专利名称：：用于认知功能的含有百里香酚和/或对-伞花烃的新颖的药物组合物或植物提取物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于改善认知功能例如学习、记忆和警觉以及缓解社会心理压力的，包含百里香酚和/或对伞花烃的新颖的保健品组合物或食品添加剂，或含有百里香酚和/或对伞花烃作为活性成分的植物提取物。百里香酚、对伞花烃和富集的百里香提取物也适用于治疗由缺氧导致的状况、缓解神经性疼痛和精神状况。
背景技术：
：记忆、学习和警觉依赖于中脑、特别是海马中的神经元回路，在那里信息被加工并且记忆被巩固。精神表现和学习依赖于突触可塑性；即通过募集新受体、形成新突触和最终产生新神经元联结来强化神经元联结。(长期)记忆的形成和脑的有效功能依赖于用于强化神经元之间通信强度的新蛋白质的合成。用于突触强化的新蛋白质的生产由神经元内的化学信号和电信号引发。长期增强(LTP)是用于描述突触传递的长效增强(体外数小时，体内数天或数周)的术语，所述增强在短的、有条件的突触前电刺激猝发(约IOOHz持续1秒)之后在中枢神经系统(CNS)中具体的突触中发生。该现象被广泛认为是记忆形成并储存于脑中的主要机制之一。在体外和活动物中均观察到LTP。在实验条件下，对突触应用一系列短的、高频电刺激能够将化学突触的强度强化至数分钟到数小时。最重要的是，LTP有助于活动物中的突触可塑性，为高度适应性神经系统提供基础。LTP过程主要涉及两种不同的受体类型，即N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体复合物和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体。在LTP期间，主要的兴奋性神经递质谷氨酸从突触前神经元释放，结合并活化突触后膜上的AMPA受体，导致其去极化。在静息膜电势下，NMDA受体通道被镁离子阻断，但是突触后膜的去极化去除该阻断，使NMDA受体活化并随后使钙进入细胞。相信细胞内钙的这一提高能活化蛋白质激酶，导致基因转录和强化蛋白质的构建(Neihoff2005，SpeakMemory210-223)，并导致增强的AMPA受体敏感度，因此进一步促进LTP的神经传递和维持。NMDA受体由NRl-和NR2-亚基组成；谷氨酸结合结构域在这些亚基的接点处形成。除谷氨酸之外，NMDA受体还需要共激动剂甘氨酸，从而调控受体功能。甘氨酸结合位点存在于NRl亚基中，而NR2亚基具有多胺结合位点，所述多胺是调控NMDA受体功能化的调节分子。因此，已知甘氨酸在NMDA受体复合物上与谷氨酸一起发挥阳性变构调控剂(positiveallostericmodulator)禾口专性共激动齐[J的作用(Danysz1998，Pharmacol.Rev.，50(4)，597-664)。甘氨酸转运蛋白(GlyT)通过将甘氨酸重摄取进入突触前神经末端或神经胶质细胞中，而在突触后甘氨酸能作用的终止和低细胞外甘氨酸浓度的维持中起重要作用。因此，甘氨酸作用的终止在很大程度上由快速重摄取介导。两种甘氨酸转运蛋白GlyTl和GlyT2是已知的，并由12个推定的跨膜区域表征，同时鉴定了由相同基因编码的三种GlyTl变体(GlyTla、b和c)(BorowskyandHoffman(1998),J.Biol.Chem.，273(44)，29077-29085)。GlyTl是前脑中唯一的氯化钠依赖型甘氨酸转运蛋白，其与NMDA受体一起共表达。在该位点中，认为GlyTl负责控制突触处的细胞外甘氨酸水平(Lopez-Corcuera(2001)，Mol.Membr.Biol.，18(1)，13-20)，导致NMDA受体功能的调控。事实上，在存在选择性GlyTl拮抗剂N_[3_(4‘-氟苯基)_3_(4'-苯基苯氧基)]丙基肌氨酸(NFPS)时，在小鼠和大鼠海马切片中Schaffer侧支刺激(Schaffercollateralstimulation)后观察到CAl锥体细胞中增强的NMDA受体应答(Bergeron，等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(26)，15730-15734)。成年小鼠中体内全身性施用NFPS提高了齿状脑回中的LTP并增强了对听觉惊吓应答(acousticstartleresponse)的前脉冲抑制，表明GlyTl的抑制以行为相关的方式影响NMDA受体功能(Kirmey，等(2003)，J.Neurosci.，23(20)，7586-7591)。这类数据突出了下述化合物用于在正常个体中预防神经病综合征和用于维持或加强生理学认知功能(例如记忆和学习)的有用性，所述化合物能够通过提高突触NMDA受体局部微环境中的细胞外甘氨酸水平来增强NMDA受体的突触功能。对下述化合物以及保健品组合物的开发存在越来越多的兴趣，所述化合物以及保健品组合物可在老人和年轻人中，日常工作需要特别高记忆和注意力的个体(包括学生、建筑工人、司机、飞行员、医师、售货员、行政人员、家庭主妇、“高效率专业人士”)中，和处于精神或日常压力下的人中，以及倾向于神经不稳定(例如精神分裂症)的人中改善学习、记忆和警觉。因此，增强NMDA受体功能并使得能够改善学习、记忆和警觉的化合物或保健品组合物会是高度期望的。JP2004002237公开了抗衰老食品或药物的用途，所述食品或药物包含迷迭香作为抗衰老化合物的许多植物来源之一。所述组合物要求保护的用途之一是除了对头发和皮肤和眼健康和骨健康的有益作用以外，还改善学习功能和记忆。发明详述根据本发明发现，下文式I的化合物或其盐、衍生物、代谢产物或类似物通过其诱导LTP的能力成为海马功能的活化剂。它们可以通过抑制甘氨酸转运蛋白GlyTl从而抑制甘氨酸重摄取，或者通过活化另一通路，或者通过这两种机制发挥作用。这些生物学活性在记忆形成和记忆巩固中是重要的，因此这些化合物可用于增强认知功能。式I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中Rl=H、OH或OMe；且R2=H、OH或OMe具体地，根据本发明发现百里香酚(thymol)和含有百里香酚的植物提取物能够通过抑制甘氨酸转运蛋白GlyTl而抑制甘氨酸重摄取。得到的细胞外甘氨酸水平的提高导致NMDA受体的额外活化，这是诱导大量基因转录活化并随后诱导LTP的第一步，所述LTP是涉及记忆形成和记忆巩固的主要细胞机制。还发现存在于植物提取物中的另一化合物对伞花烃(p-cymene)能够通过不同的机制诱导LTP。因为两种过程具有相同的生物学益处，即它们均促进导致增强的认知功能化的海马功能化，所以本发明的另一方面是这两种活性成分一起增强认知功能的用途。因此，本发明的一个方面是用于增强认知功能的新颖的保健品组合物，其包含式I的化合物或百里香酚乙酸酯(thymoacetate)。尤其优选的式I的化合物是百里香酚和对伞花烃。式I的化合物可以使用已知方法合成生产；它们可使用已知的提取流程从天然来源例如植物中提取，或者可作为植物提取物的组分使用，优选地作为百里香提取物的组分使用，所述百里香提取物含有足量的百里香酚和/或对伞花烃，从而是海马功能的有效增强剂。附图概述图1展示了GlyTl抑制测定中百里香酚和富集的百里香提取物的剂量-应答曲线。测定结果表示为放射性甘氨酸内化进入细胞的％抑制。图1清楚地证明了在细胞测定中，两种不同的百里香提取物以及百里香的最主要挥发性成分——百里香酚能够特异性抑制GlyTl的作用。图Ia显示对ALX而言，IC5tl=6.46nM图Ib显示对肌氨酸而言，IC50=35.9nM图Ic显示对ORG24569而言，IC5tl=0.02μM图Id显示对百里香酚而言，IC50=13.6μM图Ie显示对百里香提取物1而言，IC5tl=48.2μg/mL图If显示对百里香提取物2而言，IC50=45.1μg/mL图2a显示来自下台(st印-down)行为测试的结果，所述结果表述为错误数。用百里香处理的小鼠比其年龄匹配的对照表现得显著更好，并且与用阳性对照处理的小鼠表现相当。任何时间在百里香处理组和银杏或咯利普兰处理组的表现之间均未观察到统计学差异。a训练周期期间与载剂处理的年龄匹配同窝动物的显著差异。b测试周期期间与载剂处理的年龄匹配同窝动物的显著差异。c清除周期期间与载剂处理的年龄匹配同窝动物的显著差异。图2b.下台行为测试，潜伏期持续时间。用百里香提取物处理的小鼠比其年龄匹配的对照表现得显著更好，并且与用阳性对照处理的小鼠表现相当。任何时间在百里香处理组和银杏或咯利普兰处理组的表现之间均未观察到统计学差异。图3a物体出现之前3小时和之后3小时每个角落中的访问持续时间。实心圆圈表示物品的位置。图3b物体出现之前，每个角落中的访问时间被标准化为所有4个角落中花费的总时间。图3c与对照和GinkgobiIoba(GBE)处理的动物相比，百里香提取物处理的组活性阶段期间的学习曲线。所有组随时间表现得更好，尽管在对照和处理组之间未能发现差异(ρ=0.44)。所述数据显示所有的动物都能够学习该任务。图3d位置学习的逆转在第一活性阶段期间记录错误。百里香提取物的错误率从100%下降至约20%，两个对照组均下降至约60-70%(最后两个时间段中p=0.011)。每个时间段对应2小时。棺物提取物存在大量植物物种，其含有百里香酚和/或对伞花烃，并且可以作为本发明植物提取物的来源。优选地，植物是Thymus属的成员，因为其含有两种所述化合物，但是提取物的来源可以是已知含有任一所述化合物的任何植物。已知含有百里香酚和/或对伞花烃的其他植物的例子包括美洲薄荷(Monardapunctata和相关的Monarda物禾中如M.fistulosa)、阿育魏(Trachyspermumammi)、莳萝(Anethumgraveolens)、葫声EL(Trigonellafoenum-graecum)>^^nf(wintersavory)(Saturejamontana)>Jf菜(Apiumgraveolens)、茶树(Melaleucaalternifolia)禾口真豆蔻(truecardamom)(Elettariacardamomum)。百里香提取物可以用Thymus属的任何物种例如T.vulgaris、Τ.zygis、Τ.pulegioides、Τ.serpyllum、Τ.bournmuelIeri、Τ.decassatus、Τ.longicaulus、Τ·syriacus禾口Thymusschimp造。优选地，Thymus是Thymusvulgaris。通常，百里香提取物应当含有至少约25-80%的百里香酚、优选地从约40-65%的百里香酚，更优选地从约50-60%的百里香酚。通常百里香提取物应当含有至少约5-55%的对伞花烃，优选地从约10-40%的对伞花烃。在说明书和权利要求书通篇中使用时，术语“百里香提取物”旨在被广义使用，并可包括通过常规手段制造的植物提取物，所述常规手段例如蒸汽蒸馏、超临界CO2(SF-CO2)萃取、基于水的萃取、一氧化二氮萃取、基于醇的萃取或基于有机溶剂(例如乙酸乙酯、丙烷、丙酮，其任选地用修饰剂例如乙醇修饰)的萃取。因为所述提取物旨在用于人和动物消耗，所以提取物应当是经管理机构批准的提取物。关于百里香提取物的仅有的关键性参数为1)其在用于动物或人消耗的保健品组合物中使用应当是可接受的。因此要用于其制备的溶剂应当是多个管理机构批准用于期望用途的。因此，优选的提取步骤为蒸汽蒸馏、SF-CO2,C2_4醇萃取和乙酸乙酯萃取。2)其应当含有足量的活性化合物百里香酚或对伞花烃或二者，从而实现期望的效果，例如认知改善和/或社会心理状态的改善，即受试者显示改善的记忆功能或者能够以更积极的方式应付应激状况。在说明书和权利要求书通篇中使用时，术语“认知功能改善量”和“社会心理状态改善量”旨在表示这一概念。可以使用标准化的心理学评估测试来评估多种状态的改善量。在说明书和权利要求书通篇中使用时，术语“提取物”包括常规提取物(即总提取物，例如标准亲脂提取物)以及使用两个或更多提取步骤生产的这些提取物(“富集的”提取物，其中总提取物被进一步精制，通常使用二次提取来精制，从而浓缩期望的组分)。百里香提取物典型地含有其他化合物，所述其他化合物也可以是生物活性的，和/或提高活性成分百里香酚和/或对伞花烃的生物利用率。它们在百里香提取物中的存在量可以基于大量因素而变化，所述因素包括使用的Thymus物种，植物的生长条件，和(当然)用于制备百里香提取物的方法。使用超临界CO2方法制备的典型的Thymusvulgaris提取物会含有(除百里香酚和对伞花烃以外)香芹酚、1，8_桉油醇、龙脑、香叶醇、芳樟醇、冰片基乙酸酯、沉香基乙酸酯、百里酚甲基醚和a-菔烯、芹菜素(apigenin)、木樨草素(Iuteolin)、麝香草素(thymonin)、柚皮素(naringenin)和石竹烯。百里香酚有益于精神状杰如前文所述，记忆、学习和精神稳定性的基础是LTP或神经元联结的强化，这通过脑中、尤其是海马中AMPA和NMDA受体的活化发生。因为甘氨酸重摄取抑制剂通过它们对GlyTl、百里香酚和含百里香酚的百里香提取物的活性，而使得甘氨酸能够在NMDA受体附近聚集进而使所述受体活化并最终导致LTP(涉及记忆形成和记忆巩固的主要细胞机制)的诱导。另外，对伞花烃诱导相同的生物化学通路的活化(虽然在与百里香酚不同的步骤中)，导致LTP诱导，并且类似地有益于改善记忆功能。因此，百里香酚和对伞花烃和含有其中任一或二者的提取物能够活化海马功能并改善记忆形成和巩固，以及改善精神健康。本发明改善的状况在本发明的上下文中，“治疗”也包括共同治疗以及预防。预防可以表示削弱发生状况的风险、改善状况、早期干预、和/或在使未来时间中发生的状况的严重性最小化。在本说明书和权利要求书通篇中，术语“改善的认知功能”表示支持和维持认知健康和平衡的状况，例如增强的学习，包括ο语言处理ο解决问题ο智力功能·应付社会心理负担的能力·增强的注意力和精神集中·增强的记忆和记忆能力，特别是短期记忆·增强的精神警觉和精神警戒，精神疲劳的减少·精神状态的稳定，包括ο减轻产后状况ο减轻由于与配偶、孩子分离、心爱的人死亡或婚姻问题导致的心理负担ο减轻与住所、工作改变或类似事件相关的问题ο减轻交通意外或其他消极社会压力之后的应激状况减轻压力，包括ο治疗、预防和改善与超负荷工作、衰竭和/或“熄灭”相关的症状ο对压力的提高的抗性或耐性ο在正常健康个体中有利于和促进放松“状况改善”包括ο减少的应激性和疲劳ο减少、预防或减轻身体和精神疲劳ο在患病或健康的个体中促进品质良好的睡眠，也就是说对抗失眠和睡眠病症，并且更概括来说提高能量。在本发明的一个优选的方面中，组合物可被用作营养补充剂，尤其是用于感受到特别需要增强的认知功能和/或社会心理支持的人。会受益于增强的认知功能的人的非详尽列表包括老人，学生或准备考试的人，忙于大量学习的儿童，即婴儿、学步儿童、学前儿童和上学儿童，建筑工人，或者可能有危险的机械的操作者，卡车司机、飞行员、火车司机或其它运输专业人士，空运管理者，销售员、行政人员和其它“高效率专业人士”警官和军队职员，家庭主妇，或在其日常工作中接触大量压力的任何人，或其日常工作中需要特别高注意力/精神集中/高精神和心理性能的个体，例如运动员、国际象棋手、高尔夫球员、职业表演者(演员、乐师等等)。为了实现这些改善，在若干天(例如至少6天或10天)中施用是推荐的，并且通常优选每天施用，持续若干周。除了应用于人以外，本发明的组合物还在兽医领域中具有额外的用途。可受益于增强的认知功能的动物包括承受应激状况的这些动物。这类状况例如发生在捕获或运输之后，或者可能归因于居住条件(例如住所或主人的改变)，当动物发生类似的病症或者痛苦或有攻击性时，或显示亥丨J板(stereotypic)行为、或焦虑禾口强迫(obsessive-compulsive)行为时。承受压力的动物还应当包括竞赛动物(例如狗、马、骆驼)、或用于多种运动中的动物、表演动物(例如马戏团动物和出现在舞台、电视或电影中的动物)和表演驯马术和其它高度纪律性日常工作的马。优选的“动物”是宠物或伴侣动物和农场动物。宠物的例子是狗、猫、鸟、观赏鱼、荷兰猪、(jack)兔、野兔和白鼬。农场动物的例子是水产养殖鱼、猪、马、反刍动物(牛、绵羊和山羊)和家禽。保健品用途/配制物/剂量在本文中使用时，术语“保健品”表示同时在营养学和药物学两个应用领域中的有用性。因此，可以使用新颖的保健品组合物作为食物和饮料的补充剂和作为用于肠内和肠胃外应用的药物配制物，其可以是固体配制物例如胶囊或片剂，或液体配制物例如溶液或悬浮液。根据本发明的保健品组合物可进一步含有保护性水胶体(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、黏合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/孔材料、基质化合物、涂层、乳化剂、表面活性齐U、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等等)、吸附剂、运载体、填充剂、共同化合物、分散剂、湿润齐U、加工助剂(溶剂)、流动剂、口味掩蔽剂、增重剂、胶冻剂(jellyfyingagent)、凝胶形成齐U、抗氧化剂和抗微生物剂。另外，可以向本发明的保健品组合物中添加多维生素和矿物质补充剂，以获得足量的必需营养物，所述必需营养物在一些膳食中缺失。多维生素和矿物质补充剂也可以用于疾病预防和防止由生活方式导致的营养物损失和缺乏。根据本发明的保健品组合物可以是适合施用至体内的任何盖仑制剂形式，特别是便于口施用的任何形式，例如固体形式如强化的食物或饲料、食物或饲料预混物、食物或饲料(的添加剂/补充剂)、片剂、丸剂、颗粒剂、锭剂、胶囊和刨腾配制物，例如粉末和片剂，或者是液体形式，例如溶液、乳剂或悬浮液，例如饮料、糊剂和油性悬浮液。糊剂可以被掺入硬壳或软壳胶囊中，其中胶囊具有例如(鱼、猪、家禽、牛)明胶、植物蛋白质或磺酸木质素的基质。其它应用形式的例子是经皮、肠胃外或可注射的施用。膳食和药物组合物可以是受控(延时)释放的配制物形式。食物的例子是乳制品，包括例如人造黄油、涂抹物、黄油、奶酪、软奶或乳饮品。强化的食物的例子是谷物棒，烘焙物品例如蛋糕和曲奇，和马铃薯片或炸土豆条。饮料包括无醇饮品和含酒精的饮品，以及要添加进饮用水和液体食物中的液体制齐U。无醇饮品为例如软饮、运动饮品、果汁、柠檬水、茶和基于乳的饮品。液体食物为例如汤和乳制品。可以向软饮、能量棒或糖果中添加含有百里香酚和/或富集的百里香提取物或对伞花烃的保健品组合物，使得成年个体消耗认知功能改善量的含百里香酚或含百里香的植物提取物，所述量范围为每日份从约10到lOOOmg，优选地每日份从约50到750mg，或更优选地每日份从约100到500mg。对对伞花烃而言，认知功能改善量的范围为每日份从约5到500mg，优选地每日份从约25到375mg，和更优选地每日份从约50到250mg。如果保健品组合物是药物配制物，则组合物还含有可药用的赋形剂、稀释剂或佐齐U。它们的配制可使用标准技术，例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第20版，ffilliams&ffilkins,PA,USA。对口施用而言，优选地使用下述片剂和胶囊，其含有合适的粘合剂例如明胶或聚乙烯吡咯烷酮，合适的填充剂例如乳糖或淀粉，合适的润滑剂例如硬脂酸镁，和任选地含有其他添加剂。每日剂量基本与上文针对食物配制物的每日剂量相同，但是为了易于施用，可以将其分为更小剂量的每个施用单位，并且每天可以采用多个施用单位(例如1-4粒胶囊)。优选的是含有百里香酚和/或富集的百里香的植物提取物衍生物，所述衍生物在一起使用时提供10-1000mg、更优选地50-750mg、进一步更优选地100-500mg的每日剂量。对对伞花烃而言，优选的每日剂量约为5-500mg，优选地为25-375mg，进一步更优选地为50-250mg。就本发明的目的而言，对除人之外的动物，百里香或百里香提取物的合适的每日剂量可在每天每kg体重从0.OOlmg到每kg体重IOOOmg的范围内。更优选的是在每kg体重从0.Img到500mg的范围内的每日剂量，特别优选的是每kg体重从Img到IOOmg范围内的每日剂量。提供以下的非限制性例子来更好地阐述本发明。实施例1百里香提取物的制备和组成合适到百里香提取物的商业供应者包括MDidea(MDideaExportingDivision,No.9，WBSS，Ntez.YC，中国)、FLAVEX(FLAVEXNaturextrakteGmbH，Nordstrasse7，D_66780Rehlingen,德国)和WhiteLotusAromatics(602S.AlderStreet,PortAngeles,WA98362-6612，USA)。百里香提取物的制备和组成在下文的实施例中，“-se”表示苯酚型百里香提取物1，“-to”表示萜品醇型百里香提取物2，其均得自Flavex，德国。将干燥的百里香叶磨碎，并用超临界的二氧化碳萃取。萃取参数如下温度45°C；工作压强:300bar(-to)或IOObar(-se)；每Ikg植物材料需要17kg(-to)和15kg(-se)二氧化碳；通过在30°C下将压强调节至60bar，在分离器中获得提取物。25kg(-to)或50kg(-se)植物材料分别得到Ikg提取物。提取物l(-se)具有以下组成(通过气相色谱分析)总精油含量为65.3%(剩余部分是植物蜡)。挥发性组分列于下文<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>提取物2(-to)含有47.8%精油。挥发性化合物的组成列于下文_<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>百里香酷52.0%柠檬烯0.3%实施例2细胞测定实验中甘氨酸转运蛋白1的抑制稳定表达人甘氨酸转运蛋白lbCDNA(GlyTl)的CHO细胞常规培养于Dulbecco，s改良的小鹰培养基(购自Invitr0gen，CarlSbad，USA)中，所述培养基含有10%透析了的胎牛血清、青霉素、链霉素、脯氨酸和抗生素G418。在测定前一天通过胰蛋白酶消化收获细胞，并播种于上述培养基中。测定前即刻用摄取缓冲液替换培养基，所述缓冲液含150mMNaCl,ImMCaCl2,2.5mMKC1、2.5mMMgCl2、IOmM葡萄糖和IOmMN_2_羟乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸(“H印es”缓冲液)。通过添加60nM辐射标记的[3H]甘氨酸(AmershamBiosciencesGEHealthcare,Slough,UK)并在室温下孵育30分钟，来测定进入细胞的甘氨酸摄取。通过用上述缓冲液柔和洗涤三次去除未掺入的标签后，通过液体闪烁计数来量化掺入的甘氨酸。百里香提取物或百里香酚的添加以剂量依赖型方式抑制通过GlyTl转运蛋白的甘氨酸摄取。使用肌氨酸、0RG24598和ALX5407(均来自Sigma，St.Louis,USA)作为已知的GlyTl抑制剂。测量的抑制甘氨酸摄取的IC5tl值和代表性剂量-应答曲线分别显示于表1和图Ia-If■中。图1清楚地证明细胞测定实验中两种不同的百里香提取物以及百里香的最主要挥发性成分——百里香酚能够特异性抑制GlyTl的作用。图Ia显示对ALX5407而言，IC50=6.46nM图Ib显示对肌氨酸而言，IC50=35.9nM图Ic显示对ORG245698而言，IC5tl=0.02μM图Id显示对百里香酚而言，IC5tl=13.6μM图Ie显示对百里香提取物1而言，IC50=48.2μg/mL图If显示对百里香提取物2而言，IC5tl=45.1μg/mL^l:百里香提取物及其挥发性组分、百里香酚、对伞花烃、芳樟醇、石竹烯和香芹酚对进入CHO细胞的甘氨酸摄取的抑制测量的IC5tl值。数据表示为菌株士标准差，其中纯化合物的IC5tl以μM表示，提取物的IC5tl以μg/ml表示。表1氚标记的甘氨酸^物质摄取的IC5。百里香提取物148.2+9.8μg/ml~百里香提取物245.1+4.95μg/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3海马切片培养物使用环状刀对七天龄的Wistar大鼠断头。在少于1分钟内打开头骨，将大脑半球分离并转移，将每个海马切下并转移进冰冷的下述缓冲液中，所述缓冲液含有137mMNaCl、5mMKCl、0.85mMNa2HPO4U.5mMCaCl2,0.66mMΚΗ2Ρ04、0·28mMMgSO4UmMMgCl2,2.7mMNaHC03、lmM犬尿喹啉酸(Kynurenicacid)和0.6%D-葡萄糖。在相同缓冲液中使用振动刀片切片机(vibratingblademicrotome)(VT1200S；LeicaMicrosystems(Schweiz)AG,Heerbrugg，瑞士)制备横向海马切片(400μm)。将海马切片各自置于膜插入物(MillicellCulturePlateInserts,0.4μm)上，并于35°C、5%C02、95%湿度下在含BME和MEM(均来自Invitrogen)11混合物的下述培养基中培养，所述培养基含有25%热失活的马血清、IxGlutaMAX、lx青霉素/链霉素、0.6%葡萄糖和ImM犬尿喹啉酸(Stoppini，BuchsandMuller(1991)，J.Neurosci.Methods，37(2)，173-82)。培养48小时后，在140mMNaCl、5mMKClU.3mMCaCl2,25mMHEPES(pH7.3)、33mMD-葡萄糖和0.02mM牡丹荷包碱甲碘化物(bicucullinemethiodide)。常规地使用肌氨酸(100μM)和ALX5407(20ηΜ)作为阳性对照。额外的阳性对照包括向姐妹培养基中添加200μM甘氨酸。处理后将切片洗涤并固定，用于免疫组织化学分析。对增强的突触活性的标记物定量(见下表2)，所述增强的突触活性通常伴随着长期增强，代表了学习和记忆的离体模型。^2.与用缓冲液处理的姐妹培养物相比，用百里香提取物或其组分化合物(百里香酚、对伞花烃、芳樟醇、石竹烯和香芹酚)处理后突触标记物的相对活化。任何这些标记物(或其组合)的活化在经典的LTP试验中观察。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>++++显示定量的最大活化，而++表示最大活化的一半，士说明免疫反应性无改变。用百里香提取物以及用对伞花烃和百里香酚二者处理海马培养物诱导了LTP典型的生物化学标记物(pCREB活化形式的cAMP应答元件结合蛋白；pMAPK活化形式的促细胞分裂原活化的蛋白质激酶；GLURl=AMPA受体1的细胞表面存在)。实施例4孩干·φ_☆白婢肩诚_—口斤常惊_钟胃輸應勿1习惯化是非联合的学习和记忆的最简单形式之一，导致对重复刺激的应答的减少(ThompsonandSpencer(1966)，Psychol.Rev.，73(1)，16-43)。在脊椎动物中研究的主要行为之一是惊吓应答，其为简单的神经元回路介导的由突然的听觉、触觉或视觉刺激引起的身体肌肉快速收缩(Koch(1999)，Prog.Neurobiol.，59(2)，107-128)。在斑马鱼中评价百里香提取物1对听觉惊吓应答(ASR)的影响，所述斑马鱼已知在受精后20天具有与哺乳动物相当的功能性血-脑-屏障。允许测试鱼在48孔平板(Millipore,Watford,UK)中游泳，每孔中一条鱼，并将其暴露于不同浓度的测试化合物中，所述测试化合物溶于它们游泳的水中。24小时后将鱼置于自动化生命跟踪系统中，所述系统包含SonyXCE150CE照相机(TracksysLtd.，Nottingham,UK)和Ethovision软件(Noldus，Wageningen，荷兰)。习惯化15分钟后，将鱼暴露于通过Ethovision软件同步的一系列听觉声调。置于48孔板上的听觉信号由与Dell计算机连接的包装在侧面的扬声器(BellPackard；置于48孔板侧面距离IOcm处)生产，并以1秒的间隔给出(称作试验间间隔，ITI)，所述听觉信号使用NM102NoiseMeter(NoiseMeterLtd.,BurtonFleming,UK)测量时长度为0.6秒，频率为200Hz和113分贝。听觉声调的汇合由多达50个声调组成，给予两个汇合时每次听觉刺激发作之间有15秒的恢复期。通过测量应答每个听觉刺激而移动的距离来分析每个个体鱼的ASR；这提供了惊吓应答的定量读数，并且被定义为1秒内鱼从听觉刺激开始时移动的距离。结果显示于表3中。^3.在两个独立的实验中，测试百里香提取物1对ASR的影响。对鱼的环境添加百里香提取物1证明在大浓度范围上影响它们的认知能力；*表示与暴露于载剂的年龄匹配的对照组相比显著的学习差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例5#会充-a禾口WM白如忠力云M勿·-ΦΙ··帛耳对勿白射乍ffl还在口施用百里香提取物后检查了啮齿动物中联合的学习和记忆行为，所述提取物通过离体LTP测定法鉴定并证明在斑马鱼模型中有效。为此，对小鼠进行联合的学习和记忆范例。将小鼠分别地置于反应箱中，所述反应箱的地板装有36V电网。当动物接受电击时，它们正常的反应是跳到绝缘的平台上以避免疼痛刺激。跳回网上的大部分动物会在接受电击后迅速跳回平台上。将动物培训5分钟，并记录每只小鼠被电击或者犯错的次数。所述数据组成学习数据。在24小时和48小时时进行再测试，这些试验发挥记忆测试的作用。记录每组中被电击的动物数量、从平台上跳下之前的时间，和最初3分钟内的错误数量。在结束训练后5天的清除周期后，测试记忆衰退。该研究包含6个测试组(每组η=12)。整个研究期间通过每日口强饲法(IOml/kg)施用百里香、银杏和载剂作为测试物质或载体。Ginkgobiloba(银杏)的处理剂量是100mg/kgBW;百里香提取物以3种剂量测试(40(低剂量)、120(中剂量)、360(高剂量)mg/kgBff)。测试前30分钟通过腹膜内注射施用咯利普兰(0.lmg/kg体重)。与用载剂处理的同窝动物(阴性动物)相比，用百里香处理的动物在训练和记忆期期间和清除周期之后显示显著更好的学习和记忆表现，并与Gingkobiloba或咯利普兰处理的小鼠(阳性对照)表现得同样好。图2展示了下台(st印-down)行为测试结果，所述结果被表述为错误数量。可以看到，用百里香提取物处理的小鼠比年龄匹配的对照表现得显著更好，并且与阳性对照化合物处理的小鼠相当。在任何时间在百里香处理组和银杏或咯利普兰处理组的表现之间没有观察到统计学差异。在图2中，“a”表示训练周期期间与载剂处理的年龄匹配的同窝动物的显著差异；“b”表示测试周期期间与载剂处理的年龄匹配的同窝动物的显著差异；且“C”表示清除周期期间与载剂处理的年龄匹配的同窝动物的显著差异。实施例6自云禾口记,十八卩忠力云M勿·-ΦΙ··帛耳对勿白射乍ffl我们测试了用Ginkgobiloba和百里香提取物处理的小鼠的认知表现，并在IntelliCage系统(NewBehaviorAG，Zurich，瑞士)中与它们与载剂处理的年龄匹配的对照比较，所述系统允许在居住笼中在扩展的时间段中自动监测动物行为。最初IntelliCage被证实在社会群体中认知和动机范例(Galsworthy等，2005，BehavBrainRes157:211-217;0nishchenko等，2007，ToxicolSci97:428-437)中用于测试实验动物，而没有由于分离和频繁测试的环境造成过度压力。另外，IntelliCage系统在与对照居住在一起的、具有不同程度海马损伤的动物之间迅速区分((Lipp等，2004，FENSannualmeeting))，表明IntelliCage适用于测试海马-依赖型行为。测试组和处理研究包括3个测试组(每组η=12-14；第1组=载剂处理的小鼠(对照)；第2组=GinkgobiIoba(GBE)；第3组=百里香提取物(百里香))。整个8周研究期间通过每日口强饲法(10ml/kg)对所有小鼠施用测试物质。GinkgobiIoba的处理剂量是100mg/kgBff,百里香提取物的处理剂量是350mg/kgBW。IntelliCagesIntelliCage是一种系统，其能够在居住笼样环境中自动化监测带有应答器的小鼠的本能和学习行为(NewBehaviorAG，Zurich，瑞士)。每个IntelliCage实际上是一个大的大鼠笼(37.5X55X20.5cm)，向其中放置包含四个记录(工作)室的金属框架。记录室安置在笼的角落，各自覆盖地板空间的15X15X21cm直角三角型区域。笼内天线允许自动化监测每只个体小鼠的角落访问；每个角落内的光束允许自动化记录个体的鼻子触碰(nosepoke)禾口藤水瓶口(licksofthewaterbottlespout)亍为。四个三角型小鼠掩蔽体所置于笼中心，在上面放置食物漏斗，使得能够随意取用食物。每个记录室含有(1)塑料环(内径30mm)，其发挥进入室内的入口作用并且覆盖记录角落访问的环状天线；(2)网格地板，小鼠一进入室内就坐在所述地板上；(3)两个环状开口(13mm直径)，其使得能够达到水瓶口；每个开口被记录鼻子触碰的光束穿过；(4)两个机动门，其允许(门开放)或阻止(门关闭)到达水瓶口；(5)两个水瓶；(6)管道，可以通过所述管道递送空气喷气作为令鼠不悦的刺激；(7)不同颜色的发光二极管，其可以被用于调节实验。实验阶段在4-5天的适应周期期间，小鼠可以自由到达所有角落、水和饲料，并可自由探索笼子。在接下来的模块(鼻子触碰适应，3天)中，小鼠必须学习应用鼻子触碰。在这一阶段中，所有的门最初是关闭的。因此，小鼠必须进行鼻子触碰从而打开门并达到水瓶口。收集到的数据包含与驯化阶段期间相同的参数；具体地，记录每只个体小鼠最不优选的角落(即最不常访问的角落)来程序设计下一模块。物体识别为了测试小鼠的内在探索活性，将两个相同的物体分别置于角落1和2中或角落3和4中。动物具有探索笼子的机会和到达水和饲料的自由。物体出现之前3小时和之后3小时记录访问。图3a描绘了物体识别测试的结果。对银杏组而言，观察到角落4访问时间的显著增加。对百里香提取物而言，在角落3中观察到访问时间的显著增加。图3a物体出现之前3小时和之后3小时每个角落的访问持续时间。实心圆圈表示物品的位置；对百里香提取物而言角落3中ρ=0.001JiGinkgobiloba而言角落4中P=O.004。位置学习(学习能力的度量)为了研究位置学习行为，在该模块中测试小鼠。将鼻子触碰适应阶段中测定的最不优选的角落称作每只个体小鼠的“正确”角落，只有该角落中鼻子触碰会引发机动门的开放并允许达到水瓶；所有其他角落中的鼻子触碰是“不正确”的，并且导致空气喷气形式的令鼠不悦的刺激(Is)。图3b展示了与对照和Ginkgobiloba(GBE)-处理的动物相比，百里香提取物处理组活性阶段的学习曲线。所有组随时间表现得更好，尽管对照组和处理组之间未能找到差异(p=0.44)。该数据显示所有的动物成功地学习了该任务。位置学习的逆转在这一模块中，“正确”的角落被命名给与先前测试模块中“正确”角落对角线相对的角落。再次对到达“不正确”角落的访问进行阴性强化(空气喷气)。如所预期的，这一模块开始时初始错误率高，但是所有组迅速学会所述任务。最初10小时期间组之间无差异。另外，测试周期结束时百里香提取物处理的组比其他两组均表现得显著更好。图3c位置学习的逆转在第一活性阶段记录错误。百里香提取物的错误率从100%下降至20%，对照组和GBE-处理组均下降至约60-70%，表明在这一行为测试中百里香处理的动物比银杏处理的小鼠表现得更好(最后两个时间段中P=0.011)。每个时间段对应2小时。实施例7制备软明胶胶囊制备包含以下成分的软明胶胶囊<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>可以向成年人每天施用两粒胶囊，持续3个月。观察到认知功能、警觉和专注于工作的能力改善。实施例8制备即食的调味软饮<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>将所有成分混合并筛过500um的筛网。将得到的粉末置于适宜的容器中，并在管状搅拌机中至少混合20分钟。为了制备饮品，向获得的125g混合的粉末中添加足量水，制备一升饮料。即饮型软饮每份(250ml)含有约30mg百里香提取物。作为增强剂(strengthener)或对一般健康而言，每天应当饮用2份(500ml)。实施例9麵禾口/舰诚轉馳_奸翻鋪以足够施用给狗每kg体重50mg百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物的每日剂量的量，用下述玉米油悬浮液对狗用商业基础膳食(例如MeraDog"Brocken",MERA-TiemahrungGmbH，Marienstra旦e80—84，D—47625Kevelaer—Wetten，德国)进对亍喷雾，所述玉米油悬浮液含有百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物，以及抗氧化剂例如维生素C(例如来自DSMNutritionalProductsLtd,Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXC-EC)及其衍生物，即抗坏血酸单磷酸钠(例如来自DSMNutritionalProductsLtd,Kaiseraugst，瑞士的STAY_C50)或L_抗坏血酸钠/钙的三磷酸酯、二磷酸酯和单磷酸酯的混合物(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXSTAY-C35)。将食物组合物干燥至含有按重量计约90%的干物质。对于每天消耗约200g干饲料的10kg体重的平均狗而言，狗食物含有每kg食物约2500mg百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物。对更重的狗而言，相应地制备饲料混合物。为了在狗中减少压力、恐惧和攻击性，可以在动物掩蔽所(animalshelterfarm)中有规律地给予所述食物。在看兽医之前或在兽医诊所停留或假期分离时，在应激事件之前至少一周、事件期间和之后一周给予所述食物。实施例10含百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物的湿润猫食物以足够施用给猫每kg体重100mg百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物每日剂量的量，将猫用商业基础膳食(例如HappyCat“Adult”，Tierfeinnahrung，SudlicheHauptstraβe38，D-86517Wehringen，德国)与下述玉米油悬浮液混合，所述玉米油悬浮液含有百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物，以及抗氧化剂例如维生素C(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXC-EC)及其衍生物，即抗坏血酸单磷酸钠(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的STAY-C50)或L-抗坏血酸钠/钙的三磷酸酯、二磷酸酯和单磷酸酯的混合物(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXSTAY-C35)。对于消耗约400g湿润食物的5kg体重的平均猫而言，猫食物含有每kg食物1250mg的百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物。将食物组合物干燥至含有按重量计约90%的干物质。为了在猫中减少压力、恐惧和攻击性，可以在动物掩蔽所中有规律地给予所述食物。在看兽医之前或在兽医诊所停留时，在应激事件之前至少一周、事件期间和之后一周给予所述食物。实施例11■禾口/舰碰择gimg■耳又__*以足够施用给调剂者每g零食5_50mg百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物的量，用下述玉米油悬浮液对商业狗零食(例如由MeraTiernahrungGmbH，Marienstrasse80-84,47625Kevelaer-Wetten，德国提供的狗用MeraDog“Biscuit”)进行喷雾，所述玉米油悬浮液含有百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物，以及抗氧化剂例如维生素C(例如来自DSMNutritionalProductsLtd,Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXC-EC)及其衍生物，即抗坏血酸单磷酸钠(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的STAY-C50)或L-抗坏血酸钠/钙的三磷酸酯、二磷酸酯和单磷酸酯的混合物(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXSTAY-C35)。将食物组合物干燥至含有按重量计约90%的干物质。为了减少恐惧和紧张，可以在一天中除食物之外给予零食，或者在不保证饲喂时(即旅行期间)每天至多5次给予零食。实施例12以足够施用给调剂者每g零食5-50mg百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物的量，用下述玉米油悬浮液对商业猫零食(例如由Whiskas，MasterfoodsGmbH,EitzerStr.215,27283Verden/Aller，德国提供的猫用WhiskasDentabits)进行喷雾，所述玉米油悬浮液含有百里香酚和/或对伞花烃或百里香提取物，以及抗氧化剂例如维生素C(例如来自DSMNutritionalProductsLtd,Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXC-EC)及其衍生物，即抗坏血酸单磷酸钠(例如来自DSMNutritionalProductsLtd,Kaiseraugst，瑞士的STAY-C50)或L-抗坏血酸钠/钙的三磷酸酯、二磷酸酯和单磷酸酯的混合物(例如来自DSMNutritionalProductsLtd，Kaiseraugst，瑞士的ROVIMIXSTAY-C35)。将食物组合物干燥至含有按重量计约90%的干物质。为了减少恐惧和紧张，可以在一天中除食物之外给予零食，或者在不保证饲喂时(即旅行期间)每天至多5次给予零食。权利要求在动物或人中改善认知功能和/或社会心理状态的方法，包括施用认知功能-改善或社会心理状态改善量的百里香酚和/或对伞花烃。2.根据权利要求1的方法，包括施用百里香酚。3.根据权利要求2的方法，其中所述百里香酚是植物提取物的组分。4.根据权利要求2的方法，其中所述植物提取物是百里香提取物。5.根据权利要求4的方法，其中所述百里香提取物中含有至少约25-80%的百里香酚。6.根据权利要求1的方法，包括施用对伞花烃。7.根据权利要求6的方法，其中所述对伞花烃是植物提取物的组分。8.根据权利要求7的方法，其中所述植物提取物是百里香提取物。9.根据权利要求8的方法，其中所述百里香提取物含有至少约5-55%的对伞花烃。10.根据权利要求1的方法，其中所述认知功能和/或社会心理状态选自由以下组成的组保持认知警觉和平衡、学习、语言处理、解决问题、智力功能、应付社会心理负担的能力、注意力和精神集中、记忆、记忆能力、精神警觉、精神警戒、精神疲劳、精神状态的稳定、减轻压力、超负荷工作的压力、压力相关的衰竭和/或熄灭，和促进放松。11.用于制造在动物或人中改善认知功能或社会心理状态的保健品或药物的组合物，所述组合物包含认知功能改进量或社会心理状态改进量的百里香酚和/或对伞花烃。12.根据权利要求11的组合物，其包含百里香酚。13.根据权利要求12的组合物，其中所述百里香酚是植物提取物的组分。14.根据权利要求13的组合物，其为百里香提取物。15.根据权利要求14的组合物，其中所述百里香提取物含有至少约25-80%的百里香酚。16.根据权利要求11的组合物，其中所述组合物包含对伞花烃。17.根据权利要求16的组合物，其中所述对伞花烃是植物提取物的组分。18.根据权利要求16的组合物，其为百里香提取物。19.根据权利要求18的组合物，其中所述百里香提取物含有至少约5-55%的对伞花烃。20.根据权利要求11的组合物，其中所述认知功能或社会心理状态选自由以下组成的组保持认知警觉和平衡、学习、语言处理、解决问题、智力功能、应付社会心理负担的能力、注意力和精神集中、记忆、记忆能力、精神警觉、精神警戒、精神疲劳、精神状态的稳定、减轻压力、超负荷工作的压力、压力相关的衰竭和/或熄灭，和促进放松。全文摘要本发明涉及含有百里香酚和/或对伞花烃的新颖的保健品组合物，或含有百里香酚或对伞花烃作为活性成分的植物提取物。所述组合物可用于改善认知功能和社会-心理状态，例如学习、记忆和警觉、精神稳定性和维护。文档编号A61K31/015GK101827588SQ200880112212公开日2010年9月8日申请日期2008年10月17日优先权日2007年10月18日发明者伯恩德·穆斯勒,克劳斯·吉尔伯特,哈桑·莫哈杰瑞,安·福勒,安尼斯·奥利维亚·麦尼-莫肯,瑞吉纳·格劳克泽克,艾德里安·维斯申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司