专利名称：中药连翘降血糖有效部位及其提取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从连翘叶脂溶性部位提取制备抑制ct-葡萄糖苷酶的有效 部位，同时还涉及该有效部分的提取方法及应用。
背景技术：
糖尿病是一种以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相 关的全身性疾病，是由于遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，是 最普通的内分泌疾病之一。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织对胰岛 素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床 上出现三多(多食、多饮、多尿)、 一少(体重下降)、高血糖症状。根据
病因的不同，糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(1DDM， l型)和非胰岛素 依赖型糖尿病(NIDDM， 2型)。目前我国糖尿病患约1200万，全球约1.5 亿，已成为威胁人类的第3位"健康杀手"，所以预防和治疗糖尿病已成为 全球性的保健问题。多年来糖尿病的治疗主要以控制空腹血糖为目标，治疗 药物长期以来主要集中于磺脲类与双胍类药物。近年来研究发现，餐后血糖 也是糖尿病并发症发生的主要危险因子，餐后血糖是一天中血糖水平最高的 阶段，其持续时间可达8小时之久或更长，长时间高水平的餐后血糖可加重 糖尿病本身，使血糖进一步升高，如果在进餐时就能很好的控制高血糖，则 可以避免其餐后血循环中的糖分堆积，因此，控制餐后血糖可以说是控制高 血糖、防治糖尿病的重要举措。现有的糖尿病治疗药物中，磺脲类药物通过 刺激胰岛素的分泌而降低血糖；双胍类药物则通过增加外周组织对葡萄糖的
利用而降低血糖，两者对降低n型糖尿病病人空腹血糖均有较好疗效，但对
降低餐后血糖的作用却非常有限。
食物中的绝大多数碳水化合物为淀粉与蔗糖等，淀粉先后经唾液及胰液 中a-淀粉酶分解为寡糖，寡糖在小肠上皮细胞刷状缘处被Q-葡萄糖苷酶分解 为葡萄糖而被吸收后，导致餐后血糖高峰，因此，抑制cc-葡萄糖苷酶的活性 成为降低餐后血糖的一个有效途径。
"-葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研究开发出的一类新型口服降血糖药 物，其作用机理在于竞争性的抑制cc-葡萄糖苷酶，延缓和阻碍碳水化合物的消化，延迟来自双糖、低聚糖及多糖的葡萄糖的吸收，有效推迟并减轻餐 后血糖升高的时间及程度，长期服用还可以降低空腹血糖水平，此类药物对I、 II型糖尿病均适用。CC-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病有确切的疗效，而且对 于肥胖症、慢性乙肝、艾滋病及肿瘤都有一定的治疗作用。目前用于临床的 此类药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。现有的此类药物成本较高， 生产厂家很少，并具有肠道副作用。传统中药及天然植物药具有相对安全和价
格低廉的特点，开发中药及天然植物药作为a-葡萄糖酶抑制剂可以提供更广
泛的糖尿病治疗药物来源。
连翘(Fw^^am^mse(thumb.) Vahl)为木犀科连翘属植物，性微寒， 味苦，归肺、心、小肠经。具有清热解毒，消肿散结之功效，主治痈疽、瘰 疬、温热、丹毒、小便淋闭等症。连翘的茎、叶、果实、根均可入药，传统 以果实入药，随着一些学者的研究，连翘叶化学工作与药理研究发现，连翘 叶中的化学成分与果实中有极大的相似度，且连翘叶也具有良好的药理活性， 如连翘叶茶具有清除自由基和抗氧化作用，作为一种纯天然的预防和治疗有 活性氧引起的各种疾病(如衰老、心脑血管、高血压、老年性痴呆症甚至癌 症等)的药物及新型的天然食品抗氧化剂具有广泛的应用前景。但目前，对 连翘叶的应用开发主要集中在抗氧化和降血脂等方面，未见其在降血糖方面 即《-糖苷酶抑制剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中药连翘降血糖有效部位，即从连翘叶脂溶 性部位提取制备乙酸乙酯有效部位和正丁醇有效部位。
同时，本发明的目的还在于提供该有效部位的提取方法。
另外，本发明的目的还在于提供一种降血糖有效部位在制备抑制a-葡萄 糖苷酶活性药物方面的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种中药连翘降血糖有效 部位，该有效部位为连翘叶或连翘果实经丙酮与水提取后经浓縮萃取而得到 正丁醇部位和乙酸乙酯部位。
本发明的技术方案还在于采用了一种中药连翘降血糖有效部位的提取方 法，包括以下步骤将连翘叶或连翘果实在丙酮与水形成的混合溶液中重复
冷浸2—4次，每次6—8天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓縮物，将浓 縮的提取物分散在水中，第一步用乙酸乙酯萃取三次，浓縮得乙酸乙酯部位; 第二步用正丁醇萃取三次，浓縮得正丁醇部位。所述的丙酮与水的体积比丙酮水=(6—8): (2—4)。
本发明的技术方案还在于采用了中药连翘降血糖有效部位在制备降血糖 药物方面的应用。
进一步地讲，中药连翘降血糖有效部位在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂类药 物方面的应用。
同时，本发明的技术方案还采用了一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸
乙酯部位分离得到的单体化合物(+)-松脂素在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂类药
物方面的应用。其中，单体化合物(+)-松脂素也可以用其它方法分离获得。 本发明的技术方案还采用了一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部
位分离得到的单体化合物(-)-松脂素在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的 应用。其中，单体化合物(-)-松脂素也可以用其它方法分离获得。
进一步，本发明的技术方案还采用了一种中药连翘降血糖有效部位即乙 酸乙酯部位分离得到单体化合物对羟基苯甲酸异丁酯在制备cc-葡萄糖苷酶抑 制剂类药物方面的应用。其中，单体化合物对羟基苯甲酸异丁酯也可以用其 它方法分离获得。
经体外抑制a-葡萄糖苷酶筛选发现，乙酸乙酯部位及正丁醇部位具有好 的抑制^葡萄糖苷酶活性。本发明的正丁醇部位是在乙酸乙酯部位萃取过后 的溶液，再用正丁醇萃取得到的。
更进一步地讲，将乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石 油醚一乙酸乙酯按体积不同比例洗脱，洗脱物经过凝胶柱层析，减压柱等反 复纯化得到单体化合物(+)-松脂素、(-)松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯。
乙酸乙酯部位进一步制备而得的单体化合物经鉴定为(+)-松脂素、(-)松脂 素和对羟基苯甲酸异丁酯，其结构式为<formula>formula see original document page 5</formula>化合物(+)-松脂素、(-)-松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯，经体外抑制(x-葡萄 糖苷酶活性实验表明，具有良好的抑制(x-葡萄糖苷酶活性。'
具体实施例方式
实施例1
本实施例的有效部位——乙酸乙酯部位的制备方法如下取干燥连翘叶， 在丙酮与水形成的溶液中冷浸3次，其中，丙酮与水的体积比为7: 3，每次 7天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓縮物。将浓縮的提取物分散在水中， 用乙酸乙酯萃取三次，浓縮得乙酸乙酯部位。
实施例2
本实施例的有效部位——正丁醇部位的制备方法如下将实施例1的萃 取剩余溶液用正丁醇萃取三次，浓縮得正丁醇部位。 实施例3
取实施例1制得的乙酸乙酯部位，进行硅胶常压柱(200-300目)层析， 石油醚一乙酸乙酯不同比例洗脱，洗脱物经过凝胶柱层析和减压柱等分离手 得到了化合物单体化合物(+)-松脂素、(-)松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯。
结构鉴定
化合物名称(+)-松脂素性状白色无定形粉末
鉴定分子式C2QH2206，分子量358 仪器材料熔点用四川科学仪器厂生产的XRC-1型显微熔点仪测定，温
度计未校正；&， 13CNMR图谱由Bruker Am-400 MHz核磁共振仪测定。
'H-NMR (400 MHz, CD3C1) & 6.90(2H, d, /=8.04 Hz, H-2',2〃)， 6.83 (2H， d, J=l .48 Hz， H-5'， 5"),6.82 (2H, dd， J= 1.8， 8.2 Hz, H陽6',6")， 5.66 (2H， s， 4',4"-OH)，4.74(2H, d，《/= 3.98 Hz,H-2, 6)， 4.24(2H，dd乂^9.1,6.9Hz,H-4， 8)， 3.87 (2H, dd, ^9.1, 3.7 Hz, H-4， 8), 3.10 (2H, m, H-l, 5)， 3.90 (6H, s, 3', 3"-OCH3 )。 13C-NMR (400 MHz, CD3C1) (5: 146.7 (C陽3', 3")， 145.2(C-4',4〃)， 132.9 (C-r， l")， 118.9 (C-6', 6")， 114.3 (C-5', 5")， 108.6 (C-2', 2"), 85.9 (C-2, 6)， 71.6(C-4，8), 54.1(C-1，5)， 55.9 (3',3〃-OCH3 )。
化合物名称(-)松脂素性状白色无定形粉末
鉴定分子式C20H22O6，分子量358 'H-NMR(CD3C1) & 6.92~6.81(6H, m, H-2, 5, 6, 2', 5', 6')， 4.87(1H, d, /=5.14, H-7')， 4.44(1H, d, 7=7.03, H-7)， 3.90(6H, s， 2xOMe)， 3.86， 4.12(each 1H, m, H-9)， 3.86, 3.32(each 1H, m, H-IO)， 3.35(lH,m,H陽8')， 2.9( 1H, m, H-8)。 13C-NMR(CD3C1) &133.1(C-1), 130.4(C陽l')， 108.6(C-2)， 108.4(C-2')， 146.5(C-3)， 146.7(C-3')， 144.7(C-4)， 145.4(C-4')， 114.3(C-5)，114.3(C-5')， 119.2(C陽6)， 118.4(C-6')， 87.8(C-7)， 82.1(C-7')， 54.5 (C-8)， 50.2(C陽8')， 69.7(C-9)， 7L0(C-9')。
化合物名称对羟基苯甲酸异丁酯性状黄色油状物
鉴定分子式C21H1402，分子量182 !H-NMR(CD3C1) <5: 7'71(2H， dd, J4.3， 5.6, H-2, H-6)， 7.50(2H, dd, J=3.2, 5.5, H-3, H-5)， 4.08(2H, d，风2， H-8)，则1(1H， m, H-9)， 0.94(6H， d, J=8.2, H-10, H-l 1)。 13C-NMR(CD3C1) & 167.6(C-7)， 132.4(C-1)， 132.3(C-4)， 130.8(C-3)， 130.8(C-5)， 128.8(C-2)， 128.8(C-6)， 71.7(C-8)， 27.7(C-9)， 19.1(C-10)， <519.1(C-11)。 实施例4
本实施例为降血糖有效部位的应用例。 抑制a-糖苷酶活性实验 方法微孔板法
原理ct-D-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-G)，产生 硝基苯酚(PNP，黄色物质，在400nm左右有最大吸收)，cc-糖苷酶抑制剂可 抑制cc-葡萄糖苷酶与底物结合从而降低PNP的释放量。以一定时间内反应体 系中PNP的含量变化来计算提取物的酶抑制活性。
仪器MultiskanMK3酶标仪(热电上海仪器有限公司)，96微孔板，各种规
格移液器，LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)。
试剂a-葡萄糖苷酶(Sigma公司，EC 3.2.1.20， from baker's yeast，批号
105K1313),对-硝基苯基-oc-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG， Sigma公司，批号
026K1516),磷酸盐缓冲液(PH6.8)，阿卡波糖(拜糖平，Sigma公司，批号
16869)，其他试剂均为分析纯。
检测方法
112juL磷酸钾缓冲液(pH6.8)，加入20iuL (浓度为0.2U/mL ) a-葡萄糖 苷酶，8j^L样品溶液，37。C恒温15min，加入20 2.5 mmol/L PNPG， 37°C 恒温反应15 min。再加入80 ^L(浓度为0.2 mol/L)的终止剂Na2C03溶液，于405 nm波长下测OD值。实验共设4个组，每组三孔，分别为a.阴性对照组；b. 空白组；c.样品测定组；d.样品对照组。按下面方法计算抑制率，并用Origin软
件求出相应IQ()值。
抑制率计算/% = l - (OD样品组-O"样品对照组)x ioo%
(C)O阴性对照组一O"空白组)分别利用上述测定方法测定了正丁醇部位、乙酸乙酯部位、化合物(+)-松脂素、 (+松脂素、对羟基苯甲酸异丁酯和阳性对照阿卡波糖的IC50。
实验结果如表l所示。
表l IC5o测定结果
样品IC50 (mg/mL)
正丁醇部位0.65
乙酸乙酯部位0.10
(+)-松脂素0.49
(-)-松脂素0.80
对羟基苯甲酸异丁酯0.43
阳性对照阿卡波糖1.08
由表1可知正丁醇部位、乙酸乙酯部位、化合物(+)-松脂素、(-)-松脂素和
对羟基苯甲酸异丁酯ICso均小于阳性对照阿卡波糖，活性明显。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案， 尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和 范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
8
权利要求
1、中药连翘降血糖有效部位，其特征在于该有效部位为连翘叶或连翘果实经丙酮与水提取后经浓缩萃取而得到正丁醇部位和乙酸乙酯部位。
2、 一种如权利要求l所述的中药连翘降血糖有效部位的提取方法，其特 征在于包括以下步骤将连翘叶或连翘果实在丙酮与水形成的混合溶液中 重复冷浸2—4次，每次6—8天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓縮物， 将浓縮的提取物分散在水中，第一步用乙酸乙酯萃取三次，浓縮得乙酸乙酯 部位；第二步用正丁醇萃取三次，浓縮得正丁醇部位。
3、 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于；所述的丙酮与水的体 积比丙酮水=(6—8): (2—4)。
4、 中药连翘降血糖有效部位在制备降血糖药物方面的应用。
5、 根据权利要求4所述的应用，其特征在于中药连翘降血糖有效部位在制备《-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。
6、 一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物 (+)_松脂素在制备oe-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。
7、 一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物 (_)_松脂素在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。
8、 一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物 对羟基苯甲酸异丁酯在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从连翘叶脂溶性部位提取制备抑制α-葡萄糖苷酶的有效部位，同时还涉及该有效部分的提取方法及应用。其提取方法包括以下步骤将连翘叶或连翘果实在丙酮与水形成的混合溶液中重复冷浸2-4次，每次6-8天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物，将浓缩的提取物分散在水中，第一步用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得乙酸乙酯部位；第二步用正丁醇萃取三次，浓缩得正丁醇部位。经体外抑制α-葡萄糖苷酶筛选发现，乙酸乙酯部位及正丁醇部位具有好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。本发明的正丁醇部位是在乙酸乙酯部位萃取过后的溶液，再用正丁醇萃取得到的。
文档编号A61K36/634GK101618075SQ20081014047
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者康文艺, 丽 张, 王金梅 申请人:河南大学