用于神经病况的生物标记的制作方法

专利名称：：用于神经病况的生物标记的制作方法
技术领域：
：本发明提供用于诊断患者的神经病况的方法，其包含从所述患者获得生物样本，和评估所述样本中至少一种选自由具有SEQIDNO:1-440的氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度，其中所述至少一种生物标记的丰度为神经病况的指示。
背景技术：
：阿兹海默氏病(AD)是一种主要与衰老有关的进行性脑退化疾病。AD是引起脑细胞逐渐丧失的若干病症之一，并且为引起痴呆的可能的主导原因之一。AD的临床表现的特征为记忆力、认知、推理、判断和定向能力的丧失。轻度认知障碍(MCI)通常为AD首先鉴别的阶段。随着疾病的进程，运动、感知和语言能力也受到影响，直到出现多种认知功能的全部损伤。这些认知丧失是逐渐发生的，但通常会在3年到20年时间里导致严重障碍且最终导致死亡。AD的早期诊断具有许多益处，包括作出使生活质量最佳选择的额外时间、较少的关于未知问题焦虑、从治疗中获益的良好时机以及较多的为将来计划的时间。然而，诊断AD的合理的非侵入性方法不可用。阿兹海默氏病是以脑中的两种主耍病理学观察资料为特征神经原纤维缠结(NFT)和主要由称为A(3肽的片段凝集物构成的(3-淀粉样斑块。患有AD的个体在脑中(P-淀粉样斑块)和脑血管中(P-淀粉样血管病)展现特有的(3-淀粉样沉积物以及神经原纤维缠结。神经原纤维缠结不仅出现在阿兹海默氏病中，而且还出现在其它痴呆诱发的病症中。尸检(目前诊断AD的唯一权威性方法)发现，大量这些损害是在人脑中对于记忆和认知极为重要的区域发现。迫切临床需要开发出可检测早期AD、尤其MCI阶段的诊断标记。尽管在P-淀粉样蛋白成像方而已取得进程(普雷斯提(Lopresti)等人，核医学杂志(J.Nud.Med.)(2005)46:1959-1972)，但并没有临床上可用的关于AD的血清生物标记。截至目前，尚无用于确诊严重神经退化性病症或监测进程的有效生物标记(卡斯特诺(Castano)等人，神经科学研究(Neurol.Res.)(2006)28:1155-163)。尽管致力于使用蛋白质组技术来发现AD的血液标记，并且历经数十年努力，但可能由于推定的高特异性AD标记被少量患病组织遮蔽，且预期其迅速被清除和代谢，而导致其呈现极低丰度，故关于鉴别有用标记的进程极为缓慢。此外，由于血液蛋白质组中诸如白蛋白等可以比低丰度靶生物标记高数百万倍的浓度存在的驻留蛋白占优势且因所述驻留蛋白质而变得复杂，故研究人员已避开血液研究。为此，研究人员已集中在研究脑脊髓液(CSF)作为AD生物标记的靶流体(参看张(Zhang)等人，阿兹海默氏病杂志(J.Alzheimer'sDisease)(2005)8:377-3386)。然而，CSF方法将临床应用局限于常规筛选。此外，脑血管血液循环以较高效率灌注AD病变，尤其在淀粉样血管病的情况下更是如此。
发明内容一方面，提供用于诊断患者的神经病况的方法，其包含从所述患者获得生物样本，和评估所述样本中至少一种选自由具有SEQIDNO:1-440的氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度，其中所述至少一种生物标记的丰度为神经病况的指示。在一个实施例中，生物标记的丰度高于对照样本的生物标记丰度。在另一实施例中，生物标记的丰度低于对照样本的生物标记丰度。所述方法还可在评估步骤之前包含从所述样本采集低分子量肽以产生至少--个包含所述肽的部分。生物标记可为与载体蛋白复合的低分子量蛋白质。在另一实施例中，低分子量蛋白质另外从所述载体蛋白纯化。在另一实施例中，低分子量蛋白质经消化且任选经测序。在一个实施例中，生物样本为血液、血清或血浆。在另一实施例中，评估步骤包含选自由以下组成的群组的分析质谱法，诸如串联质谱法(MSMS);免疫分析，诸如酶联免疫吸附剂分析(ELISA);免疫-质谱法；和悬浮珠粒阵列(suspensionbeadarray)。所述方法也可包含获得脑微血管病变的神经影像，其可任选使用磁敏感加权成像(susceptibilityweightedimaging)、灌注力卩权成像(perfusionweightedimaging)禾口磁共振波谱学(magneticresonancespectroscopy)获得。神经病况可为阿兹海默氏病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、稳定轻度认知障碍(稳定MCI)、进行性轻度认知障碍(PMCI)、血管性痴呆(VD)、血管病黑洞(angiopathyblackhole)、淀粉样脑血管病(CAA)和脑微出血。在一个实施例'l'，提供用于诊断患者的阿兹海默氏病的方法，其包含从所述患者获得生物样本，和评估所述样本中至少一种选自由具有以下氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度SEQIDNO:1、3-13、15、16、21、22、24-28、31-33、37-44、56-59、66-68、93-101、111-128、143-153、156-1170、172-183、263-279、310-335、348、355-359、362、363、365、372、373、376-402、406-426和436-44，其中所述至少一种生物标记的丰度为阿兹海默氏病的指示。另一方面，生物标记为与代谢路径或细胞过程有关的肽。在其它方面中，生物标记为与炎症、雌激素活性、色素上皮源性因子(pigmentepkhelium-derivedfactor,PEDF)、维生素D代谢和骨矿化、凝血和血小板活性、补体级联、酰基肽水解酶(APH)活性、维生素A和甲状腺素、磷脂酶活性、球蛋白活性、糖基化或经糖基化、蛋白酶抑制、角蛋白和相关蛋白、血红素降解、丙酮酸代谢、钙相关蛋白、防御素(defensin)、凝溶胶蛋白、玻璃粘连蛋白、前纤维蛋白、凝血栓蛋白、过氧化还原酶(peroxiredoxin)、醇脱氢酶、载脂蛋白、铁和铜代谢或NMDA受体相关蛋白有关的肽。另一方面，提供用于诊断患者的轻度认知障碍的方法，其包含从所述患者获得生物样本，和评估所述样本中至少一种选自由具有以下氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度SEQIDN0:2、4、14、17、23、29、34、45-55、60-65、69-92、102-110、129-142、154、155、171、184-191、193-226、248-279、281-320、333、336-347、349-354、360、361、364、366-371、374、375、403-405和427-435，其中所述至少一种生物标记的丰度为轻度认知障碍的指示。另一方面，提供用于诊断患者的脑微出血的方法，其包含从所述患者获得生物样本，和评估所述样本中至少一种选自由具有SEQIDNO:441-452的氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度，其中所述至少一种生物标记的丰度为脑微出血的指示。在一些实施例中，本发明的方法在评估步骤之前包含从所述样本采集低分子量肽以产生至少一个包含所述肽的部分。低分子量肽的尺寸可例如小于50KDa、小于25KDa或小于15KDa。所述方法还可包含诊断低分子量肽。所述消化可使用酶促或化学方式实现。在一个实例中，可使用胰蛋白酶消化所述肽。在其它方面中，提供对神经病况的生物标记具特异性的抗体，以及用于检测患者的神经病况的包含至少一种所述抗体的试剂盒。抗体可例如为单克隆或多克隆抗体，且也可为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。其它目的、特征和优势将从以下实施方式而显而易见。提供详细描述和特定实例仅出于说明的目的，因为所属领域技术人员通过此详细描述将对在本发明的精神和范围内的各种变更和修改显而易见。此外，所述实例将描述本发明的原理且预期将不会在所有实例中具体说明本发明的应用，其中其将明显有益于现有技术所属领域技术人员。无具体实施例方式已由与诸如白蛋白等载体蛋白结合的蛋白质的谱系发现作为神经病况的指示的低分子量(LMW)肽。评估患者样本中所述LMW肽的存在是例如在治疗期间检测神经病况和监测所述疾病的进程的有效方式。LMW肽尤其适用于在神经病况的早期期间对其进行检测。LMW肽尤其适用于检测AD、MCI和脑微出血。可使用所属领域中已知的多种方法检测作为生物标记的LMW肽。举例来说，可将抗体用于免疫分析中以检测生物标记的存在。例示性免疫分析例如包括ELISA、放射免疫分析、免疫荧光分析、"夹心"免疫分析("sandwich"immunoassay)、免疫蛋白印迹(westernblot)、免疫沉淀分析和免疫电泳分析。在其它方面中，可在检测LMW肽的过程中使用微珠、阵列、微阵列等分析。例示性分析包括(但不限于)悬浮珠粒分析(施文克(Schwenk)等人，"用于抗体蛋白质组学的高度复合的微珠分析中结合特异性的测定(Determinationofbindingspecificitiesinhighlymultiplexedbead-basedassaysforantibodyproteomics),"分子与细胞蛋白质组学(Mo/.Ce〃Prafeo附/")，6(1):125-132(2007))、抗体微阵列(博瑞拜克(Borrebaeck)等人，"使用抗体微阵列的高通量蛋白质纟fl学最新(High-throughputproteomicsusingantibodymicroarrays:anupdate),，'分子诊断学专家评论(Ex:戸"ev.Mo/.)7(5):673-686(2007))、适体阵列(沃尔特(Walter)等人，"高通量蛋白质阵列分子诊断学展望(High-throughputproteinarrays:prospectsformoleculardiagnostics)，"分子医学进程(7hwcfeMo/Met/.)8(6):250-253(2002))、亲和体阵列(affybodyarray)(尼伦伯格(Renberg)等人，"蛋白质捕获微阵列中的亲和体分子多结构域配体和不同检测型式的评估(Affibodymoleculesinproteincapturemicroarrays:evaluationofmultidomainligandsanddifferentdetectionformats),"蛋白质组学研究杂志(/iVWeowe6(1):17卜179(2007))和反相阵列(范米特(VanMeter)等人，"反相蛋白质微阵歹U:应用于生物标记发现和转化医学(Reverse-phaseproteinmicroarrays:applicationtobiomarkerdiscoveryandtranslationalmedicine),"分子诊断学专家评论U^eWWev.Mo/.D/ag".)7(5):625-633(2007))。所有这些出版物都是以引用的方式并入本文中。在另--实例中，本发明的生物标记可使用质谱法(MS)检测。此方法的-一个实例为串联质谱法(MS/MS)，其涉及通常由某种碎裂形式分开的多个质量选择或分析步骤。大部分此类分析都使用电喷雾电离，随后两阶段质量选择第一阶段(MSI)选择完整11分析物(母离子)的质量；且在通过用气体原子碰撞碎裂母离子后，第二阶段(MS2)选择特定母离子片段，共同产生所选反应监测阵列。在一个实施例中，使用碰撞诱导的解离由特定肽离子产生一组片段。碎裂方法主要产生沿肽键破裂的裂解产物。归因于碎裂的简易性，使得可将所观察到的片段质量与已知肽序列的预计质量数据库相比较。已描述多种不同的算法以从串联质谱(MS/MS)数据中鉴别出肽和蛋白质，包括肽片段指纹法(peptidefragmentfingerprinting)(SEQUEST、MASCOT、OMSSA禾QX!Tandem)、肽重新测序(PEAKS、LuteFisk和Sherenga)和基于序列标签的搜索(sequencetagbasedsearching)(SPIDER、GutenTAG)。同样，可使用多重反应监测(MRM)来鉴别患者样本中的本发明的生物标记。此项技术应用MS/MS法例如来胰蛋白酶消化输入样本，随后使用MS来分配所选离子并取样，从而通过跟踪代表分析物的胰蛋白酶片段的准确m/z离子来使分析物的选择更客观和分散。所述方法可执行多次，以致一次可测量多个离子，从而提供用于分析物测量的无抗体方法。例如参看安德森(Andersen)等人，分f浙潘應歪/^處邀学^Mo/era/w&Ce〃w/ar/Vw画zcs入5.4:573-588(2006);怀特克尔(Whiteaker)等人，歪^廣邀学坏,;;'染^a/VWeome尺^J6(10):3962-75(2007)。两份出版物都以引用的方式并入本文'l'。在另'实例屮，可使用纳流量反相液相色谱-串联质谱(nanoflowreverse-phaseliquidchromatography-tandemmassspectrometry)来检测本发明的生物标记。例如参看多蒙B(DomonB),艾伯索德R.(AebersoldR.)科学(Sc/e匿),312(5771):212-7(2006)，其以引用的方式并入本文中。使用此方法，技术人员通常通过胰蛋白酶消化获得肽片段，并且产生所述片段的质谱，随后将其与诸如SEQUEST等数据库相比较以进行蛋白质鉴别。另--方面，本发明的生物标记可使用免疫质谱法检测。例如参看利奥塔L(LiottaL)等人，临床研究杂志(JClinInvest.)，116(l):26-30(2006);尼德科夫(Neddkov),蛋白质组学专家评论(ExpertRev.Proteomics)，3(6):631-640(2006)，其以引用的方式并入本文中。免疫质谱提供一种快速测定患者样本内存在的肽生物标记同功异形体的准确尺寸和身份的方式。当发展为高通量诊断分析时，一滴患者的血液、血清或血浆都可用于微柱或微孔的高密度基质中，所述微柱或微孔填充有含有针对肽标记的固定多克隆抗体的复合底物。捕获含有表位的所有所述肽的同功异形体。通过质谱仪(诸如MALDI-TOFMS)直接洗脱和分析所捕获的包括分析物片段在内的分析物群。可将准确质量/电荷(m/z)位置处特定肽生物标记的存在用作诊断测试结果。可通过测定一系列12离子峰是否存在于指定m/z位置处的简单软件迅速执行分析。在另一实例中，可使用标准免疫分析基方法来检测本发明的生物标记，其中使用片段特异性抗体来测量并记录诊断片段的存在。例如参看纳亚(Naya)等人"前列腺癌的检测中前体前列腺特异性抗原同功异形体比率的评估(Evaluationofprecursorprostate-specificantigenisoformratiosinthedetectionofprostatecancer.)"内分泌月中瘤学(Ura/Onco/.)23(1):16-21(2005)。此外，所属领域技术人员熟知其它免疫分析，诸如ELISA(麦达(Maeda)等人，"关于石棉相关间皮瘤的血液测试(Bloodtestsforasbestos-relatedmesothelioma),"月中瘤学(O腳Zogy)71:26-31(2006))、微流控ELISA(李(Lee)等人，"微流控酶联免疫吸附剂分析技术(Microfluidicenzyme-linkedimmunosorbentassaytechnology),'，临床化学进程(美C7/w.C/ze附.)42:255-259(2006))、纳米悬臂免疫分析(nanocantileverimmunoassay)(克罗萨瓦(Kurosawa)等人，"用于环境监测的石英晶体微平衡免疫传感器(Quartzcrystalmicrobalanceimmunosensorsforenvironmentalmonitoring),"生物传感器与生物电子学(5/ose似5z'oe/e"raw),22(4):473-481(2006))和等离子体共振免疫分析(plasmonresonanceimmunoassay)(尼德科夫(Nedelkov),"表面等离子体共振质谱阵列平台的开发(DevelopmentofsurfacePlasmonresonancemassspectrometryarrayplatform),"分析化学(Xwfl/.CT;，.)79(15):5987-5990(2007))。所有出版物都以引用的方式并入本文中。在另-实例屮，本发明的生物标记可使用电化学方法检测。例如参看林(Lin)等人，分析科学(Anal.Sci.)23(9):1059-1063(2007)。在一个实施例中，LMW肽是在评估步骤之前从生物样本中采集。举例来说，可将100(xl血清与2xSDS-PAGE雷米里缓冲液(LaemmliBuffer)(含有200mMDTT)混合，煮沸10分钟并装载于包含5cm长的10%丙烯酰胺凝胶的制备池(PrepCell)(491型制备池，加州伯乐生命医学产品公司(Bio-RadLaboratories,CA))上。在250V的恒定电压下执行电泳。在从所述系统中洗脱出溴酚蓝指示剂染料后，LMW肽和蛋G质即从凝胶中迁移出来且将其捕集于洗脱室中的透析膜中。可用具有Tris-廿氨酸电泳缓冲液(runningbuffer)的相同组成的缓冲液以400ml/min的流速洗脱这些分子，并历时10分钟收集一份。或者，可使用捕获颗粒从样本采集LMW肽，所述捕获颗粒包含分子筛部分和分析物结合部分，如以引用的方式并入本文中的2006年9月27日申请的美国专利申请案第11/527,727号中所述。简单说来，分子筛部分或分析物结合部分或二者包含具有改变的孔隙度的交联区，或足以排除高分子量分子的孔径。在另一实施例中，在检测前将LMW肽消化，从而降低肽尺寸。所述消化可使用所属领域熟知的标准方法进行。例示性处理包括(但不限于)酶促和化学处理。所述处理可得到部分以及完全消化。酶促处理的一个实例为胰蛋白酶消化。本发明的生物标记尤其适用于在神经病况早期期间(诸如当所述病况仍与MCI或PMCI相联系)对其进行检测，或用于检测脑血管病变，诸如脑微出血。为说明起见，轻度认知障碍(MCI)病例在梅奥临床分类标准(MayoCliniccriteriaforclassification)分类为MCI-多区域损害(MCI-MCDI)，其具有以下特征i)通过经校正的逻辑记忆测试(correctedLogicalMemorytesting)或病史申述者的报导以及CDR=0.5所确定的记忆障碍。ii)日常生活活动正常；iii)正常的一般认知功能；iv)如通过标准分和教育所测量到的某一年龄的异常记忆；v)总CDR为0.5且无痴呆；vi)无明显血管问题、需胰岛素糖尿病或未受控制的高血压的过往史。同时，稳定轻度认知障碍(稳定MCI)是基于数项评估的总和分数(Sumofboxes)=0.5-3.5、CDR逻辑记忆障碍(其中至少一项评估表明逻辑记忆障碍)、不总在MCI范围内的神经心理学测试和临床判断。进行性轻度认知障碍(PMCI)表示在两个场合中患者的总和分数^3.5、与CDR完全一致的神经心理学测试、逻辑记忆原始分数低至零和临床判断。可通过如上文所述检测生物标记并且将生物标记的量与对照相比较来测量生物标记的丰度。生物标记的丰度为神经病况的指示剂。如果生物标记"没有对照丰富"，那么生物标记是以明显比在对照样本屮的量低的量存在于测试样本屮。如果生物标记比对照"更丰富"，那么生物标记是以明显比在对照样本中的量高的量存在于测试样本中。举例来说，差异可为5°/。、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1000%或更高。对照可为来自正常患者或处于已知疾病状态的患者的样本或其等效物。举例来说，对照可来自罹患AD、MCI或脑微出血的患者。对照也可为标准量或已知量的参考肽。所检测的神经病况可例如为阿兹海默氏病(AD)、轻度认知障碍(MCI)、稳定轻度认知障碍(稳定MCI)、进行性轻度认知障碍(PMCI)、血管性痴呆(VD)、血管病黑洞、淀粉样脑血管病(CAA)和脑微出血。除非另作指示，否则本文所述的病况和活性是指其通常认可的定义。举例来说，如实例中较为详细地描述，认知障碍是根据梅奥临床标准定义。在另一实施例中，生物标记为与代谢路径或细胞过程有关的肽。在其它实施例中，生物标记为与炎症、雌激素活性、色素上皮源性因子(PEDF)维生素D代谢和骨矿化、凝血和血小板活性、补体级联、酰基肽水解酶(APH)活性、维生素A和甲状腺素、磷脂酶活性、球蛋白活性、糖基化或经糖基化、蛋白酶抑制、角蛋白和相关蛋白、血红素降解、丙酮酸代谢、钙相关蛋白、防御素、凝溶胶蛋白、玻璃粘连蛋白、前纤维蛋白、凝血栓蛋白、过氧化还原酶、醇脱氢酶、载脂蛋白、铁和铜代谢或NMDA受体相关蛋白有关的肽。一方面，可同时评估一种以上生物标记。举例来说，以所述方法评估至少2种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少50种、至少75种、至少100种生物标记。分析一种以上生物标记可增加诊断的准确性。可将本发明的方法与神经成像技术组合用于检测与神经病况有关的神经病和脑微血管病变。举例来说，可使用神经成像检测与认知障碍有关的脑微出血。使用磁共振成像可检测继发于含铁血黄素残余物的病灶性信号强度减低。MR影像上的这些斑点称为"无效信号(signalvoid)"、"敏感伪影(susceptibilityartifact)"、"黑洞(blackhole)"、"小点(dot)"、"微出血(microbleed)"、"陈旧性微出血(oldmicrobleed，OMB)"、"多灶性信号减低损害(multifocalsignallosslesion)"或"微出血(microhemorrhage,MH)"。总的说来，这些斑点称为小的低信号(smallhypointensity，SH)且与AD和MCI有关(科尔多尼叶(Cordonnier)等人神经病学(Neurology)(2006)66:1356-1360;韦瑞格(Werring)等人大脑(Brain)(2004)127:2265-2275)。适当的MR成像技术包括梯度再聚焦回波T,(gradientrefocusedechoT2*，GRE-T2)和磁敏感加权成像(SWI)检测脑中代谢改变的神经成像方法也可与本发明的生物标记联合使用。可使用例如检测诸如谷氨酸、谷氨酰胺和Y-氨基丁酸(GABA)等神经递质的差异的MR波谱法来分析这些与神经病况有关的系统的改变。可将这些代谢改变与认知减退和生物标记丰度相关。可易于使用所属领域中熟知的方法制备对本发明的生物标记具特异性的抗体(参看，J.萨姆布鲁克(J.Sambrook)，E.F.福雷奇(E.F.Fdtsch)和T.曼尼提斯(T.Maniatis)，分子克隆实验室手册(M/ecw/arC/ow'"g,o丄a60rato7Mfl"做/),第2版，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),第18.7-18.18页，1989)。举例来说，可易于使用自动肽合成仪制备本发明的生物标记。接着，将完全弗氏佐剂(completeFreund'sadjuvant)中诸如(肽)n-KLH(n=l-30)等免疫原注射到免疫活性动物中，随后将悬浮于不完全弗氏佐剂中的相同免疫原先后两次注射到所述免疫活性动物中，在静脉内增强抗原后3天采集脾细胞。随后将所采集的脾细胞与Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合并使用直接结合ELISA分析所得克隆的培养物上清液的抗肽反应性。可通过使用原始免疫原的肽片段检测所产生的抗体的优良特异性。在某些实施例中，将一种或一种以上针对本发明的生物标记的抗体提供于试剂盒中以用于诊断方法中。所述试剂盒还可包含用于执行所述诊断方法的试剂、说明书和其它#口广叩o在其它方面中，本发明的生物标记和抗体适用于发现神经病况的新颖方面，诸如本文所述者。以下实例仅出于说明的目的，且不应将其解释为限制。另外，文中和本申请案全文所揭示的各参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。实例实例l.背景和患者概述所述研究募集103位来自社区的参与人员(75位MCI个体和28位认知正常的个体)。在起始的75位MCI个体中，经检查有20位因各种与痴呆无关的原因而排除，目前存留55位继续进行研究。根据如NINCDS-ADRDA标准所提供的临床痴呆分级量表(ClinicalDementiaRating,CDR)总和分数^3.5，其中有17位在0.5到4.1年的观察期里变痴呆(15%年转化率)(斯契夫(Schafer)等人阿兹海默氏病和相关病症(AlzheimerDisAssocDisord.)(2004)18:219-222;麦克汉(McKhann)等人神经病学(Neurology.)(1984)34:939-944)。28位认知正常的个体中有4位已进程至MCI类型，其巾有2位通过SWI检测到明显SH。2例MCI病例冃前正处于痴呆的边缘，其中有1例具有明显SH。SWI脑成像已显示17位痴呆且进行性认知障碍的个体中有7位具有增加且"大"量(n》5)SH。所述在脑叶中随后位于皮层-皮层下图案中SH的进行性增加使得诊断模式与"可能性CAA(probableCAA)"相符(克努森(Knudsen)等人神经病学(Neurology.)(2001)56:537-539)。此观察结果为时间上与CAA典型模式中SH增加相关的一小组散发性迟发型痴呆的首个前瞻性证据。个体选择在公布的记忆诊所筛选出1348位社区个体后，使用由梅奥诊所所定义的包括和排除标准2S位老年"对照"和75位患有MCI的个体有资格进行研究(彼得森RC(PetersenRC)等人，神经病学文献3月(ArchNeurol.Mar)(1999)56:303-308)。己利用连续认知(每年2次)和放射学(每年1次)程序持续评估个体历时4.1年(在0.5到4.10年的范围内，平均总随访时间2.3±1.2年，总随访的人年数为241.7年)。所有个体都给出知情同意且所有研究都获得洛玛连达大学伦理委员会(LomaLindaUniversityInstitutionalReviewBoard)批准。获得所有个体的完整药物治疗、医学和抽烟史且明确所有个体的甲状腺功能、血清B12含量和ApoE基因型。正常个体(n=28)所有"对照个体"都无客观或主观的记忆缺陷且在神经心理学测试中处于正常界限内(总CDR为0，CDR记忆分量为0且CDR总和分数为1或低于基线值)。将CDR总和分数用作认知能力(cognitiveperformance)的量度。(107)MCI个体(n=75)所有MCI病例在梅奥临床分类标准中分类为MCI-多区域损害(MCI-MCDI)，其具有以下特征i)通过经校正的逻辑记忆测试或病史申述者的报导以及CDR-0.5所确定的记忆障碍；ii)日常生活活动正常；iii)正常的一般认知功能；iv)如通过标准分和教育所测量到的某一年龄的异常记忆；v)总CDR为0.5且无痴呆；和vi)无明显血管问题、需胰岛素糖尿病或未受控制的高血压的过往史。据检查，有20位MCI个体出于各种原因而排除癌症2位、并存疾病(co-morbidity)1位、幽闭恐怖症2位、缺少护理支持/迁居9位、失去兴趣的5位和装起搏器的1位。认知测试所有认知评定都是在4周的MR评估时间内由同一组神经心理学家进行，且在约6个月间隔后进行再评估。己执行总计476次认知测试，其屮某些个体历经多达9项评估。认知测试组合包括CDR录像带(videotapedCDR)加下述逻辑记忆I、II;北美成人阅读测试(NorthAmericanAdultReadingTest);语言流畅性语音和语义；威斯康辛卡片分类测试(WisconsinCardSortingTest);连线测试A及B(TrailMakingTestA&B);波士顿命名测试(BostonNamingTest);画钟测试(Draw-A-Clock);抑郁特征组合形式II(DepressionFeaturesBatteryVersionII);禾U老年人抑有P量表(GeriatricDepressionScale)。每月2次评审放射学和认知评定结果。在极少数情况下，如果认知测试和神经学检査表明除AD外例如额颞痴呆(frontotemporaldementia)、进行性核上性麻痹(progressivesupranuclearpalsy)、原发进行性失语(primaryprogressiveaphasia)等病症发展，另卩么将所述个体从研究中去除。如果根据年龄和教育在标准数据上出现低于>1.5的标准差(SD)，那么神经心理学测试结果标注为异常。痴呆的诊断是建立在临床判断(共识会议)、NINCDS-ADRDA标准和CDR总和分数(SOB)》3.5的基础上。(107)各组的认知过程和当前神经心理学(NP)分类在过去4.1年里，已仔细地监测各组的认知过程且己形成5级分类(表5)。此分类为共分析MR和蛋白质组研究结果的矩阵。特别关注在观察中已进程至认知丧失(MCI)、"痴呆"或"进行性MCI"的MCI和对照病例。表5.5级认知NP分类正常总和分数=0到0.5。CDR记忆0，遵从临床判断。神经心理学测试过程中存在一些偶发的异常。逻辑记忆始终正常。_不稳定正常(U-normal):总和分数《1,但可变化。一些CDR记忆障碍的指示。基于临床判断的倾向上调或下调。神经心理学测试展现存在改良或减退的适度异常。临床判断。MCI:在数项评估中，总和分数=0.5-3.5。CDR逻辑记忆障碍，其中至少一项评估中逻辑记忆障碍。神经心理学测试不总在MCI范围内。临床判断。_不稳定MCI(U-MCI):总和分数从0.5变为3.5。神经心理学测试与总和分数一致。相当大的逻辑记忆障碍。展示下调倾向。临床判断。进行性MCI(PMCI)或轻度AD[有待证实]:在两个场合下总和分数》3.5。神经心理学测试与CDR—致。逻辑记忆原始分数低至零。临床判断。在检查多项NP评估结果后得出上述评分。仅一项评估在基线水平的个体归类为正常或MCI。表6.476次NP评估表评估次数123456789参与者数量97121726121532在不稳定正常和不稳定MCI组中发现认知操作的明显波动。不稳定MCI组具有痴呆发生场合的认知状态(CDR=3.5)但可利用药物治疗提高至3.0。已获得所有组的完整药物治疗史。表7.基线NP(最初两类)和根据表5的当前NP状态当前NP总计基线NP正常U-NormalMCIU-MCIPMCIn=28正常17740028n=75MCI194081775总计181644817103表7提供使用如由基础分类(entranceclassification)(正常或MCI)得出的5级分类的各组的当前NP状态。注意到正常进行性移动至MC且10例MCI移动至U-Normal和正常，25例MCI已移动至U-MCI(8)和PMCI(17)。设计人类试验以测定在痴呆发展期间MR和蛋白质组的改变。18材料和方法通过制备池采集低分子量蛋白质将100pl血清与SDS-PAGE上样缓冲液(loadingbuffer)混合，煮沸10分钟并装载到制备池(伯乐公司，加州)上。2小时电泳后，低分子量蛋白质迁移出凝胶并将其洗脱到收集管中。纳流量反相液相色谱-串联MS(nanoRPLC-MS/MS)进一步使从制备池洗脱的蛋白质通过去污剂清除微量试剂盒(detergentclean-upmicrokit)普洛斯平(ProteoSpin)(加拿大诺冠公司(Norgen,Canada))以去除洗脱缓冲液中会干扰质谱分析的SDS。利用lOmMDTT还原已清洁的蛋白质，用50mM碘乙酰胺将其垸基化并在37'C下用胰蛋白酶(来自普洛麦格公司(Promega))消化过夜。进一步通过固相分离小柱(Sep-Pakcartridge)(马萨诸塞州沃特世公司(Waters,MA))纯化经胰蛋白酶消化的肽，并通过使用线性离子阱质谱仪(LTQ，热电公司(The廳Elect憩)，加州圣何塞(SanJose,CA))的反相液相色谱纳米喷雾串联质谱进行分析。在分离柱具有激光拉制尖端的100内径(i.d.)X10cm长熔融石英毛细管(泊利米克技术公司(PolymicroTechnologies),亚利桑那州菲尼克斯(Phoenix，AZ))中内部填充有5、200埃孔径C18树脂(麦克科姆生物技术公司(MichromBioResources)，加州)浆液。注射样本后，用流动相A(0,4%乙酸)洗涤柱5分钟，并且使用0%流动相B(0.4%乙酸，80%乙腈)到50%流动相B的线性梯度以250纳升/分钟将肽洗脱30分钟，随后以50%流动相B到100%B的线性梯度再洗脱5分钟。LTQ质谱仪以数据依赖性模式操作，其中每次全MS扫描后为5次MS/MS扫描，其中动态地选择5种最丰富的分子离子用于使用35%的标准化碰撞能进行碰撞诱导的解离(CID)。也可使用利用热电LTQ仪器(ThermoLTQinstrument)的ETD法。与传统的碰撞诱导的解离(CID)相反，ETD法(斯卡(Syka)等人美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(2004)101:9528-9533)在MS-MS分析中通过电子转移实现肽碎裂。已证实ETD在由较大、较高电荷状态的肽(包括完整小蛋白质)以及具有翻译后修饰(PTM)的肽提供较易于解译的MS-MS序列数据方面比CID有效。(科恩(Coon)等人美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(2005)102:9463-9468)。CID与ETD分析的新颖组合可增强肽鉴别的生产率。实例2:血清蛋A质组分析分离LMW蛋白质在首次血清蛋白质组研究A中，通过还原和烷基化(DTT、碘乙酰胺)随后蛋白质19消化，接着LTQ质谱来制备100)LiL全血清样本等分试样以供高效液相色谱/质谱(LC-MS)分析。对于随后的研究B和C，由各血清样本制备由低分子量(LMW)蛋白质组成的蛋白质组亚组以减少蛋白质混合物的复杂性。通过SDS-PAGE分离所得LMW蛋白质，且通过考马斯染色(Coomassiestaining)使蛋白质显像。对于研究B,样本是由从14-15位个体(对照、MCI和PMCI)汇集的血清样本组成。利用改良的LMW分离，收集分子量为25kDa的血清蛋白并通过SDS-PAGE分离。对于研究C，制备由5位已由对照进程至MCI(l个样本)和由MCI进程至PMCI的个体取得的血清样本，以得到LMW蛋白质，并且使用热电杂交LTQ-Orbitrap质谱仪执行LC-MS分析。这代表着MS
技术领域：
的技术现状且提供与LTQ相比的数个优势，诸如所获取的前体肽分子离子波谱的优良的高质量分辨率和质量准确性。数据分析和结果。使用SEQUEST搜索算法针对公共人类蛋白质数据库(NCBI)搜索MS-MS波谱以获得匹配。研究A的结果仅鉴别出含量丰富的血清蛋白。所述结果导致关注低分子量(LMW)血清蛋白(研究B)。50kDa的临界值不足以降低蛋白质的复杂性，且TCA蛋白质沉淀引起不可接受的蛋白质损失。因此，每组使用相对大量(14)的个别个体血清样本的汇集样本进行研究B的高质量分析。此研究将对照与MCI与PMCI样本/个体组屮所鉴别出的LMW蛋白质相比较。此定性分析鉴别出候选生物标记(丰度不同的蛋白质)。研究C的目的在于鉴别具有不同丰度的LMW血清蛋白，其与MCI向PMCI进程(4位个体；4对样本)以及对照向MCI进程(l位个体；l对样本)的诊断相关。这10个样本的分析产生对超过500种蛋白质的鉴别。在个体组中，个体问的apoE基因型无显著差异。通过比较串联质谱(MS2扫描)的数量确定候选生物标记蛋白，所述串联质谱与对应于数据库中源蛋白的肽序列相匹配，针对所述数据库可搜索数据。相对于丰度较低的蛋白质，丰度较高的蛋白质将由酶消化而产生数量更多且更丰富的肽，且这些肽通常会引起较多匹配的MS2波谱。以此方式，MS2波谱的数量(称为"波谱计数")为混合物中蛋A质的相对丰度的近似量度(分析化学(AnalyticalChemistry),76(14),4193-4201(2004))。丰度不同的候选蛋闩质的评估集中在相对于一组样本，在另一组样本中产生50%或更高波谱计数差异的蛋白质。研究结果展示于表8-10中。实例3:脑微出血的检测在两个地方(底特律MRI生物医学研究所(DetroitMRIInstituteforBiomedicalResearch,DMRI)和洛玛连达大学(LLU))但目前主要在LLU由评定者(其为使用同一方案的计划的组成人员且对临床状态未知)独立地进行SH计数。一次评审一个2mm切片的SWI滤波位相影像(SWIfilteredphaseimage)中SH的存在。在数据评审过程中，使用所有幅值的影像，即高通(HP)滤波位相影像和对比增强的SWI幅值影像。并排放置影像以鉴别出SH，并且使用HP滤波位相影像以用上述和下述评审对其进行标记，以检查血管连接。如图2中所示，一个切片可含有一个以上SH，随后用不同色彩边界突显出每一SH。不再对在先前切片中展现SH外观的任何切片进行重新计数。对SH赋予切片和序列编号、尺寸(1-3、3-5、>5mmO.D.)和解剖学位置。由于微动脉瘤中血液收集产生明显无效信号，故无法利用血管壁中及/或外周的血液来辨别微动脉瘤。蛛网膜下和脑沟血管空隙、对称局灶性基底神经节信号丧失不予计数。被鉴别为与脑微出血有关的生物标记呈现于表11中。实例4:对生物标记的进一步评估可使用多种方法进一步评估本发明的生物标记。除传统的生物验证分析外，也可使用质谱方法。一种验证方法为使用对候选蛋白质具特异性的市售抗体对血清样本进行的免疫蛋白印迹分析(Westernassay)。如果抗体没有巿售，那么可易于使用所属领域中熟知及本文'I'揭示的方法制备。此夕卜，可使用三级四极杆质谱(triplequadruplemassspectrometry,TQMS)技术进一步评估生物标记。所述技术使用多重反应监测(MRM)，其由(1)利用第级四极杆检测和选择分子离子；(2)在第二级四极杆中使这些离子碎裂；和(3)在第三级四极杆中检测少量已知片段的离子组成。通过分析得到分析物的分子量和片段离子的相对丰度，其可表征分析物结构和色谱洗脱时问(LC/MS)。现代TQMS仪提供具有较高分辨率和准确质量测量的先进MRM性能、在大量所选分析物与所监测的碎裂质量之间转换的快速电子设备并且易于使用。LC/TQMS固有的优势包括高检测灵敏度、较大的动态检测响应范围和并入稳定的经同位素标记的耙分析物合成类似物的能力(此允许良好的定量分析性能)(安德森(Anderson),分子和细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)(2006)5:573-588;弗雷文(Frewen)等人分析化学(Anal.Chem.)(2006)78:5678-5684)。可如在发现阶段利用掺加的内标物以及经同位素标记的生物标记的合成类似物来增进所述研究。此外，可使用自动进样器和其它方法来增大通量(例如，基于平板的样本肽富集且在LC/MS前去除)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>蛋白质名称蛋白质登录号蛋白质分子量(Da)SEQIDNO:肽序列经计算肽质量(AMU)肽起始编号肽终止编号人]068657.1l，gi|4503689|ref|NP_000499.1|纤维蛋白原，a多肽同功异形体cx前蛋白原[智人]gi|11761629|reflNP068657.1|,别4503689|ref]NP—000499.1169739164HRHPDEAAFFDTASTGK1886.88511527纤维蛋白原，a多肽同功异形体cc前蛋白原[智人〗gi|117616291rel]NP068657.I|.gii45036f9|reflNP000499.1|69739165TFPGFFSPMLGEFVSETESR2265.05528547凝溶胶蛋白同功异形体a前体[智人]gi|4504165|reflNP05(H68.1|85680166DSQEEEKTEALTSAK1665.78714728凝溶胶蛋白同功异形体a前体[智人]gi|4504165|ref]NP000168.1|—85680167EVQGFESATFLGYFK1722.84148162凝溶胶蛋白同功异形体a前体[智人]gi|4504165|ref!NP000168.1185680168FDLVPVPTNLYGDFFTGDAYVILK2704.397699凝溶胶蛋白同功异形体a前体[智人]gi|4504165|ref]NP000168.1185680169HVVPNEVWGR1275.72178188凝溶胶蛋白同功异形体a前体[智人]gi|4504165|ref!NP000168.11—85680170PNSMVVEHPEFLK1526.774961乙型肝炎病毒受体结合蛋白(片段)Q6PYX138143172GQGTTVTVSSASTK1323.68922乙型肝炎病毒受体结合蛋白(片段)Q6PYX138143173GTTVTVSSASTK.1138.601122富含组氨酸糖蛋白前体[智人]gi|4504489|reflNP000403.11一59559174ALDLINKR942.573441富含组氨酸糖蛋白前体[智人]gi|4504489|ref)NP000403.11一59559175DGYLFQLLR1124.614452富含组氨酸糖蛋白前体[智人]gi|4504489|reflNP000403.1159559176DSPVLIDFFEDTER1682.79140153富含组氨酸糖蛋白前体[智人]gil4504489|reflNP000403.11—59559177GEVLPLPEANFPSFPLPHHK2226.17467486富含组氨酸糖蛋白前体[智人]gi|45044891ret，NP000403.]1一59559178HPLKPDNQPFPQSVSESCPGK2349.13487507200780040753.3络滔*^56/125M<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>在超过33%的正常个休或轻度AD患者中发现正常与轻度AD之间的差异超过50%(具有阳性鉴别的平均样本屮)小于L00E-03的概率分数登录号名称概率MW稳定正不稳定正常(稳稳定轻度AD轻度不常正常定+不稳MCI平[平均样AD与定平均样l平均样定)均样本]本正常常本本平均样(n-5)(n=12)比较稳(n=3)(n=4)本j正(n=7)比较尸765W尸￡7—Hf/M^VU5￡-Wi^563.ft卯汰卯汰卯ft"0.67fl%辰虜基齿激薪^蚤《激蘑尸227"C尸JV2—//X/AM7V么(。￡"-0760576"ft卯ftWft卯汰60.58/W%fl%M"7"^2;嚴應^r遂嚴蘑w多應"g6ZF^^6Zr。J5U9￡-M』7595.2ft卯A卯ft卯ftM0.500%7卯％/卯％俊定歪力F丄W，(Q9fi7/2么53￡-似W7S7.4汰Wft卯汰卯ft^0.337湘％0%/卯％7卯％f2州犯；>/^667W)Z44//t/M47V262五-似"SS7./A卯A附汰卯A2fl汰B7卯％7W%7卯％柳％25%柳％溺柳％J%馬25%柳％7卵7,/卯溺25%/卯％/卯200780040753.3势溫也^86/1253定常轻5较稳正与度比稳正与度g不定常轻5比定s轻D较稳M与度M比定与定比稳常t-不正稳M较定常稳a较稳正与定M比稳正与定常<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表9.MCI和轻度AD患者的候选生物标记的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>舒織虔靜激贿转595595〃663-70/5%纤楚歪離《多，辦形併《69739葳歪贿似/25篤S7//9旭微駒飾770"6772似柳2202ZJ-53i微鮮激l邀鄉转簡？，-2基腐/a船/转薦6tf/fl一柳％扁鄉#激47/躯/〃""fl。/7-57/%巡綠还丽Bf雄还扁2遷。渭％,微表这膽发受沐聘力週/////-2駕表9续PMCI/不稳定登录号MCIMCIMCI-差异(GI—编号)蛋白质名称MW397531667397531667MCI+PMCIMCIPMCIPMCI%(22fl-4/卯％^賓凝f或丰l^"麼J^^^W7遂众犮fi("#荐歪冷入颠聘力flfl-'柳％二赝歸激嚴'转A/"7"52fl-柳％坤"fltfflfl722-2柳％緣'毅定激/萝乂/篇0flflfl2fl2-2層％染色银/#成激虔裾"/#^2//2乂7;fl2-2柳％^源廢教朦3厨劝^系伴5""聘乂/tf/2-27歸M关鸟嚴麼激麽，#022-27麵200780040753.3转滔齿被92/125:K<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>微激船，聘乂/基序錄鄉？存激鹿^—24442fl5>-2駕/躯/辦教遂翻纖曹乂/5￥湖75/25224-4-A沐成分战i歪/^效,乂/""外-57%gi|31542984间-oc(球蛋ft)抑制剂H4[智人]1033402440001010010100%gi|55956899角蛋白9[智人]620486170001414014100%gi|62739186补体因子H同功异形体a前体13905242410011101982%gi|21735614载脂蛋白Ll同功异形体a前体439573310108了i675%gi|22091452载脂蛋ClM[智人]212364421013103了54%gi|24234699角蛋白io[智人]58811871133342681853%表9续登录号蛋白质名称MW397MCI667397PMCI/不稳667MCI+PMCIMCIPMCIMCI-PMCI差异％(GI—编号)S31定MCI531gi|7^5931hect结构域和RLD5[智人]1168343321111183545%gi|17318569角蛋白1[智人]66050367435848103866%gi|21071030alB-糖蛋白[智人]5423531219136了37%gi|4505733血小板因子4(趋化因子108281313107775736211526%(C-X-C基序)配体4)[智人]gi|4557393补体成分8，Y多肽[智人]22201253664232416188125636233%gi|4504349卩球蛋白[智人]15980289100110109619576449926523431%gi|32130518载脂蛋白C-II前体[智人]1126641%268385215464940524416125%gi|4503635凝血因子li前体[智人]70019139141111633627914%gi|32483410维生素D结合蛋白前体[智人i52卯0910127710553124713%gi|34878902人J中心粒周物质1[智人]228284111100431250%<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>P20701ITALHUMAN2.34E-041287380.000.000.000.600.08100%100%0%100%100%76%100%100%(P2001)整合素a-L前体(白细胞粘附糖蛋白LFA-1a链)Q8N549Q8N549(Q8N549)9.74E-05279150.000.250.140.400.0847%26%100%100%23%66%50%100%假定蛋白C8orf36P09758TACD2—HUMAN3.03E-0435686.60.670.250.430.400.083%67%45%25%23%66%50%78%(P0975&肿瘤相关钙信号转导子2前体(P表9续P10643C07—HUMAN1.10E-0493457.30.000.500.290.800.2547%7%100%100%23%520/o33%100%(P10^43)补体成分C7前体表10:不同患者群中生物标记的分析全血清登录号名称研究集经鉴别波谱/样本数击中的样本/样本数0(n=3)1(n=4)2(n=5)4(n=12)0(n=3)1(n=4)0+1(n=7)2(n=5)4(n=12)LMW—b:登录号名称研究集经鉴别波谱正常(n=14)MCI(n=14)PMCI(n=14)200780040753.3转溢也被99/1253<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>权利要求1.一种用于诊断患者的神经病况的方法，其包含a)从所述患者获得生物样本；和b)评估所述样本中至少一种选自由具有SEQIDNO1-440的氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度，其中所述至少一种生物标记的丰度为神经病况的指示。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记的丰度大于对照样本中生物标记的丰度。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记的所述丰度小于对照样本中生物标记的丰度。4.根据权利要求1所述的方法，其另外包含在所述评估步骤之前，从所述样本中采集低分子量肽以产生至少一个包含所述肽的部分。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记为与载体蛋白复合的低分子量蛋白质。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述低分子量蛋ft质进一步从所述载体蛋A纯化。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述低分子量蛋白质经消化且任选经测序。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本为血液、血清或血浆。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述评估步骤包含选自由质谱法、免疫分析、免疫-质谱法和悬浮珠粒阵列组成的群组的分析。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫分析为酶联免疫吸附剂分析(ELISA)。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述质谱法包含串联质谱法(MSMS)。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经退化性疾病选自由以下组成的群组a)阿兹海默氏病(Alzheimer'sdisease);b)轻度认知障碍；c)稳定轻度认知障碍；d)进行性轻度认知障碍；e)血管性痴呆；f)血管病黑洞；g)脑淀粉样血管病；和h)微出血。13.根据权利要求l所述的方法，其进一步包含获得脑微血管病变的神经影像。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述神经影像是由选自由以下组成的群组的方法获得a)磁敏感加权成像；和b)磁共振波谱。15.—种用于诊断患者的阿兹海默氏病的方法，其包含a)从所述患者获得生物样本；和b)评估所述样本中至少一种选自由具有以下氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度SEQIDNO:1、3-13、15、16、21、22、24-28、31-33、37-44、56-59、66-68、93-101、111-128、143-153、156-1170、172-183、263-279、310-335、348、355-359、362、363、365、372、373、376-402、406-426和436-44;其中所述至少一种生物标记的丰度为阿兹海默氏病的指示。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记为以下肽(i)与炎症有关且具有SEQIDNO:28、368-373和390-401的氨基酸序列；(ii)与维生素D代谢和骨矿化有关且具有SEQIDNO:331和427-435的氨基酸序列；(iii)与凝血和血小板活性有关且具有SEQ1DNO:24、102-110、157-165、350-354和376-389的氨基酸序列；(iv)与补体级联有关且具有SEQIDNO:117-120、129-138、139-142和330的氨基酸序列；(v)与球蛋白活性有关且具有SEQ1DNO:76-92、144-153的氨基酸序列；(vi)经糖基化/与糖基化有关且具有SEQIDNO:23、50-55、46-49、174-183、193-201和376-389的氨基酸序列；(vii)与蛋白酶抑制有关且具有SEQIDNO:50-55、193-201和376-389的氨基酸序列；(viii)与角蛋A和相关蛋闩有关且具有SEQIDNO:154-155、202-319和336-338的氨基酸序列；(ix)与血红素降解有关且具有SEQIDNO:93-98的氨基酸序列；(x)与丙酮酸代谢有关且具有SEQIDNO:363的氨基酸序列；(xi)与钙相关蛋白有关且具有SEQIDNO:14、372-373和402的氨基酸序列；(xiii)与防御素有关且具有SEQIDNO:355-358的氨基酸序列；(xii)与凝溶胶蛋白有关且具有SEQIDNO:166-170的氨基酸序列；(xiv)与玻璃粘连蛋白有关且具有SEQIDNO:436-440的氨基酸序列；(xv)与前纤维蛋白有关且具有SEQIDNO:360的氨基酸序列；(xvi)与凝血栓蛋白有关且具有SEQIDNO:405的氨基酸序列；(xvii))与过氧化还原酶或醇脱氢酶有关且具有SEQIDNO:340-347的氨基酸序列；(xviii)与载脂蛋白有关且具有SEQIDNO:66-75的氨基酸序列；(xix)与铁和铜代谢有关且具有SEQIDNO:406-425的氨基酸序列；或(xx)与NMDA受体相关蛋白有关且具有SEQIDNO:35-36的氨基酸序列。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物标记为具有选自由SEQIDNO:93-98、139-142、166-170、348、355-358、402和406-425组成的群组的氨基酸序列的肽。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物标记的所述丰度小于对照样本中生物标记的丰度。19.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物标记的丰度大于对照样本中生物标记的丰度。20.根据权利要求15所述的方法，其进一步包含获得与阿兹海默氏病有关的脑微血管病变的神经影像。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述神经影像是由选自由以下组成的群组的方法获得a)磁敏感加权成像；和b)磁共振波谱。22.根据权利要求15所述的方法，其另外包含在所述评估歩骤之前，从所述样本中采集低分子量肽以产生至少一个包含所述肽的部分。23.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物标记为与载体蛋白复合的低分子量蛋白质。24.根据权利要求23所述的方法,化。25.根据权利要求24所述的方法，26.根据权利要求5所述的方法，27.根据权利要求15所述的方法,其中所述低分子量蛋白质进一步从所述载体蛋白纯其中所述低分子量蛋白质经消化且任选经测序。其中所述生物样本为血液、血清或血浆。其中所述评估步骤包含选自由质谱法、免疫分析、免疫-质谱法和悬浮珠粒阵列组成的群组的分析。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫分析为酶联免疫吸附剂分析(EUSA)。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述质谱法包含串联质谱法(MSMS)。30.—种用于诊断患者的轻度认知障碍的方法，其包含a)从所述患者获得生物样本；和b)评估所述样本中至少一种选自由具有以下氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度SEQIDNO:2、4、14、17、23、29、34、45-55、60-65、69-92、102-110、129-142、154、155、171、184-191、193-226、248-279、281-320、333、336-347、349-354、360、361、364、366-371、374、375、403-405和427-435;其中所述至少一种生物标记的丰度为轻度认知障碍的指示。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物标记的所述丰度小于对照样本中生物标记的丰度。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物标记的丰度大于对照样本中生物标记的丰度。33.根据权利要求30所述的方法，其进一步包含获得与阿兹海默氏病有关的脑微血管病变的神经影像。34.根据权利要求33所述的方法，其'|—'所述神经影像是由选自由以下组成的群组的方法获得a)磁敏感加权成像；和b)磁共振波谱。35.根据权利要求30所述的方法，其另外包含在所述评估歩骤之前，从所述样本中采集低分子量肽以产生至少一个包含所述肽的部分。36.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物标记为与载体蛋白复合的低分子量蛋白质。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述低分子量蛋白质进一歩从所述载体蛋白纯化。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述低分子量蛋白质经消化且任选经测序。39.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物样本为血液、血清或血浆。40.根据权利要求30所述的方法，其中所述评估步骤包含选自由质谱法、免疫分析、免疫-质谱法和悬浮珠粒阵列组成的群组的分析。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述免疫分析为酶联免疫吸附剂分析(ELISA)。42.根据权利要求40所述的方法，其中所述质谱法包含串联质谱法(MSMS)。43.—种用于诊断患者的脑微出血的方法，其包含a)从所述患者获得生物样本；和b)评估所述样本中至少一种选自由具有SEQIDNO:441-452的氨基酸序列的肽组成的群组的生物标记的丰度，其中所述至少一种生物标记的丰度为微出血的指示。44.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物标记的所述丰度小于对照样本中生物标记的丰度。45.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物标记的丰度大于对照样本中生物标记的丰度。46.根据权利要求43所述的方法，其进一步包含获得与阿兹海默氏病有关的脑微血管病变的神经影像。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述神经影像是由选自由以下组成的群组的方法获得a)磁敏感加权成像；和b)磁共振波谱。48.根据权利要求43所述的方法，其另外包含在所述评估歩骤之前，从所述样本巾采集低分子量肽以产生至少一个包含所述肽的部分。49.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物标记为与载体蛋白复合的低分子量蛋白质。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述低分子量蛋白质进一歩从所述载体蛋白纯化。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述低分子量蛋白质经消化且任选经测序。52.根据权利要求43所述的方法，其中所述生物样本为血液、血清或血浆。53.根据权利要求43所述的方法，其中所述评估歩骤包含选自由质谱法、免疫分析、免疫-质谱法和悬浮珠粒阵列组成的群组的分析。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述免疫分析为酶联免疫吸附剂分析(ELISA)。55.根据权利要求53所述的方法，其中所述质谱法包含串联质谱法(MSMS)。56.—种抗体，其对选自由具有SEQIDNO:1-440的氨基酸序列的肽组成的群组的肽具特异性。57.根据权利要求56所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或嵌合抗体。58.—种用于检测患者的神经病况的试剂盒，其包含至少一种根据权利要求56所述的抗体和关于其储存或使用的说明书。全文摘要已发现低分子量(LMW)肽，其为诸如阿兹海默氏病(Alzheimer′sDisease，AD)、认知障碍和脑微出血等神经病况的指示。评估患者样本中所述LMW肽的存在是检测神经病况和监测所述疾病进程的有效方式。所述LMW肽尤其适用于在不采取侵入性程序的情况下在早期期间检测神经病况。文档编号A61K38/10GK101636175SQ200780040753公开日2010年1月27日申请日期2007年11月1日优先权日2006年11月1日发明者伊曼纽尔·彼得里科因,克劳迪乌斯·米勒,兰斯·廖塔,周卫东,弗吉尼娅·埃斯皮纳,沃尔夫·基尔希,真垣绅雄,马克·罗斯申请人:乔治梅森知识产权公司;洛玛琳达大学