专利名称：脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医疗检测试剂技术，尤其涉及一种用于MRI (磁共振成像)对比增强的 脑部肿瘤及神经退行性病变特异性对比剂及其制备方法。
背景技术：
核磁共振成像是近年来一种新型的高科技影像学检查方法，是80年代初才应用 于临床的医学影像诊断新技术。在临床MRI检测中大约30%以上的诊断需用磁共振成像对 比剂(MRI contrast agent)，以提高成像对比度，使原来缺乏对比差异的组织结构显示得 更加清晰，从而更好的显示体内组织器官的结构和病变的性质及功能状态，能够大大提高 诊断的准确性和早期性。对比剂根据所含磁性物质的种类分为顺磁性和超顺磁性对比剂， 顺磁性对比剂一般是钆的螯合物，超顺磁性对比剂一般是超顺磁性氧化铁对比剂。钆类对 比剂有效地提高了磁共振成像MRI的诊断水平，但Gd-DTPA有不少缺点如弛豫率较低、非生 物相容性、去螯合化后对细胞的毒性作用知之甚少、分布无特异性，入血后迅速进入细胞间 隙很快经肾脏排泄等往往不能使MR图像对比明显改善，同时也要求设备能够快速扫描其 价格也昂贵。超顺磁性对比剂较传统MR对比剂敏感性高，具有生物相容性，可以被细胞通 过正常的生化代谢途径再利用或进人体内铁循环，可顺利地通过光学及电子显微镜观察。 但是普通超顺磁性氧化铁对比剂主要被网状内皮系统所识别，被吞噬细胞摄取，沉积在网 状内皮细胞丰富的组织和器官中，主要用于肝脏、淋巴结等的MR增强。肿瘤组织因不含正 常的吞噬细胞而保持较高信号，所以反映的是肿瘤周围正常组织的信号变化，而不是特征 性的肿瘤部位的信号变化。而磁共振特异性对比剂是指利用病变细胞对靶向配体的特异性 吞噬作用，吞噬含有靶向配体的对比剂后，使对比剂特异性地聚集在病变部位，使病变部位 的T2值降低。正常组织细胞表面缺乏相应的受体，不能摄取特异性对比剂，正常组织部位 T2值不升高或升高不明显，从而增加了病变组织与正常组织的对比度，提高了磁共振诊断 的敏感性和特异性。目前特异性对比剂的研究，多集中在以单抗为靶向配体的对比剂。但原 料单抗的制备普遍存在着制备繁琐、周期长、价格高昂等缺点。同时利用单抗可能在人体中 发生免疫反应，产生抗-抗体从而限制重复使用。乳铁蛋白是一种多功能的蛋白质。已经 有文献报道乳铁蛋白能通过单向受体介导的转胞作用通过血脑屏障。有证据表明脑微血管 内皮细胞上有乳铁蛋白的结合位点，乳铁蛋白修饰的外源性基因在整个大脑均有表达。同 时，乳铁蛋白偶联的基因载体在脑部有较高的累积。
发明内容
本发明的目的在于利用乳铁蛋白和乳铁蛋白受体高亲和力的特性来实现靶向显 影，提供一种特异性、选择性、对比效果好、毒副作用低的脑部肿瘤及神经退行性病变特异 性磁共振对比剂及其制备方法。本发明提供的这种脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂，是偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒。该偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒是以乳铁蛋白为 特异性配体偶联超顺磁性氧化铁纳米粒得到的偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒。即 采用乳铁蛋白为靶向配体，偶联超顺磁性氧化铁纳米粒，得到偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧 化铁纳米粒对比剂。所述的超顺磁性氧化铁纳米粒是可以是超顺磁性三氧化二铁纳米粒、 超顺磁性四氧化三铁纳米粒、包裹超顺磁性三氧化二铁的纳米粒、包裹超顺磁性四氧化三 铁的纳米粒，其他超顺磁性氧化铁的纳米粒。上述的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂粒径分 布为10-20纳米。本发明还提供上述磁共振肿瘤特异性对比剂的制备方法，该制备方法包括以下步 骤(1)制备活化后的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液取超顺磁性氧化铁纳米粒，分 散于pH = 5. 0的lmol/L醋酸钠缓冲液中，加入EDC和NHS (终浓度分别为5mM和12. 5mM)， 振荡15分钟，用磁铁除去未反应的EDC和NHS，再加入pH = 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液重 新分散超顺磁性氧化铁纳米粒，获得活化后的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液；(2)制备乳铁蛋白溶液取乳铁蛋白溶解于pH = 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液中；(3)将步骤( 制备的乳铁蛋白溶液加入步骤(1)获得的活化后的超顺磁性氧化 铁纳米粒悬浮液中，反应比例为0. Img lmg，室温条件下过夜反应，获得反应后产物；(4)分离取出步骤(3)获得反应后产物，用磁铁去除未反应的乳铁蛋白，获得偶 联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的沉淀；(5)用pH = 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液清洗步骤⑷获得的偶联乳铁蛋白的超 顺磁性氧化铁纳米粒沉淀三次，用PH = 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液重新分散偶联乳铁蛋 白的超顺磁性氧化铁纳米粒，即得本发明偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂， 其浓度为10mg/mL。本发明偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的体外表征(1)偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的确定利用5. 聚丙烯酰胺凝胶 电泳确定乳铁蛋白成功偶联至超顺磁性氧化铁纳米粒，见
图1。(2)偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径分布利用透射电镜测定。偶 联乳铁蛋白前后超顺磁性氧化铁纳米粒的粒径分别为8纳米和13纳米，见图2。(3)偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的磁饱和曲线利用磁强振动计测 定。偶联乳铁蛋白前后超顺磁性氧化铁纳米粒的磁饱和强度分别为78emU/g和51emU/g，见 图3。(4)偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的弛豫率曲线将偶联乳铁蛋白的超 顺磁性氧化铁纳米粒用水稀释成不同浓度，加入96孔板中，利用Magnetom A Trio Tim 3.0 测定不同浓度的偶联超顺磁性氧化铁纳米粒的T2值，得到偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化 铁纳米粒的弛豫系数(r2)为90. 72mM-1S-10本发明的有益效果通过一下动物实验表明实验动物=Wistar大鼠，湖北预防医学科学院提供，体重在300_400g之间，雄性。设备西门子 Magnetom A Trio Tim 3.0肿瘤动物模型的制备在大鼠前因右偏3毫米，前偏1毫米的的位置将颅骨钻开， 利用立体定位仪将IX IO6个细胞注入该位置，约10天后瘤直径达到(5mmX5mm)用于动物成像实验。实验动物成像大鼠肿瘤模型8只，随机分为2组，一组为实验组，尾静脉注射经 PBS稀释的偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂，按12mg/mL;—组为对照组，尾 静脉注射相同剂量的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂，在2分钟内注射完毕，分别在2小时、 24小时、48小时扫描，观察肿瘤部位信号的变化。MR信号值测量方法尽量取相同层面瘤体最大径上的5个圆形兴趣区，面积为 2mm，测其ROI值，然后计算其平均值。数据处理采用SASSO版本统计软件，用随机区组设计资料的方差分析方法对数 据进行处理，之后用SNK-q检验进行两两间比较。结果发现，瘤体信号值在注射乳铁蛋白偶联的超顺磁性氧化铁纳米粒后，信号呈 明显改变，并随着观察时间的延长，试剂乳铁蛋白偶联的超顺磁性氧化铁纳米粒有向瘤体 四周扩散的趋势，最大改变为53. 55%，见图4。
权利要求
1.一种脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂，其特征在于，它是偶联乳铁 蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒。
2.根据权利要求1所述的脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂，其特征在 于，所述的偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒是以乳铁蛋白为特异性配体偶联超顺磁 性氧化铁纳米粒得到的偶联乳铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒。
3.根据权利要求1或2所述的脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂，其特 征在于，超顺磁性氧化铁纳米粒是超顺磁性三氧化二铁纳米粒、超顺磁性四氧化三铁纳米 粒、包裹超顺磁性三氧化二铁的纳米粒或包裹超顺磁性四氧化三铁的纳米粒。
4.根据权利要求1或2所述的脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂，其特 征在于所述的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂粒径分布为10-20纳米。
5.根据权利要求3所述的脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂，其特征在 于所述的超顺磁性氧化铁纳米粒对比剂粒径分布为10-20纳米。
6.一种如权利要求1所述的脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂的制备 方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤(1)制备活化后的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液取超顺磁性氧化铁纳米粒，分散于 PH = 5. 0的lmol/L醋酸钠缓冲液中，加入EDC和NHS (终浓度分别为5mM和12. 5mM)，振荡 15分钟，用磁铁除去未反应的EDC和NHS，再加入pH = 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液重新分 散超顺磁性氧化铁纳米粒，获得活化后的超顺磁性氧化铁纳米粒悬浮液；(2)制备乳铁蛋白溶液取乳铁蛋白溶解于pH= 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液中；(3)将步骤(2)制备的乳铁蛋白溶液加入步骤⑴获得的活化后的超顺磁性氧化铁纳 米粒悬浮液中，反应比例为0. Img lmg，室温条件下过夜反应，获得反应后产物；(4)分离取出步骤(3)获得反应后产物，用磁铁去除未反应的乳铁蛋白，获得偶联乳 铁蛋白的超顺磁性氧化铁纳米粒的沉淀；(5)用pH= 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液清洗步骤(4)获得的偶联乳铁蛋白的超顺磁 性氧化铁纳米粒沉淀三次，用PH = 7. 4的0. lmol/L PBS缓冲液重新分散偶联乳铁蛋白的 超顺磁性氧化铁纳米粒，即得本发明脑部肿瘤及神经退行性病变特异性磁共振对比剂。
全文摘要
本发明利用乳铁蛋白与表面表达乳铁蛋白受体的细胞的高亲和力来实现靶向性显影，提供了一种在磁共振成像中能特异性使肿瘤及神经退行性病变(包括AD、PD等)显像的对比剂及其制备方法。本发明磁共振特异性对比剂是采用EDC法将超顺磁性氧化铁纳米粒与乳铁蛋白偶联，粒径为20纳米以下，该偶联物具有粒径小、无毒性、特异性高、选择性好、对比效果强、组织浓度足够活体成像等特性。
文档编号A61K49/14GK102091336SQ20091027317
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者尹明媛, 徐海波, 徐辉碧, 朱艳红, 杨海, 杨祥良, 蒋玮丽, 谢辉, 赵彦兵 申请人:华中科技大学