专利名称：咖伦宾在制备用于治疗2型糖尿病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及咖伦宾的新的医疗用途，具体涉及咖伦宾在制备用于 治疗2型糖尿病药物中的应用。
背景技术：
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是临床常见的内分泌代谢性疾病，是继心脑血管 疾病和肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性疾病。目前在全球范围内糖尿病的发病率 呈上升趋势，其中又以2型糖尿病居多。糖尿病可引发心、脑、肾、血管等多器官并发症，致 死致残率极高，因此积极防治糖尿病有着十分重要的意义。目前用于治疗2型糖尿病的化学药物虽有较好疗效，但是副作用及其毒副反应也 较多，促使人们不断寻找更加安全有效的治疗药物。我国中医药学具有悠久的历史，早在公 元前400多年就有中草药治疗糖尿病的记载，近年来从中药中筛选治疗糖尿病的有效成分 受到广泛关注。
发明内容
本发明的任务是提供一种新的治疗2型糖尿病的药物，使其具有降糖作用良好、 能改善糖耐量、降低血脂、增加对胰岛素的敏感性等特点。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种治疗2型糖尿病的药物是咖伦宾。咖伦宾，英文名称Columbin，又称古伦宾，异名黄藤内酯。是由防己科植物金果榄 Tinospora capiltopies Gagnep的干燥块根中提取得到的呋喃二萜类化合物。在传统中 医中，金果榄具有清热解毒、利咽止痛的功效，用于治疗急性咽喉炎、扁桃体炎等。1896年 Hilger Albert首次由植物Apoth kit的古伦仆根中得到咖伦宾。上海药物研究所率先从 金果榄中提取纯化出咖伦宾的高纯度结晶，并进行了理化性质的测定和结构鉴定。本发明从金果榄药材中提取纯化得到咖伦宾，并对得到的产物进行了鉴定。金 果榄，英文名称Tinospora Root，拉丁名称Radix Tinosporae，为防己科植物青牛胆 Tinospora sagittata (Oliv. )Gagnep.或金果揽 Tinospora capiIlipesGagnep.的干燥块 根(参见《中国药典》2005年版一部，150页)。青牛胆分布在秦岭以南至南岭山脉，金果榄 主要分布在南岭山脉及南至中南半岛(参见《中国中药资源志要》，384页)。植物形态(云南省药物研究所发布)金果榄，又名圆角金果榄、圆叶金果榄。常绿 缠绕藤本。块根卵圆形、椭圆形、肾形或圆形，常数个相连，表皮土黄色。茎圆柱形，深绿色， 粗糙有纹，被毛。叶互生，叶柄长2 3. 5厘米，略被毛；叶片卵形至长卵形，长6 9厘米， 宽5 6厘米，先端锐尖，基部圆耳状箭形，全缘，上面绿色，无毛，下面淡绿色，被疏毛。花 近白色，单性，雌雄异株，成腋生圆锥花序，花序疏松略被毛，总花梗长6 9厘米，苞片短， 线形；雄花具花萼2轮，外轮3片披针形，内轮3片倒卵形，外侧均被毛；花瓣6，细小，与花 萼互生，先端截形，微凹，基部渐狭，雄蕊6，花药近方形，花丝分离，先端膨大；雌花萼片与 雄花相同，花瓣较小，匙形，退化雄蕊6，棒状，心皮3。核果球形，红色。花期3 5月。果期9 11月。生于疏林下或灌木丛中，有时亦生于山上岩石旁边的红壤地中。分布广东， 广西、贵州等地。青牛胆缠绕藤本。根深长，块根黄色，形状不一。小枝细长，粗糙有槽纹，节上被 短硬毛。叶互生，具柄；叶片卵状披针形，长7 13厘米，宽2. 5 5厘米，先端渐尖或钝， 基部通常尖锐箭形或戟状箭形，全缘；两面被短硬毛，脉上尤多。花单性，雌雄异株，总状花 序；雄花多数，萼片椭圆形，外轮3片细小；花瓣倒卵形，基部楔形，较萼片短；雄蕊6，分离， 直立或外曲，长于花瓣，花药卵圆形，退化雄蕊长圆形，比花瓣短；雌花4 10朵，小花梗较 长；心皮3或4枚，柱头裂片乳头状。核果红色，背部隆起，近顶端处有时具花柱的遗迹。花 期3 5月。果期8 10月。生于灌木林下石隙间。分布广西、湖南、湖北、四川、贵州等 地。广西地区尚有覆瓦叶金果榄，功效相同。金果榄性状呈不规则圆块状，长5 10cm，直径3 6cm。表面棕黄色或淡褐色， 粗糙不平，有深皱纹。质坚硬，不易击碎、破开，横断面淡黄白色，导管束略呈放射状排列，色 较深。气微，味苦(参见《中国药典》2005年版一部，150页)。本实验使用的药材金果榄购自湖北省恩施州咸丰县药材公司。咖伦宾(Columbin)是防己科植物金果榄Tinospora capiltopies feign印的干燥 块根中提取得到的呋喃二萜类化合物，上海药物研究所率先从金果榄中提取纯化出咖伦宾 的高纯度结晶，并进行了理化性质的测定和结构鉴定。咖伦宾的理化性质咖伦宾纯品为白色针晶，味苦，常温稳定。mp 1950C (甲 醇结晶)，旋光度为[α 1+52. 50 (吡啶)。分子式为C2tlH22O6,分子量为358. 38。不 溶于水，Ig咖伦宾可溶于30mL丙酮、50mL乙酸乙酪、75mL甲醉，易异构化为异 咖 伦 宾(参 见 Choudhury M. K, et al. Structural elucidation of coIumbin, aditerpene isolatedfrom the rhizomes of Artistolochia albida. Indian Journal ofPharmaceutical Sciences (1997),59(1),34-37.禾口 Swaminathan K, et al. Structure ofcolumbin, a diterpenoid furanolactone from Tinospora cordifolia Miers. ActaCrystallographica, Section C :Crystal Structure Communications (1989), C 45(2) ,300-3.)。咖伦宾已被确认为是一个具有呋喃环二萜类内酯的化合物，结构见
图1。咖伦宾具有呋喃环的共轭双键结构和两个羰基结构、一个C = C双键，紫外光谱中 共轭双烯在λ max 215 270 ( ε 2500 30000)有最大吸收，而含有α，β -不饱和羰基功 能团则在λ max220 250( ε 10000 17500)有最大吸收。咖伦宾的提取工艺文献使用的是热提法，用乙醚提取咖伦宾(参见朱任宏等.金 果榄中的植物及碱中性物质.化学学报1955，21 :168)，参照文献方法，本发明实验中增加 了用甲醇重结晶步骤。本发明具体按以下方法提取咖伦宾金果榄粉碎为金果榄粗粉^g(约100目)，用乙醚浸泡48h，乙醚提取液过滤后 37°C常压蒸馏浓缩得浸膏，浸膏加入甲醇中(约为粗品量的20 25倍)，水浴64°C加热溶 解完全，趁热抽滤，滤液置冰水浴中池，析出结晶，抽滤，少量甲醇洗涤，干燥，称重，然后测 定收率。合并提纯的提取物，称重为40. 6g，收率为40. 6g/5000g = 0.812%。产物的鉴定1、化学法将约Img按上述本发明提取方法制得的提纯品加入约IOmL水中，超声波震荡30min，不溶解；加入3滴0. IM的NaOH溶液，边加边震荡，溶解；加入3滴0. IM的 H2SO4溶液震荡，有沉淀析出。试验现象符合内酯结构的二萜的溶解特性(参见姚新生等， 《天然药物化学》第四版，243页)。熔点测定本实验用X4型显微熔点仪来测定熔点。显微镜下可见提纯品为针状结 晶，测定熔点为183 185°C (文献值m.p. 183 184°C )，与文献描述相符(参见李泓波 等.江西青牛胆的化学成分.天然药物研究与开发，2005，17 O) :125-127)。2、紫外光谱甲醇溶解提纯品QOO μ g.mL—1)，进行紫外扫描，结果显示紫外最 大吸收波长为218nm，与文献描述相符(参见^feng Zhang, et al. Characterization of isoquinoline alkaloids, diterpenoids and steroids in the Chineseherb Jin-Guo-Lan(Tinospora sagittata and Tinospora capillipes)byhigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization with mu11 i stagemas s spectrometry. Rapid Commu. Mass Spectrom. 2006 ；20 :2328-2342), B 2。图 2 为咖伦宾 提纯品的紫外吸光度-波长曲线图，扫描仪器为756PC紫外可见分光光度计(扫描型)；扫 描条件是最小波长200nm，最大波长600nm，扫描间隔Inm ；峰高下限0. 0100。最大吸收波长 为218nm，吸光度为1. 22M，符合咖伦宾紫外吸收特征以及文献的描述。3、色谱法用薄层色谱法检验提纯品，对照品(含量> 99% )由本室提供，展开剂 为氯仿甲醇-7 3，显色剂为5%的硫酸。结果显示，提纯品展开后仅有一个点，且和对照 品Rf值相同。HPLC方法使用岛津Siimadzu 10A高效液相色谱仪，紫外检测波长为217nm， 流动相为甲醇乙腈水-20 20 60，提纯品和对照品浓度为70 μ g.mL、分别对其进 行HPLC分析。结果显示，提纯品与对照品色谱行为一致，没有明显杂质峰。典型色谱图见 图3和图4。4、质谱法使用仪器为LCQ型液相色谱-质谱联用仪(离子阱检测器，美国 Finnigan公司产品)。流动相为甲醇水-90 10 (V/V)，流速为5 μ L. mirT1 ；提纯品溶 于甲醇，浓度为200 μ g.mL—1，进样量10 μ L。质谱条件离子源为电喷雾离子源(ESI)； 检测方式为正离子检测；碰撞气氦气；鞘气氮气，5单位，流速为0. 75L. mirT1 ；辅助 气氮气，流速为0. 15L. mirT1 ；离子源喷射电压4. 5kV ；毛细管温度300°C，电压19V ；扫 描质量范围100 800。ESI-MSm/z结果一级质谱图中准分子离子峰为359[M+H]+， 其他主要碎片峰为315 [M-CO2] +和376 [M+HNj + ；对准分子离子峰359 [M+H] +进行二级 质谱扫描，主要碎片离子峰为m/z 313，经比较均与文献一致(参见Yufeng Zhang, et al.Characterization of isoquinoline alkaloids, diterpenoids and steroids in the Chineseherb Jin-Guo-Lan(Tinospora sagittata and Tinospora capillipes) byhigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization with multistagemass spectrometry. Rapid Commu. Mass Spectrom. 2006 ;20 :2328-2342)。质谱 扫描图见图5，图6。含量测定使用岛津Siimadzu 10A紫外高效液相色谱仪，流动相为乙腈 水-40 60，检测波长为217nm。将对照品和本发明提纯品用甲醇溶解配制成2. 24 μ g. πιΓ1, 分别重复进样五次，计算各自平均峰面积。相对含量=SeZSi = 170932/180145 = 98.7% (SE, S1分别为本发明提纯品和对照品平均峰面积)，色谱图见图7和图8。从化学法看出本发明提纯物为含内酯环的二萜类化合物，熔点测定其熔点为183 185°C，紫外光谱显示最大吸收为218nm，色谱法显示提纯品与对照品的色谱行为一 致，质谱扫描ESI-MS m/z为359 [M+H]+、315 [M-CO2]+、376 [Μ+HNj+，以上结果均符合文献对咖 伦宾特征的描述。表明本发明提取方法得到的提纯物即为咖伦宾，其相对含量为98. 7%。咖伦宾对2型糖尿病大鼠的降糖作用实验资料本发明实验通过高糖高脂喂饲联合小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病大鼠 模型，观察咖伦宾对2型糖尿病大鼠的降糖作用。1.药物及配制咖伦宾按上述的本发明方法从金果榄粉末中提取制备得到，其相对含量 98. 7 %，用2 %吐温-蒸馏水配成5mg/ml、10mg/ml的混悬溶液使用。二甲双胍(深圳市中联制药有限公司产品)，用生理盐水配成40mg/ml的混悬液使用。2.动物造模及分组Sprague Dawley(SD)大鼠(n = 80)，雌雄各半，体重200士20g，购自华中科技大学 同济医学院实验动物中心。清洁级饲养，自由摄食、摄水，室温控制在20-29°C，12小时光照 周期。用高糖高脂饲料喂养3个月，联合小剂量链脲佐菌素(STZ，Sigma公司产品)30mg/ kg腹腔注射，建立实验性2型糖尿病大鼠模型(参见K. Srinivasan，B. Viswanad et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dosestreptozotocin-treated rat A model for type 2diabetes and pharmacological screening. Pharmacological Research, 2005, 52 :313-320)。以空腹血糖(FBG)彡11. lmmol/L为造模成功。将大鼠按血糖随机分为5组正常 对照组、模型对照组、咖伦宾低剂量组、咖伦宾高剂量组和阳性对照(二甲双胍)组，灌胃给 药，每天1次，连续给药4周。具体分组如下
分组给药
正常对照组蒸馏水(5ml/kg)
模型对照组蒸馏水(5ml/kg)
二甲双胍组二甲双胍200mg/kg 咖伦宾低剂量组 咖伦宾25mg/kg
咖伦宾高剂量组咖伦宾50mg/kg3.测定指标及方法(1) 一般指标各组动物每10天称量体重1次，每2周测空腹血糖1次。(2)葡萄糖耐量实验第4周末次给药前，大鼠禁食10h，不禁水。末次给药后池， 眼眶静脉丛采血测定血糖值(作为Oh血糖)。然后各组大鼠用50%葡萄糖液(2. 0g/kg) 灌胃，眼眶采血，分离血清，依照葡萄糖氧化酶(G0D-P0D)法测定0.5、1、池血糖水平。
(3)血脂测定空腹采血后按照试剂盒方法，分别检测血清中总胆固醇(TC)、甘油 三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)。(4)血清Ins检测及胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index, ISI)计算 大鼠第4周末次给药后2h,眼眶静脉丛采血，按照胰岛素放射免疫分析试剂盒方法，测定 血清中insulin含量及空腹血糖(FBG)，按文献方法求算ISI，即FBG与FINS (空腹胰岛素 值)乘积倒数的自然对数 ISI = [In 1/(FBG^FINS)](参见 S. Inchiostro. Measurement of insulin sensitivity in Type 2diabetes mellitus comparison between KITT and HOMA-% S indices and evaluation of theirrelationship with the components of the insulin resistance syndrome. DiabeticMedicine, 2004, 22 :39-44.)。(5)实验数据采用SPSS 11. 5统计软件进行统计学分析。4.结果(1)动物体重变化模型对照组、咖伦宾低剂量组、咖伦宾高剂量组、二甲双胍组 动物体重在给药期间均有下降趋势，但与正常对照组比较均无统计学差异，见表1。表1.给药期间各组大鼠体重的比较(gJ士s)
权利要求
1.咖伦宾在制备用于治疗2型糖尿病药物中的应用。
2.一种用于治疗2型糖尿病的药物制剂，其特征在于含有有效量的咖伦宾和药学上可 接受的载体。
3.根据权利要求2所述的用于治疗2型糖尿病的药物制剂，其特征在于它是片剂、胶囊 或注射剂。
全文摘要
本发明提供了一种新的治疗2型糖尿病的药物，该治疗2型糖尿病的药物是咖伦宾，本发明实验证实，咖伦宾具有良好的降糖作用，能改善糖耐量，降低血脂，增加对胰岛素的敏感性，可以作为药物用于2型糖尿病的治疗。
文档编号A61P3/10GK102091066SQ20091027317
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者文小平, 柯徐, 袁世英, 赵刚, 陈汇, 顾世芬 申请人:华中科技大学