专利名称：：苣荬菜提取物在制备治疗缺血性心脑血管病新药中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，是关于植物苣荬菜提取物在制备新药中的用途。
背景技术：
：苣荬菜为菊科植物苣荬菜(sonchusbrachyotusDC)的全草，属多年生草本植物。苣荬菜分布很广，在我国主要产于山东、河北、陕西、山西、吉林、辽宁、黑龙江等地，民间常作为野菜食用。其性寒味苦，具有清热解毒、凉血利湿、消肿排脓、化瘀止痛之功效，民间常用于治疗急性痢疾、阑尾炎、肠炎、产后出血、痔疮、肿痛等症，花入药可用于治疗黄疸型肝炎。近年来文献报道了苣荬菜对病毒性肝炎有显著疗效，并对肝损伤具有明显的保护作用。对苣荬菜的化学成分也作了很多研究，根据文献报道苣荬菜的主要化学成分有脂类、烷烃类、萜类、甾体类、黄酮类、氨基酸类、蛋白质和多种微量元素等。苣荬菜在我国分布广泛，植物资源丰富，其中的黄酮、萜类等有效成分有很强的药理活性、但国内对苣荬菜的药理作用和临床应用的研究尚不够深入，尤其是在治疗心血管病、脑血管病等药物中的用途未见文献报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种苣荬菜提取物在制备治疗缺血性心、脑血管病药物中的用途。本发明的解决方案是从苣荬菜植物中提取药用有效部位-苣荬菜提取物，该提取物中以芦丁计其总黄酮含量在50%以上。申请人用本发明的苣荬菜提取物进行了急毒和药效试验，观察了苣荬菜提取物对小鼠耐缺氧作用，对饥饿小鼠存活时间、对大鼠颈动脉血栓形成、对大鼠血液流变学、对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血、对冠脉结扎所致犬急性心肌缺血、对大鼠急性脑缺血的影响，以及对麻醉犬脑血流量及脑血管阻力的影响。一、苣荬菜提取物对小鼠耐缺氧作用的影响取雄性小鼠40只，雄随机分为空白对照组、苣荬菜提取物大、小剂量组(12.5、6.3g/kg)(按生药计，下同)、阳性药复方丹参片组(3.0g/kg)，每组10只。一次性灌胃给药，空白对照组给予等量蒸馏水。药后20min快速将小鼠放入事先备好的密闭广口瓶内，记录小鼠自入瓶开始至死亡时的存活时间为小鼠耐缺氧时间(以小鼠呼吸停止为死亡指标)。结果表明，与空白对照组相比，苣荬菜提取物大、小剂量均能明显延长小鼠的耐缺氧存活时间(P<0.05，表1)，表明其可减少缺氧小鼠氧消耗，增加耐缺氧能力。表l苣荬菜提取物对小鼠耐缺氧作用的影响(％±A77=10)组别剂量存活时间(g/kg)(mirO空白对照组11.4±2.7苣荬菜提取物12.520.8±4.4'1苣荬菜提取物6.316.5±2.5h复方丹参片3.016.0±3.9h与空白对照组比较b代O.05二、苣荬菜提取物对饥饿小鼠生存时间的影响取健康小鼠40只，雌雄各半，同上随机分为四组。灌胃给药，给药量为0.5mL/20g体重，每日l次，给药期间禁食不禁水，空白对照组给予等量蒸馏水，观察至动物全部死亡。记录小鼠的生存时间。结果苣荬菜提取物大剂量可以明显延长饥饿小鼠的生存时间(P<0.05)，小剂量组亦有延长趋势。表明苣荬菜提取物可明显延长饥饿小鼠的生存时间(表2)。表2苣荬菜提取物对饥饿小鼠生存时间的影响(X土s，flO)iliSi存活时间(g/kg)__^~3.9±0.512.55.0±1.2h6.34.3±1.03.05.4±1.2b与空白对照组比较"代o.三、苣荬菜提取物对大鼠颈动脉血栓形成的影响取雄性大鼠40只，同上随机分为4组，每日灌胃给药l次，给药体积为1.0mL/100g，连续7d，正常对照组给予等体积的蒸馏水。末次给药后1h开始实验。通过刺激电极给予2mA直流电刺激以损伤动脉内皮细胞。随着动脉管腔内血栓逐渐形成，血流逐渐被阻断，当血流完全阻断时，显示动脉血管堵塞时间，即为血栓形成时间。从表3可以看出，苣荬菜提取物大、小剂量均可显著延长大鼠颈动脉血栓的形成时间，表明其具有明显抗血栓形成作用。空白对照组苣荬菜提取物苣荬菜提取物复方丹参片表3苣荬菜提取物对大鼠颈动脉血栓形成的影响(X士s，^10)组别剂量(g/kg)血栓形成时间(mirO空白对照组苣荬菜提取物苣荬菜提取物复方丹参片3.21.61.513.6±2.625.6±5.8C17.1±3.lh30.7±6.2C与空白对照组比较代0.05，c代O.01四、苣荬菜提取物对大鼠血液流变学的影响取雄性大鼠40只，随机分为4组，分组及给药方法同上。末次给药后lh从颈静脉窦取血2mL加入抗凝管中，用血液黏度仪测定全血血液粘度。从表4可以看出，苣荬菜提取物可以显著地降低大鼠高、中、低切变率的血液粘度，表明苣荬菜提取物具有明显改善血液粘度的作用。表4苣荬菜提取物对大鼠血液流变学的影响(X土s，r10)组别剂量(g/kg)血液粘度(mPa.s)200/s50/s1/s空白对照组苣荬菜提取物苣荬菜提取物复方丹参片一4.62±0.233,23.47±0.33c1.64.02±0.58°1,53.77±0.15c5,53±0.344.08±0.37c4.59±0.42c3.92±0.27.44±2.7615.51±1.31c18.29±0.97c13.21±0.82c与空白对照组比较173(0.01五、苣荬菜提取物对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血的影响取雌雄大鼠40只，随机分为4组，分组及给药方法同上。于末次给药1.5h后，记录标准II导联心电图，作为基础心电图对照，然后尾静脉注'射垂体后叶素0.5U/kg，立即记录注射垂体后叶素后5、10、15、30s、1、2、3min的心电图，观察T波、ST段和心率的变化。以心电图出现下列指标一项者即为阳性心肌缺血J点升高1.5mv以上，T波低平(降低原T波高度50%以上)、双向、倒置，ST段水平下移0.5mv，心律不齐。结果表明，苣荬菜提取物大、小剂量组均可明显减少由垂体后叶素所致的急性心肌缺血阳性率(P<0.05，表5)。表5苣荬菜提取物对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血的保护作用_(fIO)_^~~^SJi心肌缺血(％)一且乂"_(g/kg)阴性率_阳性率空白对照组==^5苣荬菜提取物3.2802(T苣荬菜提取物1.6604(T复方丹参片组1.58515。与空白对照组比较e代0.01六、苣荬菜提取物对冠脉结扎所致犬急性心肌缺血的影响健康犬15只，雌雄兼有，随机分为苣荬菜提取物2g/kg，阳性药复方丹参片lg/kg及心肌缺血模型组。手术分离冠状动脉左前降支近1/2处，引线备用。结扎冠脉后30min记录心外膜电图，计算30个导联ST段移位的总值(2-ST)及ST段移位超过2mv的导联数(N-ST)作为药前值。十二指肠给药，给药体积为10.0ml/kg，缺血模型组给予等体积的蒸馏水。分别记录给药开始后不同时间的心外膜电图，计算S-ST、.N-ST及其变化率。同时取静脉血检测CK-MB、CK、AST、LDH。给药后4h，进行心肌染色，计算出梗塞区面积占缺血区心肌面积的百分比。结果表明，与模型组相比，苣荬菜提取物可明显改善心肌缺血程度(P〈0.05，表6-9)。表6.苣荬菜提取物对犬急性心肌缺血程度(E-ST)的影响(n=5，X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表7.苣荬菜提取物对犬急性心肌缺血范围(N-ST)的影响(n=5，X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表9.苣荬菜提取物对犬急性心肌缺血心肌酶谱的影响(n=5，X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>七.苣荬菜提取物对麻醉犬脑血流量及脑血管阻力的影响健康犬20只，随机分为4组，即苣荬菜提取物大、小剂量组(2.0、1.0g/kg)，阳性对照尼莫地平组5mg/kg和正常对照组，每组5只。动物按常规麻醉。仰卧固定，分离气管，插管，同时分离一侧颈总动脉及其分支、颈外动脉、颈内动脉和枕动脉。结扎颈总动脉分支、颈外动脉和枕动脉。将血流计探头置于颈总动脉上，记录颈内动脉血流量，以颈内动脉血流量代表脑血流量。然后分离股动脉，插管，连接压力换能器，记录血压(平均动脉压)。针电极刺入四肢皮下，记录II导联心电图。将以上指标同步记录于十六导生理信号记录分析系统，同时计算脑血管阻力、心率。脑血管阻力按平均动脉压/脑血流量计算。十二指肠给药。术后稳定30min，待血压和血流量稳定后，记录脑血流量、平均动脉压和心电图作为药前值。然后经十二指肠插管给药。给药体积为4ml/kg。空白对照组给予等体积的蒸馏水。分别记录给药后15、30、60、120、180、240min的各项指标的变化。结果苣荬菜提取物大剂量组给药后30-240min，小剂量组给药后120-240min可明显增加麻醉犬脑血流量，与空白对照组比较有显著性差异(P〈0.05)。尼莫地平给药后15-120min也明显增加犬脑血流量。结果见表10。苣荬菜提取物大剂量组给药后30-240min明显降低麻醉犬脑血管阻力(P〈0.05)，小剂量组给药后120min开始出现降低脑血管阻力的作用，180min时作用明显(P<0.05)。结果见表ll。苣荬菜提取物大、小剂量组对麻醉犬平均动脉压、心率和心电图各指标无明显影响。表10.对麻醉犬脑血流量(m丄/min)的影响(X±s,n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注与空白对照组比较'P<0.05，MP<0.05200810016943.8敦通*被10/163<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>八.苣荬菜提取物对大鼠局灶性脑缺血的保护作用健康雄性大鼠60只，随机分为5组，即空白对照组、阳性药尼莫地平(10mg/kg)、苣荬菜提取物大、小剂量组(3.2、L6g/kg)4个试验组，每组12只。一次性灌胃给药，给药体积为1.0mL/100g体重，正常对照组给予等体积的蒸馏水。给药后1h参照Longa和Laing的方法制备大脑中动脉梗塞模型(MCAO)。大鼠麻醉后，于颈部作约2cm切口，分离出右颈总动脉及分支颈内、外动脉，结扎颈外动脉，进而分离并结扎颈内动脉进耳分支。于颈总动脉(近内、外颈动脉分叉处)上作一切口，由此沿颈内动脉插入一根头端加工成圆珠状(直径〈0.30mm)尼龙线，插入约17mm(由颈内、外动脉分叉处起算)，用缝线固定尼龙线。缝合颈部肌肉、皮肤后回笼词养。观测指标及检测方法神经功能缺损评分于MCAO术后24h参考Longa等的评分标准0分,无明显神经病学症状；l分，不能完全伸展右侧前肢；2分，行走时向右侧旋转；3分，行走时向右侧倾倒；4分，无自主活动，并伴意识障碍。神经病学评分后立即断头处死大鼠，迅速取脑，生理盐水漂洗后置-20。C冰箱中冷冻30min，做连续脑组织冠状切片，2%TTC生理盐水溶液染色测定缺血梗死面积，计算其占总面积的百分比。结果见表12.表12.苣荬菜提取物对局灶性脑缺血大鼠神经学评分和梗塞面积的影响(X±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注与脑缺血模型组比较，*P〈0.05'**P〈0.01;结果表明，苦苣菜提取物大剂量组可明显降低局灶性脑缺血大鼠的神经学评分及大脑及皮层的梗塞面积，表现出较好的脑缺血保护作用。九苣荬菜提取物对大鼠急性脑缺血的保护作用雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组，分别为假手术组、脑缺血模型组、苣荬菜提取物大、小剂量组(3.2、1.6g/kg)、阳性对照药芪龙胶囊组(0.2g/kg)。每组10只。每日灌胃给药l次，给药体积为1.0ml/200g，假手术组和脑缺血模型组均给予等体积的蒸馏水，连续7天。末次给药后lh，腹腔麻醉大鼠，颈部正中切口，分离两侧颈总动脉，双重结扎(假手术组仅穿双线但不结扎)，造成急性不完全性脑缺血。结扎后3h快速断头取脑，称脑湿重，计算脑指数，然后置于11(TC烤箱中烘烤72小时至恒重，计算脑含水量。结果苣荬菜提取物大剂量组可降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑指数和脑含水量，表明苣荬菜提取物可减轻大鼠急性不完全性脑缺血所引起的脑水肿，亦对大鼠急性不完全性脑缺血具有保护作用。结果见表13。表13.对急性不完全性脑缺血大鼠脑指数、脑含水量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注与假手术组比较，*P〈0,05，**P〈0.01;与脑缺血模型组比较，aP<0.05八、安全药理及毒性实验研究1.安全药理试验表明，苣荬菜提取物2g/kg十二指肠给药对犬的呼吸、血压及心电图均无明显影响。2.苣荬菜提取物最大给药量试验一次性灌胃给予苣荬菜提取物100g/kg后动物无明显毒性反应，小鼠体重增长良好，无动物死亡。结果详见表14。表14.苣荬菜提取物灌胃给药对小鼠体重的影响(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>试验结果表明本发明釆用常压耐缺氧、饥饿小鼠生存时间、电刺激诱发血栓形成模型、药物和冠脉结扎致急性心肌缺血、急性脑缺血模型等实验方法，观察苣荬菜提取物的心血管、脑血管药理药效活性。结果表明，苣荬菜提取物灌胃给药12.5g/kg和6.3g/kg均能明显增加小鼠常压下耐缺氧存活时间，亦能延长饥饿小鼠的生存时间。3.2g/kg可明显降低大鼠血液粘度，延长大鼠体内血栓形成时间。苣荬菜提取物3.2g/kg和1.6g/kg对由垂体后叶素所致冠状动脉痉挛引起的大鼠急性心肌缺血具有明显的拮抗作用。苣荬菜提取物2g/kg可明显减轻冠脉结扎所致犬急性心肌缺血程度，对犬急性心肌缺血具有明显的保护作用。苣荬菜提取物大、小剂量组可明显增加麻醉犬脑血管流量、降低脑血管阻力的作用。苣荬菜提取物3g/kg可降低急性不完全性脑缺血大鼠的脑指数和脑含水量，亦对大鼠急性不完全性脑缺血具有保护作用。通过以上试验证明了苣荬菜提取物的药理药效活性，从而确认苣荬菜提取物可以用于制备治疗缺血性心、脑血管病的药物，在所述的药物中含有苣荬菜提取物。以及药学上可以接受的载体，该药物药效成分明确，无明显毒副作用，更有利于保证药物的安全性和有效性。下面再用一个实验例子对本发明做进一步说明。取干燥的苣荬菜适量，置多效提取罐内，加入10倍体积的70%乙醇，回流提取二次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓縮液加水溶解，放置沉降，过滤，滤液过860021大孔吸咐树脂柱，先用水冲洗至流出液为淡黄色；再用70%乙醇洗脱，洗脱至流出液无HC1-Mg粉反应，合并洗脱液，减压回收乙醇；浓縮液再上聚酰胺柱纯化处理，先用水洗去杂质，再用70%乙醇洗脱，洗脱液经减压浓縮成浓縮液，真空干燥，即得苣荬菜提取物，按照<<中华人民共和国药典>〉2005年版一部P576方法，以芦丁为对照品进行检测，所得苣荬菜提取物中总黄酮含量在50%以上。将苣荬菜提取物按常规方法可制成片剂，颗粒剂、胶囊剂或丸剂，每片(粒)0.3g，供临床口服治疗心血管病、脑血管病使用，本品使用片剂或胶囊剂，拟使用剂量为每次0.3-0.6g，每日3次口服。4周为1疗程。权利要求1、一种苣荬菜提取物，在制备治疗缺血性心血管病药物中的用途，其中所述的药物中含有苣荬菜提取物，以及药学上可接受的载体。2、苣荬菜提取物在制备治疗缺血性脑血管病药物中的应用。全文摘要一种苣荬菜提取物，以苣荬菜为原料，通过溶剂提取，经大孔树脂、聚酰胺柱纯化、精制得到的苣荬菜提取物。经药效学及毒理学试验证明，本发明苣荬菜提取物具有较好抗血栓、耐缺氧作用，对心肌缺血、脑缺血具有明显的保护作用，可用于制备治疗缺血性心血管、脑血管病药物。该提取物制成的药物无明显毒副作用，其药效成分明确，疗效确切，更有利于保证药物的安全性和有效性。本发明原材料易得，工艺合理，成本低，具有可观的经济效益和社会效益。文档编号A61P9/00GK101411736SQ20081001694公开日2009年4月22日申请日期2008年6月23日优先权日2008年6月23日发明者崔淑香,军李,杰李,梁玉记,牟艳玲,燕王,芃王,王元书,王晓静,王福文,解砚英申请人:山东省医学科学院药物研究所