藻酸钠含钙液态胶体支架材料的制作方法

专利名称：藻酸钠含钙液态胶体支架材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种骨再生、骨缺损修复用的体内骨生物反应器诱导成骨材料，特别涉及一 种可吸收可注射的藻酸钙液态胶体支架材料。
技术背景先天、外伤、炎症及肿瘤等原因造成的长骨及扁骨缺损的修复是长期困扰临床医师的课 题。如何获得足够量的供骨以用于移植充填缺损，同时满足缺损受区骨质的塑形、强度和/ 或承重等形态功能的长期要求，且不引起免疫排斥是一直以来的研究热点。自体骨移植是临床常用的传统骨缺损移植修复法，供骨区有髂骨、腓骨、肋骨、颅骨等， 可提供松质骨、皮质骨和全骨。因为自体移植，故无移植免疫排斥反应，若受区血供良好， 有健康的软组织覆盖，则骨愈合速度快；但供骨来源有限，供骨量常不足，且塑形欠佳，对 缺损受区骨质强度及承重等功能要求也不能很好满足，还有移植骨术后吸收及供区增加额外 创伤等问题。异体/种骨移植骨量充足，经过物理或化学方法处理减弱了免疫原性，也不增加 额外创伤，但仍易发生免疫排斥，并可有术区感染、骨延迟愈合软骨钙质沉着、骨瘤、骨代 谢疾病和炎症性关节炎等并发症，且有潜在的传染病原体的危险。组织工程指"应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理 两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组 织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的学科"。骨组织工程通过将具有成骨潜能的种子 细胞(如骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞)与能提供细胞依附并可引导细胞生长的基质 支架复合体外培养，在能够诱导细胞增殖和分化的细胞因子(如骨形态发生蛋白BMP)的作 用下，诱导成骨，较之传统的自体骨移植修复方法而言，创伤小，供骨量大；但体外培养操 作复杂，耗时长，在力学、细胞因子等三维微环境方面与体内实际环境差距较大，亦增加供 细胞区二次损伤。近来发展的生物反应器是组织工程中的重要方法，可模拟体内环境便于组织替代物的长 入，为系统研究活组织对不同机械和生化环境的反应提供了便利条件。文献报道多为体外构 建，如将干细胞与有良好生物相容性的多孔或液态可生物降解支架体外复合共培养后回植体 内，具体细胞培养方式有灌注、三维培养、旋转培养等，较之传统的骨组织工程构建方法而言，能更近似的模拟体内环境；但其研发需特制设备，且构建过程中必须考虑的参数亦较多， 如环境的温度、酸碱度、营养物质和代谢废物的出入途径、细胞的种植密度和分布、力学参 数等，往往不能同时兼顾；对体内物理、化学生物环境的也仅只是近似模拟。
体内生物反应器是一种更先进的方法，是在体内骨膜下腔形成骨生物反应器，将含钙胶 体材料注射于骨生物反应器内逐步形成骨组织。目前国内外均有研究，主要问题在于；含钙 胶体材料配制复杂、不成熟。

发明内容
根据上述需求，本发明提供一种配制简单、可注射可吸收的藻酸钙液态胶体材料。 本发明藻酸钙液态胶体材料，通过以下步骤配制
1) 电子天平精确称量并分装的藻酸钠颗粒经10K Gy强度的Co,照射1000min进行灭菌 化处理；
2) 以灭菌三蒸水为溶剂，制成3。/。的水溶液10ml;
3) 25'C室温中，磁转子持续搅拌下，加入3呢CaCl2 1.7ml,混匀；
4) 胶体中加入0. 1M乙酸溶液酸碱滴定至pH中性。
本发明藻酸钙液态胶体材料，其中所述藻酸钠2X浓度25'C时粘度为250cps。 本发明藻酸钙液态胶体材料，其中所述0.1M乙酸溶液用分子量为60.05的分析纯级
冰醋酸配制。
本发明藻酸,丐液态胶体材料，其中所述氯化钙为分析纯级。
本发明藻酸钙液态胶体材料，其中所述三蒸灭菌水可替换为灭菌DMEM细胞培养液。
本发明藻酸钙液态胶体材料，胶体可注射，以注射于体内骨膜下腔骨生物反应器内用以 诱导成骨，生物相容性好，具有良好的可塑性，满足密闭骨膜下腔的力学支撑和对骨膜细胞 的机械刺激需要；体内可吸收，吸收降解的速率与体内新骨形成的速度相匹配，体内胫骨和 颅骨骨生物反应器的成骨质量好，作为移植用供骨的潜力大。另外，此法操作简单，不需采 取自体细胞体外培养，成本低，也可避免因体外细胞培养带来的污染可能；不额外添加异体 或异种细胞/生长因子，造价低，更无免疫排斥等危险。为骨生物反应器提供了良好的支架材 料。
具体实施例方式
为进一步阐述本发明藻酸钠含钙胶体材料，下面结合实施例作更详尽的说明。藻酸钠盐是海带、马尾藻等褐海藻中分离的天然多聚糖，是由1一4(直链型键合)的a —L 一古洛糖酵酸(G单元)和e —D—甘露糖醛酸(M单元)残基组成的阴离子型共聚物，遇钙离子
(阳离子)会形成稳定的海藻酸钠、钙混合盐凝胶，具良好的生物相容性、亲水性和塑型能 力，容易制成并保持不同的形状；还具有可降解性，体内降解为甘露糖和古洛糖，可随尿排 出；安全性好，已被广泛应用于原位药物传递系统。我国1987年10月1日颁布实施的中华人民 共和国卫生部标准中包含海藻酸盐，FDA也已批准海藻酸盐用于人类的伤口敷料及食品添加 剂。
既往文献报道，藻酸盐扫描电镜超微结构观察可见匀质网眼承载量大，多孔结构可提供 的宽大内部空间和表面积，有利于细胞基质分泌和浓度保持，因此多被用作骨髓基质成骨细 胞的持续释放载体以构建体内可注射型组织工程。将骨髓基质成骨细胞与浓度为20g/L的海藻 酸盐水溶液混合，用氯化钙水溶液进一步混合后，将复合液体注射到6只裸鼠背部皮下，8周 取标本。X线片显示，所有实验组标本均有明显的成骨现象，且质地似骨组织一样坚硬。在注 射后8周内未见炎症、细胞浸润和异物反应。既往体外不同浓度藻酸盐对细胞影响的研究中， 电镜下动态观察到不同浓度(0.25%—8%)的藻酸盐凝胶影响去抗原异种骨构建的组织工程载 体中骨髓基质细胞的形态和分泌性能，发现自1%始，凝胶均匀复合在异种骨的骨孔中，细胞 生长均匀，形态饱满且有基质分泌，而4%以上浓度的藻酸盐中细胞生长受限甚至无法见到细 胞生长。既往藻酸钙凝胶的力学性能研究中还发现，藻酸钙凝胶强度依赖于钙离子及海藻酸 盐的浓度和比例曹强等在30g/L藻酸钠10ml内加入硫酸钙粉末0.4g制成藻酸钙凝胶柱，发现 其压縮强度为0.440MPa，拉伸强度为O. 133MPa，弯曲强度为O. 056MPa，接近未成年人骨松质 力学性能(压縮强度0.54 MPa)，与人类骨密质力学性能(压縮强度133 —197MPa，拉伸强度 51 — 149MPa，弯曲强度177—221MPa)相去甚远，机械性能较差，认为不适宜在受力部位单独 使用。
本发明藻酸钙液态胶体材料，通过以下步骤配制
1) 电子天平精确称量并分装的藻酸钠颗粒经10K Gy强度的Co,照射1000min进行灭菌 化处理；
2) 以灭菌三蒸水为溶剂，制成3。/。的水溶液10nil;
3) 25'C室温中，磁转子持续搅拌下，加入3。/。CaCl2 1.7ml，混匀；
4) 胶体中加入O. 1M乙酸溶液酸碱滴定至pH中性。
其中藻酸钠选用Sigma公司产货号A2158, 2%浓度25。C时粘度为250cps;氯化钙选用Sigma公司的分析纯级，货号C7902;0. 1M乙酸溶液选用北京化工厂产分析纯、分子量为60. 05的冰醋酸配置；按上述方法配制的藻酸钠含钙胶体材料称为SA型，其中的灭菌三蒸水可用Hyclone公司的HyQ DMEM/High Glucose型培养液替代，配置的藻酸钠含钙胶体材料称为SD型。可注射胶体材料的作用在于(1)作为支架机械支撑，在其注射入体内后，将骨膜与其下 的骨皮质分隔开来，形成密闭的骨膜下腔，为细胞迁移、成骨等生物行为提供空间和相对稳 定的微环境；其逐步降解的过程与亦可与成骨反应在时间上相适应；(2)具有一定体积的支 架对浅层骨膜持续的机械刺激可产生成骨细胞增殖的生物学效应支架材料产生的力学负荷 可传导到成骨细胞并使其表面受到牵张，此生物材料/细胞交接面的变形可被成骨细胞附着位 点感知，而骨细胞对机械变形刺激的感受又比其它类型的细胞敏感得多，从而使外来的机械 力刺激对成骨细胞的增殖、定向及基因活性等细胞行为有明显的刺激作用。虽然诸多文献报 道机械力对成骨细胞增殖等细胞行为产生显著效应，但对机械刺激导致成骨细胞增殖及骨特 异性蛋白表达的机理至今尚不清；(3)可注射胶体支架含钙，其内氯化钙内的钙盐以晶体或 离子形式存在，可参与趋化成骨细胞进入反应器，也为成骨过程提供原料，促使基质钙化成 骨。(4)腔内I型胶原的作用胶体注射4W始，骨钙素血清浓度升至正常值，局部组织骨钙 素表达阳性、骨基质I型胶原蛋白染色阳性等结果表明类骨质的形成。类骨质的出现预示着 骨组织开始形成，其中I型胶原是骨基质中的主要胶原，可与钙盐结合；游离的Ca"沉积到 I型胶原上而启动骨基质的矿化过程。此外，I性胶原还具有底物作用，起粘附功能，使细 胞附着，从而使业已开始形成的矿化基质连接成片，并不断扩大；(5)因从分子生物学和组 织学水平初步观察到成骨早期有I型胶原、II型胶原存在，同时也观察到了软骨细胞和基质 的出现，推断此微环境在成骨过程中不仅有膜内成骨方式，而且也有软骨内成骨方式。
权利要求
1、一种藻酸钙液态胶体材料，其特征在于，所述藻酸钙液态胶体材料通过以下步骤配制1)电子天平精确称量并分装的藻酸钠颗粒经10K Gy强度的Co60照射1000min进行灭菌化处理；2)以灭菌三蒸水为溶剂，制成3％的水溶液10ml；3)25℃室温中，磁转子持续搅拌下，加入3％CaCl21.7ml，混匀；4)胶体中加入0.1M乙酸溶液酸碱滴定至pH中性。
2、 根据权利要求1所述的藻酸钙液态胶体材料，其特征在于所述藻酸钠2%浓度25 "C时粘度为250cps。
3、 根据权利要求2所述的藻酸钙液态胶体材料，其特征在于所述乙酸溶液用分子量 为60. 05的分析纯级冰醋酸配制。
4、 根据权利要求3所述的藻酸钙液态胶体材料，其特征在于所述氯化钙为分析纯级。
5、 根据权利要求4所述的藻酸钙液态胶体材料，其特征在于所述三蒸灭菌水替换为 灭菌DMEM细胞培养液。
全文摘要
一种藻酸钙液态胶体材料，按以下步骤配制精确称量并分装的藻酸钠颗粒经10K Gy Co⁶⁰照射1000min灭菌化处理；以灭菌三蒸水为溶剂，制成3％的水溶液10ml；25℃室温中磁转子持续搅拌下，加入3％CaCl₂ 1.7ml混匀；胶体中加入0.1M乙酸溶液滴定至pH中性。其中三蒸灭菌水可替换为灭菌DMEM培养液。本发明藻酸钙液态胶体材料，用以注射于体内骨膜下腔骨生物反应器内用以诱导成骨，生物相容性好，可塑性强，满足密闭骨膜下腔的力学支撑和机械刺激需要；体内可吸收，成骨质量好，作为移植用供骨的潜力大，操作简单，不需体外细胞体培养，不需添加细胞因子或生长因子，成本低，无感染，无免疫排斥等危险，为骨生物反应器提供了良好的支架材料。
文档编号A61L27/00GK101322855SQ20081011737
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月30日 优先权日2008年7月30日
发明者赵振民, 黄晨昱 申请人:中国医学科学院整形外科医院