专利名称：一种富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的方法
技术领域：
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种仙鹤草素的纯化方法，特别是涉及一种
利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法。
背景技术：
仙鹤草蔷薇科(Rosaceae)龙牙草属(Agrimonia)植物的通称，尤指欧洲龙牙 草(A. eupatoria)。该种为耐寒多年生草本，原产于欧洲，其他温暖地区也有栽培。高 30-100cm，全株具白色长毛，根茎横走，圆柱形，秋末自先端生一圆锥形向上弯曲的白色科 芽。茎直立。单数羽状复叶互生，小叶大小不等，间隔排列，卵圆形至倒卵形，托叶卵形。总 状花序顶生或腋生，花小，黄色，萼茼外面有槽并有毛，顶端生一圈钩状剌毛，裂片5 ;花瓣 5;雄蕊10;心皮2。瘦果倒圆锥形，萼裂片宿存。花期7-8月，果期9-10月。全国各地均 产，分布于荒地、山坡、路弯、草地。以地上部分入药，称为仙鹤草，夏秋采收，其芽也入药。 全草含仙鹤草素、仙鹤草内酯、鞣质(为焦性儿茶酚鞣质、没食子鞣质等)、甾醇、有机酸、酚 性成分、皂甙等。根含鞣质8.9%，茎含鞣质6.5%，叶含鞣质16.4%。茎、叶还含木犀草 素-7-13 -葡萄糖甙和芹菜素-7-13 -葡萄糖甙。 仙鹤草素是一种对人类健康有显著保健作用的天然活性物质，已引起国际社会的 普遍关注。经科学研究及临床应用证明，仙鹤草素具有止血，强心，强壮，止痢及消炎作用。 主治脱力劳乏、妇女月经不调、红崩白带、胃寒腹痛、赤白痢疾、吐血、咯血、肠风、尿血、子宫 出血，十二指肠出血等症状。近年来，人们发现天然植物仙鹤草中含有大量的仙鹤草素，从 中提取仙鹤草素甲并且取得了可喜进展，由于其原料仙鹤草为中药，原料来源较广。名称为 "从仙鹤草提取仙鹤草素的方法"的专利申请中便公开了将仙鹤草经溶剂萃取法优化提取 仙鹤草素工艺流程。上述专利文献中的仙鹤草素提取工艺主要是经过溶剂萃取，吸附树脂 柱进行纯化等工艺步骤提取而成，其分离效果远远不如高速逆流色谱分离法的分离效果。
发明内容
本发明的目的在于克服常规技术提取率相对较低、提取纯度低等缺点，提供一种 利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法。为实现上述目的，本发 明采用的技术方案是 —种利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法。
其步骤如下 (1)用70%丙酮-水浸提仙鹤草，浸提液蒸去丙酮后，得初提物； (2)仙鹤草素的初步纯化将初提物用高速逆流色谱分离法进行初步分离，收集
含仙鹤草素的组分，蒸干溶剂； (3)仙鹤草得精制再将(2)所得组分用高速逆流色谱分离法制成高纯度98%以 上的仙鹤草素纯品 高速逆流色谱法对仙鹤草进行初步纯化，可选用的溶剂体系主要有三个。均以上
3相为固定相，下相为流动相。 一号溶剂体系由三个组分构成，A组分可选用乙酸乙酯、乙酸 丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯等脂肪脂类。B组分可选用正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇。 C组分为水，优选乙酸乙酯-正丁醇-水体系。A、B、C体积比为0.5-2 : 2-10 : 2-10. 二 号溶剂体系由四个组分构成，A组分可选用乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯 等脂肪脂类。B、 C组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂 肪醇或脂肪酮。D组分为水，优选乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水体系。A、B、C、D体积比为
0.5-5 : io-ioo : 0.5-5 : io-ioo.三号溶剂体系由两个组分构成，A组分可选用正丁醇、
异丁醇、叔丁醇等脂肪醇。B组分为水，优选正丁醇-水体系。A、B体积比为1-100 : 1-100.
高速逆流色谱分离法对仙鹤草素精制溶剂体系主要有三个。均以上相为固定相， 下相为流动相。一号溶剂体系由三个组分构成，A组分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤 代烃。B组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮。C组分为水，优选氯仿-甲 醇-水体系。A、 B、 C体积比为2-15 : 2-25 : 1-15. 二号溶剂体系由四个组分构成，A组 分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃。B、C组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙 酮、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇或脂肪酮。c组分为水，优选氯仿-异丙醇-甲醇-水 体系。A、B、C、D体积比为2-10 : 0.5-5 : 2-10 : 1-10.三号溶剂体系由五个组分构成， A、C组分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃。B、D组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、异 丙醇、丙酮、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇或脂肪酮。E组分为水，优选二氯甲烷-异丙 醇-氯仿-甲醇-水体系。A、B、C、D、E体积比为0. 5-2 : 0.5-2 : 1-10 : 2-10 : 1-10.
实验适用于室温为15-30。C下进行。 用本法制备的仙鹤草素纯度可达到98%以上。本法适用于以各种含仙鹤草素的天 然植物，天然植物的提取物为原料制备高纯度的仙鹤草素。适用于采用各种型号的逆流色 谱仪分离制备仙鹤草素，用高速逆流色谱法制备仙鹤草素可连续、高效、快速的液液分配色 谱分离，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点。
具体实施例方式 实施例1 : 采用乙酸乙酯_正丁醇_水和氯仿_甲醇_异丙醇_水两溶剂体系制备纯度高于 98%的仙鹤草素使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙 烯柱，柱的容积为240ml，8823A-UV紫外检测器Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先 用固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2. Oml/min的流速将流动相泵入柱内， 待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分。仙 鹤草素的制备分两步进行(l)将体积比为l : 2 : 3的乙酸乙酯-正丁醇-水混溶于分液 漏斗中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。 用l : l的上相和下相混合液20ml溶解取得的粗提取物100mg进行分离，收集含仙鹤草素
的组分，蒸干。(2)将体积比为5 : 6 : 0.5 : 4的氯仿-甲醇-异丙醇-水混溶于分液漏
斗中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用
1 : 1的上相和下相混合液2ml溶解(1)所得样品进行分离，收集含仙鹤草素的组分峰，冷 冻干燥。得白色仙鹤草素固体，经HPLC分析，其纯度达到98X以上。
实施例2:
采用乙酸乙酯_异丁醇_丙酮_水和氯仿_甲醇_水两溶剂体系制备纯度高于 98%的仙鹤草素使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙 烯柱，柱的容积为240ml，8823A-UV紫外检测器Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用 固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2. Oml/min的流速将流动相泵入柱内，待 整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分。仙鹤
草素的制备分两步进行(i)将体积比为5 : 40 : i : 60的乙酸乙酯-异丁醇-丙酮-水
混溶于分液漏斗中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相) 为流动相。用1 : 1的上相和下相混合液20ml溶解取得的粗提取物200mg进行分离，收集
含仙鹤草素的组分，蒸干。(2)将体积比为7 : 13 : 8的氯仿-甲醇-水混溶于分液漏斗
中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用
1 : 1的上相和下相混合液2ml溶解(1)所得样品进行分离，收集含仙鹤草素的组分峰，冷 冻干燥。得白色仙鹤草素固体，经HPLC分析，其纯度达到98. 23%以上。
实施例3: 采用正丁醇-水和二氯甲烷_异丙醇_氯仿_甲醇_水两溶剂体系制备纯度高于 98%的仙鹤草素使用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙 烯柱，柱的容积为240ml，8823A-UV紫外检测器Yokogawa 3057便携式记录仪。进样前，先用 固定相充满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2. Oml/min的流速将流动相泵入柱内，待 整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，然后根据检测器紫外图谱，接收目标成分。仙鹤 草素的制备分两步进行(l)将体积比为45 : 53的正丁醇-水混溶于分液漏斗中，摇匀后 静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用1 : 1的上 相和下相混合液20ml溶解取得的粗提取物150mg进行分离，收集含仙鹤草素的组分，蒸干。
(2)将体积比为i :i:4:7: 5的二氯甲烷-异丙醇-氯仿-甲醇-水混溶于分液漏
斗中，摇匀后静止分层。取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相。用
1 : 1的上相和下相混合液2ml溶解(1)所得样品进行分离，收集含仙鹤草素的组分峰，冷 冻干燥。得白色仙鹤草素固体，经HPLC分析，其纯度达到98.02X以上。
权利要求
一种利用高速逆流色谱法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的方法，其特征在于，其步骤如下(1)用70％丙酮-水浸提仙鹤草，浸提液蒸去丙酮后，得初提物；(2)仙鹤草素的初步纯化将初提物用高速逆流色谱分离法进行初步分离，收集含仙鹤草素的组分，蒸干溶剂；(3)仙鹤草得精制再将(2)所得组分用高速逆流色谱分离法制成高纯度的仙鹤草素纯品
2. 根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法其特质是用高速逆流色谱分离法对仙鹤草素进行初步纯化，可选的溶剂体系由三个体系构成，A组分可选用乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯等脂肪脂类。B组 分可选用正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇。C组分为水，优选乙酸乙酯_正丁醇_水体系。 A、B、C体积比为0. 5-2 : 2-10 : 2-10.
3. 根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的 制备方法其特质是用高速逆流色谱分离法对仙鹤草素进行初步纯化，可选的溶剂体系 由四个体系构成，A组分可选用乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯等脂肪脂 类。B、 C组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇 或脂肪酮。D组分为水，优选乙酸乙酯_正丁醇_甲醇_水体系。A、 B、 C、 D体积比为o.5-5 : io-ioo : o. 5-5 : io-ioo.
4. 根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法其特质是用高速逆流色谱分离法对仙鹤草素进行初步纯化，可选的溶剂体系由两个体系构成，A组分可选用正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇。B组分为水，优选正丁醇-水 体系。A、B体积比为1-100 : 1-100:
5. 根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法其特质是用高速逆流色谱分离法对仙鹤草素精制溶剂体系由三个组分构成，A组分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃。B组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等脂肪醇 或脂肪酮。C组分为水，优选氯仿-甲醇-水体系。A、B、C体积比为2-15 : 2-25 : 1-15.
6. 根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制 备方法其特质是用高速逆流色谱分离法对仙鹤草素精制溶剂体系由四个组分构成，A组 分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃。B、C组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙 酮、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇或脂肪酮。c组分为水，优选氯仿-异丙醇-甲醇-水 体系。A、B、C、D体积比为2-10 : 0.5-5 : 2-10 : 1-10.
7. 根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法其特质是用高速逆流色谱分离法对仙鹤草素精制溶剂体系由五个组分构成，A、 C组分可选用氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃。B、D组分可选用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、 丙酮、正丁醇、异丁醇、叔丁醇等脂肪醇或脂肪酮。E组分为水，优选二氯甲烷_异丙醇_氯 仿-甲醇-水体系。A、B、C、D、E体积比为0. 5-2 : 0.5—2 : 1—10 : 2-10 : 1-10。
全文摘要
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种仙鹤草素的纯化方法，特别是涉及一种利用高速逆流色谱分离法富集纯化仙鹤草中仙鹤草素的制备方法。其特点是采用高速逆流色谱分离法从天然植物仙鹤草浸提液经过两次纯化得到98％纯度的仙鹤草素。本法适用于以各种含仙鹤草素的天然植物，天然植物的提取物为原料制备高纯度的仙鹤草素。适用于采用各种型号的逆流色谱仪分离制备仙鹤草素，用高速逆流色谱法制备仙鹤草素可连续、高效、快速的液液分配色谱分离，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点。
文档编号A61P7/04GK101775028SQ20091021688
公开日2010年7月14日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者姚德利, 姚德坤, 姚航, 闫峰 申请人:大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司