Hiv联合疫苗与初免加强方法

专利名称：Hiv联合疫苗与初免加强方法
HIV联合疫苗与初免加强方法
相关申请的交叉引用本申请要求2007年1月12日申请的美国临时申请号60/880103的优先权，该申 请的内容通过引用全部结合到本文中。
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冃乐在2004 年底，联合国艾滋病规划署(joint United Nationsprogram on HIV/ AIDS，UNAIDS)和世界卫生组织(WHO)发布了 UNAIDS/WH0全球HIV和AIDS流行病概况，估 计仅在2004年，全球就有超过300万人死于AIDS，尽管各种预防措施，另有500万人新感染 了 AIDS。这使得受HIV感染的目前仍生存的个体数目达到令人震惊的4000万。极为不幸 的是，治疗选择有限，通常是费用过高，且最终无法治愈。发明控制这种破坏性疾病的新方 法是迫切需要的，而且相信这取决于开发出安全有效的HIV疫苗。尽管20多年的研究与开发，科学家仍未开发出针对HIV的安全有效的疫苗。 虽然我们看到随着能够暂时降低病毒负载的高效抗反转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy, HAART)的出现，在治疗HIV感染方面取得了一些成功，但是该 方法却遇到许多问题，包括毒性、在主要的经济发达国家以外的地区费用过高以及耐药性 病毒毒株数目不断增加。主要是因为这些难题，所以关注重点又转回到作为控制HIV感染 最佳方法的疫苗的开发上。HIV感染和AIDS的预防从理论上讲可用以下示例来实现，即用彻底灭的活猿猴免 疫缺陷病毒(SIV)或SIV感染细胞免疫的猕猴(rhesus macaque monkey)受到免于致死 SIV攻击的保护。此后，一直采用多种方法开发针对HIV/AIDS的人疫苗。这些方法包括灭 活病毒、表达HIV-I抗原的病毒样颗粒、表达HIV-I抗原的活重组病毒载体、基于被膜的亚 单位疫苗、使用含有HIV-I基因序列的DNA的基因疫苗接种、多价肽疫苗等。存在与所有这 些方法相关的固有的优缺点，但迄今为止，无任何方法被证实是成功的。针对HIV/AIDS的疫苗开发不断力图解决3个主要问题。第一，需要什么样的HIV 抗原呈递给免疫系统以产生保护性应答？第二，什么是将这些抗原呈递给免疫系统的最有 效的方法？最后，什么样的人免疫应答组分赋予针对HIV感染的保护(细胞免疫、体液免疫 或粘膜免疫，或这三种免疫的某种组合)？为了获得成功，有效的疫苗必须解决所有这些 问题。
概述本发明提供针对HIV/AIDS的新的联合初免-加强疫苗(combination prime-boost vaccine)，该疫苗诱导针对HIV的持久的体液免疫应答、细胞介导的免疫应答 和粘膜免疫应答。所述疫苗部分地包括使用遗传修饰的HIV，一种完整的被杀死病毒作为初免注射 (prime injection)。这就利用了天然病毒表面结构以提供最大的刺激。初免疫苗(priming vaccine)利用快速复制的无毒HIV-I构建而成，其中将天然的Env糖蛋白信号序列用更有效和无细胞毒性的信号序列置换，且其中nef基因的一部分缺失。可以大量生产出这种遗 传改造的病毒(其不仅可以由一种，而且可以由多种HIV-I亚型构建)，使之灭活，并用作被 杀死的完整病毒疫苗以诱导强体液免疫应答或抗体介导的免疫应答。被杀死的完整病毒疫 苗具有以下重大优势它在宿主免疫系统中表达基本上所有的病毒蛋白，并以其天然的成 熟构象呈递病毒蛋白。所述疫苗还包括递送形成病毒样颗粒的gag-HIV表位融合蛋白的重组腺病毒作 为加强免疫方式(boost immunization modalities)的用途。可以从所有主要的HIV-1 亚型构建这些无法复制的重组腺病毒(rAd)载体，该载体携带与中和表位区及细胞毒性 T细胞表位区两者融合的HIV gag基因。这些载体可以在支持其复制的允许辅助细胞系 (per missive helper cell line)中产生，然后将它们一同给予，其中它们能够感染，但却 不能在宿主细胞内复制，并代之以产生含有用于呈递至免疫系统的HIV靶抗原的病毒样颗 粒。因此，复制缺陷型rAd可用作加强疫苗，并且不仅能够诱导体液免疫和细胞介导的免 疫，还能够潜在地诱导粘膜免疫。总之，我们认为这种联合方法代表有效的HIV/AIDS接种方法。本文还描述了用于实施本发明方法的组合物和药盒。本发明的这些实施方案、其它实施方案及特征和特性就下面的描述、所附的附图 和权利要求书而言是显而易见的。为了全面理解本发明的范围，可进一步了解的是，可将本 发明的各个方面进行组合以得到适当的本发明的实施方案。
附图简述

图1.结合nef缺失、EnvNSS置换突变体的构建。对于所研究的各HIV-I毒株，弓丨 入nef基因的靶向缺失，并将HIV-I Env的天然信号序列置换成蜜蜂蜂毒肽(A)的信号序 列。然而，由于在env的N端编码区和vpu的C端编码区之间重叠(A，插图)，这就导致vpu 基因也被破坏。根据亚型特异性的变异、细胞嗜性、主要对组织培养适应性病毒、信号序列 长度和EnvNSS中存在的带正电荷的氨基酸残基的数目，选出4种截然不同的HIV-I毒株用 于该项研究。最值得注意的是，EnvNSS中存在的带正电荷的氨基酸数目对于Env糖蛋白的 有效生物合成尤其重要。图B中，简单描述了选出的毒株的表型性质，而在图C中，相应病 毒的Env信号肽中带正电荷的氨基酸残基用下划线表示，推定的信号序列切割位点用双斜 杠(//)表示。图2. A3. 01和H9细胞中HIV-1NM_3突变型的复制和感染性。在原病毒DNA转染之 后，每2天分离出细胞，收集培养物上清液的样品，通过p24 ELISA进行分析以监测病毒的 复制情况。为了评价所产生的病毒粒的感染性，通过MAGI测定法对样品作进一步的分析， 使结果标准化以表示每ng p24蛋白存在的感染性病毒粒的数目。如本图所示，在A3.01细 胞(A)和H9细胞(B)两者中，遗传修饰的结合nef缺失EnvNSS置换突变型(NL4-3T)更快 速地复制至与野生型病毒(NL4-3W)相同的滴度或大于野生型病毒的滴度，尽管野生型病 毒的感染性约为NL4-3T突变型感染性的10倍(B，插图)至50倍(A，插图)。图3.复制缺陷型rAd载体的示意图。通过将融合蛋白克隆到Ad5骨架载体的缺 失ElA区中来产生复制缺陷型rAd载体，该融合蛋白由与一系列中和表位或T细胞表位融 合的截短形式的HIV-Igag基因或HIV-2gag基因组成。图中显示5种rAd载体(rAdl-5)中每一种，以及每个插入表位的名称和氨基酸序列。rAdl-3含有中和表位(与HIV-2gag融 合)，而rAd4和rAd5含有T细胞表位(与HIV-Igag融合)。图4.动物选择和时间表。选择18只雄性猕猴用于本项研究，将猕猴关养在加利福 尼亚国家灵长类动物研究中心(CaliforniaNational Primate Research Center, Davis, California)。图中显示各研究对象各自的动物编号以及开始研究时动物的年龄。将动物分 成3组第1组、第2组和对照。标出用于每组的接种时间表，包括时间点和免疫原(AT-2 用AT-2灭活的完整杀死病毒抗原与CpG佐剂免疫，rAd 用rAd抗原与CpG佐剂免疫)。根 据攻击日期，将各动物组再细分成2个另外的组(*这是使动物33226适应所必需的，出于 我们认为与接种方案无关的临时健康考虑，推迟该动物的接种)。将在第33周时受到攻击 18只动物中的12只指定为WOVOl亚组，而将其余6只在第39周受攻击的动物指定为W0V02 亚组。病毒攻击由静脉内给予SHIV 89. 6和SHIV SF162p4病毒的组合组成。按图5中的 标注收获样品，按该图中标明的日期对每只动物进行尸体剖检。图5.动物体重测量。在接种前和接种后以及攻击前和攻击后定期给动物称重和 检查以评价它们的一般健康状况和福利。所有动物都对接种方案有良好的耐受，没有可测 量的体重减轻或不良副作用(接种日期用黄色箭头表示)。同样，虽然也一些动物在攻击后 显示出体重略有波动(攻击日期用红色箭头表示)，但是所有动物保持相对健康，监测数月 直到尸体剖检。图6.⑶4 ⑶8T细胞之比。通过流式细胞术测定采样血液中⑶4+T细胞/ μ 1和 ⑶8+Τ细胞/μ 1的数目，计算出⑶4 ⑶8之比。健康动物⑶4 ⑶8之比通常>1(用虚 线表示)。所有各组动物，包括未接种对照在攻击前和攻击后都保持一致的CD4 CD8之 比。接种日期用浅灰色箭头表示，攻击日期用深灰色箭头表示。图7. T细胞增殖测定。进行了淋巴细胞增殖测定以评价HIV特异性⑶4+Τ细胞应 答。细胞用ΑΤ-2灭活的HIV刺激，通过掺入放射性标记的底物来测定细胞的增殖情况。刺 激指数(SI)2(用虚线表示)用作阳性增殖的截断值。接种日期用浅灰色箭头表示，攻击日 期用深灰色箭头表示。在攻击前接种期间(图A)以及攻击后期间(图B)对动物进行了评 价。图8. IFN- y ELISP0T测定。通过IFN- y ELISPOT测定法对CD8+细胞毒性T细胞 (CTL)应答进行了评价。在第6周、第12周、第20周和第38周检查IFN-γ分泌细胞的频 度。采用一组代表HIV-IGag蛋白保守区的20种肽(15聚体)刺激细胞。由1名HIV-I血清 反应阳性患者中分离出的PBMC用作阳性对照。该图中的结果用每100万PBMC表达IFN- γ 的细胞数表示。显示了在第33周受攻击的W0V01动物组的代表性数据。图9.血浆vRNA (病毒量)测定。在SHIV攻击之后，通过分支DNA (bDNA)测定法测定血浆SIV RNA水平。用于该测定的分界检出限为log 2. 1血浆vRNA拷贝/ml(用虚线 表示)。显示了在第33周受攻击的W0V01动物组的代表性数据(用深灰色箭头表示)。图10.血浆IgG抗HIV抗体测定。通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)，使用HIV-I IIIB纯的病毒裂解物作为捕捉抗原，对血清样品中存在的抗HIV-I抗体水平进行了分析。 接种日期用浅灰色箭头表示，攻击日期用深灰色箭头表示。显示了在第33周受攻击的 W0V01动物组的代表性数据。图11.初免-加强疫苗试验的时间线。以第1组和第2组免疫后(接种组)的周数以及以对照组攻击后的周数表示的疫苗试验时间表一览。浅灰色圆圈表示样品收获时间 点，深灰色圆圈表示使W0V02亚组动物适应后所采集的其它样品，W0V02亚组动物在第39 周受攻击(与WOVOl亚组动物在第33周受攻击不同)。浅灰色箭头表示接种时间，深灰色 箭头表示攻击时间。AT-2 用500μ 1 ΑΤ-2灭活的完整杀死病毒抗原与500 μ 1 CpG佐剂 免疫，rAd 用500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐剂免疫，SHIV攻击用SHIV 89. 6和SHIV SF162p4的组合进行病毒攻击，TCID50 = 100
详述A.定义为方便起见，将本说明书、实施例和所附权利要求书所使用的某些术语汇总于此。 除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所普遍理 解的相同含义。本文名词前无特定数词时是指一个或多个(即至少一个)。举例来讲，“元件”是 指一个元件或者多于一个元件。术语“给予”包括递送本发明化合物的任何方法，包括但不限于将药物组合物或治 疗药递送到受治疗者系统，或者递送到受治疗者的特定部位内或特定部位上。本文所用术 语“全身性给药”、“全身性给予”、“外周给药”和“经外周给予”是指以不同于直接进入中枢 神经系统的方法给予化合物、药物或其它物质，由此使之进入患者系统，从而进行代谢和其 他类似过程，例如皮下给药。“胃肠外给药”和“胃肠外给予”是指不同于肠内给药和局部 给药的给药方式，一般通过注射来进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶 内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸肌 内注射和输注。术语“氨基酸”为本领域所知。本文用于标明氨基酸和保护基的缩写一般根据 IUPAC-IUB生物化学命名委员会的推荐(参见Biochemistry (1972) 11 :1726_1732)。在某 些实施方案中，用于本发明应用的氨基酸是存在于蛋白质中的天然存在的氨基酸或天然存 在的含有氨基和羧基的这类氨基酸的合成代谢产物或分解代谢产物。特别合适的氨基酸侧 链包括选自以下氨基酸的侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组 氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。术语“氨基酸”还包括本文所提及的任何具体氨基酸的类似物、衍生物和同类物， 以及C端或N端受保护的氨基酸衍生物(例如被N端或C端保护基修饰)。例如，本发明包 括使用其中侧链加长或缩短同时仍提供羧基、氨基或用于环化的其它反应性前体官能团的 氨基酸类似物，以及具有含合适官能团的不同侧链的氨基酸类似物。例如，题述化合物可包 括氨基酸类似物，例如氰丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、 二羟苯丙氨酸、5_羟色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸或二氨 基丁酸。具有对本文而言合适的侧链的其它天然存在的氨基酸代谢物或前体为本领域技术 人员所公认，并且包括在本发明的范围内。当氨基酸的结构允许存在立体异构型时，还包括的是这类氨基酸的(d)和⑴立 体异构体。本文中的氨基酸和氨基酸残基的构型用合适的符号(d)、(1)或(dl)标明。此夕卜，当氨基酸或残基的构型未标明时，则可具有构型(d)、(l)或(dl)。因此应了解的是，由 这类不对称所引起的异构体包括在本发明的范围内。可以通过标准的分离技术，以及通过 立体受控合成，获得基本纯形式的这类异构体。对于本申请而言，除非有相反的明确说明， 否则指定的氨基酸应解释为包括(d)立体异构体或(1)立体异构体两者。
本文所用术语“抗体”包括例如任何同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的完整抗体， 包括多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体和人源化抗体；以及其特异性识别并能够结合蛋白 质表位的片段。可以采用常规技术使抗体成为片段，并以相同方式筛选出可利用的片段。 因此，该术语包括能够选择性与特定蛋白质反应的抗体分子的蛋白酶剪切部分区段或重组 制备部分区段。这类蛋白酶解片段和/或重组片段的非限制性实例包括Fab、F(ab' )2、 Fab'、Fv和含有通过肽接头连接的V[L]区和/或V[H]区的单链抗体(scFv)。scFv可以 共价或非共价连接以形成具有两个或更多个结合位点的抗体。术语“包含”以包含性开放式的意义使用，是指还可包括其它组分。术语“保守取代”是指分子性质十分相似的氨基酸的交换。例如，在脂族基丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸内的互换可视为保守的。有时这些中的一个被甘氨酸取代也可 被视为保守的。其它保守的互换包括以下基团内的互换脂族基天冬氨酸和谷氨酸、酰胺基 天冬酰胺和谷氨酰胺、羟基丝氨酸和苏氨酸、芳族基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、碱性基团 赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及含硫基团甲硫氨酸和半胱氨酸。有时基团甲硫氨酸和亮氨酸 内的取代也可视为保守的。优选的保守取代基为天冬氨酸_谷氨酸、天冬酰胺_谷氨酰胺、 缬氨酸_亮氨酸_异亮氨酸、丙氨酸_缬氨酸、缬氨酸_亮氨酸_异亮氨酸_甲硫氨酸、苯丙 氨酸_酪氨酸、苯丙氨酸_酪氨酸_色氨酸、赖氨酸_精氨酸和组氨酸_赖氨酸_精氨酸。“等同的”当用来描述核酸序列或核苷酸序列时，是指编码功能上等同的多肽的核 苷酸序列。等同核苷酸序列可包括因有一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列， 例如等位变异体，因此可包括因遗传密码简并性而不同的序列。例如，核酸变异体可包括由 核苷酸取代、缺失或添加所产生的变异体。取代、缺失或添加可包括一个或多个核苷酸。变 异体可以在编码区、非编码区或两者中发生改变。编码区的变化可产生保守或非保守的氨 基酸取代、缺失或添加。可采用本领域众所周知的方法，通过直接化学合成经共价键制备变异肽。变异体 还可包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。也可使缺失、插入和取代进行任何 组合以获得最终的构建体，前提是最终的构建体具有所需要的活性。可以通过编码肽分子 的DNA的核苷酸定点诱变(以Adelman等，DNA 2 183 (1983)为例)，从而产生编码变异体 的DNA，其后使该DNA在重组细胞培养中进行表达，来制备这些变异体。变异体通常具有与 野生型多肽性质相同的生物活性。本领域清楚还可合成已知多肽的所有可能的单氨基酸取 代(Geysen 等，Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18 :3998_4002 (1984))。虽然不同取代的作用不 总是累加的，但是有理由预期，多肽上不同残基位置上的两个有利或中性的单取代可以安 全地联合而不会导致丧失任何蛋白质活性。用于简并多肽的制备方法可参见Rutter，美国 专利号 5，010，175 ；Haughter 等，Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82 :5131_5135 (1985) ；Geysen 等，Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18 3998-4002 (1984) ；W086/06487 和 W086/00991。在设计取代策略时，普通技术人员可确定改变哪一个残基以及哪一个氨基酸或哪 一类氨基酸为合适的置换。还可考虑家族或天然存在的同源蛋白质的序列变异的研究。某些氨基酸取代常常比其它氨基酸取代更耐受(tolerate)，这些常常与原始氨基酸及其置换 氨基酸之间大小、电荷等的相似性有关。还可按照上述方法进行氨基酸的插入或缺失。取 代优选为保守的，参见例如 Schulz 等，Principle of ProteinStructure (Springer-Verlag ,New York (1978))；以及 Creighton, Proteins !Structure and Molecular Properties (W. H. Freeman & Co.，San Francisco (1983))；两份文献都通过引用全部结合到本文中。 本文所用术语“基本上无细胞溶解性的”是指反转录病毒不会显著损害或杀死其 感染的细胞。本文所用核酸的“功能性”片段是能够编码基因的信号序列的核酸片段，该基因与 该片段连接。因此，核酸的“功能片段”包括能够在合适的条件下编码信号序列的核酸。本领域技术人员已知的术语“HIV”是指人免疫缺陷病毒。有两种类型的HIV: HIV-I和HIV-2。有许多不同的HIV-I毒株。HIV-I毒株可被分为三组“主要(major) ”组， 即M组，“异常(outlier) ”组，即0组和“新(new) ”组，即N组。这三个组可代表三种独立 进入人体的猿猴免疫缺陷病毒。在M组内有至少10个亚型或分化体例如，分化体A、B、C、 D、E、F、G、H、I、J和K。“分化体”是一组生物(例如一个种)，其成员有共同的衍生自共同 祖先的同源特征。本申请任何提及HIV-I时都包括所有的这些毒株。术语“包括”是用来指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。术语“非感染性的”是指降低到不存在感染能力。
“患者”或“受治疗者”或“宿主”是指人或非人类动物。术语“递药装置”是指可用来给予受治疗者治疗药或药物的任何装置。递药装置 的非限制性实例包括皮下注射器、多室注射器(multichamber syringe)、支架、导管、透皮 贴剂、微针(microneedle)、微研磨器(microabrader)和可植入控释装置。在一个实施方案 中，术语“递药装置”是指能够在注射前使两种化合物混勻的双室注射器。本文所用术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适于与人组织和动 物组织接触而无过度毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，并与合理的利益/风险 比相当的化合物、物质、组合物和/或剂型。本文所用术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或溶媒， 例如参与将题述化合物从一种器官或身体的一部分运送或转运到另一种器官或身体的另 一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。在与制剂的其它成分相容 并且对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的 物质的一些实例包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯 淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍 胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花 生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11)多元 醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼 脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水； (18)林格溶液(Ringer' s solution) ； (19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯 和/或聚酐；和(22)用于药物制剂的其它无毒相容性物质。术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的聚合形的核苷酸，或是脱 氧核糖核苷酸，或是核糖核苷酸或其类似物。下面是多核苷酸的非限制性实例基因或基因片段的编码区或非编码区、由联锁分析界定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、 转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸(branched polynucleotide)、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引 物。多核苷酸可包含修饰核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。修饰如果存在，则核 苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后进行。核苷酸序列可以被非核苷酸组分间隔 开。多核苷酸可以在聚合后进一步被修饰，例如通过与标记组分缀合。术语“重组”多核苷 酸是指基因组、cDNA、半合成来源或合成来源的多核苷酸，其不是天然存在的多核苷酸或者 与其它非天然排列的多核苷酸连接。“寡核苷酸”是指不超过约100个核苷酸的单链多核苷 酸，例如不超过约75、50、25或10个核苷酸。 本文术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)可互换使用，是指氨基酸的聚 合物。该聚合物可以是直链或是支链，它可包含修饰氨基酸，而且可被非氨基酸间隔开。该 术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物，例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或 任何其它操纵，例如与标记组分缀合。在某些实施方案中，本发明的多肽可以经化学合成、在无细胞系统中经核糖体合 成、或者在细胞内经核糖体合成。可以采用各种本领域公认的方法进行本发明多肽的化 学合成，包括分步固相合成、经由肽片段构象辅助再连接(conformationally-assisted re-ligation)的半合成、克隆或合成肽区段的酶促连接和化学连接。天然化学连接采用 两个未受保护的肽区段的化学选择反应以产生瞬时硫酯连接的中间体。然后，该瞬时硫酯 连接的中间体自发地进行重排，以提供在连接位点具有天然肽键的全长连接产物。全长 连接产物在化学上与通过无细胞合成而产生的蛋白质相同。全长连接产物可以根据被允 许的情况而进行重新折叠和/或氧化，以形成天然的含有二硫键的蛋白质分子(参见例 如美国专利号 6，184，344 和 6，174,530 ；以及 T. W. Muir 等，Curr. Opin. Biotech. (1993) 第 4 卷，第 420 页；M-Miller 等，Science (1989)第 246 卷，第 1149 页；A. Wlodawer 等， Science (1989)第 245 卷，第 616 页；L. H. Huang 等，Biochemistry (1991)第 30 卷， 第 7402 页；M. Schnolzer 等，Int. J. Pept. Prot. Res. (1992)第 40 卷，第 180-193 页； K. Rajarathnam^, Science (1994) ||264^,||90^ ；R. E. Offord,"Chemical Approaches to Protein Engineering(蛋白质工禾呈的化学方法)，，，载于 Protein Design and the Development of Newtherapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste 主 编，(Plenum Press, New York, 1990)，第 253-282 页；C. J. A. Wallace 等，J. Biol. Chem. (1992)第 267 卷，第 3852 页；L. Abrahmsen 等，Biochemistry (1991)第 30 卷，第 4151 页；T. K. Chang 等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91 12544-12548 ；Μ. Schnlzer 等，Science (1992)第 3256 卷，第 221 页；和 K. Akaji 等，Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985)33 184)。正如本领域技术人员所知，“反转录病毒”是通过整合DNA中间体(原病毒DNA) 复制的二倍体正链RNA病毒。具体地讲，在被RNA病毒感染时，慢病毒基因组(lentiviral genome)被病毒编码的反转录酶反转录成DNA，该反转录酶在各反转录病毒中作为蛋白质 携带。然后该病毒DNA伪随机地整合至宿主的感染细胞的细胞基因组中，形成通过子细胞 遗传的“原病毒”。反转录病毒基因组含有至少3个基因编码病毒核心蛋白和结构蛋白的 gag ；编码反转录酶、蛋白酶和整合酶的pol和编码病毒表面蛋白的env。在反转录病毒科 中，HIV被归类为慢病毒，与动物慢病毒具有遗传和形态相似性，动物慢病毒例如感染以下动物的病毒猫(猫免疫缺陷病毒)、绵羊(绵羊髓鞘脱落病毒)、山羊(山羊关节炎-脑炎 病毒)和非人类灵长类(猿猴免疫缺陷病毒)。本文所用“充分缺失”是指核酸序列的缺失足以防止转录并进而产生相应的蛋白 质产物。B.预防或治疗慢病毒感染的方法本发明提供预防或治疗慢病毒感染的方法，该方法包括给予有需要的动物(a)有 效量的本发明的已被杀死的基本上是非感染性的无毒重组慢病毒作为初免注射，以及(b) 有效量的包含慢病毒蛋白编码核酸的重组复制缺陷型腺病毒载体作为加强免疫方式。本文所用术语“有效量”是指为达到所需结果所必需的有效的、在一定剂量下并持 续一定时间的量。本文所用术语“动物”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，优选是人。在某些实施方案中，将(a)给予动物之后，再将(b)给予所述动物。在某些实施方案中，在治疗或预防疗程中不止一次将(b)给予患者。在某些实施方案中，将(a)给予有需要的患者，且在给予(a)后大约3周、8周、16 周时将(b)给予有需要的患者。在某些实施方案中，预防或治疗慢病毒感染的方法包括给予有需要的患者(a) 有效量的包含具有糖蛋白120信号序列的重组慢病毒的疫苗，其中所述糖蛋白120信号序 列选自seq id no :3-6中所列的多肽序列或其功能片段或变异体，其中所述其功能片段或 其变异体含有不超过1个(1)的带正电荷的氨基酸；以及(b)有效量的包含慢病毒蛋白编 码核酸的重组复制缺陷型腺病毒载体。下面还将对在上述方法中用作(a)和(b)的组合物作进一步描述。C.用于初免注射的组合物多种已被杀死的基本上是非感染性的无毒重组慢病毒可以用作(a)，即初免注射， 其中病毒被膜糖蛋白的天然信号序号(优选gpl20)被修饰以提供基本上是非感染性的信 号序列。在某些实施方案中，该病毒通过使nef基因缺失而致使无毒。按照前述实施方案，提供非感染性nss (天然信号序列)的修饰致使在nss序列中 不超过1个氨基酸带正电荷。优选所述慢病毒为Hiv-I。在某些实施方案中，慢病毒是基本上无细胞溶解性的能够高效复制的重组hiv-1， 其中病毒被膜糖蛋白的nss被长度约20至约40个氨基酸的信号序列置换，其中所述信号 序列含有不超过1个(1)的带正电荷的氨基酸。gpl20信号序列的修饰可以用中性氨基酸取代以下天然信号序列中的带正电荷的 氨基酸来进行(m R v K e KK TQHLff R WGff R wgtmllgmlmicsa ；seq id no 1)；这类修饰 可以表示为=Mx1Vx2Ex3Ktqhlwx4Wgwx5Wgtmllgmlmicsa(seq id 而2)，其中乂1、父2、父3、父4和父5 为中性氨基酸。带正电荷的残基用粗体字和下划线表示。示例性修饰的信号序列包 括MR VAEI K TQHLff R WGff R WGTMLLGMLMICSA(YL-1 ； SEQ ID NO 3), MTV K E KK TQHLff IffGff IffGTMLLGMLMICSA (YL-2 ；SEQ ID NO: 4)，M E VVEI K TQHLffIffGffIffGTMLLGMLMICSA (YL-3 ；SEQ ID NO 5), MIVAEI K TQHLffIffGffIffGTMLLGMLMICSA (YL-4 ；SEQ ID NO 6)，M K FLVNVALVFMVVYISYIYADPINM (经修 饰的蜂毒肽信号肽，下划线序列是插入接头的结果，表示信号序列与成熟gpl20蛋白之间 的5个氨基酸；seq id no 7),mlllllmlfhlglqasisgr -dpinm(经修饰的白介素3信号肽，下划线序列是插入接头结果，表示信号序列与成熟gpl20蛋白之间的7个氨基酸；SEQ ID NO 8)或其功能片段或变异体。其它组合物和用于制备这类组合物的方法可参见美国专利号7,067, 134，该专利 通过引用全部结合到本文中。可采用本 领域已知技术，来制备本发明的重组慢病毒。在一个实施方案中，可以在 适于慢病毒在宿主中复制和表达的条件下，将慢病毒导入宿主细胞。因此，本发明还提供用 重组慢病毒转染的细胞，其中该病毒的被膜糖蛋白gpl20的天然信号序列被修饰以提供基 本上无细胞毒性的病毒，或者用基本上是非感染性的信号序列置换。所述细胞优选T淋巴 细胞，更优选不是从经转化细胞系衍生的T细胞。本发明进一步的特征是包括给予有效量的如上所述的无毒慢病毒和基本上非感 染性慢病毒的方法。介于约0. 01-约2. 5mg/kg体重之间、优选介于约0. 05-约0. 5mg/kg 体重之间、最优选介于约0. 10-约0. 23mg/kg体重之间的剂量水平可用于本文所述方法的 初免注射。可与载体材料相混合以产生单一剂型的活性成分的量将随受治疗的宿主和具体 的给药方式而变化。疫苗的剂量可随例如以下因素而变化个体的疾病状态、年龄、性别和 体重以及抗体在个体中诱导所需应答的能力。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。 例如，可每日给予若干分剂量，或者可以根据紧急治疗情况的需要按比例减少剂量。还可以 根据情况改变疫苗剂量以提供最佳的预防剂量反应。本发明的组合物适于以生物相容性形式体内给予受治疗者。本文所用术语“适于 体内给予的生物相容性形式”是指其中治疗作用超过任何毒性作用的被给予的物质形式。 可以给予任何动物(优选人)该物质。本发明的疫苗可另外含有合适的稀释剂、佐剂和/或载体。优选疫苗含有可在体 内提高疫苗免疫原性的佐剂。佐剂可以选自许多本领域已知的佐剂，包括革兰氏阴性菌内 毒素的脂质A部分、分枝杆菌的海藻糖二霉菌酸、磷脂溶血磷脂酰胆碱、溴化二甲基双十八 烷基铵(DDA)、某些线性聚氧丙烯-聚氧乙烯(POP-POE)嵌段聚合物、氢氧化铝、脂质体 和CpG(胞嘧啶-磷酸-胍)聚合物。疫苗还可包含已知提高免疫应答的细胞因子，包括 GM-CSF、IL-2、IL-12、TNF 和 IFN γ。本发明的疫苗可以配制成口服、真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和阴道 内或任何其它标准免疫途径给予的疫苗，并作为此类疫苗引入(introduce)。在题述疫苗的制剂中，润湿剂、乳化剂和润滑剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁) 以及着色剂、释放剂、包衣材料、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂可存在于制剂中。题述组合物可适于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道、作为气雾剂 和/或胃肠外给予。制剂可方便地呈单位剂型，并可通过制药学领域众所周知的任何方法 制备。可与载体材料混合以产生单剂量的组合物的量可根据待治疗的受治疗者和具体的给 药方式而变化。制备这些制剂的方法包括将本发明的组合物与载体及任选一种或多种配合剂混 合的步骤。一般而言，通过将药物与液体载体或微细的固体载体或两者均勻地紧密混合，然 后有需要时将该制品成形，来制备制剂。适于口服给药的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、糖锭剂(采用调味基料(flavored basis)，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂的形式，或者作为 水性液体或非水液体中的溶液剂或混悬剂，或者作为水包油或油包水液体乳液剂，或者作 为酏剂或糖浆剂，或者作为锭剂(采用惰性基料，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)， 各种剂型含有其预定量的题述组合物作为活性成分。本发明的组合物还可以推注、糖药剂 或糊剂给予。 在用于口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、散剂、颗粒剂等)中， 题述组合物与一种或多种药学上可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或下面 的任一种(1)填充剂或补充剂(extender)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或 硅酸；⑵粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树 胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、 某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7) 润湿剂，例如鲸蜡醇(acetyl alcohol)和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润 土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合 物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，组合物还包含缓冲剂。相似类型的固 体组合物还可在使用如乳糖(lactose/milk sugar)和高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填 充和硬填充明胶胶囊剂中作为填充剂。可以任选与一种或多种配合剂一起，通过压制或模制来制成片剂。可以使用粘合 剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸 淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压制片。可以在合适的机器 中，将用惰性液体稀释剂湿润的题述组合物的混合物经压模来制备模制片。片剂和其它固 体剂型(例如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂)，可任选划痕，或者可以用包衣材料和包壳材 料(shells)制备，例如制药领域众所周知的肠溶衣和其它包衣材料。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、 糖浆剂和酏剂。除题述组合物以外，液体剂型可含有通常用于本领域的惰性稀释剂，例如 水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄 酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚(germ)油、橄榄油、蓖麻油 和芝麻油)、甘油、四氢呋喃基醇(tetrahydrofuryl alcohol)、聚乙二醇和山梨坦的脂肪酸 酯及其混合物。除题述组合物以外，混悬剂可含有助悬剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨 醇和山梨坦酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。用于直肠或阴道给药的制剂可呈栓剂，它可通过将题述组合物与一种或多种合适 的例如包括以下的无刺激性赋形剂或载体混合来制备可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸 盐/酯，而且它在室温为固体，但在体温下为液体，因此，可在体腔内融化并释放出活性药 物。适于阴道给药的制剂还包括阴道栓、阴道塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂制 剂，含有诸如本领域已知是合适的载体。经皮给予题述组合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶 齐U、溶液剂、贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载体，以及需 要时与任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂相混合。除题述组合物以外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可含有赋形剂，例如动植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石粉和氧 化锌或其混合物。
除题述组合物以外，散剂和喷雾剂还可含有赋形剂，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧 化铝、硅酸钙和聚酰胺粉或这些物质的混合物。喷雾剂另还可含有常规抛射剂，例如含氯氟 烃和挥发性未取代烃，例如丁烷和丙烷。可另外通过气雾剂给予本发明的组合物。这可通过制备含有所述化合物的水性气 雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来实现。可以使用非水(例如碳氟化合物抛射物)混悬剂。可 以使用声波喷雾器(Sonicnebulizers)，因为它们将使暴露于剪切力的药物达到最小，该剪 切力可导致题述组合物中所包含的化合物降解。通常，通过用常规药学上可接受的载体和稳定剂配制题述组合物的水性溶液或混 悬液，来制备水性气雾剂。载体和稳定剂随特定题述组合物的要求而变化，但是通常包括非 离子表面活性剂(吐温(Tween)、普流罗尼克(Pluronic)或聚乙二醇)、无毒蛋白样血清白 蛋白、山梨坦酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(例如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气雾剂一般由 等渗溶液制备。另外，疫苗可以作为注射剂经胃肠外给予(静脉内、肌内或皮下)。本发明的疫苗 组合物可任选含有一种或多种佐剂。可以使用任何合适的佐剂，例如CpG聚合物、氢氧化 铝、磷酸铝、植物油和动物油等，其中佐剂的量取决于所使用的具体佐剂的性质。另外，抗感 染疫苗组合物还可含有至少一种稳定剂和缓冲剂，稳定剂例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、 糊精和葡萄糖等糖类以及白蛋白或酪蛋白等蛋白质，缓冲剂例如磷酸碱金属盐等。适于胃肠外给药的本发明的药物组合物包含题述组合物与一种或多种药学上可 接受的无菌等渗水性或非水溶液、分散液、混悬液或乳液，或者与临用前重配成无菌注射溶 液剂或分散剂的无菌散剂的组合，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、致使制剂与既定接 受者血液等渗的溶质、悬浮剂或增稠剂。用于本发明药物组合物的合适的水性载体和非水载体的实例包括水、乙醇、多元 醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)以及注射 用有机酯(例如油酸乙酯)。可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、通过保持所需粒径 (在分散剂的情况下)、以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。此外，可将本发明的非感染性重组慢病毒包封在脂质体中，并通过注射给药。市售 脂质体递药系统可获自Novavax，Inc.，Rockville, Md.，其以Novasomes 的名称销售。这 些脂质体经特别制备用于递送免疫原或抗体。在本发明的一个实施方案中，可以使用含有 与这些非磷脂带正电荷的脂质体表面结合的Isd肽或抗体分子的Novasomes 。P.用作加强免疫方式的组合物多种基于5型腺病毒(Ad5)基因组的复制缺陷型重组腺病毒载体可被用作上述方 法的(b)，即加强免疫方式。更确切地说，由Ad5基因组组成的骨架载体，含有缺失的腺病毒 ElA基因，该基因是病毒复制所必需的(Graham，F.等(1977)General Virology36 :59_72)。 正是在这个缺失基因区插入了我们的靶HIV-I基因(见下文和图3)。靶HIV-I基因可选自 Los Alamos 国家实验室 HIV 数据库(Los AlamosNational Laboratory HIV Databases), 网址 http //www. hiv. lanl. gov/content/index。在某些实施方案中，HIV基因被插入所述ElA区。HIV基因可为例如HIV-Igag或HIV-2gag。 在其它实施方案中，HIV基因和至少一个中和表位或T细胞表位被插入ElA区。所 述至少一个中和表位或T细胞表位可选自例如SEQ ID NO 14-34中的任一个。表达载体包含遗传工程改造形式的腺病毒。对腺病毒遗传组构的认识，即36kb线 性双链DNA病毒，使得可以用长达7kb的外源序列对大段腺病毒DNA进行取代。与反转录 病毒不同，腺病毒感染宿主细胞不会引起染色体整合，因为腺病毒DNA可按附加型形式进 行复制而无潜在的基因毒性。此外，腺病毒结构稳定，在大量扩增后未观察到基因组重排。 腺病毒可以不论细胞周期而影响几乎所有的上皮细胞。迄今为止，腺病毒感染似乎仅与轻 微疾病例如人急性呼吸道疾病相关。腺病毒特别适于用作基因转移载体，因为它具有中等大小的基因组、易于操纵、滴 度高、靶细胞范围广和感染性强。病毒基因组的两端均含有100-200个碱基对反向重复 (ITR)，它是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)区和晚期(L)区含 有通过病毒DNA复制开始而被分开的不同的转录单位。El区(ElA和ElB)编码负责调节病 毒基因组转录的蛋白质和少数细胞基因。E2区(E2A和E2B)的表达引起用于病毒DNA复 制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞阻断(shut-off)。 晚期基因的产物(包括大部分病毒壳体蛋白)仅在由主要晚期启动子(MLP)产生的单一初 级转录物的有效加工后表达。MLP，(位于16. 8m. u.)在感染晚期特别有效，由该启动子产 生的所有mRNA具有5'-三联前导(TPL)序列，使它们成为用于翻译的优选的mRNA。在现有系统中，重组腺病毒由穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组产生。由于 两个原病毒载体之间可能发生重组，所以可从这个过程中产生野生型腺病毒。因此，由单个 噬斑分离出单个病毒克隆并检查其基因组结构十分关键。现有的复制缺陷型的腺病毒载体的产生和增殖取决于独特的称为293的辅助细 胞系，它由Ad5 DNA片段转化人胚肾细胞而得到，并组成型地表达El蛋白。由于腺病毒基 因组的E3区可有可无，所以现有的借助于293细胞的腺病毒载体，在El区、E3区或两个区 内可带有外源DNA。实际上，腺病毒可包装约105%的野生型基因组，提供大约2个多kb的 DNA容量。再加上在El区和E3区中可被置换的约5. 5kb的DNA，现有腺病毒载体的最大容 量为7.5kb以内，即约为载体总长度的15%。80%以上腺病毒的病毒基因组留在载体主链 上，是载体携带的细胞毒性的来源。此外，El缺失病毒的复制缺陷性是不完全的。例如，用 目前有效的感染复数(MOI)高的载体可观察到病毒基因表达渗漏。辅助细胞系可衍生自人细胞，例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其它人胚胎间 充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可衍生自允许人腺病毒感染的其它哺乳动物物种的 细胞。这类细胞包括例如非洲绿猴肾细胞株系细胞或其它猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。 如上所述，优选的辅助细胞系是293。用于293细胞培养和腺病毒增殖的方法可包括通过将各细胞接种到1公升装有 100-200ml培养基的硅化转瓶(Techne，Cambridge, UK)中，使天然细胞聚集体生长。在 40rpm下搅拌之后，用锥虫蓝估算细胞存活率。在其它形式中，如下使用Fibra-Cel微载体 (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5g/l)。在250ml锥形瓶中，将重新悬浮于5ml培养基的细胞 接种物加到载体(50ml)中后静置1-4小时，不时搅拌。然后培养基用50ml新鲜培养基更 换，并开始振荡。对于病毒产生，使细胞生长至约80%汇合，此后更换培养基(为25%的最终体积)，加入ο. 05MOI的腺病毒。使培养物静置过夜，之后将体积增加至100%，再开始振 荡72小时。除腺病毒载体为复制缺陷型或至少条件性缺陷型的要求以外，我们认为腺病毒载 体的性质不是成功实施本发明所至关重要的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或A-F 亚组中的任一种。为了获得用于本发明的条件性复制缺陷型腺病毒载体，5型腺病毒C亚组 是优选的原料。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，有关该病毒的大量生物化学信息和遗传 信息是已知的，它 一直以来被用于大部分的使用腺病毒作为载体的构建。腺病毒易于培养和操纵，并在体外和体内具有广泛的宿主范围。可以高滴度(例 如IO9-IO11噬斑形成单位/ml)获得该组病毒，且它们具有高度感染性。腺病毒的生活周期 无需整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外源基因是附加型的，因此，对宿主细 胞的基因毒性低。在用野生型腺病毒接种的研究中没有副作用的报道，这就表明它们作为 体内基因转移载体的安全性及治疗潜力。腺病毒载体已用于真核基因表达和疫苗开发。最近，动物研究表明，重组腺病 毒可用于基因疗法(Stratford-Perricaudet 禾口 Perricaudet，(1991)，载于 Human Gene Transfer, 0. Cohen-Haguenauer 禾口 Μ· Boiron 主编，John Libbey Eurotext, France 版本， 第 51-61 页；Stratford-Perricaudet 等(1990) Hum. Gene Ther.，1 :241_256 ；以及 Rich 等 (1993) Hum. Gene Ther.，4 :461_476)。给予不同组织重组腺病毒的研究包括气管灌输、肌肉 注射、外周静脉内注射和立体定位术接种(stereotactic inoculation)到脑内。本发明进一步的特征是包括给予有效量的基于如上所述的5型腺病毒(Ad5)基因 组的复制缺陷型重组腺病毒载体的方法。介于约lXlCf-lXliTpfu/kg体重之间、优选介 于约5X 108-5X 109pfu/kg体重之间、最优选介于约8. 46X 108_2. 21X 109pfu/kg体重之间 的剂量水平可以在本文所述方法中用作加强免疫方式。可与载体材料混合以制备单一剂型 的活性成分的量将根据待治疗宿主和具体的给药方式而改变。疫苗的剂量可根据例如以下 因素而变化疾病状态、个体年龄、性别和体重以及抗体在个体中诱导所需应答的能力。可 以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每日给予若干次分剂量，或者可以根据 紧急治疗情况的需要按比例减少剂量。还可以根据情况改变疫苗剂量以提供最佳的预防剂 量反应。E.药盒本发明提供例如用于预防或治疗慢病毒感染的药盒。例如，药盒可装有一种或多 种如上所述的药物组合物和任选其使用说明书。在又一个实施方案中，本发明提供装有一 种或多种药物组合物和一个或多个用于完成给予这类组合物的装置的药盒。可以将药盒组分进行包装，以手工或者部分自动化或全自动化地实施前述方法。 在涉及药盒的其它实施方案中，本发明包括装有本发明组合物和任选其使用说明书的药 盒。这类药盒可具有各种用途，包括例如成像、诊断、治疗和其它应用。
实施例通过下面的实施例对本发明作进一步说明，实施例不得解释为以任何方式作为限 制。所引用的所有参考资料的内容，包括参考文献、已授予专利权的专利、本申请全文引用 的已公开或未公开的专利申请，均通过引用明确结合到本文中。除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术人员所掌握的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生 物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这类技术在文献中有大量的记载(参见 例如 Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis 主编(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989) ；DNA Cloning,第 I 册和第 II 册 (D. N. Glover 主编，1985) ；Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait 主编，1984) ；Mullis 等，美国专利号 4，683，195 ；Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames 和 S. J. Higgins 主 编，1984) ；Transcription And Translation(B. D. Hames 禾口 S. J. Higgins 主 编，1984)； (R. I. Freshney,Alan R. Liss,Inc.,1987) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文，Methods InEnzymology(Academic Press, Inc. , N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells (J. H. Miller 和 M. P. Calos 主编，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；第 154 和 155 册(Wu 等主编)，ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology (Mayer 禾口 Walker主编，Academic Press,London, 1987) ；Handbook Of Experimental Immunology,第 I-IV册(D.M. Weir 和 C. C. Blackwell 主编，1986) (Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，1986)t 施彻丨 ι^ MmjMmmmmM hiv-I就HIV而言，许多障碍阻碍了用作疫苗的被杀死的完整病毒或灭活病毒的开发， 包括科学家无法安全地制备出大量灭活的病毒，已知毒力减弱通常导致病毒复制减少。我 们克服这一问题的方法是构建能够以高滴度复制的无细胞毒性的无毒HIV-1，是基于对两 个病毒蛋白Nef和Env的修饰。HIV-I的nef基因编码210-250个氨基酸的蛋白质，大小为25_27kDa。多个功能 归因于Nef，包括细胞表面蛋白(例如CD4和MHC I类分子)下调。据推测，细胞表面上有 效CD4分子的减少起防止细胞重复感染的作用，而去除MHC I复合体代表病毒免疫逃避策 略之一。另外，Nef显示出在病毒感染中起重要作用，此外，还显示出通过与蛋白激酶相互 作用来调节宿主细胞信号转导途径。然而，因为归因于Nef的最重要的功能在于其在HIV-I 致病性方面的作用，所以它涉及该遗传修饰病毒的构建。若干证据表明，HIV和其它灵长类 慢病毒的Nef蛋白对于病毒发病机制极其重要。在相关病毒SIV中，已经证实，nef缺失毒 株不仅是不致病的，而且用这些病毒感染提供了针对随后野生型病毒攻击的保护作用。此 夕卜，在人HIV-I感染的重症联合免疫缺陷小鼠模型(SCID-hu)实验中证实，Nef是体内有效 致病性所必需的。然而，比这些报道更引人注目的是鉴定出被HIV的nef缺陷毒株感染的长 期非进行性AIDS患者。虽然被HIV-I感染，但是这些个体不会发展成完全的(full-blown) AIDS (或者经相当长的时程后才发展成完全的AIDS)，遗传分析表明对感染性病毒的最好 的有效改变是破坏nef基因。总之，该证据表明含有nef基因靶向缺失的HIV-I毒株可具 有无毒或强减毒的表型。env基因是有关构建我们的遗传修饰HIV-I的另一个目标基因或更准确地讲是 Erw糖蛋白的信号序列。Env蛋白最初被合成为高度糖基化的160kDa前体，由大约850个氨 基酸组成。该多聚蛋白随后被宿主内肽酶切割成表面糖蛋白gpl20和跨膜蛋白gp41，它们 分别负责细胞附着和病毒进入。Env蛋白的一个不寻常的特征是其不寻常的信号序列。所 有信号序列基本上是沿相同的通用线路构建而成的。具体而言，它们具有带正电荷的N端区、中部疏水区和界定切割位点的极性C端区。然而，HIV-IEnv蛋白天然信号序列(EnvNSS) 含有不寻常的长疏水域和带高正电荷的N端。之前我们就曾表明，用蜜蜂蜂毒肽(EnvMSS) 置换EnvNSS导致Env蛋白表达和分泌增加、快速从分子伴侣钙联接蛋白解离和有效的信号 序列切割。另外，我们观察到当EnvNSS被替换后，糖蛋白折叠和胞内转运的动力加快。然 而，更重要的是发现，EnvNSS的存在是造成细胞凋亡和坏死两者的原因。发现由其天然信号 序列表达的重组gpl20快速杀死细胞，而用蜂毒肽信号序列将其置换则消除了此作用。总 之，该数据表明，HlV-IEnvNSS被其它更有效和无细胞毒性的信号序列(例如蜜蜂蜂毒肽的 信号序列)置换，可导致具有无细胞毒性表型且复制能力提高的HIV-I的产生。 总之，靶向缺失nef基因结合用蜜蜂蜂毒肽信号序列置换EnvNSS的组合，可产生 致病性降低的病毒，同时在受感染细胞中保持能够快速高滴度地进行复制。为此，我们的 实验室首先构建了遗传修饰的HIV-1，其将这些突变结合到经深入研究和充分表征的原病 毒pNL4-3中。HIV-1NL4_3是实验室适应性(laboratory-adapted) B亚型病毒，它具有T细 胞嗜性和强的合胞体(syncitium)诱导能力(图1B)。而且，pNL4_3原病毒是HIV_1NL4_3 毒株的感染分子克隆，可获自NIHADDS研究与参比试剂计划(NIH ADDS Research and ReferenceReagent program)，适于遗传修饰的。使用该原病毒，我们首先构建了靶向缺失的nef基因以降低病毒致病性(图1A)。 通过限制性内切酶消化导致Nef起始密码子下游的206个核苷酸切除而产生缺失，但不切 除对病毒复制十分重要的HIV长末端重复序列(LTR)的上游。该缺失不仅切除了对Nef功 能重要的若干内部区域，而且还导致产生一系列使蛋白质严重截短的成熟前终止密码子。 最终结果是剩下仅18个氨基酸的编码区，我们认为这导致了非功能性蛋白质的产生，该蛋 白质被宿主细胞快速降解，因为我们无法用蛋白质印迹分析检测出它的存在。原病毒的第二个修饰是用蜜蜂蜂毒肽置换EnvNSS以降低细胞毒性并增加病毒复 制的效率。如上所述，HIV-I含有异常长的带有高正电荷的信号序列。pNL4-3EnvNSS的长 度为28个氨基酸，含有5个带正电荷的氨基酸(图1C)。应用PCR和分子克隆技术，将该信 号序列用高效蜜蜂蜂毒肽信号序列置换，蜂毒肽信号序列长度为21个氨基酸，仅含有1个 带正电荷的氨基酸。十分重要的是注意到EnvNSS所处的HIV-Ienv基因N端与病毒基因组 中的HIV-lvpu基因的C端重叠(图1A)。所幸的是，HIV-lvpu基因虽然在病毒感染中起作 用，但是对于病毒复制可有可无，读者可发现它并不限制病毒的增殖。一经构建，通过将原病毒DNA转染至支持HIV-I复制的易感T细胞系A3. 01和H9 中来回收野生型(NL4-3W)和遗传修饰的(NL4-3T)病毒两者。一经转染至易感细胞中，原病 毒DNA克隆立即开始表达其编码的HIV-I基因产物，导致子代病毒粒产生，可收获并用于后 续实验。在用感染性分子克隆转染后，对细胞进行培养，每2天分离出经收集的培养物上清 液的样品，在转染后第4天开始通过p24ELISA进行分析以监测病毒复制。该实验测定了受 感染细胞释放到培养物上清液中的P24抗原的量。这是一项被广为接受的间接测定HIV-I 复制水平的测定法。在A3. 01和H9细胞中，遗传修饰的NL4-3T病毒复制到与野生型HIV-I 相同或比野生型HIV-I高的滴度，并且进行复制的动力显著加快，NL4-3T在转染后96小时 达到病毒复制峰值，比野生型NL4-3W早48小时(图2)。为了进一步表征这些病毒，通过评价病毒感染性的半乳糖苷酶指示剂多核激活物 (multi-nuclear activator of a galactosidaseindicator, MAGI)测定法对样品进行了分析。在该系统中，在细胞表面表达CD4(病毒受体)的基于HeLa的细胞系用各种病毒稀 释液感染。复制性病毒一旦进入细胞，便可开始产生病毒蛋白，包括病毒反式激活蛋白Tat。 Tat随后激活已导入细胞基因组的由病毒LTR启动子驱动的B-半乳糖苷酶基因表达。在 受感染细胞内产生的B-半乳糖苷酶然后继续切割供应给细胞的底物5-溴-4-氯-3-吲 哚-β -D-半乳糖苷，导致显现出蓝色。因此，统计作为受到“感染”的蓝色细胞，并通过计 算与病毒稀释度成比例的蓝色细胞数，确定存在的感染性病毒粒的总数。这些实验结果表 明，尽管NL4-3T病毒具有快速复制到高滴度的能力，但是其感染性比野生型低10倍至50 倍(图2插图)。这些结果证实，通过遗传修饰产生能够以高滴度复制的减毒HIV-I毒株是 确实可行的。为了进一步支持这些结果并证实这种现象对于HIV-I生物学是普遍的，而不仅 仅限于我们所选的毒株(NL4-3)，在若干其它HIV-I毒株(包括89. 6、CM235-4和94UG 114.1.6)中产生类似的构建体(图IB和图C)。这些毒株不仅代表各种HIV-I亚型，而且 还代表合胞体诱导、分离株来源和细胞嗜性的变异。简而言之，所有回收的病毒的表现与 NL4-3的类似，含有nef缺失和EnvNSS置换的组合遗传修饰病毒，比它们的野生型对应病毒 更有效地进行复制，尽管感染性大幅降低。例如，HIV89.6为B亚型合胞体诱导的双嗜HIV-I 分离株。突变型89. 6T病毒当转染至易感A3. 01细胞时，比野生型病毒更有效得多地进行 复制，峰值超过lOOOng/ml p24 (与实验室适应性NL4-3毒株相当)，而野生型病毒尽管感染 性比修饰病毒高10倍，但峰值只达到600ng/ml p24以下。这些结果证实了我们的假设，即 HIV-Inef基因缺失和Env信号序列置换的组合导致感染性大为减弱的HIV-I有效地进行复 制。由多个HIV-I亚型构建这些类型的修饰病毒的能力非常重要，因为将多个HIV-I亚型 组合到单个疫苗制剂以提供针对目前全球存在的不断增加的HIV毒株的保护是必要的。实施例2 复制缺陷型重组腺病毒和VLP腺病毒载体具有若干使之成为有吸引力的疫苗载体的性质。它们在允许细胞系中 快速复制到高滴度，并且能够产生大量的目标蛋白质。它们能够既感染分裂细胞又感染非 分裂细胞，且具有附加型性质，因此不会整合至宿主基因组(这就使转化风险和潜在的致 癌作用降到最低)。它们能够使外源基因靶向许多位点，包括粘膜、胃肠道，以及靶向胃肠 外器官或组织，从而诱导粘膜免疫和全身性免疫。此外，军用和民用接种计划以前就确定了 Ad疫苗载体的安全性，该计划采用未减毒完全可复制形式的更具毒性的4型和7型腺病毒 的肠包衣胶囊剂。然而，重要的是注意到当前使用的腺病毒载体(包括用于本研究的腺病 毒载体)，已被工程改造成为仅复制一轮的复制缺陷型病毒。我们的系统利用基于5型腺病毒(Ad5)基因组的复制缺陷型重组腺病毒载体。也 就是说，由Ad5基因组组成的骨架载体含有的腺病毒ElA基因缺失，ElA基因是病毒复制所 需要的。正是在这个缺失基因区插入了我们的靶HIV-I基因(见下文及图3)。这些重组病 毒可以在提供反式ElA蛋白的允许细胞系(例如293细胞)中体外增殖到高滴度，而在生 产者细胞系以外不能复制超过单个循环(这是指在接种宿主体内，腺病毒载体能够进入细 胞并产生所需要的蛋白质，但不产生子代腺病毒粒)。这就为rAd系统提供了额外的安全和 控制措施。我们的实验室产生了总共5个复制缺陷型rAd载体用于本项研究。各载体由ElA 缺失的Ad5骨架组成，在该骨架中插入了 HIV-Igag基因或HIV-2gag基因以及一系列选自病毒不同区的HIV-I特异性中和表位或T细胞表位(图3)。 HIV-I的gag基因通常产生55kDa多聚蛋白，它随后被也在本区内编码的病毒蛋白酶切割成病毒壳体蛋白(P24)、基质蛋白(pl7)和p6/9结构蛋白。然而，我们的实验室发 现，编码该病毒蛋白酶的gag区缺失及其随后由rAd载体表达，能使在受rAd感染细胞中形 成病毒样颗粒(VLP)。因此，当用含有截短HIV gag基因的复制缺陷型rAd颗粒(rAd-Gag) 感染时，不仅产生Gag蛋白，而且能够自我装配成病毒粒样结构，该结构随后从受感染细胞 中分泌出来，但不发生腺病毒载体的任何病毒复制。此外，可将选定的HIV表位掺入并该缺 失区并与该缺失区融合(rAd-Gag-多表位(poly印itope))，当它在宿主细胞内表达时便产 生不但具有HIV Gag表位而且还具有所选中和表位或T细胞表位的VLP。感染-蛋白质产 生-VLP形成-释放这一循环，代表着这类免疫接种的免疫原性的重要方面。
通常当抗原在宿主细胞内部进行内在表达时(例如由rAd载体表达)，所述抗原被 细胞加工，并通过主要组织相容性I类(MHC I)系统呈递到免疫系统，MHC I系统参与诱导 1型应答或细胞介导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。研究表明这类应答对控制HIV感 染初期十分重要，因为它导致受感染细胞的清除。相反地，当宿主细胞接收到外源抗原(例 如VLP的形式)时，该抗原被细胞加工，并通过MHCII系统呈递给免疫系统，MHC II系统参 与诱导2型应答或抗体介导的体液应答。该类型的应答在产生中和抗体以防止细胞的HIV 感染开始以及抗体介导的靶向病毒粒予以清除中十分重要。因此，rAd系统不仅具有产生 细胞免疫的能力，还具有产生体液免疫的能力，预期这两种免疫在产生针对HIV-I感染的 保护性免疫应答中起着重要作用。可将所产生的用于这些实验的一组复制缺陷型rAd载体分成两类，一类含有 HIV-I中和表位，一类含有HIV-I CTL表位。rAd载体l、rAd载体2和rAd载体3含有与得 自多种HIV-I亚型的gpl20可变区3和恒定区3的中和表位(设计来提高体液应答)融合 的HIV-2gag基因。此外，rAd载体3含有gp41的保守中和表位(CNE)，即病毒融合蛋白。 rAd载体4和rAd载体5含有与B亚型HIVhxb2病毒的T细胞表位(设计来提供细胞免疫应 答)融合的HIV-Igag基因，B亚型HIVhxb2病毒选自若干病毒蛋白，包括Tat、Rev、Nef、病毒 反转录酶(RT)和gpl20糖蛋白。被最初构建成dsDNA质粒的这些复制缺陷型rAd载体转 染到辅助293细胞，该细胞提供腺病毒复制所需要的ElA基因以回收感染性rAd颗粒。然 后通过DNA测序和蛋白质表达分析对回收的病毒进行筛选以证实HIV-IGag多表位融合蛋 白的表达。通过将这些选定的免疫显性表位掺入不仅包括大范围的HIV-I亚型，而且还包 括病毒蛋白靶标的rAd载体中，我们能使疫苗诱导不仅针对一种HIV毒株而且针对许多种 HIV毒株的免疫应答的能力最佳化。这再一次是出于对疫苗的慎重考虑，该疫苗必需针对甚 至在单个感染个体内可以若干种存在的病毒提供保护。实施例3 接种策略本文所采用的总体接种策略是两重初免_加强方法。在一个初免_加强系统中， 首先将宿主暴露于第一种类型的抗原/载体中，然后暴露在另一类型中(例如在我们的系 统中，为灭活的完整杀死病毒和复制缺陷型rAd)。这类方法不仅用不同的病毒表位攻击免 疫系统，而且还利用不同的途径和呈递途径去攻击。研究显示这导致了更强的免疫，增强了 免疫系统中体液和细胞两种武器的应答。同样，根据给药途径，还可使粘膜免疫显示出来。 研究表明，比起通过单独用其组分抗原/载体的任一种重复接种，与有效的佐剂结合后，初免-加强接种方法能够刺激强得多且范围广得多的免疫应答。
实施例4 疫苗配制在本文所述实验中，我们的初免-加强策略的两个组分包括1)灭活的完整杀死病 毒抗原，和2)复制缺陷型rAd载体。为了制备我们的灭活的完整杀死病毒抗原，使用我们的遗传修饰HIV-1NL4-3T病 毒感染A3. 01细胞(人T细胞系)。使病毒生长至高滴度，使培养物增殖，且每2天更换培 养基。感染后第8天起，收获含有病毒的上清液，将新鲜培养基和未感染的A3. 01细胞加到 受感染的细胞培养物中以继续并维持病毒产生。每48小时进行一次直到感染后16天，此时 合并所有培养物上清液。通过以700xg离心10分钟一次，然后再通过0. 45 μ m过滤器，使 含有病毒的上清液去除细胞碎片澄清。然后将该澄清的上清液进行超速离心以沉淀并浓缩 病毒。除去现已不含病毒的上清液，将沉淀重新悬浮于少量体积的PBS中，向其中加入化学 试剂aldrithiol-2 (AT-2)，终浓度为1000 μ Μ。ΑΤ_2处理显示是一种反转录病毒灭活的稳 健方法。它通过修饰病毒核衣壳蛋白的锌指区引起配位锌排出和丧失感染性而起作用(病 毒能够结合并进入细胞，但无法开始反转录过程)。与其它灭活方法(例如热暴露或福尔 马林处理)不同，ΑΤ-2灭活具有附加的益处，即对病毒糖蛋白的结构和构象没有负面影响， 其结构和构象保护得十分完整。出于此原因，以及在确定ΑΤ-2为反转录病毒灭活所选方法 中所做的不断努力和评价，为此在我们的实验中选择了该化合物。将ΑΤ-2处理过的病毒母 液在37°C下孵育1小时使病毒彻底灭活。然后将病毒铺在20%蔗糖垫上，再次进行超速离 心以进一步浓缩病毒，将其与残余蛋白质和化学污染物(例如AT-2)分离开来。将病毒按 lmg/ml的终浓度重新悬浮于500 μ 1等分液中，并保存在_80°C温度下，直到准备用于接种 方案(因此各等分液在500 μ IPBS中含有500 μ g总病毒蛋白)。重要的是注意，取出若干 等分量的灭活病毒母液，通过MAGI测定法进行测定以确定是否仍有任何残留的感染性。在 各受测样品中，病毒感染性被完全消除，没有感染性病毒污染的迹象。为了制备我们的复制缺陷型rAd病毒母液，使用5种载体的每一种来感染293允 许细胞培养物并使之生长至高滴度。收获感染细胞，裂解，通过超速离心用CsCl梯度聚集 成带使病毒粒纯化。分离出病毒条带，通过对PBS2+与10%甘油进行充分透析以除去残余 CsCl0然后对该母液病毒进行滴定，以IX IOltl个感染性颗粒/ml的终浓度重新悬浮。从中 分出500 μ 1等分液，各含有100 μ 1 5种病毒母液的每一种(因此各等分液含有1 X IO9个5 种rAd每一种的感染性颗粒，在500 μ 1含10%甘油的PBS2+中共有5 X IO9个感染性颗粒)。 然后将这些等分液保存在-80°C下，直到准备用于接种方案。为了确保复制缺陷型rAd颗粒 在_80°C下冷冻后保持感染性，通过对表达ElA的293细胞的噬斑测定，测定了得自各病毒 母液和等分混合病毒悬液的样品的感染性。在任何冷冻rAd母液中未观察到感染性丧失。实施例5 佐剂选择疫苗配制的一个重要部分是选择适当的佐剂。佐剂虽然不是诱导免疫应答本身所 必需的，但却起着提高针对共给予抗原的免疫应答的作用。佐剂可具有许多作用，例如提高 抗体滴度，增加CTL应答或增强粘膜免疫。实际上，根据所选择的佐剂，对特定抗原产生的 免疫应答可被转向不同的方向。例如，现经许可用于人的主要佐剂为明矾，它推动免疫系统 朝向2型抗体介导的应答。然而，对于我们的目的，明矾提供相对弱的佐剂作用，且仅抗体 应答未必对反转录病毒感染有保护性。一种比起传统疫苗佐剂相对较新的替代佐剂是开发出的所谓CpG基序或免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODN)。CpG基序是小段的免疫刺激性细菌 DNA的规定序列。这些通过刺激宿主的先天性免疫系统以增加对靶抗原的免疫应答而起作 用。与明矾不同，CpGDNA不仅在刺激产生抗体介导的应答上能够诱导强得多的免疫反应，而 且还能够刺激强CTL应答(一般认为这在控制HIV感染方面特别重要)。已经测定了 CpG 基序的各种序列组，并且使其在非人类灵长类宿主中的功效最优化，同时它们还是市售的。 对于其在非人类灵长类(包括猕猴)中诱导体液免疫应答和细胞免疫应答两者的能力，选 择了序列5' -TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-S‘的CpG ODN用作这些实验的佐剂。注意，本 文所用的ODN是在硫代磷酸酯主链上合成，以防止被宿主核酸酶消化，因此延长了它们的 体内半寿期。实施例6 接种时间表和实验概要 该疫苗研究的试验对象是18只雄性猕猴(Macacamulatto)，被关养在地处戴维斯 的加利福尼亚大学加州地方灵长类研究中心(California Regional Primate Research Center at the University ofCalifornia at Davis)。在初免-加强方法接种策略中使用了两种类型的抗原，两种都在给予宿主动物之 前与CpG ODN佐剂相混合AT-2灭活的完整杀死病毒抗原经制备、纯化并进行了 AT-2灭活的遗传修饰 HIV-I NL4-3 T病毒。规定动物将接受悬浮于500 μ 1 PBS中的500 μ g抗原(与500 μ 1佐 剂一起配制)以进行免疫。复制缺陷型重组腺病毒抗原(rAd抗原)制备5种表达HIV-Igag基因和多个选 定中和表位和T细胞表位的rAd载体的高滴度母液并进行纯化。规定动物将接受总体积为 500 μ 1的1 X IO9感染单位的各重组病毒(1 X IO9感染单位χ5种重组病毒=5 X IO9感染单 位)(与500 μ 1佐剂一起配制)以进行免疫。CpG 寡脱氧核苷酸(ODN)佐剂序列 5' -TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 ‘的纯的 硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸获自Coley pharmaceuticals.将500 μ g该ODN悬浮于总体积为 500 μ 1的PBS中用于上述各抗原的配制。如图4所示，相继将动物分成3组(指定为第1组、第2组和对照)，各组有共6只 猕猴。用于各动物组的免疫时间表见下，其中包括接种时间、抗原/佐剂的类型和用量。所 有免疫剂经肌内给予。第1组第0周-500 μ 1灭活的完整杀死病毒抗原与500 μ 1 CpG佐 剂第3周-500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐剂第8周-500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐 剂第16周-500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐剂第2组第0周-500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐剂第3周-500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐剂第8周-500 μ 1 rAd抗原与500 μ 1 CpG佐剂第16周-500 μ 1灭活的完整杀死病毒抗原与500 μ 1 CpG佐剂对照对照动物，不接 受对HIV抗原或攻击病毒的预先抗原暴露。在接种后，根据攻击日期将动物进一步细分(图4)。12只动物的初始组(来自第 1组、第2组和对照各4只——指定为W0V01)在初次免疫后第33周，用杂合猴-人免疫缺 陷病毒(SHIV)经静脉内攻击。SHIV攻击由以各病毒为100的组织培养感染剂量50 (TCED5tl) 给予的SHIV89.6和SHIVsf162p4的组合感染组成。其余的6只动物(来自第1组、第2组和对 照各2只——指定为W0V02)在初次免疫后第39周，用相同的组合SHIV接种物攻击。这种组间的分离对使动物33226适应是必需的。在第33周的攻击之前的医学检查中，动物33226出现猕猴关节炎(rhesusarthritis)的某些临床症状，包括CBC计数升高。 虽然与接种方案无关，但是该病症可能影响免疫结果和攻击效果。在主治兽医会诊后决定， 推迟对该动物的攻击6周以监测其病况。出于统计理由，各组的2只动物(包括来自第2 组的33226)受延迟，在第39周才进行攻击，而其余动物则按时间表在第33周进行攻击。免疫前和免疫后采集各动物中血样，之后每月一次直到要进行攻击，以评价对接 种方案的免疫应答。此外，为了评价对病毒攻击的免疫应答以及监测病毒量和潜在的疾病 进程，在攻击后第1周、第2周和第5周及之后每月一次采集样品。攻击后约6个月，对动 物进行安乐死，进行尸检，再次收集样品，包括血液、脾和腋窝淋巴结。实施例7 动物健康状况和疫苗耐警件在研究过程中，定期监测所有动物以评价它们的健康状况。这包括常规身体检查 以及定期测量体重。所有动物对接种和攻击的耐受良好，无可测量的不良副作用。如图 5 (A-D)所示，在第0周、第3周、第8周和第16周的整个接种期以及直到攻击时，第1组和 第2组的所有动物均显示体重稳定增加。紧接攻击后，两个接种组的一些动物出现体重轻 微下降(< 0. 5kg)，但是它们很快恢复，并继续保持健康状况，体重稳定增加直到尸体剖 检。同样，在紧接攻击后，W0V01 (图5E)和W0V02(图5F)亚组的一些对照动物显示体重略 有波动，但是恢复正常并保持体重稳定直到尸体剖检。在预定的第33周攻击前，确定1只动物(33226)出现通常称为猴关节炎的疾病症 状。这在猕猴中并非罕见，不应认为是因接种方案而发生或诱发。由于这种情况，对动物进 行监测直到第39周，因此经由主治兽医会诊后，认为适于继续进行研究，同5只W0V02亚组 的其余动物一起接受攻击。攻击后约6个月，使所有动物安乐死，并进行了尸体剖检。动物未显示出明显的病 变或淋巴结增大。没有体重减轻或全血细胞计数(CBC)异常的迹象。总之，结果表明设计用于第1组和第2组的方案是安全的，因为所有接种都有良好 的耐受性，没有观察到不良副作用。在实验过程中，动物保持健康，无明显问题或体重减轻 的迹象。实施例8 疾病进程的临床症状虽然所用的两种攻击病毒(SHIV8af^P SHIVsf162p4)是非致病性毒株，但是测量了血 液中⑶4+细胞和⑶8+细胞的水平，并监测⑶4 ⑶8之比以确定任何动物是否表现出疾 病进程的临床症状。健康动物正常地保持⑶4 ⑶8之比> 1，然而由于SIV或SHIV感染 而发展成猴AIDS的动物⑶4+细胞可显著下降，因此⑶4 ⑶8之比降低。在第1组(图6A-B)和第2组(图6C-D)接种动物中，⑶4 ⑶8水平如预期一样 保持相对稳定，攻击后CD4+细胞未显著下降。同样，攻击后未接种的对照动物(图6E)保 持相对健康，并维持稳定的⑶4 ⑶8之比。实施例9 淋巴细胞增殖情况为了确定在接种后T细胞是否致敏以进行针对HIV-I特异性克隆扩充，进行了淋 巴细胞增殖测定。在攻击前(图7A)和攻击后(图7B)的不同时间点，收集第1组和第2 组动物的样品，并收集攻击后对照的样品。细胞受AT-2灭活HIV-Imn病毒刺激6天，通过掺 入放射性标记的胸苷来测定CD4+淋巴细胞的增殖情况。将刺激指数(即刺激细胞的增殖 比未刺激细胞的增殖)2设为截断值。如图6A所示，第1组和第2组动物在接种期显示对HIV-I抗原的显著应答。接受初次灭活病毒接种后接着3次重组腺病毒加强免疫的第1组 动物，在7/10时间点(70%)内显示快速和持续不变的增殖应答。同样，接受初次重组腺病 毒接种接着2次连续重组腺病毒和最后1次灭活病毒加强免疫的第2组动物，在4/10时间 点(40% )内也显示强增殖应答，显然与第3周、第8周和第16周的接种时间点相符。攻击后(图7B)，第1组和第2组动物都显示对HIV-I抗原及时和长期的增殖应 答。两组在7/8(88%)时间点内具有阳性刺激指数，其中第1组接种动物显示略为较强的 应答。在攻击前显示无HIV-I特异性增殖迹象的对照动物，在暴露于SHIV攻击病毒后1周 开始对HIV-I抗原显示某种轻微的应答。这种应答极可能是由攻击病毒本身存在的病毒表 位所致。注意到攻击后第17周，对照动物中所观察到的HIV-I特异性T细胞刺激的高水平 与动物TB测试相关，不应作为指示性的，因为所有对照动物都在这个时间点上显示出CBC 升高。结果表明所采用的接种方法能够诱导HIV-I特异性T细胞增殖应答。所测试的两 个方案中，相对于第2组动物，第1组动物似乎显示出较强和较长期的免疫应答，表明灭活 病毒致敏后接着进行重组腺病毒加强免疫，可能是诱导强免疫应答更有效的方法。实施例10 细胞毒件T淋巴细胞(CTL)应答被认为是控制HIV-I感染所必需的免疫应答的一个方面是产生⑶8+细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)作为细胞介导的免疫应答的组成部分。为了评价接种动物内的CTL应答， 进行了干扰素-Y (IFN-γ) ELISP0T测定。使用代表HIV-IGag蛋白的保守表位的一组20 种(15聚体)肽来刺激通过PBMC产生的EFN- γ，PBMC分离自攻击前和攻击后的第1组和 第2组动物。得自HIV-I血清阳性供者的PBMC用作这些实验的阳性对照。图8中概述了 BFN- y ELISPOT测定的结果。虽然两组动物对所选的HIV-IGag肽 库都显示一定程度上应答，但是大多数都落在50个IFN- γ分泌细胞/IO5个PBMC的分界 值之下。只有第1组动物显示持续不变的免疫应答，特别是在病毒攻击后(3/4动物在第38 周即攻击后第5周显示阳性ELISP0T应答)。这与淋巴增殖测定的结果一致(图7)，该测 定显示相对于第2组动物，第1组动物对HIV-I特异性抗原有较强的应答。第1组和第2组所表现的这一相对较弱的应答可能部分由表位选择所致。所选择 的这组20种HIV-IGag肽可能不足以刺激所分离的PBMC分泌出IFN- γ，或者对动物免疫应 答所靶定的区域不具特异性。如图8所示，比起未接种对照，第1组和第2组的接种动物在 攻击后更有效地清除病毒，间接表明了活性CTL应答的存在。实施例11 血浆病毒量测定用于这些实验的SHIV攻击是2个非致病毒株SHIV89.dP SHIVsf162p4W组合。由于 不致病性质，因此测定临床疾病进程可能不足以监测接种的任何保护作用。代以通过分支 DNA(bDNA)测定法来测定病毒RNA水平，这可确定每ml血浆存在的病毒拷贝数。这就给出 了血液中存在的病毒量的准确值，低至Log 2. 1拷贝/ml的检出限。第1组和第2组动物具有相似的病程(图9A-B)，病毒量峰值出现在攻击后的第2 周，为约IO5-IO6拷贝/ml。然后，到第5周时，血浆VRNA水平急剧降至< IO3拷贝/ml，到 第9周低于检出限。对照、未接种动物同样在第2周显示出最高病毒量，水平略有升高，为 IO6-IO7拷贝/ml (图9C)。此外，比起接种动物，对照病毒量下降较慢，在攻击后第5周仍具 有IO3-IO5拷贝/ml的水平，大多数动物中直到第9周最终衰减。
总之，联合数据和所有3个组的比较(图9D)显示，比起未接种对照，第1组和第 2组的接种动物明显更快地清除病毒，如攻击后第5周血浆vRNA水平降低所证实的一样。实施例12 抗体应答控制HIV-I感染必需的免疫应答的其它重要方面是产生强体液应答即抗体介导 的应答。为了评价在接种后和在响应病毒攻击时HIV-I特异性抗体的产生和发展，通过酶 联免疫吸附测定法(ELISA)对血清样品进行了分析。使用纯的HIV-Iiiib病毒裂解物作为捕 捉抗原来测定HIV-I特异性抗体。第1组的动物(图10A)在最初的灭活病毒初免和重组腺病毒加强免疫后，快速产 生强HIV-I特异性抗体应答(IO4-IO5)。通过随后在第8周和第16周的重组腺病毒加强免 疫，该应答进一步增强(> IO5)。在第33周SHIV攻击后，抗体应答进一步增强至约106。 第2组动物(图10B)的抗体产生较迟缓，到第12周时达103-104。然而，在第16周，灭活 病毒的加强免疫诱导抗体滴度显著和长期提高达数月。同样，在第33周SHIV攻击后，抗体 水平升高至约106，表明存在记忆应答。相反地，对照动物在响应SHIV攻击时未显示HIV-I 特异性抗体产生(图10C)。这些结果表明，接种能够诱导强且长久的抗体介导的体液免疫应答。具体地讲，给 予第1组动物的方案(灭活病毒初免后接重组腺病毒加强免疫)诱导快速和强应答，该应 答持续数月并持续到攻击后。这种类型的强抗体应答是确立保护性免疫的重要因素，并可 使接种动物产生控制和清除前述攻击后的病毒感染的能力(参见正文和图9D)。实施例13 结论我们的结果强有力地证实，AT-2灭活的完整HIV-I初免后接两次或三次用携带与 B细胞表位或T细胞表位融合的HIV gag基因的重组腺病毒加强免疫，同时诱导出体液免疫 应答和细胞免疫应答。这种类型的接种可用于防止HIV-I感染以及治疗仍具有免疫能力的 HIV-I感染个体。强烈推荐使用初免-加强接种的人类临床实验。
参考文献本文提及的所有出版物和专利，包括下面列出的参考文献，都通过引用全部结合 到本文中，如同每个单独的出版物和专利通过引用具有和个别地结合到本文中一样。万一 有抵触，则以本申请书(包括本文的任何定义)为准。
等同内容本领域技术人员应当了解，或者仅仅使用常规实验法便能够确定本文所述本发明 具体实施方案的许多等同内容。虽然已经论述了本发明的具体实施方案，但是以上说明书 是示例性而不是限制性的。根据本说明书的综述，本发明的许多变动对于本领域技术人员 而言是显而易见的。本发明的全部范围应当通过参照所附权利要求书及其等同内容的全部 范围、本说明书连同这类变动来确定。这类等同内容也包括在所附权利要求书中。
权利要求
1.一种预防或治疗慢病毒感染的方法，该方法包括给予有需要的患者(a)有效量的疫 苗，所述疫苗包含具有糖蛋白120信号序列的重组慢病毒，其中所述糖蛋白120信号序列选 自SEQ ID NO 3-6所列的多肽序列或其功能片段或变异体，其中所述其功能片段或变异体 含有不超过1个(1)的带正电荷的氨基酸，和(b)有效量的重组复制缺陷型腺病毒载体，所 述载体包含慢病毒蛋白编码核酸。
2.权利要求1的方法，其中将(a)给予患者后将(b)给予所述患者。
3.权利要求2的方法，其中在治疗或预防疗程中不止一次将(b)给予所述患者。
4.权利要求1的方法，其中将(a)给予有需要的患者，且在给予(a)后大致第3周、第 8周、第16周将(b)给予所述有需要的患者。
5.权利要求1的方法，其中所述慢病毒感染是HIV感染。
6.权利要求5的方法，其中(a)是重组人免疫缺陷病毒-I(HIV-I)，其中病毒的HIV-I 被膜糖蛋白gpl20的天然信号序列(NSS)被选自蜂毒肽信号序列(MSS)和白介素3信号序 列(ILSS)的信号序列置换。
7.权利要求6的方法，其中所述(a)的有效量介于约0.10mg/kg至约0. 2;3mg/kg之间。
8.权利要求5的方法，其中(b)是复制缺陷型重组腺病毒载体，所述载体包含具有缺失 的ElA基因区的Ad5基因组，其中HIV基因被插入到所述ElA区内。
9.权利要求8的方法，其中所述HIV基因是HIV-Igag或HIV-2gag。
10.权利要求8的方法，其中HIV基因和至少一个中和表位或T细胞表位被插入到所述 ElA区内。
11.权利要求10的方法，其中所述HIV基因是HIV-Igag或HIV-2 gag。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一个中和表位或T细胞表位选自SEQID NO 14-34中的任一个。
13.权利要求8的方法，其中所述(b)的有效量介于约8.46 X 108mg/kg-约 2. ZlXlO^ig/kg 之间。
14.一种药盒，该药盒装有(a) —定剂量的有效量的疫苗，所述疫苗包含具有糖蛋白 120信号序列的重组慢病毒，其中所述糖蛋白120信号序列选自SEQ ID NO 3_6中所列的多 肽序列或其功能片段或变异体，其中所述其功能片段或变异体含有不超过1个(1)的带正 电荷的氨基酸；和(b)至少一定剂量的有效量的重组复制缺陷型腺病毒载体，所述载体包 含慢病毒蛋白编码核酸。
15.权利要求14的药盒，其中(a)和(b)在药学上可接受的载体中配制。
16.权利要求14的药盒，所述药盒还装有使用说明书。
全文摘要
本发明提供针对HIV/AIDS的新的联合初免-加强疫苗，该疫苗诱导针对HIV的持久的体液免疫应答、细胞介导的免疫应答和粘膜免疫应答。
文档编号A61P31/14GK102131522SQ200880007796
公开日2011年7月20日 申请日期2008年1月11日 优先权日2007年1月12日
发明者C·-Y·康, C·米查尔斯基 申请人:西安大略省大学