专利名称：：异佛司可林及其类似物在防治肺损伤中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到异佛司可林及其类似化合物的新用途。技术背景中国专利申请号200610010797.9公开了"一种治疗喘咳的中药组合物及其制备方法"，该发明公开了一种治疗喘咳的中药组合物及其制备方法，其有效成分是由鞘蔬苏(Coleusforskohlin)提取物和岩白菜素(Bergeninum)按一定重量配比组合而成。所述的鞘森苏提取物是采用有机溶剂对鞘蕊苏粉浸提，所得的提取液回收溶剂后得到浸膏，再将浸膏采用用硅胶、氧化铝或吸附树脂层析，收集含异佛司可林部分，在6(TC7(TC下加热浓縮，所得的浓縮物含异佛司可林21.0%，即为所需的鞘蕊苏提取物。该有效成分可加入常用的药用辅料制成各种口服制剂，其具有良好的平喘、止咳、祛痰作用，用于支气管哮喘、急慢性支气管炎等呼吸系统疾病。中国专利申请号200310110965.8公开了一种"治疗过敏性鼻炎和哮喘的制剂"，其每ml制剂含有异佛司可林0.0050.4mg，余量为医药辅料，制成医药上可以接受的吸入剂。具有较好的稳定性能，对皮肤甚至是损伤性皮肤不产生任何剌激，具有较强的抗炎作用，对过敏性鼻炎、变应性鼻炎、支气管哮喘均有疗效。中国专利申请号200310110967.7公开了一种"治疗肺心病及能量补充的脂肪乳输液及其生产方法"，每瓶输液含有异佛司可林0.10.8mg，配以适量药用辅料及乳化剂制成医药上可接受的脂肪乳输液。产品稳定、可靠，无刺激性，各项指标完全符合注射要求，经与复方丹参对比试验，在縮小梗塞范围，缓解缺血ST段抬高和降低血清CPK和LDH方面优于复方丹参组。
发明内容本发明的目的在于提供异佛司可林及其类似物的新用途。本发明涉及异佛司可林及其类似物在制备预防和/或治疗肺损伤的药物中的应用。本发明涉及异佛司可林及其类似物在制备预防肺损伤的保健品中的应用。上述的肺损伤主要包括急性肺损伤以及某些因素导致的肺损伤，例如吸烟、手术、创伤、输血、机械通气、缺血、缺血再灌注、疾病等因素致肺损伤。本发明所述的异佛司可林(Isoforskolin)是从仅分布于我国云南东北部的滇产毛喉鞘蕊花(Coleusforskolin)中提取的二萜类化合物，分子式为C22H3407，分子量为410，结构式如下异佛司可林已经有临床应用的报道，表明异佛司可林及其类似物具有解痉、舒张气管平滑肌、平喘、止咳、祛痰、抗炎、降压、抗血小板聚集、降低眼内压等作用，但其对急性肺损伤及某些因素导致肺损伤的防治作用尚无报道。本发明所述的异佛司可林除上述结构式所示的化合物外，还包括其类似物，如分子式为C22H3407、分子量为410的Forskolin;分子式为C26H3809、分子量为494的ForskolinA;分子式为C24H3608、分子量为452的ForskolinB;分子式为C2oH3206、分子量为368的Deacetylforskolin;分子式为C22H3406、分子量为394的1-Acetoxycoleosol;分子式为C24H3608、分子量为452的ForskolinI;分子式为C24H3608、分子量为452的ForskoUnJ;分子式为C22H3407、分子量为410的ColeonolC。其结构式分别如下ForskolinForskolinAForskolinB(1，6-diacetylforskolin)(1-acetylforskolin)Deacetylforskolin1-AcetoxycoleosolForskolinIO、、OHH、OA:OA:ColeonolCForskolinJ(6-acetylforskolin)本发明所述的异佛司可林及其类似物经急性毒性及长期毒性试验结果证明应用是安全的。成人每日用量为60-120mg，给药方式包括口服、注射、喷雾。本发明所述的异佛司可林及其类似物可以制备成片剂、口含片、胶囊剂、颗粒剂、口服液等多种口服剂型，也可以制备成注射液、气雾剂、贴膏剂等剂型。本发明对已知化合物异佛司可林及其类似物发掘了新的医疗、保健用途，开拓了一个新的应用领域。本发明的异佛司可林及其类似物可单独作为药用或保健有效成分，也可与其它无排斥作用的组分配伍，制成相应剂型的药剂或保健品。为了更好地理解本发明的实质，下面将用药理试验及结果来说明其在临床应用领域中的新用途。异佛司可林及其类似物对肺损伤的保护作用及机制研究1、从细胞与分子水平上研究异佛司可林(ISOF)及有效部位(CF-E,主要为佛司可林的类似物)抗肺损伤的作用采用血液凝聚仪测定受试物对N-甲酰甲硫亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)诱导人血中性粒细胞(PMN)聚集的影响；采用细胞计数的方法观察受试物对内毒素(LPS)诱导PMN与人脐静脉血管内皮细胞(ECV-304)粘附的影响;采用流式细胞仪定量测定受试物对内毒素(LPS)激活状态下PMN分泌释放细胞粘附分子功能的影响；采用放免法测定受试物对内毒素(LPS)激活状态下P丽分泌释放肿瘤坏死因子(TNF-a)能力的影响；采用放免法测定受试物对P顧细胞内环腺苷酸(c雇P)含量的影响。结果表明ISOF(25，50，100Wnol/L)及CF-E(1.25，2.5,5mg/ml)对fMLP诱导P丽聚集均具有一定的抑制作用，两者的最高抑制率分别为43.63%和55,94%(表1);ISOF各剂量组、CF-E(2.5、5mg/ml)对LPS诱导的PMN与ECV-304的黏附均具有抑制作用，最高黏附抑制率分别为62.98%和9.85%(表2);ISOF及CF-E各剂量组对LPS激活状态下PMN分泌释放细胞粘附分子均具有抑制作用(表3)，诱导剂组P丽所表达CDllb/CD18的荧光强度分别为252.15±12.77，48.60±0.86，CD14的表达率为40.77±3.91%，IS0F组，剂量为100陶ol/L时抑制作用最明显，依次为42.03±2.15，10.90士0.49和0.75土0.09%;CF-E组，剂量为5mg/ml时抑制作用最明显，依次为81.83±1.21，13.33±0.85和2.28±0.15%;ISOF(50，100Mmol/L)及CF—E(2.5，5mg/ml)均对LPS激活状态下P顧分泌TNF-a有一定的抑制作用，能升高PMN内cAMP含量，诱导剂组PMN分泌TNF-a的量为0.72±0.03ng/l.5Xl(f个细胞，ISOF(100陶ol/L)组为0.42土0.02ng/1.5Xl()6个细胞，CF-E(5mg/ml)组为0.56±0.01ng/l.5X106个细胞；溶媒组PMN内cAMP的量为1.23±0.05ng/1.5Xl()6个细胞，ISOF(lOOWnol/L)组和CF-E(5mg/ml)组分别为2.11±0.25ng/l.5X106个细胞和1.79±0.38ng/l.5X106个细胞(表4)。研究结果证明一定剂量的ISOF及CF-E对LPS激活状态下P丽聚集、粘附及分泌等功能均具有显著的抑制作用，可能与升高PMN内cAMP水平有关。推测ISOF及CF-E具有一定的抗肺损伤的作用。(见表1、2)表1受试物对fMLP诱导PMN聚集的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>x±S,n=6，与诱导剂组比较*尸〈0.05，**尸〈0.01LPS终浓度为2ug/ml。表3受试样品对LPS激活状态下PMN分泌释放细胞粘附分子CDllb/CD18，CD14的影响~"iS~荧光强度CD14的表达率CDllbCD18(%)空白对照------7.18±0.531.30±0.900.26±0.11溶媒对照------8.05±0.60L28±0.380.30±0.07诱导剂组------252.15±12.7748.60±0.8640.77±3.91ISOF2594.38±3.38w18.38±0.82w21.58±2.21*Oraol/L)5059.01±1.35"15.15土0.93"18.05±0.97*<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>x±S，n=6,与诱导剂组比较*P〈0.05，**尸<0.01LPS终浓度为2Pg/ml。表4受试物对LPS诱导下P顧分泌释放TNF-a以及对P顧细胞内cAMP含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>;c土S，n=6,与诱导剂组比较#尸<0.05,H#尸〈0.01，与溶媒组比较*P〈0.05，**尸〈0.01，LPS终浓度为2ug/ml。2、异佛司可林(ISOF)及有效部位(CF-E，主要为佛司可林的类似物)对大鼠离体肺损伤的影响建立大鼠原位离体肺灌流模型，观察ISOF对内毒素致大鼠离体肺损伤的影响。在灌流稳定30分钟后加入内毒素，总共灌流120分钟(灌流液总量为50raL)，灌流结束后显微镜计数灌流前后灌流液中中性粒细胞(PMN)，按公式计算P丽黏附率；检测大鼠肺组织湿重/干重(W/D)、肺含水量；肺组织匀浆，硫代巴比妥酸显色法检测肺组织中丙二醛(MDA)、过氧化氢还原法测定髓过氧化物酶(MPO)、放免法测定环磷酸腺苷(cAMP)和肿瘤坏死因子(TNF-a)含量，HE染色观察肺组织病理形态学变化，评价受试物抗大鼠肺损伤的药理作用；测定受试物对肺毛细血管通透性的影响，灌流结束前30分钟加l%Evansblue0.3mL于灌流液中，摇匀，30分钟后用不含血液的灌注液(60mL)冲洗肺脏，实验结束后用分光光度法测定肺组织中Evansblue的吸光度值，按公式计算白蛋白通透性与表面禾只乘积(albuminpermeability-surfaceareaproduct,PS)。结果表明与正常组比较，模型组P顧黏附率、PS、W/D和肺含水量显著升高(分别为25.86±3.46%和59.05±16.98%;5.37±0.94X10—2cm7min.g和25.00±8.8X10—2cm3/min.g;5.76±0.40和9.16±0.45;82.56±1.08%禾卩89.06士0.56%)，肺组织中TNF陽a、MDA和MPO含量显著升高(分别为21.37±2.85fmol/mL和38.08±2.72fmol/mL;0.54±0.03nmol/mgprot禾口0.77±0.07nmol/mgprot;0.07±0.02单4立/克和0.38±0.06单位/克)；cAMP含量显著降低(2.88±0.40pmol/mL和1.96±0.21pmol/mL)(表8)，肉眼观察B组肺组织体积增大，明显充血，水肿，可见点或灶状出血，光镜观察B组肺泡壁明显增厚，肺泡和肺间质水肿，大量炎性细胞浸润，可见肺泡腔縮小变形，肺泡壁破裂，肺泡塌陷实变等典型的急性炎症损害表现。与模型组比较，IS0F中、高剂量P顧黏附率、PS、W/D和肺含水量明显降低(分别为59.05±16.98%、27.10±4.24%和24.86±2.34%;25.00±8.8X10—2cm3/min.g、3.42±0.34X102cm3/min.g和3.02±1.07X10_2cm3/min.g;9.16±0.45、6.33±0.10和6.35±0.35;89.06±0.56%、84.19±0.26%禾口84.21±0.86%)(表5、6);ISOF中、高剂量组肺组织中MDA和MPO含量明显降低(分别为0.77±0.07nmol/mgprot、0.58±0.02翻l/mgprot和0.52±0.05nmol/mgprot;0.38±0.06单位/克、0.11±0.03单位/克和0.08±0.03单位/克X表7);IS0F高剂量组肺组织中TNF-a含量明显降低(38.08±2.72fmol/mL和22.77±3.30fmol/mL);IS0F低、中、高剂量组肺组织中cAMP含量均显著升高(1.96±0.21pmol/mL、2.91±0.54pmol/mL、2.84±0.19pmol/mL禾口2.56±0.24pmol/mL)(表8)，肺组织病理损伤程度减轻。除cAMP外，ISOF低剂量组各指标与模型组比较无统计学意义(P〉0.05)。结果证明一定剂量的IS0F(100|imol/L、200nmol/L)对内毒素所致大鼠离体肺损伤具有保护作用，可以减轻离体大鼠肺损伤程度。该作用可能与ISOF升高细胞、组织中cAMP含量，抑制PMN功能，降低致炎因子释放和减少氧自由基损伤有关。表5受试物对大鼠离体肺损伤模型P腦黏附率和PS值的影响分组剂量.PMN黏附率(y。)PS(X10_2cm7min.g)正常对照----25.86±3.465.37±0.94模型组----59.05±16.98##25.00±8.8##溶媒对照—^—24.29±2.94#5.57±1.26s地塞米松65|imol/L27.55±3.75*3.82±0.78**IS0F50|xmol/L44.25±3.6628.95±1.90100nmol/L27.10±4.24*3.42±0.34w200|miol/L24.86±2.34*3.02±1.07**;±s，n=8,与正常对照组比较ttP>0.05，湘/X0.01,与模型组比较*;KO.05，**;KO.01。表6受试物对大鼠离体肺损伤模型肺组织W/D和肺含水量的影响分组剂量W/D肺含水量(％)正常对照----5.76±0.4082.56±1.08模型组----9.16±0.45"89.06±0.56##溶媒对照----6.16±0.50*83.67±1.28#地塞米松65(xmol/L6.37±0.39**84.25±1.O(TIS0F50(imol/L9.31±0.3489.25±0.37100|amoI/L6.33±0.10**84.19±0.26**200pmol/L6.35±0.35**84.21±0.86**;c±s，n=8,与正常对照组比较ftp〉0.05，/X0.01，与模型组比较*/XO.05，**/XO.01。表7受试物对大鼠离体肺损伤模型肺组织MDA和MPO的影响分组剂量MDA(咖ol/mgprot)MPO(U/g)正常对照----0.54±0.030.07±0.02模型组----0.77±0.0.38土O.06**溶媒对照----0.54±0.06#0.08±0.03#地塞米松6.5nmol/L0.51±0.05**0.08±0.03**ISOF50|amol/L0.74±0.060.35±0.06100nmol/L0.58±0.02**0.11±0.03**200|amol/L0.52±0.05**0.08±0.03**;±s，n=8,与正常对照组比较#p〉0.05，糊p〈0.01，与模型组比较*;〈0.05，**p〈0.01。表8受试物对大鼠离体肺损伤模型肺组织cAMP和TNF-a的影响分组剂量cAMP(pmol/mUTNF-a(fmol/mL)正常对照----2.88±0.4021.37±2.85模型组——一1.96±0.21##38.08±2.72**溶媒对照----2.18±0.24*22.83±2.04#地塞米松65|^mol/L2.71±0.37**29.07±3.89"ISOF50jimol/L2.91±0.54**37.82±4.03100,1/L2.84±0.19**31.34±5.44200,1/L2.56±0.24**22.77±3.3(T;±s，n=8,与正常对照组比较#^>0.05，將；KO.01，与模型组比较*;<0.05，**/〈()01。3、异佛司可林(ISOF)及有效部位(CF-E，主要为佛司可林的类似物)体内给药对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的影响。股静脉注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)6mg/kg建立大鼠急性肺损伤(ALI)模型。除正常组、溶媒组外，其余各组均注射LPS前20min分别在腹腔注射给药(或lh'前灌胃给CF-E)，正常组、溶媒组腹腔注射与药物等体积的生理盐水或溶媒。肺动脉插管持续监测肺动脉压，计算平均肺动脉压(MPAP);实验结束颈动脉放血处死动物，测定动脉血氧分压(Pa02);分光光度法测定血液中高铁血红蛋白含量(MHb);进行肺泡灌洗，回收支气管肺泡灌洗液(BALF)，计数有核细胞数及中性粒细胞(PMN)比例、溴甲酚绿法测定BALF中白蛋白含量；检测大鼠肺组织湿/干比重(wet/dry,W/D);分离血浆，硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛(MDA)、过氧化氢还原法测定髓过氧化物酶(MPO)含量，放射免疫法测定环磷酸腺苷(cAMP)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)，取固定部位肺组织，石蜡切片，HE染色观察病理形态学变化。结果表明与正常组或溶媒组比较，模型组BALF中有核细胞计数、P丽比例、BALF中白蛋白含量显著升高(分别为0.30土0.14X107L和0.65±0.12X107L;1.5±1.27%和6.0±2.16%;72.31±11.31mg/L和166.66±14.88rag/L)(表9);W/D比分别为3.59±1.17和5.20±0.28(表10);MPAP分别为18.67±3.12mmHg和24.05±2.84mraHg(表11);血液中MHb百分含量显著升高，Pa02显著降低(分别为0.76±0.16%和1.12±0.26%;112.13士11.8皿nHg和88.50±12.74皿nHg)(表12);与此同时血中MDA、MPO、TNF-a含量显著升高(分别为2.00±0.59nmol/ml和3.08±1.15nmol/ml;0.84±0.47u/ml和1.98±0.64u/ml;6.15±1.84fmo1/ml和16.51±2.45fmo1/ml);cAMP含量显著降低(为9.44±2.04pmol/ml和5.40±1.66pmo1/ml)(表13、14)。肉眼观察模型组肺呈暗红色，明显充血、水肿，可见广泛的点或灶状出血，光镜下，与生理盐水组比较，见模型组肺泡壁明显增厚，肺间质水肿，大量炎性细胞浸润，可见灶性肺泡壁塌陷、肺泡破裂和实变等典型的急性炎症损害表现，提示大鼠ALI模型形成。与模型组相比较，一定剂量ISOF有降低BALF中有核细胞计数、P顧比例及白蛋白含量的作用，能降低肺组织W/D比值、降低MPAP和血液中高铁血红蛋白百分含量，降低血浆中MDA、MPO、TNF-a水平(尸〈0.01，？<0.05)以及升高血浆cAMP含量的作用(P<0.01)。能有效减轻肺组织病理损伤程度。CF-E组各指标与C组比较无统计学意义(尸>0.05)。研究证明经静脉一次性注射LPS(6mg/kg)成功复制了大鼠的ALI模型。一定剂量的ISOF有抗急性肺损伤作用，该作用可能与ISOF升高细胞、组织中cAMP含量，抑制PMN功能，降低致炎因子释放和氧自由基损伤有关。表9受试物对ALI大鼠BALF中有核细胞计数、PMN比例及白蛋白含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>;c土s，与生理盐水组比较"代O.Ol;与模型组比较"代O.Ol。表10受试物对ALI大鼠肺组织湿/干比值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>与生理盐水组比较##代0.1;与模型组比较'代O.05。表ll受试物对大鼠ALI模型MPAP的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>"二《，与生理盐水组比较#代0.05，##代0.01;与模型组比较7^0.05,"代O.Ol。表12受试物对大鼠ALI模型MHb和Pa02的影响~~样品剂量(mg/kg)MHb(%)PaO"mniHg)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与生理盐水组比较"代O.01#代0.01;与模型组比较"代0.01*代0.05。表13受试物对ALI大鼠MPO和MDA含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与生理盐水组比较7《ft敏##代0.01;与模型组比较7^0.05，WK0.01。表14受试物对ALI大鼠血浆cAMP和TNF-a水平的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>jcis,与生理盐水组比较"代O.Ol;与模型组比较*代0.05,"代O.Ol。具体实施方式样品提取工艺取10Kg滇产毛喉鞘蕊花(Co/e^/wAoW"干品，在室温下用50升95%乙醇(ethanol)提取3次，提取液经减压浓缩得到乙醇提取物，提取物加入少量水拌匀后，依次用石油醚(petroleumether)，氯仿(chloroform),正丁醇(n-butanol)进行分配。减压浓縮后，得到各自的提取物。取氯仿提取物120g上硅胶柱，用递增比例的石油醚-丙酮(petroleumether-acetone)洗脱，以薄层层析TLC监测洗脱结果。得到有效部位CF-E。有效部位CF-E再经过反复地层析和重结晶纯化，可以获得毛喉鞘蕊花的纯粹的单体成分异佛司可林、佛司可林等。可将异佛司可林及其及其类似物加入淀粉或相应的辅料，混匀后制粒，压制成片剂或胶囊等口服制剂，或者加入其他辅料制成口服液、喷雾气雾剂、贴膏剂等，或者加入注射溶媒及其他辅料等制成注射剂，用于预防和/或治疗急性肺损伤及其他因素导致的肺损伤。权利要求1、异佛司可林及其类似物在制备预防和/或治疗肺损伤的药物中的应用。2、异佛司可林及其类似物在制备预防肺损伤的保健品中的应用。全文摘要本发明涉及到异佛司可林及其类似化合物的新用途。本发明涉及异佛司可林及其类似物在预防和/或治疗肺损伤中的应用。所述的肺损伤主要包括急性肺损伤以及某些因素导致的肺损伤，例如吸烟、手术、创伤、输血、机械通气、缺血、缺血再灌注、疾病等因素所诱导的肺损伤。本发明所述的异佛司可林及其类似物成人每日用量为60-120mg，给药方式包括口服、喷雾及注射。本发明所述的异佛司可林及其类似物可以制备成片剂、口含片、胶囊剂、颗粒剂、口服液等多种口服剂型，也可以制备成注射液、气雾剂、贴膏剂等剂型。本发明对已知化合物异佛司可林及其类似物发掘了新的医疗、保健用途，开拓了一个新的应用领域。本发明的异佛司可林及其类似物可单独作为药用或保健有效成分，也可与其它无排斥作用的组分配伍，制成相应剂型的药剂或保健品。文档编号A61P11/00GK101259123SQ200810058300公开日2008年9月10日申请日期2008年4月18日优先权日2008年4月18日发明者晨卿,敏张,强东进,杨为民,裴晓宁,陈国珍,马丽梅申请人:昆明医学院