专利名称：一种治疗疾病的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及自身免疫性疾病的治疗。本发明涉及可以以低于此前已知的剂量施 用于患者的诸如人源化单克隆抗体等高效试剂。本发明对具有有效治疗需要低剂量的疾 病或病症(characteristics)的患者尤其有效。本发明设想到包含有效浓度的所述抗体的药 物组合物及其应用，以及采用包含所述抗体的组合物和药物的治疗方法。
自身免疫是指生物体不能将其自身构成部分(低至亚分子水平)识别为“自 己”，这导致针对其自身细胞和组织的免疫反应。任何由这种异常免疫应答造成的疾 病都称为自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括多发性硬化症(MS)、类风湿关节炎 (RA)、银屑病、银屑病性关节炎、溃疡性肠炎、克罗恩病、重症肌无力(MG)、II型自 身免疫性多腺体综合征(APS-II)、桥本甲状腺炎(HT)、I型糖尿病(TlD)、系统性红斑 狼疮(SLE)和自身免疫性淋巴增生综合征(ALS)。
自身免疫性疾病在T细胞识别“自身”分子(即，由宿主的细胞产生的分子) 并对“自身”分子产生反应的时候发生。由抗原呈递细胞(APC)加工的自体抗原的呈 递对“自体反应性” T细胞的激活导致它们的克隆扩增并迁移到特定组织，在这样的组 织中它们弓I发发炎和组织破坏。
一般而言，自体组织对T细胞具有耐受性，并且T细胞只对异源结构的呈递产生 反应。中央耐受和外周耐受包括两种机制，免疫系统通过所述机制阻止自体反应性T细 胞诱导它们的有害功能。中央耐受通过负选择介导。该过程在胸腺中在个体生成发育过 程中负责通过自身反应性T细胞的克隆删除来进行消除。
外周耐受是如果中央耐受失败并且自体反应性细胞逃避胸腺时可以采用的备用 方式。这种耐受机制在整个生命过程中持续发生，通过免疫忽视(免疫无能)、外周删除 和主动抑制对自体反应性细胞进行检查。
作为主动抑制的一部分的调节性T细胞(调节性T细胞，此前也称为“抑制细 胞”)保持外周耐受并调节自身免疫(Suri-Payer等，J Immunol. 157 1799-1805(1996)； Asano 等，J Exp.Med.184 387-396 (1996) ； Bonomo 等，J.Immunol. 154 6602-6611 (1995) ； Willerford 等，Immunity 3 521-530(1995) ； Takahashi 等，hit. ImmunoLlO 1969-1980(1998) ； Salomon 等，Immunity 12 431-440(2000) ； Read 等，J Exp.Med.192 295-302 (2000)) 通常，调节性T细胞抑制1型T辅助细胞(THl)和 TH2效应细胞的活化和/或功能。调节性T细胞频率或功能的调节异常能够导致自身 免疫性疾病减弱(Baecher-Allan 等，ImmunoLReview 212 203-216(2006) ； Shevach, Annu.Rev.Immunol.18 423-449(2000) ； Salomon 等，Immunity 12 431-440(2000)； Sakaguchi 等，Immunol.Rev.182 18-32(2001))。
已经有若干个调节性T细胞亚组得到表征。调节性T细胞家族由2个主要亚组组 成天然产生的例如CD4+CD25+调节性T细胞，和外周诱导的和 3调节性T细胞。 而且，NK调节性T细胞和CD8+调节性T细胞在人类和啮齿类动物中已有描述(Fehervari 等，J.Clin.Investigationll4 1209-1217(2004))。
胸腺来源的调节性T细胞(天然产生的CD4tD25+调节性T细胞)是所涉及的 主要调节性细胞，其利用被靶向自身抗原识别以维持外周免疫内平衡并调节自身免疫和 病原性免疫应答的的一系列TCR。
天然产生的CD4+CD25+调节性T细胞的主要特征是
i)它们是CD4+T细胞并占外周CD4+T细胞的5%至10%
ii)它们在胸腺中成熟
iii)它们一般具有如下特征IL-2受体(CD25)的联合表达、CD45分子的低分 子同工型、CD152(CTLA_4)、和转录因子FoxP3。
能够最好地示例调节性T细胞的作用的实验是CD4+细胞的缺乏CD25+细 胞的免疫缺陷裸小鼠的重构。CD4tD25_重构裸小鼠发生各种器官特异性自身免疫 性疾病(如胃炎、卵巢炎、睾丸炎和甲状腺炎)Muri-Payeret al. ； J.Immunol. 160 1212-1218(1998))。
将CD4+CD25+亚组包含在裸小鼠中可防止这些疾病的发作Makaguchi等，J Immunol. 155 1151-1164(1995))。在若干种其他由出生后3天进行新生胸腺摘除术 (d3Tx)造成的自身免疫性模型(如自身免疫性胃炎、前列腺炎、卵巢炎、肾小球肾炎、 附睾炎和甲状腺炎)或通过CD45RBhigh，CD4+CD25T细胞的SCID小鼠重构造成的炎性 肠病中也证明了抗器官特异性自身免疫的CD4tD25+细胞的保护价值。在小鼠中体内施 用抗CD25抗体还诱导器官局部性自身免疫性疾病。
转录调节因子FoxP3在小鼠CD4+CD25+调节性T细胞功能中的重要性的发现 和患有IPEX综合征(免疫调节异常、多发内分泌病、肠下垂和X连锁遗传病)(类似于 CD4tD25+调节性细胞缺陷小鼠中见到的严重炎性疾病)的患者在FoxP3中具有突变的观 察结果提供了在自身免疫动物模型(小鼠调节性T细胞)和人类自身免疫性疾病之间的直 接关系 Makaguchi 等，J Immunol. 155 1151-1164(1995))。
调节性T细胞的药学机制尚不完全清楚。CD4tD25+调节性T细胞抑制多克隆 和抗原特异性T细胞活化。抑制由细胞接触依赖性机制所介导，其要求通过TCR活化 CD4+CD25+调节性T细胞，但是调节性T细胞在TCR活化或促有丝分裂抗体刺激时没有 显示出增殖性应答(无反应性)Mhevach，Nature Rev.Immunol 2 389 (2002))。一旦受 到刺激，它们能够以不依赖抗原的方式抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的应答，并抑制B 细胞活化和克隆扩增。
有另外的数据表明CD4+CD25+调节性T细胞的抑制子活性还部分地依赖于抗炎 性细胞因子如 TGF-β (Kingsley 等，J Immunol.168 108(^2002) ； Nakamura 等，JExp.Med. 194 629-644(2001)) 0 TGF-β分泌的功能重要性得到如下发现的进一步支持 TGF-β缺陷小鼠出现自身免疫性疾病并且在一些模型中施用抗TGF-β的中和抗体体内 消除了对CD4+T细胞的自身免疫性或耐受性诱导活性的预防作用。
在CD4+T细胞亚组中，可能存在至少两种类型更加不同的在接触特异性外源性 抗原后受被诱导的具有抑制功能的细胞(称为“称为适应性或诱导型调节性T细胞”)1型调节性T细胞CTrl)和Th3细胞。根据其细胞因子生成曲线，这些细胞类型似乎与 CD4tD25+调节性T细胞不同。然而，这些不同细胞类型之间的关系还不清楚并且作用 模式重叠。
Trl细胞在IL-10存在的情况下受到TCR的反复刺激所诱导，并显示出通过生 成高水平的IL-10和适量的TGF-β来主要下调免疫应答(Chen等，J.Immunol.171 733-744(2003))ο
ι3细胞(在口服抗原后在EAE模型中鉴定到)生成高水平的TGF-β和不同量 的IL-4和IL-10。IL-4被证明是Th3细胞分化的关键因子(和细胞相反)(Chen等， Science 265 1237-1240(1994))。
通过使用免疫抑制性药物抑制T细胞的功能是已经成功用来治疗自身免疫性疾 病的基本治疗策略。然而，这些药物由于它们选择性差，诱导了普遍的免疫抑制，从而 不仅抑制免疫系统的有害功能，还抑制了免疫系统的有用功能。结果，可能出现若干种 风险如感染、肿瘤和药物毒性。
对于各种自身免疫性疾病，干扰T细胞功能的试剂是治疗的主要部分。
使用旨在活化调节性T细胞的用于自身免疫性疾病治疗的方法如今已经被证 明极具难度。使用竞争性Agonistic)抗CD3抗体OKT-3通过TCR活化调节性T细胞 (Abramowicz 等，N EnglJ Med. 1992 Sep 3 ； 327(10) 736)或者使用超竞争性抗 CD^ 抗 体TGN 1412通过共刺激分子CD^活化调节性T细胞将导致调节性T细胞群以及其他常 规T细胞的完全缺失和过量促炎细胞因子(包括IFN-Y、TNF-a、IL_I和IL_2)的全身 诱导和释放，从而在人中导致临床上明显的细胞因子释放综合征(CRS) (Suntharalingam 等，N EnglJ Med.2006 Sep 7 ； 355(10) 1018-28)。
在前2至3次注射5mg单克隆抗体OKT3后，大多数患者出现细胞因子释放综合 征，在1至2小时内在肾移植接受者的循环中出现高水平的肿瘤坏死因子α、白介素2、 Y -干扰素(Abramowicz 等，Transplantation. 1989 Apr ； 47 (4) 606-8)。这种导致治疗 窗狭窄，限制了这种抗体在自身免疫性疾病治疗中的用途。
用5mg至IOmg总剂量的TGN1412 (O.lmg抗CD28/kg体重)进行治疗导 致系统性炎性应答，在接受单静脉内剂量的TGN 1412后90分钟内出现多器官衰竭 (Suntharalingam 等，N Engl.J Med.2006 年 9 月 7 日；355(10) 1018-28)。
公认的是，CD4+T细胞在引发和保持自身免疫方面起着重要作用。因此，曾提 出使用抗CD4 T细胞表面分子的单克隆抗体(mAb)尤其是抗CD4单克隆抗体作为免疫抑 制试剂。尽管很多临床研究证实了这种方法的潜在益处，但是它们也举出了若干种有待 解决的问题以使抗CD4单克隆抗体更加适合于用在常规的临床实践中。
已经提出的CD4单克隆抗体的数种不同作用机制包括(1)CD4-MHCII相互 作用的拮抗导致T细胞活化的抑制，(2)由CD4的细胞表面表达下降决定的CD4受体调 控，( 在没有T细胞受体交联(可以抑制随后的T细胞活化并触发CD4 T细胞凋亡性死 亡)的情况下通过CD4受体的部分信号转导，(4)Fc介导的补体依赖性细胞毒性(CDC) 或抗体依赖性的细胞性细胞毒性(ADCC)导致CD4T细胞消耗，和(5)调节性T细胞的 刺激。
已经有若干种靶向T细胞的抗CD4抗体处在临床开发中Mchulze-Koops等， J Rheumatol.25 (11) 2065-76(1998) ； Mason 等，J Rheumatol.29 (2) 220-9 (2002)； Choy 等，Rheumatology 39(10) 1139-46(2000) ； Herzyk 等，hifect Immun.69 (2) 1032-43(2001) ； Kon 等，Eur Respir J. 18 (1) 45-52(2001) ； Mourad 等，Transplantation65(5) 632-41(1998) ； Skov 等，ArchDermatol. 139 (11) 1433-9(2003) ； Jabado 等，J Immunol. 158(1) 94-103(1997))，主要针对的是CD4细胞消减，只有少数CD4抗体归 属于其他机制，如 TRX-1、TNX-355、IDEC-15U 0KTcdr4A。
自身免疫性疾病中的临床应答与常规CD4+T细胞直接在炎症部位的CD4阻断 (而不是外周血中CD4+T细胞的作用)有关。因此，必须使用单循环或多循环的高达 IOOOmg,优选使用单循环或多循环的高达IOmg至450mg范围内的高抗体浓度的剂量来 获得临床益处(Schulze-Koops 等，J Rheumatol.25 (11) 2065-76 (1998) ； Mason 等， JRheumatol.29 (2) 220-9(2002) ； Choy 等，Rheumatology 39 (10) 1139-46(2000)； Choy 等，Rheumatology 41 1142-1148 (2002) ； Kon 等，Eur Respir J. 18 (1) 45-52(2001) ； Skov 等，Arch Dermatol.139 (11) 1433-9(2003) ； Kuritzkes 等，JInfect Dis 2004，189 286-91(2004) ； Hepburn 等，Rheumatology 42 (1) 54-61(2003))。
在不同的自身免疫性疾病中检测到B-F5抗体(鼠^Gl抗人CD4)。
对少数患有严重银屑病的患者使用鼠B-F5抗体进行了治疗并且描述了一些积极 效果(Robinet 等，Eur J Dermatol 1996 6 141-6，和 Robinet 等，JAmAcadDermatol 1997 ； 36 582-8)。
在类风湿关节炎患者中，使用B-F5的日剂量进行的安慰剂对照试验中所观察到 的结果没有显示出重大改善(Wendling 等.JRheumatol ； 25(8) 1457-61，1998)。
在多发性硬化症(MS)患者中，在复发-缓解型患者中治疗10天后观察到一 些阳性效果，所述患者中的其中一些患者在治疗后第6个月仍未复发(Racadot等，J Autoimmun, 6(6) 771-86，1993)。Rumbach 观察到类似的效果(Mult Scler ； 1(4) 207-12， 1996)。
在严重克罗恩病中，连续7天接受B-F5的患者中没有观察到显著的改善 (Canva-Delcambre 等，Aliment Pharmacol Ther 10 (5) 721-7，1996)。
据报道，在同种异体移植物排斥的防止中，B-F5的生物利用度不足以使其用 于同种异体移植物排斥的预防中(Dantal等，Transplantation，27; 62(10) 1502-6， 1996)。
在人类中使用单克隆抗体治疗的另一个缺点是这些抗体一般获自小鼠细胞，并 在人类接受者中引起抗小鼠应答。这不仅导致治疗功效低，甚至以后需要小鼠单克隆抗 体进行更多的治疗，而且还造成过敏反应风险增加。
从原理上来看，这种缺点可以通过使用人源化抗体来避免，所述人源化抗体通 过将小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR，其决定抗原结合的特异性)移植到人类免疫球 蛋白分子的框架区(FR)上来获得。人源化的目的是获得具有与CDR序列所来源的小鼠 的单克隆抗体相同的抗原结合性能并且在人类中很少产生免疫原性的重组抗体。
在一些情况中，用小鼠抗体中的CDR替代人类框架中的人CDR足以转移抗原结 合性(不仅包括特异性，还包括对抗原的亲和力)。然而，在很多抗体中，一些FR残基 对抗原结合比较重要，这是因为它们在抗原抗体复合物中直接接触抗原，或者它们影响 CDR的构型，进而影响其抗原结合性。
因此，在很多情况中，还需要用小鼠抗体中的一个或若干个框架残基替代人类 相应的FR残基。由于取代残基的数目必须尽可能小以防止抗小鼠反应，所以问题是确定哪些氨基酸残基对保持抗原结合性是关键的。已经提出过用于预测更适合的取代位点的 各种方法。虽然它们提供了可以在人源化的前些步骤中有一些帮助的一般原则，但是最 终结果却因抗体而异。因此，对于给定的抗体，非常难以预言哪些取代将提供所需的结合。
此前曾经尝试过小鼠B-F5的人源化，并在生成具有与亲本小鼠B-F5类似的 CD4结合性能的人源化B-F5 (后文称为hB_F5)中获得了成功。
因此，在WO 2004/083247中，已经发现人源化抗体BT061 (人源化B_F5或简称 为hB_F5)可用于治疗类风湿关节炎。该专利申请公开了用于肠胃外施用O.lmg至10mg， 优选为Img至5mg的组合物。所设想的剂量方案是对于类风湿关节炎患者，在10天 的周期内，静脉内Img/天，并且隔日剂量为5mg。
Wijdenes等在EULAR会议(2005年6月)的摘要和海报上也描述了所述研究。 他们描述了患有类风湿关节炎的11名患者的治疗，所述患者用每隔一天5mg的BT061进 行5次静脉输注，并结合150mg的双氯芬酸的治疗(Wijdenes等，Abstract and poster, EULAR conference, June 2005)。
该研究中所述的抗体没有公开为适合于较低剂量施用，并且仍然希望找到以较 低剂量进行的治疗，从而治疗更多的患者。发明内容
鉴于以上现有技术，本发明的目的是治疗患有自身免疫性疾病的对现有治疗没 有满意应答的患者。特别地，本发明的一个目的是找到可以以较低剂量施用于患者的自 身免疫治疗，以针对不能耐受目前剂量的患者来改善治疗应答。
因此，本发明提供了一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组 合物包含药用载体和能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物以 0.2mg至30mg的所述试剂的剂量施用于受试对象。
本发明进一步提供一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组 合物包含药用载体和能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物以 0.10mg/m2至20mg/m2的所述试剂的剂量施用于受试对象。
本发明还进一步提供一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组 合物包含药用载体和能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物以 1 μ g/kg至500 μ g/kg的所述试剂的剂量施用于受试对象。
另外，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和能够激 活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述试剂以10 μ μ g/ml至150mg/ml的浓度存在。
在本发明的一个优选方面，所述试剂是人源化抗CD4抗体或者其片段或衍生 物。
尤其是，本发明还提供了上文所限定的试剂在制备用于治疗自身免疫性疾病的 药物中的应用，其中所述试剂以上文所限定的剂量施用于受试对象。本发明还提供用于 治疗自身免疫性疾病的上文所限定的试剂，其中所述试剂以上文所限定的剂量施用于受试对象。
从以上剂量中可以理解的是，本发明人已经令人惊讶地发现，低剂量的抗体 BT061提供了对天然产生的调节性T细胞(CD4tD25+Treg)的有效的特异性的激活，从 而以远低于先前使用的那些抗体(例如在W02004/083247中所公开的那些抗体)的剂量 提供了体内临床效果。另外，本发明人还惊讶地发现，与其他T细胞相互作用抗体例如 抗CD3抗体相比，人源化抗体BT061既没有显著调节促炎症细胞因子的水平也没有诱导 促炎症细胞因子的释放。另外，所述抗体没有引起CD4+淋巴细胞的足够长时间的消减。
所述试剂的浓度没有特别的限制，只要该试剂以比已知浓度低的浓度存在即 可。然而，优选的是，所述试剂的浓度为O.lyg/ml至30mg/ml或O.lyg/ml至IOOOyg/ ml,更优选的是lyg/ml至SOOyg/ml以及2μβ/ιη1至250μβ/ιη1。最优选的是，所述试 剂的浓度为(约)15yg/ml、25 μ g/ml> 125yg/ml> 250 μ g/ml> 500 μ g/ml> lmg/ml、 12.5mg/ml或25mg/ml中的任意一种浓度。
施用于使用所述组合物的受试对象的剂量体积没有特别限制，只要所述剂量体 积输送低于已知剂量的总剂量即可，因此，由于更低水平的副作用而适用于所有患者， 尤其是适用于治疗无法耐受如W02004/083247中所公开的剂量的个体。特别是，在所述 剂量体积内所述试剂的浓度可以改变以提供在本申请中所述的需要剂量。
剂量体积因施用方法而异。优选的是肠胃外施用。肠胃外施用的实例有肌肉内 施用、静脉内施用或皮下施用。在所述组合物拟通过静脉输注施用的情况下，所述剂量 体积可以是0.1ml或0.5ml至500ml，优选为15ml至25ml，通常为约20ml。在所述组合 物拟通过皮下或肌肉注射施用的情况下，所述剂量体积可以是0.1ml至3ml，优选为0.5ml 至1.5ml，通常为约1ml。
然而，在一些实施方式中，所述组合物可以以浓缩形式提供，并稀释到所涉及 的个体所需要的浓度。优选的是，在这些情况中，所述组合物以约lml、2ml、3ml、4ml 或5ml的相对较小体积提供。在替代性的实施方式中，所述组合物以上述的所需要的浓 度和剂量体积提供(即，即用)。在一个具体的实施方式中，用于皮下施用的药物组合物 以不需要稀释的即用形式提供，因此它们可以易于由非医疗人员施用。
如上所述，此前未知的是，能够治疗自身免疫性疾病的试剂可以以本发明所设 想的低剂量施用。虽然能够治疗自身免疫性疾病的试剂的已知剂量在一些个体或疾病类 型中有效，但是以低得多的剂量就可以有效实现则开创了对一些自身免疫性疾病和患者 类型进行更为有效的治疗的方法。
参考以下附图，仅通过举例方式来说明本发明，其中
图1示出了与人外周淋巴细胞结合的BT061的剂量依赖性。稀释系列的BT061 的结合用荧光染料标记的抗人:tgG抗体进行检测。平均荧光强度通过流式细胞分析进行 测定。
图2示出了通过结合阳性和阴性选择步骤进行的CD4+CD25+调节性T细胞和 CD4+CD25"效应细胞的纯化方案。
图3示出编码小鼠B_F5Vh区的核苷酸序列6EQ ID No 5)。
图4示出编码小鼠B_F5Vk区的核苷酸序列6EQ ID No 6)。
图5示 出编码人源化B-F5的Vh区的质粒片段的核苷酸序列(SEQ IDNo : 3)。编 码V区的序列带有下划线，在核苷酸序列下方示出相应的多肽序列(SEQ ID No: 17)。图6示出编码人源化B-F5的Vk区的质粒片段的核苷酸序列(SEQ IDNo 4)。 编码V区的序列带有下划线，在核苷酸序列下方示出相应的多肽序列(SEQ ID No: 2)。图7示出了来自在不同抗CD4mAb (单克隆抗体)存在/不存在的情况下，在放 射性PBMC(供体A)存在下培养的新分离的CD25+Treg(供体A)和CD8+T细胞(供体 B)的数据。同种异体反应性CD8+T细胞的增殖在通过添加37kBq/孔的3H-Tdr培养4 天后进行测定。示出了 Cpm(3次重复)的平均值。图8A至H部分提供了显示来自如在实施例3所述的剂量组I的银屑病患者的临 床试验的数据的图，其中患者用0.5mg的BT061静脉内注射液或安慰剂进行处理。图8 的部分A至H分别提供了剂量组I的患者1至8的PASI评分的图。图9A至H部分提供了显示来自如在实施例3所述的剂量组II的银屑病患者的临 床试验的数据的图，其中患者用2.5mg的BT061静脉内注射液或安慰剂进行处理。图9 的部分A至H分别提供了剂量组II的患者1至8的PASI评分的图。图IOA和IOB分别示出在健康志愿者中用BT061(单静脉输注或皮下注射) 的临床试验中所观察到的TFNa和IL-6释放(与抗CD3单克隆抗体所报道的水平比 较)。图中包括剂量水平和恢复的时间。TRX4的结果在图中标为“2)”(由Keymeulen 等报道(2005 N.Engl.J.Med.Type IDiabetes patients))。Teplizumab 的结果在图中标为
“ 3) ”(由 Herold 等报道(2002 N.Engl.J.Med.Type I Diabetes patients))。标准值在图中 标为 “4)”(由 Straub 等报道(2007，Athr.&Rheumat))。 “*)” 表示单剂量，“_)” 表示达到峰浓度所注射的累积剂量。图11示出了在健康志愿者中施用单静脉内或皮下剂量的BT061后的IL_2和 IFN- Y血浆水平。ULN =标准上限(根据在39个健康受试对象中测得的细胞因子水平 计算得到)；ULN =平均值+2 X标准偏差)。图12示出了用单静脉内剂量的BT061处理的志愿者中的CD4细胞计数(细胞/ ml血浆)的动力学。所示的是每个剂量组3位患者的平均值。虚线表示标准上限(ULN) 和标准下限(LLN)。图13示出了用单皮下剂量的BT061处理的志愿者中的CD4细胞计数(细胞/ml 血浆)的动力学。所示的是每个剂量组3位患者的平均值。虚线表示标准上限(ULN) 和标准下限(LLN)，均根据在15位健康受试对象中测得的CD4细胞计数来计算，采用平 均给药前值+ (或减去)2 X标准偏差形式。图14的A和B部分提供了示出来自如实施例3中所述的银屑病患者的临床试验 的照片。所述照片是作为剂量组II成员之一的同一名患者的照片。A部分中显示的照片 在处理前拍摄。B部分中显示的照片在处理后28天拍摄。图15提供了如实施例5中所述的类风湿关节炎患者的临床试验结果。该图示出 至少获得ACR20应答的来自接受1.25mg、6.25mg、12.5mg和25mg的皮下BT061的剂量 组的患者的百分比的柱状图。各组中有6名患者接受所述抗体剂量同时有2名患者接受 安慰剂。图16A和16B提供了如实施例5中所述的类风湿关节炎患者的临床试验结果。图16A示出来自接受25mg皮下BT061的剂量组的患者的触痛关节数的柱状图。图16B 示出来自同一剂量组的患者的肿胀关节数的柱状图。各组中有6名患者接受所述抗体剂 量同时有2名患者接受安慰剂。图17A和17B提供了如实施例5中所述的类风湿关节炎患者的临床试验结果。 所述图示出了来自25mg皮下剂量组的一名应答者(图17A)和一名非应答者(图17B)的 个体参数(％)的变化。在所述图中，“Pat' s GA"和“Phy' s GA"分别指患者综 合评价和医师综合评价。术语“疼痛的PA”是指疼痛的患者评价。图18A和18B进一步提供了如实施例5中所述的类风湿关节炎患者的临床试验 结果。所述图示出了来自1.25mg皮下剂量组(图18A)和来自6.25mg皮下剂量组(图 18B)的患者的触痛关节数。图19A和19B进一步提供了如实施例5中所述的类风湿关节炎患者的临床试验 结果。所述图示出了来自50mg皮下剂量组(图19A)和来自6.25mg静脉内剂量组(图 19B)的患者的触痛关节数。图20示出了 B-F5人源化形式(即BT061)设计中的鼠B_F5VK(SEQIDNo 8)、 FK-001 (SEQ ID No 9、10、11 禾口 12)、 L4L (SEQ ID No 18)禾口 L4M (SEQ ID No 2)
的多肽序列的比对。图21示出了 B-F5人源化形式设计中的鼠B-F5 Vh (SEQ ID No 7)、M26 (SEQ ID No 13、14、15 和 16)、H37L (SEQ ID No 1)和 H37V(SEQID No 17)的多肽序列
的比对。
具体实施例方式下文将对本发明进行更加详细的描述。适用于本发明的试剂是能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的那些试剂。所述试 剂可以是多肽、蛋白或抗体。在所述试剂是抗体的情况下，其可以是单克隆抗体。优选 的是，所述抗体是单克隆抗CD4抗体。所述抗体还可以优选为IgGl抗体，并且可以是 未修饰的IgGl抗体。在本发明的一个优选方面，与施用抗CD3抗体后见到的水平相比，所述试剂在 施用后不引起受试对象血浆中促炎性细胞因子水平的大量上升。尤其是，在施用所述试 剂后，IFN-Y、TNF-a、IL_6和/或IL_2的水平与健康受试对象中测得的血浆水平相比 没有大量上升(见表Al)。特别是，如果表Al中给定的具体细胞因子的ULN当作X， 那么在施用本发明的所述试剂后96小时内，X可以增加小于20倍。优选的是，X可以 增加小于10倍。更优选的是，这些水平出现在开始施用后10分钟至施用结束后96小时 的时期内。在自身免疫性疾病患者中 可能是，施用所述试剂前的细胞因子水平由于免疫细 胞的修饰活化情况(与健康受试对象中的细胞的活化情况相对而言)的原因而已经高过在 健康受试对象中所观察到的那些水平(在表Al中给出的ULN)。在那些情况下，将在刚 要施用所述试剂前的具体细胞因子的浓度当作X，并且在施用本发明的所述试剂后96小 时内，X可以增加小于20倍。优选的是，X可以增加小于10倍。更优选的是，这些水 平出现在开始施用后10分钟至施用结束后96小时的时期内。
权利要求
1.一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和能 够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物以所述试剂为0.2mg至30mg 的剂量施用于受试对象。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述试剂以0.2mg至20mg的量施用于受试对象。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述试剂以0.3mg至5mg的量施用于受试对象。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述试剂以0.3mg至Img的量施用于受试对象。
5.一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和能 够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物以所述试剂为O.lOmg/m2受 试对象体表面积至20mg/m2受试对象体表面积的剂量施用于受试对象。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中，所述组合物以所述试剂为0.12mg/m2受试 对象体表面积至15mg/m2受试对象体表面积的剂量施用于受试对象。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中，所述组合物以所述试剂为0.20mg/m2受试 对象体表面积至lOmg/m2受试对象体表面积的剂量施用于受试对象。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中，所述组合物以所述试剂为0.30mg/m2受试 对象体表面积至0.50mg/m2受试对象体表面积的剂量施用于受试对象。
9.一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和能 够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物以所述试剂为Iy g/kg至 500 μ g/kg的剂量施用于受试对象。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述组合物以所述试剂为2μ g/kg至 400 μ g/kg的剂量施用于受试对象。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述组合物以所述试剂为2μ g/kg至 250 μ g/kg的剂量施用于受试对象。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述组合物以所述试剂为2.5μ g/kg至 20 μ g/kg的剂量施用于受试对象。
13.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述自身免疫性疾病选自银 屑病、类风湿关节炎、多发性硬化症、I型糖尿病、炎性肠病、克罗恩病、自身免疫性甲 状腺炎、自身免疫性重症肌无力、系统性红斑狼疮和诸如移植物抗宿主或一般器官耐受 问题等移植有关疾病。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其中，所述疾病是银屑病。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中，所述组合物能够通过使患者的银屑病面 积与严重程度指数(PASI)评分改善至少40%来治疗银屑病。
16.如权利要求16所述的药物组合物，其中，所述组合物能够通过使患者的银屑病面 积与严重程度指数(PASI)评分改善至少50%来治疗银屑病。
17.如权利要求13所述的药物组合物，其中，所述疾病是类风湿关节炎。
18.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物用于肠胃外施用。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其中，所述组合物用于肌肉内施用、静脉内施 用或皮下施用。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述组合物用于静脉内施用并以0.5ml 至500ml的剂量体积提供或者以用于稀释至0.5ml至500ml的剂量体积的形式提供。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其中，所述剂量体积为15ml至25ml。
22.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述组合物用于皮下施用并以0.1ml至 3ml的剂量体积提供。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中，所述剂量体积为0.5ml至1.5ml。
24.如权利要求19所述的药物组合物，其中，所述组合物用于肌肉内施用并以0.1ml 至3ml的剂量体积提供。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其中，所述组合物以0.5ml至1.5ml的剂量体 积提供。
26.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述组合物作为单剂量使用 或者作为多剂量的一部分使用。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中，所述组合物为多剂量的一部分，并且各 剂量每天、每2天、每周、每2周、每4周、每8周、每12周、每24周、每48周、每 6个月或每年施用。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病是银屑病并且所述 剂量每2周施用1次。
29.如权利要求27所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病是银屑病并且所述 剂量每4周施用1次。
30.如权利要求27所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病是类风湿关节炎并 且所述剂量每2周施用1次。
31.如权利要求27所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病是类风湿关节炎并 且所述剂量每4周施用1次。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和能够激活CD4+CD25+调节性T 细胞的试剂，其中，所述试剂以lOyg/ml至150mg/ml的浓度存在。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中，所述试剂以0.5mg/ml至75mg/ml的浓 度存在。
34.如权利要求32或33所述的药物组合物，其中，所述组合物的体积为0.5ml至 500ml。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中，所述组合物的体积为15ml至25ml。
36.如权利要求32所述的药物组合物，其中，所述试剂以10mg/ml至28mg/ml的浓度存在。
37.如权利要求36所述的药物组合物，其中，所述组合物的体积为0.1ml至3ml。
38.如权利要求37所述的药物组合物，其中，所述组合物的体积为0.5ml至1.5ml。
39.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，在施用开始后10分钟至施用 结束后96小时的时间内，所述受试对象的血浆中的细胞因子水平比即将施用前的水平增 加小于20倍，并且其中所述细胞因子选自IFN-Y、TNF-a、IL_6和IL_2。
40.如权利要求1至38中任一项所述的药物组合物，其中，在施用开始后10分钟至 施用结束后96小时的时间内，所述受试对象的血浆中的细胞因子水平比标准上限(ULN) 值增加小于20倍，其中所述细胞因子选自IFN-Y、TNF-α、IL_6和IL_2，并且其中所 述 ULN 值分别为 3.8pg/ml、2.8pg/ml、4.4pg/ml 和 19.4pg/ml。
41.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，在施用后72小时至96小时 的时间内，所述受试对象的血浆中的CD4+淋巴细胞的细胞计数为至少250个细胞/ μ 1。
42.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述试剂是人源化单克隆抗 体或者其片段或衍生物。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中，所述试剂是抗CD4抗体或者其片段或 衍生物。
44.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述试剂是具有由以下多肽 序列限定的V域的人源化抗CD4抗体或者其片段或衍生物-H链V域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKS ENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 1)-L链V域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASI LESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (SEQ IDNO 2)，或者包含与SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2具有至少80%的序列同一性的多肽序列的V域。
45.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述试剂是衍生自小鼠单克 隆抗CD4抗体B-F5的人源化抗CD4抗体。
46.—种自身免疫性疾病的治疗方法，所述方法包括对受试对象施用药物组合物，其 中，所述组合物包含能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，并且其中所述试剂以权 利要求1至12中任一项所限定的剂量施用于所述受试对象。
47.如权利要求46所述的治疗方法，其中，所述自身免疫性疾病如权利要求13、权 利要求14或权利要求17所述。
48.如权利要求46或权利要求47所述的治疗方法，其中，所述试剂是衍生自小鼠单 克隆抗CD4抗体B-F5的人源化抗CD4抗体或者其片段或衍生物。
49.如权利要求46至48中任一项所述的治疗方法，其中，所述试剂是具有由以下肽 序列限定的V域的人源化抗CD4抗体或者其片段或衍生物-H链V域EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKS ENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 1)-L链V域DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (SEQ IDNO 2)，或者包含与SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2具有至少80%的序列同一性的多肽序列的V域。
50.如权利要求27所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病是银屑病并且所述 剂量每周施用1次。
51.如权利要求27所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病是类风湿关节炎并 且所述剂量每周施用1次。
52.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，在施用后3小时至6小时的 时间内，所述受试对象的血浆中的CD4+淋巴细胞的细胞计数低于250个细胞/ μ 1。
53.如权利要求1至52中任一项所述的药物组合物，其中，在施用后72小时至96小 时的时间内，所述受试对象的血浆中的CD4+淋巴细胞的细胞计数等于或大于即将施用前 所述受试对象的细胞计数的50%。
54.如权利要求15或16所述的药物组合物，其中，所述改善在施用单剂量所述组合 物后的56天可见。
55.如权利要求15或16所述的药物组合物，其中，所述改善在施用单剂量所述组合 物后的75天可见。
56.如权利要求15、16、54或55所述的药物组合物，其中，所述试剂的剂量为 0.5mg。
57.如权利要求15、16、54或55所述的药物组合物，其中，所述试剂的剂量为 2.5mg。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和能够激活CD4+CD25+调节性T细胞的试剂，其中，所述组合物拟以0.2mg至30mg的所述试剂的剂量施用于受试对象。
文档编号A61P37/06GK102027017SQ200980117317
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月10日 优先权日2008年3月13日
发明者于尔根·林德内尔, 克里斯托夫·尤尔克, 克里斯托夫·布鲁切尔, 埃尔玛·克劳泽, 安德里亚·瓦滕贝格-德曼特, 弗兰克·奥斯特罗斯, 本杰明·德尔肯, 西尔克·艾格纳, 西比勒·凯瑟, 达尼埃莱·沃尔夫, 马蒂亚斯·杰默 申请人:生物测试股份公司