孔用于保持活塞缩回和固定。
·O形圈(10和13号) ·用于配合10cc和20cc注射器的塑料套(长度大约3.5cm) ·具有端部的P-1000 PipetmanTM ·具有初生儿尺寸袖带和气囊的血压计 ·用于控制泵以保持所需压力分布的可编程序逻辑控制器(PLC)(任选地，如果需要可以使用手动控制)。
1.材料和化学品 ·猪的降主动脉(Pel-Freez BiologicalsTM，Catalog#59402-2或等效物) ·氰基丙烯酸酯胶水(VetbondTM，3M或等效物) ·18号针 ·0.9％盐水，保持在37℃ ·红色食用色素 ·血管穿孔器，2.8mm或其它尺寸 ·塑料卷 2.动脉的清洁和储存 1.在使用前将动脉在-20℃储存 2.在H2O浴中37℃将动脉解冻。
3.从动脉的外表面清理脂肪和结缔组织。
4.将动脉切为～5cm的段。
5.可以将动脉再冷冻到-20℃并且储存备用。
3.用于试验的动脉制备物 1.将动脉内翻外，使得光滑的内部壁朝向外。
2.使13号O形圈在20cc注射器上展开，或使10号O形圈在10cc注射器上展开，在一个侧面上钻成大约0.6cm(0.25in)的孔。
3.将动脉拉到注射器上，注意不要撕破动脉或产生太松的配合。动脉应该贴合地配合在注射器上。将相同大小的另一个O形圈滑动到注射器的底部上。
4.小心地拉动两个O形圈到动脉的两端上。O形圈的距离应该至少3.5cm。
5.用某些手术剪的刀刃，轻柔地刮削动脉的表面以便使动脉的表面变粗糙。
6.使用18号针在注射器柱体中的孔的位置上戳一个通过动脉的孔(参见上述说明) 7.将活体检查穿孔器的末端插入通过动脉中的孔。按下穿孔器的活塞以便在动脉中产生空心孔。重复几次以便确保孔是空心的并且没有结缔组织。
8.用侧支对孔进行修补。通常，这是通过从胶乳手套切取补丁并且用氰基丙烯酸酯胶水将其粘合在孔上来进行的。使胶水固化至少10分钟。
9.将动脉放置在温热的、加湿的容器中并且置于保温室中。使动脉温热至少30分钟。
4.溶液和设备准备 1.目视检查水浴和保温室保持在29-33℃。
2.确保在泵的容器中有足够的0.9％盐水以便完成一天的试验。如果需要，则添加更多的盐水。
3.将0.9％盐水和其中加入几滴红色食用色素的0.9％盐水加入到水浴的容器中，使得在进行试验之前将溶液温热。
4.通过用Kim WipesTM加衬里在保温室中准备用于温热动脉的容器并且加入少量的水以保持动脉湿润。
5.检查管子是否有气泡。如果发生气泡，打开泵并且允许0.9％盐水流动，直到除去所有的气泡。
5.敷料的施用 1.打开止血敷料小袋并且取出止血敷料 2.将止血敷料以网状物衬垫侧面向上放置在动脉中的孔上。
3.用适合于待试验制品的量的盐水慢慢地润湿止血敷料。
说明标准(13-15mg/cm2纤维蛋白原)2.4x2.4cm止血敷料应该用800μl盐水或其它血液代用品润湿。可以根据要进行的特定的实验的要求调节使用的盐水的量；然而，任何改变都应该记录在收集数据用表中。
说明滴加温热到29-33℃的0.9％盐水或其它血液代用品来润湿止血敷料，注意保持盐水从边缘流入在润湿特性方面的与阳性对照的任何明显的差异都应该记录在收集数据用表上。
4.轻柔地将塑料套放置在止血敷料上，注意使其平放在O形圈之间。轻轻地按压以确保就位。
5.用塑料卷包裹动脉和止血敷料 6.用血压袖带缠绕，注意使气囊与止血敷料邻接。
7.给气囊打气到100-120mmHg，并且监控压力，如果压力降低到低于100mmHg，则再次为其打气。将压力保持5分钟。
说明时间和压力可以根据实验的要求改变，从标准条件的任何变化都应该记录在收集数据用表上。
8.在聚合之后，小心地将动脉解卷并且记录止血敷料的状况。与阳性对照的任何变化都应该记录在收集数据用表上。
排除标准网状物衬垫必须保持在动脉中的孔上。如果其在聚合过程中有所移动，并且不能完全地覆盖孔，则必须将该止血敷料排除。
试验方法 1.试验设备组装的简图 试验设备的组装表示在图2中。可以利用一些另外的未表示的部件来读取(压力计)或控制系统内部的压力。
2.设备和动脉组件 用温热到37℃的红色0.9％盐水填充动脉和注射器，注意使注射器和动脉内的气泡量减到最少。在最高处开口的情况下注满动脉可以帮助减少气泡。将动脉和注射器连接于试验装置，确保管中的气泡尽可能少。应该校准蠕动泵，使其递送大约3ml/min。如果可用，PLC应该根据对于待试验制品的适合情况确定的预定的压力范围和保持时间操作。如果手动控制，则通过手动打开和关闭泵来遵循压力/时间特征，同时参照借助系统的一个或多个压力读数部件读取的系统压力。在试验结束后，对止血敷料进行对动脉的粘着和动脉孔中栓塞的形成方面的主观评价。与阳性对照的任何变化都应该记录在收集数据用表上。
成功标准
能够经受压力3分钟的止血敷料被认为是通过了试验。在止血敷料成功地通过试验时，应该立即停止数据收集，以便在试验结束时产生的动脉中压力的自然降低不会被包括在图中。如果操作者没能停止数据收集，可以将这些点从数据文件中删除，以避免将试验后发生的自然的压力下降与实际的敷料失败相混淆。从施用止血敷料到完成的整个试验期间必须落入预定的标准。达到的最大压力应该记录在收集数据用表上。
说明在一个步骤中的典型的攻击是250mmHg，3分钟，但是可以根据待试验的制品改变。对标准方法的改变应该记录在收集数据用表上。
失败标准
在试验过程中的任一点开始泄漏盐水的止血敷料被认为是在试验中失败。
说明由动脉膨胀引起构造失败可以忽略并且继续试验或再起动试验(只要总的试验时间没有落在确定的极限之外即可)。
在发生渗漏时，应该使压力降低到～20mmHg，之后停止数据收集，以便在图上容易地观察到失败。发生渗漏的压力应该记录在收集数据用表上。如果在实验中间由于设备故障停止了数据收集，则可以以5秒间隔手工收集数据，直到试验结束或止血敷料失败，无论那一个先发生。应该将数据点记录在收集数据用表的背面，明显地标记，并且手工输入到数据表中。
排除标准
如果总的试验时间超过了该方法所允许的最大时间，无论原因如何，得到的结果必须排除。如果有由于侧支不能通过修补或手指压力固定而产生的泄漏，则得到的结果必须排除。如果由于O形圈泄漏导致试验失败，则得到的结果必须排除。如果网状物衬垫没有完全地覆盖动脉中的孔，则得到的结果必须排除。
粘着性能试验 1.设备和备件 止血钳、猪的动脉和止血敷料(通常在EVPA试验完成之后，尽管其对于进行粘着试验不是必需进行的) I.动脉+敷料的准备
在没有完成EVPA试验的情况下施用敷料之后，敷料准备用于粘着试验和重量极限试验(如果适用)。在施用敷料和随后的EVPA分析之后，然后将动脉和注射器系统慢慢地从泵断开，使得溶液不会四处喷射。将来自EVPA试验的温热的红色盐水溶液保留在注射器中，直到粘着试验和重量极限试验(如果适用)完成。
粘着试验的性能 1.在准备动脉和敷料(经过或未经过EVPA分析)之后，轻轻地提起网状物的一个角并且对该角连接已知质量的止血钳。
说明如果FD在EVPA试验性能过程中形成了通道泄漏，则在止血敷料的对面进行粘着试验，以便得到的对总的粘着的更精确的评价。
2.轻轻地放开止血钳，注意不要使止血钳跌落或扭曲。转动注射器，使得止血钳在顶部附近并且允许止血钳以敷料所允许的尽可能远地剥离敷料。这通常在10秒内进行。在止血钳停止剥离敷料之后，根据以下标准为绷带的粘着打分 敷料性能评分 粘着的量 490+％ 375-90％ 250-75％ 1-50％ 0.5 只有栓塞保持止血钳 0没有粘着 排除标准
网状物衬垫必须保持在动脉中的孔上。如果其在聚合过程中有所移动，并且不能完全地覆盖孔，则必须将该止血敷料排除。
成功标准
粘着评分为3的敷料被认为是通过该试验。
失败标准
如果在施加之后或者在进行EVPA试验之前敷料没有粘着于动脉，则其打分为0并且粘着试验失败。如果敷料得到≤2的评分，则认为敷料在粘着试验中失败。
重量保持性能试验
在“粘着试验”的最初打分之后，然后可以以递增的方式为止血钳增加重量，直到网状物衬垫被完全地从动脉拉下来。然后记录敷料保持的最大重量，作为敷料可以保持附着于动脉的重量的测量值。
水分试验
使用Brinkman Metrohm Moisture Analyzer System进行水分试验。该系统包含以下独立部件，774烘箱样本处理器、774SC控制器、836 Titrando、5ml和50ml 800 Dosino Units和801搅拌器。使用用于数据收集、分析和储存的Brinkman Tiamo软件将系统连接于电脑。组装水分系统并且根据生产商的推荐和说明书运行，以便使用卡尔费希尔法测量冻干样本的水分含量。
将所有部件打开并且在使用前使其达到工作温度。运行乳糖和水作为标准样品和用于校准仪器。在机器成功地校准之后，如下准备样本。将重量为至少30mg的敷料碎片置于小瓶中并且盖上盖子。将小瓶按照编号顺序置于774烘箱样本处理器中，将一个空的有盖小瓶置于该环境空间(conditioning space)中。然后使机器运行，以测定对照和样本中的水分含量(残留水分)。
SDS-PAGE凝胶电泳
将每种敷料切割为四分之一，每个部分约50mg，并且将一个部分放置在15mL锥形管中。为了产生对照(即，时间0)，加入1.0mL的Okuda Dissolving Solution(10M尿素、0.1％十二烷基硫酸钠、0.1％β-巯基乙醇)。对于其余3个碎片，加入80μL的0.9％盐水以便润湿敷料。然后将碎片在37℃培养2、5、和10分钟或者所需的时间。为了在期望的时间停止反应，加入1.0mL的Okuda Dissolvingsolution。然后将样品在室温下培养过夜，然后在70℃培养30分钟。
为了准备用于加载在凝胶上的样品，将先前溶解在OkudaDissolving Solution中的样品加入到样品缓冲液中，使得20μL的等分试样包含10μg。然后将1μL的0.1M二硫苏糖醇加入到每个样品中。然后将20μl的每种稀释样品加载在10个孔的1.0mm厚的8％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上。然后使凝胶在140V运行，直到染料前沿到达凝胶的末端。然后将其取出并且在振动平台上的考马斯蓝着色剂(在ddH2O中含50％v/v甲醇、0.25％w/v考马斯亮蓝、10％w/v乙酸)中放置至少1小时。然后将凝胶转移到振动平台上的脱色溶液(25％甲醇、10％乙酸、65％ddH2O)中，直到背景几乎是无色的。
在脱色之后，对凝胶进行扫描，并且通过Scion密度试验软件分析γ-γ二聚物谱带和Aα和Bβ谱带，以便测定发生的转化的量。
权利要求
1.用于处理哺乳动物的受伤组织的固体敷料，其包括至少一个实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层是从包含所述纤维蛋白原组分和所述纤维蛋白原活化剂的单一水溶液形成的。
2.用于处理哺乳动物的受伤组织的固体敷料，其包括至少一个实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层被浇铸为整体的。
3.权利要求1或2的固体敷料，其另外包括至少一个支撑层。
4.权利要求3的固体敷料，其中所述支撑层包括衬垫材料。
5.权利要求3的固体敷料，其中所述支撑层包括内部支撑材料。
6.权利要求3的固体敷料，其中所述支撑层包括可再吸收的材料。
7.权利要求3的固体敷料，其中所述支撑层包括不可再吸收的材料。
8.权利要求7的固体敷料，其中所述不可再吸收的材料选自硅氧烷聚合物、纸、纱布和乳胶。
9.权利要求3的固体敷料，其另外在所述止血层和所述衬垫层之间至少包括生理学可接受的密封剂。
10.权利要求6的固体敷料，其中所述可再吸收的材料选自蛋白质材料和碳水化合物物质。
11.权利要求10的固体敷料，其中所述蛋白质材料为选自角蛋白、丝制品、纤维蛋白、胶原和明胶的至少一种物质。
12.权利要求10的固体敷料，其中所述碳水化合物物质选自海藻酸及其盐、壳多糖、脱乙酰壳多糖、纤维素、N-乙酰基氨基葡萄糖、蛋白多糖、羟基乙酸聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸/乳酸共聚物、及其两种或更多种的混合物。
13.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层还包含纤维蛋白交联剂和/或钙离子源。
14.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层还包含以下的一种或多种至少一种填料；至少一种增溶剂；至少一种发泡剂；和至少一种脱模剂。
15.权利要求14的固体敷料，其中所述填料选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、角蛋白、丝制品、纤维蛋白、胶原、明胶、白蛋白、聚山梨酯、壳多糖、脱乙酰壳多糖、海藻酸及其盐、纤维素、蛋白多糖、羟基乙酸聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸/乳酸共聚物、及其两种或更多种的混合物。
16.权利要求14的固体敷料，其中所述增溶剂选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、右旋糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、白蛋白、山梨酸酯、聚山梨酯、及其两种或更多种的混合物。
17.权利要求14的固体敷料，其中所述脱模剂选自明胶、甘露糖醇、山梨糖醇、聚山梨酯、山梨聚糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨酸酯、葡萄糖、及其两种或更多种的混合物。
18.权利要求14的固体敷料，其中所述发泡剂选自如下的混合物碳酸氢钠/柠檬酸、碳酸氢钠/乙酸、碳酸钙/柠檬酸、和碳酸钙/乙酸。
19.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层还包含至少一种治疗性增补剂，所述治疗性增补剂选自抗生素、抗凝血剂、甾体、心血管药物、生长因子、抗体(多克隆和单克隆的)、趋化物、麻醉剂、抗增殖剂/抗肿瘤剂、抗病毒药、细胞因子、集落刺激因子、抗真菌剂、驱寄生虫剂、抗炎药、防腐剂、激素、维生素、糖蛋白、粘连蛋白、肽、蛋白质、碳水化合物、蛋白多糖、抗血管生成素、抗原、核苷、脂质、脂质体、纤维蛋白溶解抑制剂、和基因治疗剂。
20.权利要求19的固体敷料，其中所述治疗性增补剂以等于或大于其在纤维蛋白中的溶解度极限的量存在。
21.权利要求3的固体敷料，其中所述止血层另外包含至少一种密封剂，其量对于改善所述止血层对所述支撑层的粘着是有效的。
22.权利要求21的固体敷料，其中所述密封剂选自蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、明胶、麦芽糖、聚维酮、脱乙酰壳多糖和羧甲基纤维素。
23.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层实质上是完全均质的。
24.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层是单块的。
25.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层已经被冻干。
26.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层具有至少6％的水分含量。
27.权利要求1或2的固体敷料，其中所述止血层具有小于6％的水分含量。
28.权利要求1或2的固体敷料，其中所述纤维蛋白原组分是哺乳动物的纤维蛋白原。
29.权利要求28的固体敷料，其中所述哺乳动物纤维蛋白原选自牛族动物的纤维蛋白原、猪科动物的纤维蛋白原、绵羊的纤维蛋白原、马属的纤维蛋白原、山羊的纤维蛋白原、猫科动物的纤维蛋白原、犬科动物的纤维蛋白原、鼠科动物的纤维蛋白原或者人类的纤维蛋白原。
30.权利要求1或2的固体敷料，其中所述纤维蛋白原组分选自鸟纤维蛋白原和鱼纤维蛋白原。
31.权利要求1或2的固体敷料，其中所述纤维蛋白原组分选自人纤维蛋白原、人纤维蛋白I、人纤维蛋白II、人纤维蛋白原α链、人纤维蛋白原β链、人纤维蛋白原γ链、及其两种或更多种的混合物。
32.权利要求28、30或31的固体敷料，其中所述纤维蛋白原选自重组产生的纤维蛋白原和转基因的纤维蛋白原。
33.权利要求28的固体敷料，其中所述哺乳动物纤维蛋白原以基于所述敷料的面向伤口的表面为1.5mg/cm2到13.0mg/cm2的量存在。
34.权利要求1或2的固体敷料，其中所述纤维蛋白原活化剂选自凝血酶、凝血酶原、蛇毒、及其任何两种或更多种的混合物。
35.权利要求34的固体敷料，其中所述凝血酶是哺乳动物的凝血酶。
36.权利要求35的固体敷料，其中所述哺乳动物的凝血酶选自牛族动物的凝血酶、猪科动物的凝血酶、绵羊的凝血酶、马属的凝血酶、山羊的凝血酶、猫科动物的凝血酶、犬科动物的凝血酶、鼠科动物的凝血酶和人类的凝血酶。
37.权利要求34的固体敷料，其中所述凝血酶选自鸟凝血酶和鱼凝血酶。
38.权利要求35或37的固体敷料，其中所述凝血酶选自重组产生凝血酶和转基因的凝血酶。
39.权利要求34的固体敷料，其中所述凝血酶以2.50单位/mg所述纤维蛋白原组分到0.025单位/mg所述纤维蛋白原组分的量存在。
40.处理哺乳动物的受伤组织的方法，包括为受伤组织放置权利要求1或2的固体敷料并且对所述敷料施加充分的压力，其持续时间足以形成足够的纤维蛋白以减少从所述受伤组织损失血液和/或其它液体。
41.实质上由纤维蛋白原组分、纤维蛋白原活化剂和水的混合物组成的组合物，其中所述混合物是冻结的并且在低于0℃的温度下稳定至少24小时。
42.权利要求41的组合物，其中所述混合物还包含以下的一种或多种至少一种密封剂、至少一种填料、至少一种增溶剂、至少一种发泡剂、和至少一种脱模剂。
43.权利要求41的组合物，其中所述混合物还包含至少一种治疗性增补剂，所述治疗性增补剂选自抗生素、抗凝血剂、甾体、心血管药物、生长因子、抗体(多克隆和单克隆的)、趋化物、麻醉剂、抗增殖剂/抗肿瘤剂、抗病毒药、细胞因子、集落刺激因子、抗真菌剂、驱寄生虫剂、抗炎药、防腐剂、激素、维生素、糖蛋白、粘连蛋白、肽、蛋白质、碳水化合物、蛋白多糖、抗血管生成素、抗原、核苷、脂质、脂质体、纤维蛋白溶解抑制剂、和基因治疗剂。
全文摘要
本发明公开了用于处理哺乳动物患者(例如人)的受伤组织的固体敷料，其包括实质上由纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂组成的止血层，其中所述止血层是由包含纤维蛋白原组分和纤维蛋白原活化剂的单一的水溶液浇铸或形成的。还公开了使用这些敷料处理受伤组织的方法和可用于制备这些敷料的止血层的冻结组合物。
文档编号A61F13/00GK101516301SQ200780035242
公开日2009年8月26日 申请日期2007年8月6日 优先权日2006年8月4日
发明者M·马科皮, D·伯尔 申请人:Stb救生技术公司