专利名称：多孔状胶原蛋白基质制备方法
技术领域：
本发明是有关于一种自结缔组织制备多孔状胶原蛋白基质的方法。
背景技术：
胶原蛋白基质可用以制造特别是人造组织、人造器官及药剂输送载体。胶原蛋白 基质一般都是由胶原蛋白纤维重组而成，胶原蛋白纤维是由富含胶质的结缔组织萃取出 来。现有习知用以萃取出胶原蛋白纤维的方法需要严苛的物理或化学处理，例如研磨、均质 化或酸/碱降解，其都会损坏胶原蛋白纤维的网络结构。
发明内容
本发明是基于下列不可预期的发现以一种实质上不包含盐类的弱酸溶液处理结 缔组织时，可使结缔组织膨胀至极大的限度而不会破坏胶原蛋白的网络结构。因此，本发明一方面的特征为一种直接自结缔组织制备多孔状胶原蛋白基质的方 法。此方法包含(i)提供一结缔组织，其表面积为20平方毫米(mm2)至2平方米(m2)(例 如25平方毫米至900平方米)；(ii)以一酸液使该结缔组织的体积至少膨胀百分之五十 (例如为100%至500%)而形成一膨胀结缔组织；以及(iii)清洗该膨胀结缔组织以除去 非胶原蛋白物质借此形成一多孔状胶原蛋白基质。上述的结缔组织是源自真皮组织或筋 腱。上述用于膨胀的酸液的酸碱值(PH值)介于1至6(例如2至4)，且酸液实质上不包含 盐类，也就是说溶液中没有盐类成分，或者是盐类浓度非常低，使得溶液的离子强度不大于 0. 005M。在一些实施例中，上述的酸液可由甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、硼酸、磷 酸或其混合物来制备。较佳的是，上述酸液为0. 1-6M的醋酸溶液。在膨胀步骤之前，可用一溶剂润洗上述的结缔组织，所述溶剂包含一有机溶剂以 及选择性的包含水。当溶剂包含有机溶剂以及水时，溶剂与水的体积比为1 4至9 1。 在一些实施例中，有机溶剂包含，但不限于醇、酮、丙酮、乙腈、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、 二甲亚砜及其混合物。当结缔组织是源自表皮且含有毛发或毛根时，较佳的是以蛋白水 解酶预先处理含有毛发或毛根的表皮以移除毛发或毛根，蛋白水解酶可为，例如分散酶 (dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(ρ印sin)、胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)、凤梨蛋白酶(bromelain)、无花果蛋白酶(ficin)或其混合物。上述的膨胀步骤可借由将结缔组织浸泡于酸液而达成。可选择地，上述的浸泡步 骤是借由同时以一超音波处理结缔组织或同时将一液体喷射至结缔组织而达成。在上述的膨胀步骤之后，可清洗膨胀后的结缔组织以除去非胶原蛋白物质，借此 制备出一多孔状胶原蛋白基质。上述的清洗步骤可借由将该膨胀结缔组织浸泡于一清洗液 而达成，该清洗液可进一步包含一清洁剂、蛋白酶或其混合物。可选择地，上述浸泡步骤可 一起将一液体喷射至该膨胀结缔组织而达成或一起以一超音波处理该结缔组织而达成，或 结合二种物理力量而达成。一种由前述方法所制备的多孔状胶原蛋白基质也属于本发明的范畴内。
为了让本发明的上述和其他目的、特征、和优点能更明显，并视后附的申请专利范 围所界定者为准，下文特举本发明一些实施例并配合所附图示，作详细说明如下。
图1是根据实施例1所描述的方法制备的多孔状胶原蛋白基质的扫描式电子显微 图(放大倍率100倍)。图2是根据实施例1所描述的方法制备的多孔状胶原蛋白基质的扫描式电子显微 图(放大倍率400倍)。
具体实施例方式本发明提供一种方法，是直接自结缔组织制备多孔状胶原蛋白基质，其中胶原蛋 白为结缔组织中的主要蛋白质。胶原蛋白是一种三股螺旋(triple-helix)杆状分子，此分 子具有约300纳米(nm)的长度及约1. 5纳米(nm)的直径。大量的胶原蛋白分子形成胶原 蛋白纤维丝，而一束胶原蛋白纤维丝形成一胶原蛋白纤维。胶原蛋白分子之间以及胶原蛋 白分子内部存在着共价的交联，借此在结缔组织内形成了纤维状的网络。在本发明的方法中，起始材料即为结缔组织，可取自于动物，例如牛、猪、马、羊、 鸡、鸭、火鸡、鹅、鲸鱼或者鲨鱼等畜类或鱼类。适用于本发明方法的结缔组织包含，但不限 于，真皮组织、皮下组织、韧带、筋腱、腱膜、软骨、骨头组织。假如需要的话，先用人工(例 如借由粗略的切开(gross dissection))或机械清理结缔组织以除去不需要的材料，例如 脂肪及脂质。在一实施例中，真皮组织是取自新鲜的动物皮，将动物皮除去脂质、以盐水 (saline)清洗皮数次后，以一植皮刀(dermatome)除去动物皮的表面层即可获得真皮组 织。所得的真皮组织可用磷酸盐缓冲溶液进一步清洗。假如需要，结缔组织可以先用一适合的有机溶剂或者是一有机溶剂与水的混合液 进行处理，使有机溶剂可以渗透入结缔组织。有机溶剂包含，但不限于醇、酮、丙酮、乙腈、氯 仿、N，N- 二甲基甲酰胺、二甲亚砜或其混合物。当使用有机溶剂与水的混合液时，有机溶剂 与水的比例高于1 5(例如1 4、1 1或4 1)。当结缔组织含有毛发或毛根时，可先以蛋白水解酶处理以除去毛发或毛根，蛋 白酶可为，例如分散酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白 酶(P印sin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、凤梨蛋白酶(bromelain)、无花果蛋白酶 (ficin)或其混合物。接着，将上述任一结缔组织浸泡于适量酸液中，经过适当的时间后，使得结缔组织 膨胀到所需的标准，亦即比原厚度至少增加50%的厚度(较佳为原厚度的2-10倍)。上述 的酸液可以一有机酸来制备，有机酸可为，例如甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、硼 酸、磷酸或其混合物。在一实施例中，酸液可为浓度0. 1-6M(较佳为0. 1-2M或0. 5-1. 25M) 的醋酸。为了获得较佳的膨胀效果，本发明所使用的酸液实质上不包含盐类。在上述的膨胀步骤中，结缔组织是悬浮于以上所述的酸液中。假如需要的话，可利 用一或数道液体来处理结缔组织，促使酸液渗透入结缔组织并缩短膨胀结缔组织所需的时 间。上述的液体可以由一容器的喷嘴或喷孔来喷出，上述的酸液及结缔组织是置放于该容 器内。
或者，或此外，可将一超音波震动装置产生一超音波或借由一电磁场或一凸轮 (cam)所产生的高频率水波施加于浸泡于酸液中的结缔组织，以促使酸液渗透入结缔组织。使用一清洗液来清洗上述膨胀步骤所制备的膨胀结缔组织，以实质上除去上述膨 胀结缔组织中的非胶原蛋白物质，借此以制备一多孔状胶原蛋白基质。所述的清洗液可含 有清洁剂、螯合剂、蛋白酶或其混合物。用以制备清洗液的范例清洁剂包含，但不限于十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulphate, SDS)、Tego化合物(例如介面活性剂Tween-80、非离子清洁剂TffR(Triton W. R. 1339)、对-异辛烷基聚氧-乙烯苯酚聚合物(p-isooctylpolyoxy-ethylene phenol polymer)与四丁酚醛(Triton A20)表面活性剂)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、溴化十六烧基三甲基铵(cetyltrimethyl ammonium bromide)、二辛烧钠磺基 琥珀酸酯(dioctyl sodium sulphosuccinate)、品名为“Emasol 4130”的聚氧基乙烯山梨 糖醇油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monoleate)介面活性剂、品名为 “Lubrol W” 的 非离子介面活性剂、品名为“Nonidet P40”的非离子介面活性剂)。在一实施例中，使用一 含有SDS浓度0. 01 %至10%的清洗液，在4°C至45°C温度下处理所述膨胀结缔组织1小时 至150小时。 所述清洁液所含的螯合剂包含，但不限于乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA)、1，4，7，10-四氮杂环十 二烧基 _1，4，7，10，-四乙酸(1， 4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraaceticacid, D0TA)>1,4,7,10-四 氮杂环十 二烧基_1，4，7，10，-四亚甲基磷酸[1，4，7，10-tetraazacyclododecane-l， 4, 7,10-tetrakis (methylene phosphonicacid)，D0TP]、环己二胺四醋酸(trans-1， 2-diaminocyclohexantetra-aceticacid, CDTA)、4,5_ 二 轻基苯-1,3- 二石黄酸(4,
5-dihydroxybenzene-l,3-disulphonicacid, Tiron)> 硫月尿(thiourea)>8- ψ 基
啉-5-石黄酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonicacid)、3,6- 二石黄基-1,8- 二轻基萘(3,
6-disulpho-l,8-dihydroxy-naphthalene)>Eriochromeschwarz T[l_(l_ 15 ~2~ 蔡基f禹 M ) -2- 15 -5-石肖基 _4_ 蔡石黄酸]{Eriochromeschwarz T [1- (l-hydroxy-2-naphthylazo )-2-hydroxy-5-nitro-4-naphthalene sulphoriicacid]、红紫酸I安(ammonium purpurate) 等。较佳的螯合剂为0. OlmM至IOOmM的EDTA。或者，或此外，清洗液可包含一或多种蛋白水解酶，例如无花果蛋白酶(ficin)、胃 蛋白酶(ρ印sin)、胰蛋白酶(trypsin)、分散酶(dispase)、溶血素(hermolysin)或其混合 物，以除去连接于细胞外基质的蛋白质、其它非胶原蛋白的蛋白质与胶原蛋白分子的末端 肽(telopeptide)。在此技术领域中，有限度的酵素切割(亦即使非胶原蛋白的蛋白质降解 但仍保持胶原蛋白纤维的完整性)的条件是众所皆知的。在清洗步骤中，可将所述膨胀的结缔组织浸泡于前面所提到酸液之中的任一种一 段适当的时间。在一实施例中，将一或多道液体自一喷嘴或喷孔喷射至所述的结缔组织，以 促进非胶原蛋白物质的移除。所述液体可为水、包含清洁剂的溶液或包含酵素的溶液。在 另一实施例中，使用超音波处理浸泡于清洗液中的膨胀结缔组织，可改善清洗效率。可将已经进行过上述清洗步骤的多孔状胶原蛋白基质冷冻并控制冷冻速率以使 基质含有所需的冰晶尺寸。然后可用冷冻干燥法进行保存。或者，多孔状胶原蛋白基质可 浸泡于一磷酸盐缓冲溶液中并储存于4°C的温度环境。当有需要时，可借由一般的化学或物理方法使上述的多孔状胶原蛋白基质交联化。用于使上述多孔状胶原蛋白基质交联化 的交联剂包含戊二醛(glutaraldehyde)、甲醛(formaldehyde)、碳二酰胺(carbodiimide) 或其它聚环氧树脂化合物(poly印oxy compound)，例如乙二醇二缩水甘油醚(glycol diglycidyl ether)、聚醚多缩水甘油醚(polyol polyglycidylether)、二羧酸二缩水甘油 酉旨(dicarboxylic acid diglycidyl ester)。前述用以制备多孔状胶原蛋白基质的方法在至少两个方面上不同于现有习知的 方法。第一，本发明的方法不需要严苛的物理或化学处理法(例如研磨、均质化或酸/碱降 解)，这些方法都会破坏结缔组织中胶原蛋白纤维的网络结构。第二，用以膨胀结缔组织的 酸液实质上不包含盐类，而一般现有习知方法是利用盐类来稳定胶原蛋白纤维。在此也揭露一种多孔状胶原蛋白基质，其是以前述任一种制备方法所制备。所述 的多孔状胶原蛋白基质可以用来制造人造组织、人造器官、植入物，以及药剂输送载体系 统，或者作为细胞生长的支架。相信在此技术领域中的熟悉技艺者基于前述的描述，都可将 本发明充分的利用而不需进一步的详细描述。因此，下文所举实施例仅仅只是作为范例，并 非用以在任何方面限制本发明。在此引用的所有文献并入本案以作为参照。实施例1 由猪皮制备多孔状胶原蛋白基质自猪身上取得皮肤组织，除去脂质后，以盐水(saline)清洗皮数次，以植皮刀 (dermatome)除去皮的表皮层以获得一厚度为0. 3毫米(mm)的真皮组织。进一步以磷酸盐 缓冲溶液清洗所述的真皮组织。在清洗过后，将所有缓冲溶液残余物自真皮组织的表面完 全的除去。将真皮组织置入一装有浓度0. 5M醋酸溶液的容器内，并在37°C定温放置不同的 时间来膨胀真皮组织。在定温放置期间，容器是放置于一震动器上，以使真皮组织悬浮。经 由不同时间膨胀后真皮组织的厚度列于下表一表一经过不同时间的醋酸处理后膨胀真皮组织的厚度
权利要求
1.一种自结缔组织制备多孔状胶原蛋白基质的方法，其特征在于该方法包含提供一结缔组织，其表面积为20平方毫米至2平方米；以一酸液使该结缔组织的体积至少膨胀百分之五十而形成一膨胀结缔组织，其中该酸 液的酸碱值(PH值)介于1至6且该酸液实质上不包含盐类；以及清洗该膨胀结缔组织以除去非胶原蛋白物质，借此形成一多孔状胶原蛋白基质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该结缔组织的尺寸为25平方毫米至 900平方厘米。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该弱酸液包含由甲酸、羧酸、草酸、醋 酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、硼酸、磷酸及其混合物所组成的群组中选择的一种酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中该酸液的酸碱值(pH值)介于2至4。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中该酸液包含浓度0.1-6M的醋酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中在该膨胀步骤中，该结缔组织膨胀后 体积为 100% -500% O
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该膨胀步骤包含将该结缔组织浸泡于 该酸液，且同时将一液体喷射至该结缔组织。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该清洗步骤包含将该膨胀结缔组织浸 泡于一清洗液，该清洗液包含一清洁剂、一蛋白酶或其混合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于其中该清洗步骤包含将该膨胀结缔组织浸 泡于该清洗液中，且同时将一液体喷射至该膨胀结缔组织中。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该膨胀步骤包含将该结缔组织浸泡 于该酸液中，且同时以超音波处理该结缔组织。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于其中该清洗步骤包含将该膨胀结缔组织 浸泡于该清洗液中，且同时以超音波处理该结缔组织。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于更包含在膨胀步骤之前，以一溶剂处理 该结缔组织，该溶剂包含一有机溶剂以及可选择性的包含水，其中该有机溶剂是选自由醇、 酮、丙酮、乙腈、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜及其混合物所组成的群组。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于其中该溶剂包含有机溶剂以及水且有机 溶剂与水之间的体积比为1 4至9 1。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该结缔组织包含多根毛发或毛根， 且该方法更包含，在该膨胀步骤之前，以微碱溶液或蛋白水解酶处理该结缔组织以松弛 (loosen)该些毛发或毛根。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于其中该蛋白水解酶是选自分散酶 (dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(ρ印sin)、胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)、凤梨蛋白酶(bromelain)、无花果蛋白酶(ficin)及其混合物所组成的群 组。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该结缔组织是源自于真皮组织或筋腱。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于更包含在该清洗步骤之后，干燥该多孔状 胶原蛋白基质。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中该清洗步骤包含以一第一清洗液以 及一第二清洗液处理该膨胀结缔组织，该第一清洗液包含一清洁剂、一螯合剂或其混合物， 而该第二清洗液包含一蛋白酶。
19.一种多孔状胶原蛋白基质，其特征在于是根据权利要求1所述的方法制备。
20.一种多孔状胶原蛋白基质，其特征在于是根据权利要求4所述的方法制备。
全文摘要
一种使用实质上不包含盐类的酸液，直接由结缔组织制备多孔状胶原蛋白基质的方法。
文档编号A61L27/50GK102099063SQ200980101281
公开日2011年6月15日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者黄玲惠 申请人:惠合再生医学生技股份有限公司, 成功大学