修饰的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶的制作方法

专利名称：修饰的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及医药领域，更具体地说，涉及用于治疗冠心病、动脉粥样硬化、炎 性病症和血栓形成相关病症的组合物和方法。
背景技术：
有超过5000万的美国人存在心血管问题，并且许多其他国家也面临着高且不断 增加的心血管病发病率。其是美国和大多数欧洲国家的第一位死亡和残疾原因。到心脏问 题被检测出来时，根本的原因——动脉粥样硬化通常是相当晚期了，已经发展了几十年。动脉粥样硬化是一种哺乳动物多基因复杂疾病，具有在动脉壁(主动脉、冠状动 脉和颈动脉)中脂类和其他血液衍生物的沉积物或斑块的特征。根据过程进展，这些斑块 可在更大或更小程度上钙化。它们还与主要由动脉中的胆固醇酯组成的脂肪沉积物的累积 相关。胆固醇累积在动脉壁泡沫细胞中，从而使管腔变窄并减少血流量。伴随而来的是动脉 壁的增厚，带有平滑肌肥大，泡沫细胞出现以及纤维组织累积。因此，高胆固醇血症可引起 非常严重的心血管病理例如梗塞、外周血管病、中风、猝死、心脏失代偿、大脑血管意外等。胆固醇为血液中不同的脂蛋白所携带，这些脂蛋白包括极低密度脂蛋白(VLDL)、 低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。VLDL在肝脏中合成并在血液中被转化为 LDL，使之有可能供给外周组织以胆固醇。与此相反，HDL从外周组织中捕获胆固醇分子并 将它们转运到肝脏，在肝脏中胆固醇分子被转化为胆汁酸并分泌。动脉粥样硬化发展和冠 心病(CHD)风险与血清中 HDL 水平逆相关。Gordon 等(1989)N. Engl. J. Med. 321 1311 ； Goldbourt等(1997)Thromb Vase. Biol. 17 :107。低HDL胆固醇通常出现在向心性肥胖、糖 尿病和其他代谢综合征特征的背景下。Goldbourt等，出处同上。已提出低HDL胆固醇水平 与增加的CHD风险相关，而高浓度的HDL则对早发动脉粥样硬化发展具有保护效应。Gordon 等(1986)Circulation 74:1217。有研究表明在男性中随着血浆中HDL浓度每增加lmg/dL 发展为临床动脉粥样硬化的风险就下降2-3%。Gordon等(1989)N. Engl. J. Med. 321 :1311。 已确认可通过用他汀类药物，即胆固醇生物合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的 抑制剂治疗可以降低LDL胆固醇的浓度，因此在主要指征为高LDL水平的情况下，该治疗已 被用作一种成功的方法用于降低动脉粥样硬化风险。然而，尚不清楚他汀类药物对主要脂 类异常是低HDL胆固醇的患者是否有益。卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)是一种通过将酰基从磷脂酰胆碱转移到胆固 醇的3-羟基上，形成胆固醇酯和溶血磷脂酰胆碱，从而催化游离胆固醇酯化的酶。McLean 等(1986)Proc. Natl. Acad Sci. 83 :2335 和 McLean 等(1986)Nucleic Acids Res. 14(23) 9397。LCAT在肝脏中合成并分泌入血浆中，在血浆中其与HDL相结合，称为抗动脉粥样硬化 脂蛋白。这些HDL颗粒具有容纳过量胆固醇的能力，所述胆固醇随后为HDL颗粒中LCAT所 酯化。HDL颗粒中的胆固醇酯分子或直接通过SR-BI受体被转运到肝脏中，或者通过CETP 介导被转移到包括极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL的含apoB脂蛋白，然后通过LDL-受体途 径转运到肝脏中。此称为反向胆固醇转运的机制(GlomSet(1968) J. LipidRes. 9 155)容许 从体内去除过量的胆固醇，因而涉及阻止动脉粥样硬化形成。LCAT通过在质膜和循环的脂蛋白之间产生游离胆固醇梯度在该过程中起关键作用。本发明提供了具有增加的酶活性和/或稳定性的修饰的LCAT蛋白以及使用这些 修饰的LCAT蛋白治疗冠心病、动脉粥样硬化、炎性病症和血栓形成相关病症的方法。发明概述在此提供的是在野生型LCAT蛋白氨基酸序列中包含氨基酸取代的修饰的LCAT蛋 白。在一个方面中，修饰的LCAT蛋白较该修饰的LCAT蛋白所来源于的野生型LCAT蛋白 酶活性更强。在另一个方面中，修饰的LCAT蛋白较该修饰的LCAT蛋白所来源于的野生型 LCAT蛋白增加高密度脂蛋白(HDL)水平至更大的程度。在另一个方面中，修饰的LCAT蛋白 在体内更稳定，或较其所来源于的野生型蛋白免疫原性更低。在一个实施方案中，修饰的LCAT蛋白包含在SEQ ID NO 1中第31位处或在直向 同源野生型LCAT蛋白氨基酸序列中相应于SEQ IDN0 :1中第31位的位置处的氨基酸残基 取代。在多个方面中，修饰的LCAT蛋白来源于野生型人、兔、猴、仓鼠、小鼠或大鼠LCAT蛋白。在另一个实施方案中，修饰的LCAT蛋白来源于SEQ ID NO 1所示的野生型LCAT 氨基酸序列，并包括在位置Fl、L3、L4、N5、L7、C31、N384或E416处的取代。在多个方面中， 该取代是 F1A、F1G、F1I、F1L、F1M、F1P、F1V、F1C、F1Y、F1T、F1Q、F1N、F1H 或 F1D。在其他方 面中，该取代是L3I、L3F、L3C、L3W或L3Y。还在其他方面中，该取代是L4A、L4I、L4M、L4F、 L4V、L4W、L4Y、L4T、L4Q 或 L4R。还在其他方面中，该取代是 N5A、N5M、N5H、N5K、N5D 或 N5E。 仍在其他方面中，该取代是L7M、L7F或L7E。在其他方面中，该取代是C31A、C31I、C31M、 C31F、C31V、C31W、C31Y、C31T、C31R 或 C31H。还在其他方面中，该取代是 N384C、N384Q 或 E416C。在其他的实施方案中，修饰的LCAT蛋白包含在SEQ ID NO :1中第C31位的取代以 及在氨基酸残基第Fl、L4、N5、V28、P29、G30、L32、G33或N34位的取代。在多个方面中，该 取代是 F1A、L4F、N5E、N5Q、N5D、N5A、V28A、V28I、V28C、V28T、V28R、P29G、P29F、P29T、G30A、 G301、L32A、L32I、L32M、L32F、L32C、L32W、L32Y、L32T、L32S、L32N、L32H、L32E、G33I、G33M、 G33F、G33S、G33H、N34A、N34C、N34S 或 N34R。在其他方面中，在第 C31 位的取代是 C31A、 C31I、C31M、C31F、C31V、C31W、C31Y、C31T、C31R 或 C31H。在一个方面中，修饰的 LCAT 蛋白 包含C31Y取代和额外的取代Fl、L4、L32或N34，以及在某些方面中，这些取代是F1S、F1W、 L4M、L4K、N34S、L32F 或 L32H。还在其他的实施方案中，在此描述的修饰的LCAT蛋白进一步包括运载体，以及在 多个方面中，运载体是免疫球蛋白恒定(Fc)区或水溶性聚合物，或更具体地说，水溶性聚
合物是聚乙二醇。在其他的实施方案中，在此所提供的修饰的LCAT包括是重复的且共价连接至修 饰的LCAT蛋白的末端的野生型LCAT蛋白氨基端氨基酸序列的一个区域。在一个方面中， 野生型LCAT蛋白氨基端氨基酸序列的该区域长度为10-15个氨基酸。在其他方面中，该野 生型LCAT蛋白氨基酸序列的该区域是重复的且共价连接至修饰的LCAT蛋白的氨基端、修 饰的LCAT蛋白的羧基端或两者。还提供了包含在此提供的修饰的LCAT蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。还提供了治疗LCAT相关病症的方法，包括以有效治疗所述病症的量施用在此提供的修饰的LCAT蛋白的步骤。在不同的实施方案中，修饰的LCAT是静脉内施用或通过快 速浓注施用。在治疗方法的多个方面中，LCAT相关病症是动脉粥样硬化、炎症、血栓形成、 冠心病、高血压、LCAT缺陷综合征、阿尔茨海默病、角膜浑浊、代谢综合征、血脂异常、心肌梗 塞、中风、临界性肢体缺血(critical limb ischemia)和/或心绞痛。还提供了用于增加受试者中HDL胆固醇的方法，包括向受试者施用治疗有效量的 在此提供的修饰的LCAT蛋白的步骤。本发明进一步提供了用于预防受试者中胆固醇累积的方法，包括施用治疗有效量 的在此提供的修饰的LCAT蛋白。附图描述

图1提供了能用于产生修饰的LCAT蛋白的野生型LCAT蛋白的Genbank登记号。发明详述I.定义当在本文中使用时，术语“LCAT”或“卵磷脂_胆固醇酰基转移酶”指一种催化由 磷脂酰胆碱和存在于脂蛋白中未酯化的胆固醇合成胆固醇酯和溶血卵磷脂的野生型糖蛋 白酶。该酶主要由肝脏产生并在血液中循环，与脂蛋白可逆结合。人LCAT(SEQ ID NO 1 ； GenBank登记号AAB34898)具有49kDa的多肽质量，或带有附加的碳水化合物质量后大约 67kDa的多肽质量。用于获得在本发明中有用的修饰的LCAT蛋白的多种LCAT氨基酸序列 示于图1中。人LCAT (SEQ ID NO 1 ；GenBank 登记号 AAB34898)FWLLNVLFPP HTTPKAELSN HTRPVILVPG CLGNQLEAKL DKPDVVNWMCYRKTEDFFTI WLDLNMFLCL GVDCWIDNTR VVYNRSSGLV SNAPGVQIRVPGFGKTYSVE YLDSSKLAGY LHTLVQNLVN NGYVRDETVR AAPYDWRLEPGQQEEYYRKL AGLVEEMHAA YGKPVFLIGH SLGCLHLLYF LLRQPQAWKDRFIDGFISLG APWGGSIKPM LVLASGDNQG IPIMSSIKLK EEQRITTTSPWMFPSRMAWP EDHVFISTPS FNYTGRDFQR FFADLHFEEG WYMWLQSRDLLAGLPAPGVE VYCLYGVGLP TPRTYIYDHG FPYTDPVGVL YED⑶DTVATRSTELCGLWQ GRQPQPVHLL PLHGIQHL匪 VFSNLTLEHI NAILLGAYRQGPPASPTASP EPPPPE术语“修饰的LCAT”指如上定义的卵磷脂_胆固醇酰基转移酶，其中野生型LCAT 蛋白中的一个或更多个氨基酸被另外的氨基酸取代，或者一个或更多个氨基酸被添加到该 修饰的LCAT蛋白所来源于的野生型LCAT的任一末端或中间。考虑的修饰的LCAT蛋白与 该修饰的LCAT蛋白所来源于的野生型LCAT蛋白相比具有改善的药代动力学特性。更具体 地说，修饰的LCAT蛋白具有(i)如在相同的体外测定条件中所测定的，与该修饰的LCAT蛋 白所来源于的野生型LCAT蛋白相比增加的酶活性，(ii)与该修饰的LCAT蛋白所来源于的 野生型LCAT蛋白相比增加的在体内增加HDL水平的能力，(iii)与该修饰的LCAT蛋白所 来源于的野生型LCAT蛋白的血浆稳定性相比，增加的血浆稳定性或半衰期，即增加的循环 半衰期，和/或(iv)与该修饰的LCAT蛋白所来源于的野生型LCAT蛋白相比减少的免疫原 性(即引起更少的免疫应答)。用于测定LCAT酶活性的测定法包括例如使用apoAI-脂质 体测定法以及使用血浆LCAT活性测定法，它们分别在人工系统和生理学相关系统中测定胆固醇酯化速度。用于测定体内LCAT稳定性的测定法包括ELISA，其测定LCAT蛋白施用后 血液中重组LCAT蛋白的半衰期。考虑修饰的LCAT蛋白的生物活性片段达到这样的程度， 即该片段包括在野生型LCAT氨基酸序列中导入的氨基酸改变。术语“衍生化”、“衍生物”或“衍生的”包括过程以及所得到的修饰的LCAT蛋白， 其中例如以及不受限制，(1)化合物具有环部分；例如在化合物中的半胱氨酰残基之间的 交联；(2)化合物是交联的或具有交联位点；例如，化合物具有半胱氨酰残基并因此在培养 物中或在体内形成交联的二聚体；(3) 一个或多个肽基键为非肽基键所取代；(4)N-末端 为如下所取代-殿队、NRC(0)礼、-NRC(0) 0礼、-NRS (0)2礼、-NHC(0)NHR、琥珀酰亚胺基、或取 代的或未取代的苄氧基羰基-NH-，其中R和礼以及环取代基如下文中所定义；(5) C-末端 为-C(0)R2或-NR3R4所取代，其中R2、R3和R4如下文中所定义；和(6)其中单个氨基酸部分 通过用能与所选择的侧链或末端残基反应的试剂处理而被修饰的化合物。除了衍生化包括 在修饰的LCAT蛋白氨基酸序列的羧基端、修饰的LCAT蛋白氨基酸序列的氨基端、或修饰的 LCAT蛋白氨基酸序列的羧基端和氨基端添加一个或更多个氨基酸残基，对修饰的LCAT蛋 白进行衍生化不会进一步改变修饰的LCAT蛋白氨基酸序列。此外，可通过对氨基酸残基进 行侧链修饰而对修饰的LCAT蛋白进行衍生化，前提是野生型人LCAT序列中第31位处半胱 氨酸以及如通过包括必需空位的氨基酸序列比对所鉴定的人同系物和直向同源蛋白中相 应的半胱氨酸残基处的侧链修饰被排除出本发明的范围。此外，应当理解在本文中无论何 时提及“修饰的LCAT蛋白”，对于所描述的本发明的方面还考虑到修饰的LCAT蛋白衍生物。术语“药理学活性的”意指如此描述的物质被确定为具有影响医学参数(例如血 压、血细胞计数、胆固醇水平)或疾病状况(例如动脉粥样硬化、炎性病症和血栓形成病症) 的活性。术语“生理学可接受的盐”包含任何已知或随后发现为药学可接受的盐。某些具体 的实例是乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤化物，例如盐酸化物和氢溴化物；硫酸盐；柠檬酸盐； 酒石酸盐；羟乙酸盐；和草酸盐。当提到本发明的制剂时，在本文中使用的“基本上同质的”意指该制剂包括在制剂 中全部治疗分子的制备中可检测的单种类的治疗化合物，除非另外说明全部治疗分子的特 定百分数。一般而言，基本上同质的制剂同质至足以展示该同质制剂的优点，例如在临床应 用中批间药代动力学容易预测。“生物效力(bioefficacy)”指产生期望生物效应的能力。不同化合物、或相同化 合物的不同剂量、或相同化合物的不同施用的生物效力通常被归一化为化合物的量以容许 进行适当的比较。“动脉粥样硬化”指以由动脉壁内粥样斑块累积所引起的动脉硬化和/或缩窄为特 征的状况。该粥样斑块分成三种成分，(1)粥样斑，即一种处于大斑块中心的软薄片状物质 的结节性累积，包含最接近动脉腔的巨噬细胞；(2)在下面的胆固醇晶体区；(3)在更晚期 病变的外部基质处的钙化。动脉粥样硬化的指征包括例如动脉中斑块的发展，它们的钙化， 苏丹IV染色所能确定的程度或动脉中泡沫细胞的发展。可通过冠状动脉血管成形术、超高 速CT或超声测定动脉的缩窄。“炎症”或“炎性病症”指由组织损伤或破坏引起的局限性、保护性反应，其可用于 破坏、稀释或分隔(隔绝)有害因子和损伤的组织。当在本文中使用时，术语“炎性疾病”或“炎性状况”意指任何其中过量或不受调节的炎症反应导致过度炎性症状、宿主组织损伤 或组织功能损失的疾病。此外，当在本文中使用时，术语“自身免疫病”意指任何下组病症 其中组织损伤与对身体自身成分的体液或细胞介导的应答相关。当在本文中使用时，术语 “变应性疾病”意指任何由变态反应引起的症状、组织损害或组织功能丧失。当在本文中使 用时，术语“关节炎疾病”意指任何一种特征在于可归因于多种病因学的关节炎性病变的一 大类疾病。当在本文中使用时，术语“皮炎”意指任何一种特征在于可归因于多种病因学的 皮肤炎症的一大类皮肤疾病。当在本文中使用时，术语“移植排斥”意指任何直接针对移植 组织(包括器官和细胞(例如骨髓))的免疫反应，特征在于移植和周围组织的功能丧失、 疼痛、肿胀、白细胞增多以及血小板减少。“血栓形成”和“血栓形成相关病症”指导致血管堵塞以及与这样的堵塞相关的状 况的异常血栓形成。血管在作为血流剪切速度的函数的相当大的切应力下工作。经常地， 对小血管和毛细血管有损害。当这些血管受损时，触发止血以停止流血。在通常的情况下， 这样的损伤通过通常称为“血栓形成”的系列事件得以应对。血栓形成取决于血小板粘附、 活化和聚集以及在可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白凝块中得以结束的凝血级联。 在创伤部位处血栓形成阻止了血液成分的外渗。随后，发生伤口愈合和血块溶解并恢复血 管完整性和流动。术语“HDL”指高密度脂蛋白。当在本文中使用时，术语“LDL”指低密度脂蛋白。术语“ VLDL”指极低密度脂蛋白。术语“治疗”或“处理”包括向需要的受试者施用药理学活性量的本发明的修饰的 LCAT蛋白，其抑制、减缓或逆转例如病理性动脉粥样硬化、炎性病症或血栓形成相关病症的 发展。在另一个方面中，当在本文中使用时，治疗意指向有需要的受试者施用在动脉粥样硬 化方面会增加HDL胆固醇水平的量的本发明的化合物。在抑制动脉粥样硬化方面，“抑制” 意指预防、减缓、稳定或逆转动脉粥样斑块的形成或生长、炎性病症或血栓形成相关病症。 在此，疾病和病症的治疗也意在包括将本发明的修饰的LCAT蛋白(或其药用盐、衍生物或 前药)或包含该修饰的LCAT蛋白的药物组合物治疗性施用于认为需要对疾病或病症，例如 炎性病症、血栓形成病症、冠心病、高血压、LCAT缺陷综合征、阿尔茨海默病、角膜浑浊、代谢 综合征、血脂异常、心肌梗塞、中风、临界性肢体缺血、心绞痛等进行治疗的受试者。处理还 包括向未被诊断为具有该需要的受试者施用修饰的LCAT蛋白或药物组合物，即对受试者 的预防性施用，用于预防状况或病症。一般而言，受试者最初通过执业医师和/或经授权的 医学从业者进行诊断，并建议、推荐或处方用于经由施用本发明的修饰的LCAT蛋白或组合 物的预防性和/或治疗性(急性或慢性)处理的方案。短语“治疗有效量”是会达到改善病症严重程度以及发病频率目的的本发明的化 合物的量。病症严重程度的改善包括例如在动脉粥样硬化方面，阻止血管壁中胆固醇的累 积，增加HDL胆固醇的血液水平，逆转动脉粥样硬化，以及缓解动脉粥样硬化的进展，预防 或治疗炎性病症，以及预防或治疗血栓形成相关病症。当在本文中使用时，术语“受试者”意指显示动脉粥样硬化、炎性病症或血栓形成 相关病症或有发展上述疾病的风险的人或其他哺乳动物。这样的个体可具有例如以下状 况如炎症、血栓形成、冠心病、高血压、LCAT缺陷综合征、阿尔茨海默病、角膜浑浊、代谢综合征、血脂异常、心肌梗塞、中风、临界性肢体缺血、心绞痛等或有发展上述病症的风险。这 些病症的预后和临床指征都是本领域已知的。11 修饰的LCAT蛋白A.测定法用于测定LCAT酶活性、血浆稳定性(血浆中的酶半衰期)或血浆LCAT蛋白水平 的测定法是本领域已知的。可按 Albers J.等(1986)Methods in Enzymol. 129 :763_783 ； Dobiasova M.等(1983) Adv. LipidRes. 20 :107-194中所描述的测定血清中的绝对LCAT活 性和内源性胆固醇酯化速度。在一个方面中，可通过在LCAT和含Apo A-I的放射性标记的 LCAT底物温育后测量放射性标记的胆固醇到胆固醇酯的转化，从而测定LCAT活性。可测量 胆固醇酯化速度(CER，nmol CE/mL/小时)，所述测量是通过测定在经痕量放射性胆固醇进 行了放射性标记的血浆温育后，标记的胆固醇到胆固醇酯的转化速度而进行的，所述放射 性标记是通过在4°C下用[14C]胆固醇-白蛋白混合物平衡而进行的。内源性胆固醇酯化 速度(如使用血浆LCAT活性测定法测定的)不但反映了 LCAT的质量，还反映了血清中存 在的LCAT底物和辅因子的特性和量，并因此提供了更好的治疗性LCAT活性的量度。用于测量血液中LCAT稳定性(半衰期)和血浆LCAT蛋白浓度的测定法也是本领 域己知的。在施用后，可通过使用 JR Crowther :ELISAtheory and practice, methods in molecular Biology第42卷)描述的ELISA测定血浆中的重组LCAT蛋白水平。用于测定 LCAT稳定性和蛋白浓度的试剂包括抗-LCAT抗体，其市售自几家销售商。如下给出使用该 测定法来测定修饰的LCAT的活性和/或稳定性的实例。B.氨基酸修饰提供了在野生型LCAT蛋白氨基酸序列中包含氨基酸取代的修饰的LCAT蛋白。由 于野生型LCAT蛋白中的氨基酸序列通过一个或更多个氨基酸的取代被修饰，因此在一个 方面中，该修饰的LCAT蛋白是非天然存在的蛋白。修饰的LCAT蛋白来源于任何野生型LCAT 蛋白，图1中列出了示范性的野生型LCAT蛋白。对于本发明包括治疗起因于LCAT相关病症的人状况的方面，本发明提供了修饰 的LCAT蛋白，其中人LCAT蛋白被修饰以包括一个或更多个氨基酸取代，或一个或更多个 氨基酸添加，以及在一个方面中，野生型人LCAT氨基酸序列示于SEQ ID NO :1中。在SEQ ID NO 1所示的人LCAT蛋白序列中特定氨基酸的讨论中，本领域技术人员应当理解，考虑 并包括在其他人LCAT氨基酸序列(即等位变体或其他天然存在的LCAT序列)或直向同源 LCAT氨基酸序列中相同或相应的氨基酸残基处的相同或相似的修饰。关于SEQ ID NO :1， 考虑了在如下位置处的氨基酸取代(使用单字母氨基酸名称，继之以蛋白序列中的位置， 即 “F1” 指在 SEQ ID NO :1 中第 1 位的苯丙氨酸)F1、W2、L3、L4、N5、V6、L7、F8、P9、P10、 Hll、T12、T13、P14、K15、A16、E17、L18、S19、N20、H21、T22、R23、P24、V25、126、L27、V28、 P29、G30、C31、L32、G33、N34、Q35、L36、E37、A38、K39、L40、D41、K42、P43、D44、V45、V46、 N47、W48、M49、C50、Y51、R52、K53、T54、E55、D56、F57、F58、T59、160、W6U L62、D63、L64、 N65、M66、F67、L68、C69、L70、G71、V72、D73、C74、￥15、176、D77、N78、T79、R80、V81、V82、 Y83、N84、R85、S86、S87、G88、L89、V90、S91、N92、A93、P94、G95、V96、Q97、198、R99、V100、 P101、G102、F103、G104、K105、T106、Y107、S108、V109、E110、Y111、L112、D113、S114、S115、 K116、L117、A118、G119、Y120、L121、H122、T123、L124、V125、Q126、N127、L128、V129、N130、N131、G132、Y133、V134、R135、D136、E137、T138、V139、R140、A141、A142、P143、Y144、D145、W146、R147、L148、E149、P150、G151、Q152、Q153、E154、E155、Y156、Y157、R158、K159、L160、A161、G162、L163、V164、E165、E166、M167、H168、A169、A170、Y171、G172、K173、P174、V175、F176、L177、1178、G179、H180、S181、L182、G183、C184、L185、H186、L187、L188、Y189、F190、L191、L192、R193、Q194、P195、Q196、A197、W198、K199、D200、R201、F202、1203、D204、G205、F206、1207、S208、L209、G210、A211、P212、W213、G214、G215、S216、1217、K218、P219、M220、L221、V222、L223、A224、S225、G226、D227、N228、Q229、G230、1231、P232、1233、M234、S235、S236、1237、K238、L239、K240、E241、E242、Q243、R244、1245、T246、T247、T248、S249、P250、W25UM252、F253、P254、S255、R256、M257、A258、W259、P260、E261、D262、H263、V264、F265、1266、S267、T268、P269、S270、F271、N272、Y273、T274、G275、R276、D277、F278、Q279、R280、F281、F282、A283、D284、L285、H286、F287、E288、E289、G290、W29UY292、M293、W294、L295、Q296、S297、R298、D299、L300、L301、A302、G303、L304、P305、A306、P307、G308、V309、E310、V311、Y312、C313、L314、Y315、G316、V317、G318、L319、P320、T321、P322、R323、T324、Y325、1326、Y327、D328、H329、G330、F331、P332、Y333、T334、D335、P336、V337、G338、V339、L340、Y341、E342、D343、G344、D345、D346、T347、V348、A349、T350、R351、S352、T353、E354、L355、C356、G357、L358、W359、Q360、G361、R362、Q363、P364、Q365、P366、V367、H368、L369、L370、P371、L372、H373、G374、1375、Q376、H377、L378、N379、M380、V381、F382、S383、N384、L385、T386、L387、E388.H389、1390、N391、A392、1393、L394、L395、G396、A397、Y398、R399、Q400、G401、P402、P403、A404、S405、.P406’.T407.、A408.、S409、P410、E411、P412、P413、P414、P415
和/或E416。在这些位置中的一个或更多个位置处的氨基酸为任何天然存在的或非天然存 在的氨基酸所取代。例如以及不受限制，修饰的LCAT包含C31Y取代和在氨基酸残基F1、 L4、L32和N34中一个或更多个残基处的取代。在一个方面中，该第二取代是F1S、F1W、L4M、 L4K、N34S、L32F 和 / 或 L32H。 在多个方面中，提供了具体的取代。例如以及不受限制，脂肪族氨基酸残基(G、A、 V、L或I)为另外的脂肪族氨基酸残基所取代，芳香族氨基酸残基(F、Y或W)为另外的芳香 族残基所取代，脂肪族羟基侧链残基(S或T)为另外的脂肪族羟基侧链残基所取代，碱性残 基(1(、1 或11)为另外的碱性氨基酸残基所取代，酸性残基(D或E)为另外的酸性氨基酸残 基所取代，酰胺侧链残基(N或Q)为另外的酰胺侧链残基所取代，疏水残基(正亮氨酸、M、 A、V、L或I)为另外的疏水残基所取代，中性氨基酸残基(C、S、T、N或Q)为另外的中性残 基所取代，影响链取向的残基(G或P)为另外的影响链取向的残基所取代，和/或含硫侧链 残基(C或M)为另外的含硫侧链残基所取代。在其他方面中，同样不受限制，保守取代被导入野生型LCAT氨基酸序列中
原始残基示范性的保守取代
AG, S
RK
NQ，H
DE
CS
QN
ED
GA，P
HN，Q
IL, V
LI，V
KR，Q，E
ML，Y，I
FM, L, Y
ST
TS
WY
Tyrff, F
ValI，L
同样不受限制，预期的其他修饰包括那些在下表2中所列的修饰. 表2 C.衍牛物除上述修饰的LCAT蛋白之外，考虑修饰的LCAT蛋白的其他“衍生物”可替代上述 修饰的LCAT蛋白。这样的衍生物可改善化合物的溶解度、吸收、生物半衰期等。该部分能 替代地消除或削弱化合物的任何不期望的副作用等。这样的修饰的LCAT蛋白的衍生物包括其中如下的那些衍生物1.修饰的LCAT蛋白或其某些部分是环状的。例如，肽部分可被修饰以包含两个或 更多个半胱氨酸残基(例如在接头中)，其通过二硫键形成可环化。2.修饰的LCAT蛋白交联或使之能在分子间交联。例如，肽部分可被修饰以包含一 个半胱氨酸残基并因此能与类似的分子形成分子间二硫键。蛋白还可通过其C-末端被交 联。3. 一个或更多个肽基[_C(0)NR_]连接(键)为非肽基连接取代。示范性的非肽 基连接是-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-0C (0) NR-]、膦酸酯、-CH2-磺酰胺[-CH2-S (0) 2NR-]、脲 [-NHC (0) NH-]、-CH2-仲胺和烷基化肽[-C (0) NR6-其中R6是低级烷基]。4. N-末端被衍生化。通常，N-末端可被酰化或被修饰成取代的胺。示范性的N-末 端衍生物基团包括-NRR1 (除-NH2 以外)、-NRC (0) R\-NRC (0) 0R\-NRS (0) 2R\-NHC (0) NHR1、 琥珀酰亚胺或苄氧基羰基-NH- (CBZ-NH-)，其中R和R1各自独立地是氢或低级烷基，前提是 R和R1不都是氢以及其中苯环可用选自如下的1-3个取代基取代CfC4烷基、(^-(；烷氧基、 氯和溴；修饰成琥珀酰亚胺基；修饰成苄氧基羰基-NH-(CBZ-NH-)基；以及其中游离C末端 被衍生化为-C (0) R2的肽，其中R2选自低级烷氧基和_NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢和 低级烷基。“低级”意指具有1-6个碳原子的基团。5. C-末端被衍生化。通常，C-末端被酯化或酰胺化。例如，可使用本领域中描述的方法将(NH-CH2-CH2-NH2)2添加在本发明的化合物的C-末端。同样地，可使用本领域中 描述的方法将_NH2添加在本发明的化合物的C-末端。示范性的C-末端衍生基团包括例 如-C(0)R2，其中R2是低级烷氧基，或--NR3R4，其中R3和R4独立地是氢或C「C8烷基(或 C「C4焼基)。6.用另一例如更稳定的交联部分(例如亚烷基)取代二硫键。参见例如 Bhatnagar 等(1996), J. Med. Chem. 39 3814-9 ；Alberts 等(1993)Thirteenth Am. Pep. Symp. ,357_9。7. 一个或更多个单独的氨基酸残基被修饰。如下文所详述的，已知多种衍生剂与 所选择的侧链或末端残基特异性反应。此外，可通过将蛋白的目标氨基酸残基与能与所选择的侧链或末端残基反应的有 机衍生试剂反应，将单个氨基酸的修饰导入修饰的LCAT氨基酸序列中。示例如下。赖氨酰和氨基端残基可与琥珀酸或其它羧酸酐类反应。使用这些试剂的衍生化 具有逆转赖氨酰残基电荷的作用。其他适合于衍生含a-氨基残基的试剂包括亚氨酸酯 类例如甲基吡啶亚胺甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物 (chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；0-甲基异脲；2，4戊二酮；和转氨酶催化的与乙醛 酸的反应。可通过与包括苯甲酰甲醛、2，3_ 丁二酮、1，2_环己二酮和茚三酮的一种或几种常 规试剂反应而修饰精氨酰残基。由于胍官能团的高pKa，因此精氨酸残基的衍生化要求反应 在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸基团以及精氨酸胍基起反应。已广泛地研究了酪氨酰残基自身的特异性修饰，特别感兴趣的是通过与芳香族重 氮化合物或四硝基甲烷反应，将光谱标记导入酪氨酰残基中。最通常地，N-乙酰咪唑和四 硝基甲烷可用于分别形成0-乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)可通过与碳二亚胺类(R' -N = C = N-R')例 如1-环己基-3- (2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3- (4-氨鐺-4，4- 二甲基戊 基)碳二亚胺反应而被选择性修饰。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基可通过与铵离子反应被 转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基常被脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。可选 地，在温和的酸性条件下这些残基可被脱酰胺。这些残基的任何一种形式都落入本发明的 范围内。在除第31位残基之外的位置上的半胱氨酰残基可被氨基酸残基或其它部分取 代以消除二硫键，或相反地稳定交联。参见例如Bhatnagar等(1996)，J. Med. Chem. 39 3814-9。利用双功能试剂的衍生化具有将肽或它们的功能性衍生物与水不溶性的支持物 基质或其他大分子载体相交联的用途。通常使用的交联剂包括，例如1，1_双(重氮乙酰 基)-2_苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯类，例如，带有4-叠氮水杨酸的酯类，同双官 能亚氨酸酯，包括双琥珀酰亚胺酯类例如3，3' - 二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双功 能马来酰亚胺类例如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生试剂例如甲基_3-[(对-叠 氮苯基)二硫代]丙亚氨酸酯(propioimidate)产生光可活化的中间体，其能在光存在 下形成交联。可选地，反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利号3，969，287 ；3，691，016 ；4，195，128 ；4，247，642 ；4，229，537 ；和 4，330，440 中描述反应性底
物可用于蛋白固定化。其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基 的磷酸化，半胱氨酸中硫原子的氧化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链a -氨基的甲基化 (Creighton, T. E. , Proteins Structure and MoleculeProperties, ff. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))，N-末端胺的乙酰化，以及在某些情况下，C-末端羧基的
酰胺化。这样的衍生化的部分优选改良本发明化合物的一种或更多种特征，包括酶活性、 溶解度、吸收、生物半衰期等。替代地，衍生化的部分得到与未被衍生化的化合物具有相同 或基本上相同的特征和/或性质的化合物。该部分能替代地消除或减弱化合物的任何不期 望的副作用等。碳水化合物(寡糖)基团可方便地连接到已知是蛋白中糖基化位点的位点上。一 般而言，当它们是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分时，0-连接的寡糖被连接到丝氨酸(Ser)或 苏氨酸(Thr)残基，而N-连接的寡糖则被连接到天冬酰胺(Asn)残基，其中X可以是除脯 氨酸之外的任何氨基酸。X优选是除脯氨酸之外的19种天然存在的氨基酸的一种。N-连 接的和0-连接的寡糖的结构以及在每一种中所见的糖残基是不同的。通常在两者上都所 见的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和0-连接 的寡糖的末端残基，并且，由于其负电荷，可给糖基化化合物赋予酸性特性。这样的位点可 掺入本发明化合物的接头中，并优选在多肽化合物的重组生产过程中由细胞糖基化(例如 在哺乳动物细胞如CH0、BHK、COS中)。然而，这样的位点可通过本领域已知的合成或半合 成方法得以进一步糖基化。本发明的修饰的LCAT蛋白同样可在DNA水平上进行改变。该化合物任何部分的 DNA序列可被改变为与所选择的宿主细胞更加相容的密码子。在一个方面中，对于宿主细 胞——大肠杆菌，优化的密码子是本领域已知的。密码子可被取代以消除限制酶切位点或 以包括沉默的限制酶切位点，其可有助于在所选择的宿主细胞中DNA的加工。运载体、接头 和肽DNA序列可被修饰以包括任何前述序列改变。另一组有用的衍生物是缀合于毒素、示踪剂或放射性同位素的上述分子。这样的 缀合尤其可用于包含结合肿瘤细胞或病原体的肽序列的分子。这样的分子可用作治疗剂 或用作手术助剂(例如放射免疫导向手术或RIGS)或用作诊断剂(例如放射免疫诊断或 RID)。作为治疗剂，这些缀合的衍生物具有诸多优势。它们便利了毒素和放射性同位素 (如果没有肽序列提供的特异性结合，它们应当是有毒性的)的使用。它们还可通过促进缀 合配偶体的更低有效剂量，减少伴随着使用放射和化学治疗的副作用。有用的缀合配偶体包括 放射性同位素，例如 90Y、131I、225Ac 和 213Bi ； 蓖麻毒蛋白A毒素、微生物来源的毒素例如假单胞菌内毒素(例如PE38、PE40) 等； 捕捉系统中的配偶体分子(参见下文)； 生物素、链霉抗生物素蛋白(在捕捉系统中用作配偶体分子或用作示踪剂，尤其用于诊断应用)；和 细胞毒剂(例如阿霉素)。这些缀合的衍生物的一种有用的适用是在捕捉系统中使用。在这样的系统中，本 发明的分子应当包含良性捕捉分子。该捕捉分子应当能特异性结合包含例如毒素或放射性 同位素的分离的效应分子。运载体缀合的分子和效应分子两者都应当被施用于患者。在这 种系统中，除了当与运载体缀合的捕捉分子结合时，效应分子应当具有短半衰期，因此使得 任何毒副作用减至最小。运载体_缀合的分子应当具有相对长的半衰期，但应当是良性且 无毒的。这两个分子的特异性结合部分可以是已知的特异性结合对(例如生物素、链霉抗 生物素蛋白)的一部分或可由肽生成方法例如在此描述的方法所产生。可通过本领域已知的方法制备这样的缀合的衍生物。就蛋白效应分子(例如假 单胞菌内毒素)而言，这样的分子可自相关的DNA构建体表达为融合蛋白。可例如根据对 BEXA抗体(Coulter)所描述的，制备放射性同位素缀合的衍生物。可例如根据对BR96抗 体(Bristol-Myers Squibb)所描述的，制备包含细胞毒剂或微生物毒素的衍生物。可例如 根据来自NeoRx的专利、专利申请以及出版物所描述的，制备捕捉系统中使用的分子。用于 RIGS和RID的分子可例如根据来自NeoProbe的专利、专利申请和出版物进行制备。D.运载体/载体部分本发明的化合物还可与载体分子例如线性聚合物(例如聚乙二醇、聚赖氨 酸、葡聚糖等)、支链聚合物(参见例如美国专利4，289，872 ；美国专利5，229，490 ;W0 93/21259)；脂类；胆固醇基团(例如类固醇)；或碳水化合物或寡糖共价或非共价地缔合。 其他可能的载体包括抗体部分，以及特别是来源于抗体的恒定区。其他还可能的载体包括 一种或更多种水溶性聚合物连接物，例如聚乙二醇或聚丙二醇，如美国专利号4，640，835， 4，496，689，4，301，144，4，670，417，4，791，192 和 4，179，337 中所描述。本领域已知的其他 有用的聚合物包括单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他糖基聚合物、聚_ (N-乙烯基 吡咯烷酮)_聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇 (例如甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。1.免疫球蛋白恒定区运载体/载体在一个方面中，本发明的修饰的LCAT蛋白包括至少一个通过N-末端、C-末端或氨 基酸残基之一的侧链连接至蛋白的运载体。在一个实施方案中，Fc区是运载体。因此，Fc 区可融合至肽的N或C末端或N和C两末端。如在此所示范的，也可使用多个运载体；例如 在每一末端处的Fc或在一个末端处的Fc及在另一个末端或侧链处的PEG基团。在多个实施方案中，Fc部分是天然Fc或Fc变体。例如以及不受限制，Fc部分 是人免疫球蛋白IgGl重链的Fc区或其生物学活性片段、衍生物或二聚体，参见Ellison， J. ff.等，Nucleic Acids Res. 10:4071-4079(1982)。然而，应当理解供本发明使用的Fc区 可来源于来自任何物种的IgG、IgA、IgM、IgE或IgD。天然Fc区由可通过共价(即二硫键) 和/或非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。天然Fc分子的单体亚基 间的分子间二硫键数目根据(例如IgG、IgA、IgE)或亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgAl、 IgGA2)在1-4个之间变化。天然Fc的一个实例是由IgG的木瓜蛋白酶消化所产生的二硫 键合的二聚体(参见 Ellison 等(1982)，Nucleic Acids Res. 10 4071-9)。在多个方面中，考虑Fc序列包括那些本领域已知的序列，例如FcIgGl (GenBank登记号 P01857)、Fc IgG2 (GenBank 登记号 P01859)、FcIgG3 (GenBank 登记号 P01860)、 Fc IgG4 (GenBank 登记号 P01861)、FcIgAl (GenBank 登记号 P01876)、Fc IgA2 (GenBank 登记号 P01877)、FcIgD (GenBank 登记号 P01880)、Fc IgM(GenBank 登记号 P01871)和 FcIgE (GenBank 登记号 P01854)。可通过例如制备多种残基或序列的取代而构建Fc部分的变体、类似物或衍生物。 在一个方面中，掺入的Fc变体包含人源化自非人天然Fc的分子或序列。可选地，Fc变体包 含缺少一个或更多个天然Fc位点或残基的分子或序列，所述天然Fc位点或残基影响或参 与(1) 二硫键形成，(2)与所选择的宿主细胞不相容，(3)在所选择的宿主细胞中表达时的 N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，(6)结合除补救受体外的Fc受体或(7)抗 体依赖性细胞毒作用(ADCC)，其中每一项都详细描述于美国专利申请号20040087778中， 其公开内容以其整体在此并入作为参考。变体(或类似物)Fc多肽部分包括任何插入变体，其中一个或更多个氨基酸残基 补充Fc氨基酸序列。插入可位于蛋白的任一末端或两末端，或可位于Fc氨基酸序列的内 部区域。在任一末端或两末端具有额外的残基的插入变体可包括例如融合蛋白和包括氨基 酸标志或标记的蛋白。例如，Fc分子可任选地包含N-末端Met，尤其当该分子在细菌细胞 例如大肠杆菌中重组表达时。在Fc缺失变体中，Fc多肽中的一个或更多个氨基酸残基被除去。可在Fc多肽的 一个末端或两个末端进行缺失，或在Fc氨基酸序列中除去一个或更多个残基。因此，缺失 变体包括Fc多肽序列的所有片段。在Fc取代变体中，Fc多肽的一个或更多个氨基酸残基被除去并用另外的残基取 代。在一个方面中，取代是自然界中保守的取代以及该类型的保守取代是本领域熟知的。可 选地，本发明还包含非保守取代。例如，半胱氨酸残基可被缺失或用其他的氨基酸取代以阻止Fc序列的某些或所 有的二硫化物交联的形成。每个半胱氨酸残基可被除去和/或用其他的氨基酸例如Ala或 Ser取代。作为另一个实例，还可进行修饰以导入氨基酸取代，从而(1)消除Fc受体结合位 点；⑵消除补体(Clq)结合位点；和/或(3)消除抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)位点。这 样的位点是本领域已知的，并且任何已知的取代皆落入在此使用的Fc的范围内。关于IgGl 中 ADCC 位点，例如参见 Molecular Immunology, Vol. 29，No. 5，633-639 (1992)。同样地，一个或更多个酪氨酸残基可用苯丙氨酸残基取代。此外，还考虑了其他变 体氨基酸插入、缺失和/或取代，并且处于本发明的范围内。在一个方面中，这些可以是保 守的氨基酸取代。此外，改变可以是改变的氨基酸的形式，例如肽模拟物或D-氨基酸。如上所述，天然Fc和Fc变体都是在本发明范围内使用的合适的Fc结构域。天 然Fc可被广泛地修饰以形成Fc变体，前提是与补救受体的结合要被保持；参见例如TO 97/34631和W0 96/32478。在这样的Fc变体中，可除去提供不是本发明的融合分子必需的 结构特征或功能活性的天然Fc的一个或更多个位点。可通过例如取代或缺失残基、插入残 基到位点中，或截去包含该位点的部分，从而除去这些位点。插入或取代的残基还可以是改 变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。期望Fc变体可能有多种原因，几个原因描述如下。 示范性的Fc变体包括分子和序列，其中1.除去参与二硫键形成的位点。这样的除去可避免与用于产生本发明分子的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸蛋白的反应。为了该目的，可截去N-末端处含半胱氨酸片段 或可缺失半胱氨酸残基或用其他氨基酸(例如丙氨酰、丝氨酰)取代。即使在半胱氨酸残 基被除去的情况下，单链Fc区仍能形成非共价结合的二聚Fc区。2.修饰天然Fc以使之与所选择的宿主细胞更相容。例如，可除去接近典型的天然 Fc的N-末端的PA序列，该序列可为大肠杆菌中的消化酶如脯氨酸亚氨基肽酶所识别。还 可添加N-末端甲硫氨酸残基，尤其是当该分子在细菌细胞如大肠杆菌中重组表达时。3.当在所选择的宿主细胞中表达时，除去天然Fc的N-末端部分以阻止N-末端异 质性。为了该目的，可缺失N-末端前20个氨基酸残基的任何一个，特别是处于第1、2、3、4 和5位的那些残基。4.除去一个或更多个糖基化位点。通常糖基化的残基(例如天冬酰胺)可赋予细 胞溶解反应。这样的残基可缺失或用非糖基化残基(例如丙氨酸)取代。5.除去参与与补体的相互作用的位点，例如Clq结合位点。例如，可缺失或取代人 IgGl的EKK序列。对于本发明的分子而言，补体募集可能不是有利的，因此可用这样的Fc 变体来避免。6.除去影响结合除补救受体外的Fc受体的位点。天然Fc可具有用于与某些白细 胞相互作用的位点，其并非本发明的融合分子所必需的，因此可以除去。7.除去ADCC位点。ADCC位点是本领域中已知的；关于IgGl中的ADCC位点，参见 例如Molec. Immunol. 29 (5) :633_9 (1992)。对于本发明的融合分子，这些位点同样是不需 要的，因此可被除去。8.当天然Fc来源于非人抗体时，该天然Fc可被人源化。通常，为了人源化天然 Fc，可用在人天然Fc中通常所见的残基取代非人天然Fc中所选择的残基。用于抗体人源 化的技术是本领域熟知的。应当注意到除非存在阻止通过二硫键形成而二聚化的特定条件，当存在合适的半 胱氨酸残基时，Fc单体会自发地二聚化。即使除去或用其他残基取代在Fc 二聚体中正常 形成二硫键的半胱氨酸残基，该单链都通常会通过非共价相互作用形成二聚体。术语“Fc” 在此用于意指如下这些形式的任何一种天然的单体、天然的二聚体(二硫键连接的)、修 饰的二聚体(二硫键和/或非共价连接的)以及修饰的单体(即衍生物)。Fc序列还可被衍生化，即具有不同于氨基酸残基插入、缺失或取代的修饰。在一个 方面中，该修饰在性质上是共价的，并且包括例如与聚合物、脂类、其他有机和无机部分的 化学键接。然而，还可考虑到非共价修饰。可制备本发明的衍生物以增加循环半衰期，或可 设计本发明的衍生物以改善多肽对期望细胞、组织或器官的靶向能力。例如在题名为“具有增加的半衰期的改变的多肽”的W0 96/32478中所描述的，还 有可能使用完整的Fc分子的补救受体结合域作为本发明化合物的Fc部分。在此被称为 Fc的分子类的额外成员是那些在题为“具有增加的半衰期的免疫球蛋白样结构域”的TO 97/34631中所描述的成员。2.水溶性聚合物运载体如上所述，还考虑到聚合物运载体。用于连接用作运载体的化学部分的各种手段 是普遍可得到的，参见例如题为“N-末端化学修饰的蛋白组合物和方法”的国际公开号W0 96/11953，其整体在此并入作为参考。该PCT出版物披露了将水溶性聚合物选择性连接到蛋白的N_末端上及其它内容。因此，本发明考虑到包含水溶性聚合物(WSP)的化合物。适宜地，临床上可接受的 WSP包括不限于PEG、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基 纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇( 乂幻、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、 乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮) 聚乙二醇、丙二醇均聚物(PPG)和其他聚环氧烷、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基 化多元醇(P0G)(例如甘油)和其他聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇、或聚氧乙基 化葡萄糖、colonic acids或其他碳水化合物聚合物、Ficoll或葡聚糖和它们的混合物。 事实上，提供了任何形式的已用于衍生化其它蛋白的PEG，例如且不限于单-(C1-C10)烷氧 基_或芳氧基-聚乙二醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，因此在制造中具有优势。PEG基团可以是任何适宜的分子量并且可以是线性或支链的。考虑用于本发明的 PEG的平均分子量为约2kDa-约lOOkDa，约5kDa_约50kDa，约5kDa_约lOkDa。在另一个 方面中，PEG部分具有约6kDa-约25kDa的分子量。通过在PEG部分上的反应基(例如醛、 氨基、硫醇或酯基)与目标肽或蛋白上的反应基(例如醛、氨基或酯基)，PEG基团通常经酰 化或还原性烷基化被连接到肽或蛋白上。使用在此描述的方法，可以制备聚合物/肽缀合 物分子的混合物，并且，在此所提供的优势在于选择包含于混合物中的聚合物/肽缀合物 的比例的能力。因此，必要时，可以预定的聚合物/蛋白缀合物比例制备肽与所连接的多个 聚合物部分(即0、1或2个)的混合物。一种用于合成肽的聚乙二醇化的有效策略由如下组成通过在溶液中形成缀合连 接，结合各自带有相互反应性的特定官能度的肽和WSP (PEG)部分。该肽可容易地用常规固 相合成制备。用适当的官能团在特定的位点上“预活化”该肽。纯化前体并在与PEG部分 反应前进行充分表征。肽与PEG的连接通常发生在水相中并可通过反相分析HPLC而容易 地得到监测。该聚乙二醇化肽可容易地通过制备HPLC纯化并通过分析HPLC、氨基酸分析和 激光解吸质谱鉴定。多糖聚合物是另一类可用于蛋白修饰的WSP。葡聚糖是由主要通过1-6键连接的 各个葡萄糖亚基组成的多糖聚合物。在许多分子量范围内的葡聚糖自身是可得到的，并且 在约lkD-约70kD的分子量范围内是容易得到的。葡聚糖是一种单独或与另外的运载体 (例如Fc)结合用于本发明作为运载体的合适的水溶性聚合物。参见例如W0 96/11953和 W0 96/05309。已报道了缀合至治疗或诊断免疫球蛋白的葡聚糖的应用；参见例如欧洲专利
发明者B·单, D·P·梅宁格尔, M·周, M·施瓦茨, T·布恩, W·沈 申请人:安姆根有限公司