在cns神经性损伤后非-急性期间处理的组合物及方法

专利名称：在cns神经性损伤后非-急性期间处理的组合物及方法
在CNS神经性损伤后非-急性期间处理的组合物及方法
技术领域：
发明领域涉及治疗中枢神经系统神经损伤。更特别是，本发明针对在创伤性神经损伤后非-急性或慢性期间给受试者施用神经调节蛋白[例如，神经胶质生长因子 2(GGF2)]。
背景技术：
中枢神经系统(CNS)损伤是严重的健康问题。此类别的损伤包括事件，例如缺血性损伤，出血性损伤，穿透性创伤及非-穿透性创伤。CNS损伤通常不完全痊愈，留给受试者变动于极其弱到死亡的一些程度的永久的功能障碍。残留的功能障碍可包括运动，感觉， 认知，情绪及自主异常。关键类别的CNS神经损伤包括脑损伤。脑损伤是导致一些程度的永久的残疾包括运动，感觉及认知缺乏及情绪不稳定性(例如创伤后应激障碍，注意力缺乏病症，抑郁症及情绪不稳定性)的破坏性病情。脑损伤的常见原因包括缺血性中风，出血性中风，硬膜下血肿，硬膜上血肿，闭合性头损伤(加速/减速，脑震荡及旋转)，穿透性脑损伤(枪伤及其他投射物伤)。中风是死亡的第三-主导原因，及是西方世界中残疾的主要原因。因此，中风造成大的社会经济学负担。中风的病因学可为缺血性中风(其为大部分中风的情形)或出血性中风。缺血性中风可由在体内别处形成凝块及经血流行进到脑导致(栓塞性中风)，或由脑动脉内侧形成的血凝块导致(血栓性中风)。在由于缺失葡萄糖及氧而立即梗塞核心内大量细胞死亡后，由于第二机理(例如谷氨酸盐兴奋性中毒，凋亡性机理，及自由基产生)，梗塞区扩展数天。神经损伤后(例如缺血性事件)动物及人可经几天，几周及几个月不用任何治疗剂而恢复功能。但是，时常，此恢复仅为部分，及动物及人患有可包括运动，感觉及认知缺乏的永久的残疾。熟知增加个体患中风的可能性的危险因素。这些包括，及不限于，不可变化的危险因素老年，遗传，ace，性别，中风或心脏病的之前历史；及可变化，治疗或控制的危险因素高血压，吸烟，糖尿病，颈动脉或其他动脉疾病，心房颤动，其他心脏病，镰形细胞病，高血胆留醇，差的摄食，及身体不活动及肥胖症。至今，缺血性中风的非-减轻性治疗限于在中风后急性期施用治疗剂。急性期跨神经损伤(例如，中风)的起始时间到神经损伤后大致6小时。急性期之后是半-急性期， 其跨神经损伤后大致6小时 2天。因此，使用当前非-减轻性治疗剂力图反转血流阻塞， 恢复脑的氧合作用及限制丧失脑结构的程度。不同于用于急性使用的tPA，无用于治疗中风的药物获得批准。患者保留一些水平的功能障碍，其最佳可多少内源性地改善大致60天。 此恢复可仅通过物理治疗增加。不幸的是，许多患者被留下有少的改善希望的永久的残疾。目前，被食品和药物管理局(FDA)批准的用于治疗缺血性中风的药物仅有组织纤溶酶原活化子(tPA)。tPA是将纤溶酶原转变为纤溶酶的丝氨酸蛋白酶。纤溶酶然后断裂纤维蛋白，其是阻塞脑中血管及导致中风的凝块的成分。其在理想情况下在自症状起始的3小时内施用。一般而言，认为仅3% 5%的患中风的个体及时达到医院得到此治疗。理想情况下，阻塞后头3小时内施用tPA，但可在晚至阻塞后6小时由一些临床医师施用。不幸的是，对于此治疗认为绝大部分经历中风的患者未及时达到医院。对于那些在有效的时间窗内到达医院的患者，tPA施用力图反转血流阻塞，恢复脑的氧合作用及限制丧失脑结构的程度。但是，有一些限制tPA持续使用的显著的禁忌症。在约3 6小时的初始时期后， 至多，tPA可导致脑内出血及出血性中风。由于所述理由，tPA限于急性期期间施用，以便实现任何治疗性功效。至今无其他用于治疗中风的治疗已获得批准。其他实验治疗(例如动脉递送的促尿激酶)处于研究中作为用于破裂凝块及恢复血流的潜在手段。但是，科学文献已描述许多被证明对于保护脑质有益及在中风实验动物模型中恢复功能的试剂。全部这些试剂致力于降低急性细胞死亡，发炎，及凋亡及因此，必需在缺血性事件后几小时内(一些达M小时)递送。迄今，都知道急切需要CNS损伤(例如中风)的治疗手段。(Abe等人，2008年，J Cereb Blood Flow Metab. 7 月 23 日，电子公开首页，Sun 等人，2008 年，Stroke, 7 月 10 日， 电子公开首页(页码还不可用)；Dohare等人，2008年，Behav Brain Res. 193(2) :289 97 ；Belayev 等人，2001 年，Stroke, 32 (2) :553 60)。但是，所述试剂尚未显示当在几小时的滞后时间后，至多在一些实验动物模型中约在中风后一天时施用时限制中风后对脑的损伤，恢复功能或增强恢复。仅知的对于中风后显示功效数天及数周的治疗是减轻性或康复性的，例如职业性或物理治疗。的确，本发明人未发现任何已显示在中风后增强恢复数天或数周的试剂或药物。急性阻塞后，常有毁坏的脑质的局限区，其被半影区域围绕，其如果不恢复循环， 将在数小时内死。此半影区域的至死亡的时间可用神经保护剂(例如NMDA拮抗剂，钙通道阻断剂，自由基清除剂及捕获剂，抗-凋亡剂，胱天蛋白酶抑制剂，parp抑制剂，等)在实验模型中延长几小时。为此目的，“神经保护剂”可在它们死于在急性期呈于它们的各种损伤之前解救神经元。M 48小时后，但是，有少的希望从坏死性死亡及凋亡性死亡保护细胞持续几天(见图1，用于抗-凋亡性治疗的治疗性窗未证明相比急性保护治疗宽得多 [Schulz et al.，1998，Cell Death Differ. 5(10) :847-57 ；Komjati et al.，2004，Int J MolMed. 13(3) :373-82]。神经调节蛋白呈现神经保护性质，如上述其他试剂，其显示降低中风后数小时内递送到动物见到的残疾的益处。见美国申请系列号09/530，884，将其整个内容通过引用并入本文。从神经损伤的发病率来看，特别关于中风，有可有效施用给受试者以限制神经损伤后对脑的损伤，恢复功能和/或增强恢复的治疗剂的需求。神经调节蛋白(NRG)及NRG受体包括用于涉及神经，肌肉，上皮，及其他组织中器官发生的细胞间信号转导的生长因子-受体酪氨酸激酶系统(Lemke，Mol. Cell. Neurosci. 7 :247-262,1996 and Burdenet al. ,Neuron 18 :847_855，1997)。NRG家族由编码多种含表皮生长因子(EGF)-样，免疫球蛋白(Ig)，及其他可识别结构域的配体的4种基因构成。多种分泌的及膜-附接的异构体发挥此信号转导系统中配体的作用。NRG配体的受体是EGF受体(EGFI )家族的全部成员，及包括EGFR (或ErbBl)，ErbB2，ErbB3，及ErbB4， 在人中也分别被称为 HERl HER4(Meyer et al.，Development 124 :3575-3586,1997 ；Orr-Urtreger et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1867-71,1993 ；Marchionni et al., Nature 362 :312_8，1993 ；Chen et al.，J.Comp. Neurol. 349 =389-400,1994 ；Corfas et al.，Neuron 14 :103_115，1995 ；Meyer et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91 1064-1068, 1994 ；andPinkas-Kramarski et al. ，Oncogene 15 :2803-2815,1997)。4种NRG基因，NRG-1，NRG-2, NRG-3,及NRG-4，定位于不同的染色体座位 (Pinkas-Kramarski et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 9387-91,1994 ；Carraway et al.，Nature 387 :512_516，1997 ；Chang et al.，Nature 387 :509_511，1997 ；and Zhang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :9562_9567，1997)，及共同编码多种 NRG 蛋白。NRG-1 的基因产物，例如，包括一组大致15种不同的结构上-相关的异构体(Lemke，Mol. Cell. Neurosci. 7 247-262,1996 and Peles andYarden, BioEssays 15 :815—824，1993)。首鉴定的 NRG-I 的亚型包括 Neu 分化因子(NDF ；Peles et al.，Cell 69，205-216，1992 and Wen etal.，Cell 69，559-572，1992)，神经生长因子(HRG ；HoImes et al.，Science 256 1205-1210，1992)，乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA ；Fallset al.，Cell 72 :801_815，1993)， 及神经胶质生长因子 GGFl，GGF2，及 GGF3 (Marchionni et al. Nature 362:312-8,1993)。NRG-2基因通过同源性克隆(Chang et al.，Nature 387 :509_512，1997 ；Carraway et al. , Nature 387 :512_516,1997；and Higashiyama etal. , J.Biochem. 122 :675_680, 1997)及通过基因组方法(Busfield et al.，Mol. Cell. Biol. 17 :4007_4014，1997)鉴定。 NRG-2 cDNA也已知为ErbB激酶(NTAK ；Genbank登录号No. AB005060)的神经-及胸腺-来源的活化子，神经调节蛋白(Don-I)的趋异剂，及小脑-来源的生长因子(CDGF;PCT申请 WO 97/09425)。实验证据显示，表达ErbB4或ErbB2/ErbB4组合的细胞可能显示对NRG-2 的特别稳健的应答(Pinkas-Kramarski et al.，Mol. Cell. Biol. 18 :6090_6101，1998)。 NRG-3基因产物(Zhang等人，supra)也已知结合及活化ErbB4受体(Hijazi et al.，Int. J. Oncol. 13 1061-1067,1998)。EGF-样结构域以全部形式的NRG的核心存在，及需要结合及活化ErbB受体。3种基因中编码的EGF-样结构域的推断的氨基酸序列大致30 40%相同(比对)。而且，NRG-I 及NRG-2中似乎有至少2种亚型的EGF-样结构域，其可赋予不同的生物活性及组织_特异性潜力。对NRG的细胞应答通过表皮生长因子受体家族的NRG受体酪氨酸激酶EGFR， ErbB2，ErbB3，及ErbB4介导。全部NRG的高-亲和力结合主要经ErbB3或ErbB4介导。NRG 配体的结合导致与其他ErbB亚基的二聚化，及通过对特异性酪氨酸残基的磷酸化的反式激活。在某些实验环境中，ErbB受体的几乎全部组合似乎能响应NRG-I异构体的结合形成二聚体。但是，看起来ErbB2是可在稳定配体-受体复合物中起重要的作用的优选的二聚化偶体。ErbB2不结合其自身的配体，但必需与其他受体亚型之一异源配对。ErbB3不具有酪氨酸激酶活性，但是其他受体的磷酸化的靶。NRG-1，ErbB2，及ErbB4的表达已知必要于小鼠发育期间心室心肌小梁形成。发明概述本发明提供用于治疗哺乳动物神经损伤后的新方法。方法基于可通过给哺乳动物施用治疗有效量的多肽来实现含表皮生长因子-样(EGF-样)结构域的多肽的治疗性益处的观察；在某些实施方式中，在神经损伤后第1小时，第2小时，第8小时，第12小时，第24小时，第30小时，第36小时、第42小时，第2天或更久时或后进行治疗。在本发明的一个实施方式中在急性窗损伤后之后起始治疗。在本发明的一个实施方式中在半-急性窗损伤后之后起始治疗。在本发明的一个实施方式中期间及仍持续在急性窗损伤后之后起始治疗。 在本发明的一个实施方式中治疗在半_急性窗损伤后期间起始及在半_急性窗损伤后之后仍持续。因此，本发明包括给哺乳动物施用含EGF-样结构域的多肽(或编码多肽的核酸)， 其在神经损伤后第1，2或3天甚至达及包括第4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14天；在神经损伤后一周或多于一周，2周或多于2周；在神经损伤后3周或多于3周；在神经损伤后4周或多于4周；在神经损伤后1个月或多于一个月；在神经损伤后2个月或多于2个月；在神经损伤后3个月或多于3个月；在神经损伤后4个月或多于4个月；在神经损伤后5个月或多于5个月；在神经损伤后6个月或多于6个月起始。根据本发明，EGF-样结构域由神经调节蛋白基因编码。根据本发明的施用包括以对于治疗哺乳动物的神经损伤后慢性期有效的量施用包括EGF-样结构域的肽，或编码所述多肽的核酸分子。根据本发明的另一方面，提供哺乳动物缺血性事件后急性或半_急性期外期间促进神经恢复的方法。本发明的治疗可在急性或半-急性时期内开始，但包括超过急性或半-急性时期分别至少1次，2次，3次，4次，5次，6次或多于6次治疗。本发明的方法包括给所述哺乳动物施用包括表皮生长因子-样(EGF-样)结构域的多肽，其中所述EGF-样结构域由神经调节蛋白(NRG)-I基因编码，及所述施用在缺血性事件后进行至少2或3或4天，尽管治疗可在急性或半急性时间框架内开始，及以足以在所述哺乳动物缺血性事件后慢性期期间促进神经恢复的有效量治疗。在本发明的特定实施方式中，神经调节蛋白基因可为NRG-I基因，NRG-2基因， NRG-3基因或NRG-4基因。本发明的神经调节蛋白多肽可，进而，由这4种神经调节蛋白基因任之一编码；本发明的神经调节蛋白多肽可，进而，由这4种神经调节蛋白基因任之一的变体或同系物编码。见图6A 6D是全长人GGF2 (NRG-1的亚型)的氨基酸及核酸序列。在本发明的一个方面，适宜哺乳动物包括但不限于，小鼠，大鼠，兔，狗，猴或猪。在本发明的更特定的实施方式中，哺乳动物是人。 定义本文中的术语‘约”包括指定的值士1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15%的
指定的值。在一实施方式中“约”表示98 102%的指定的值。在一实施方式中“约”表示 95 105%的指定的值。损伤后，“急性期”跨神经损伤(例如，中风)起始时间到神经损伤后大致6小时。 急性期之后是“半_急性期”，其跨神经损伤后大致6小时 2天。在一实施方式中，“半_急性期”跨神经损伤后大致6小时 3天。半-急性期之后时期称为神经损伤后“慢性期”。 后_急性期包括半_急性及慢性损伤后时期。通过〃表皮生长因子-样结构域〃或〃 EGF-样结构域〃是指结合及活化ErbB2， ErbB3, ErbB4，或其组合，及与如公开于 Holmes 等人，Science 256 1205 1210，1992 年； 美国专禾Ij No. 5，530，109 ；美国专利 No. 5，716，930 ；美国专利 No. 7，037，888 ；Hijazi 等人， Int. J. Oncol. 13 1061 1067，1998 年；Chang 等人，Nature 387 509 512，1997 年； Carraway^A,Nature 387 512~516,1997^ ；Higashiyama^A,J Biochem. 122 675~680，1997年；及TO 97/09425)的EGF受体-结合结构域带有结构相似性的由NRG-I，NRG_2， 或NRG-3基因编码的多肽基序。对于对应于由NRG-I基因编码的EGFL结构域1 6的核酸及氨基酸序列见图7 12。“表达载体"是指源于，例如，噬菌体，腺病毒，反转录病毒，痘病毒，疱疹病毒，或人工染色体的，用于转移，运作性连接到启动子的多肽(例如，神经调节蛋白)编码序列到宿主细胞，以至于编码的肽或多肽在宿主细胞内表达的遗传加工的质粒或病毒。术语“神经损伤”及“损伤”常在本文中互换使用。“神经创伤”是“神经损伤”的一实施方式及可通常认为是同义词。“神经损伤”是导致神经组织的一些破坏或死亡的损伤。 神经损伤通常作为后遗症具有一些损失，例如，心理，感觉或肌肉功能减少。“神经保护剂”可在它们死于在急性或半-急性损伤后期呈于它们的各种损伤之前解救神经元。急性阻塞后，常有被半影区域围绕的毁坏的脑质的局限区，所述半影区如果不恢复循环将在数小时内死。此半影区域至死亡的时间可用“神经保护剂”(例如NMDA拮抗剂，钙通道阻断剂，自由基清除剂及捕获剂，抗-凋亡剂，胱天蛋白酶抑制剂，parp抑制剂， 等)，在实验模型中延长几小时。为此目的“神经保护剂”可在它们死于在急性期呈于它们的各种损伤之前解救神经元。“神经调节蛋白〃或〃NRG"是指由NRG-I，NRG-2, NRG-3或NRG-4基因或核酸 (例如，cDNA)编码，及结合及活化EGFR，ErbBl，ErbB2,ErbB3,或ErbB4受体，或其组合的多肽。〃神经调节蛋白-1”，“ NRG-1","神经生长因子”，“GGF2”，或〃 pl85erbB2 配体"是指结合ErbB2受体及由描述于美国专利No. 5，530，109 ；美国专利No. 5，716，930 ； 及美国专利No. 7，037，888 (将各均通过引用整体并入本文)的pl8krbB2配体基因编码的多肽。结合到erbB2受体可为通过erbB2受体与erbBl，erbB3或erbB4的异源配对的间接
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？口口。“神经调节蛋白-样多肽"是指具有由神经调节蛋白基因编码的EGF-样结构域， 以及结合及活化EGFR，ErbBl，ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4,或它们的组合的多肽。结合到erbB2 受体可为通过erbB2受体与erbBl，erbB3或erbB4的异源配对的间接结合。本文中的术语“神经恢复”用于指在损伤，疾病，感染或其他神经系统分裂后，脑， 脊髓或外周神经的神经系统向正常状态恢复其功能的过程。“运作性连接的"是指编码多肽(例如，cDNA)与一或多个调控序列的核酸以当适当的分子(例如，转录活化子蛋白)结合到调控序列时使基因表达的方式连接。本文所用的“肽”包括约625，600，575，550，525，500，475，450，425，400，375，350， 325，300，275，250，225，200，175，150，125，100，75，50 或少于 50 个氨基酸，或者基本上由其
构成或由其构成的肽。“启动子"是指足以指导转录的最小的序列。本发明也包括足以致使启动子-依赖性基因表达基于细胞类型或生理状态(例如，含氧量低的对比含氧量正常的条件)可控制的，或可被外部信号或试剂诱导的启动子元件；所述元件可位于天然的基因的5'或3' 或内部区中。术语"治疗有效量"旨在表示引起由研究者，兽医，医学医生或其他临床医师观察的组织，系统，动物或人的生物或医学应答的药物或药学试剂的量。治疗性变化是以期望减轻疾病或解决病情的方向所测的生物化学特征性中的变化。更具体而言，“治疗有效量"是足以降低与医学病情或虚弱相关的症状，以标准化导致特异性身体功能损伤的疾病或病症中的身体功能，或提供改善in —或多种临床上所测的疾病参数的量。本文中的术语“治疗”指神经损伤后获得至无损伤的恢复；加速神经损伤后自然恢复的速度；或促进恢复到更高功能水平。不被理论束缚，在慢性损伤后窗中，其未含盖将有能力减少任何进一步神经性死亡，即，已知在慢性窗发生时神经死亡。但是，本发明的治疗包括，在慢性时期期间，例如，减少组织(例如，肌肉或骨)的将由包括的神经提供的组织中别样发生的降低功能或活力。此外，本发明的治疗包括，在慢性时期期间，例如，减少由包括的神经提供的组织中别样发生的萎缩(例如，肌肉或骨)。通过〃转化的细胞〃是指已利用重组DNA技术或已知的基因治疗技术导入编码神经调节蛋白或具有神经调节蛋白EGF-样结构域的多肽的DNA分子的细胞(或细胞后代)。除非另有定义，本文所用的全部技术及科学术语具有与被本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

图1显示中风/缺血后进行期的示意图。图中“0T”表示职业疗法及“PT”表示物
理治疗。图2示中脑动脉的永久的结扎后的前肢行为分值。将大鼠如所示用GGF2，NRGl, FGF，或媒质处理。以100yg/kg的FGF及GGF2在第21天行为测试中展示显著的改善。(，， +，Y，*表示通过ANOVA及后-Tukey显著不同于媒质(对于bFGF，NRGl，GGF2以6. 5 μ g/ kg,及对于 GGF2 以 100 μ g/kg))。图3示中脑动脉的永久的结扎后的后肢行为分值。将大鼠如所示用GGF2，NRGl, FGF，或媒质处理。GGF2以6. 5 μ g/kg及NRG以1· 0 μ g/kg,在第7天及第14天行为测试，但不在第21天的研究终点显著好于媒质。GGF2以100 μ g/kg及FGF在处理后全部行为时间点显著好于媒质。(11，+，Y，*表示通过ANOVA及后-Tukey显著不同于媒质(对于bFGF， NRGl，GGF2 以 6. 5 μ g/kg 及对于 GGF2 以 100 μ g/kg))。图4示中脑动脉永久的结扎后的身体摆动行为分值。将大鼠如所示用GGF2，NRG1， FGF，或媒质处理。GGF2以100 μ g/kg及FGF在第21天相比媒质显著改善。(▼，+，Y，* 表示通过重复的测量ANOVA及后-hoc Tukey显著不同于媒质(对于bFGF，NRG1, GGF2以 6. 5 μ g/kg 及对于 GGF2 以 100 μ g/kg))。图5A显示中脑动脉的永久的结扎后前肢行为分值。将大鼠在结扎后起始1，3或 7天用GGF2处理。将GGF2每天以0. lmg/kg静脉内递送10天。用全部处理范例在第21 天时间点前肢行为分值显著好于媒质。(*，Y，+表示通过重复的测量ANOVA及后-hoc Tukey,分别在第1，3及7天处理组显著不同于媒质)。图5B显示中脑动脉的永久的结扎后的后肢行为分值。将大鼠在结扎后起始1，3 或7天用GGF2处理。将GGF2每天静脉内以0. lmg/kg递送10天。当在结扎后1或7天起始治疗时后肢行为分值显著好于媒质，及相比在第21天时间点结扎后3天起始治疗的媒质改善。(*，Y，+表示通过重复的测量ANOVA及后-hoc Tukey，分别在第1，3及7天处理组显著不同于媒质)。图5C显示中脑动脉永久的结扎后的身体摆动行为分值。将大鼠在结扎后起始1，3 或7天用GGF2处理。将GGF2每天静脉内0. lmg/kg递送10天。当结扎后1天起始治疗时身体摆动分值显著好于媒质，及相比结扎后3或7天起始治疗的媒质改善。(*，Y，+表示通过重复的测量ANOVA及后-hoc Tukey，分别在第1，3及7天处理组显著不同于媒质)。图6A D显示全长GGF2的核酸及氨基酸序列。图7 12显示表皮生长因子样(EGFL)结构域1 6的核酸及氨基酸序列。图13显示来自NRG-I基因的表皮生长因子样肽的核酸及氨基酸序列。图14显示来自NRG-I的表皮生长因子样(EGFL) β片段的核酸及氨基酸序列。图15显示来自NRG-I的表皮生长因子样(EGFL) α片段的核酸及氨基酸序列。图16显示来自NRG-2的表皮生长因子样(EGFL) α片段的核酸及氨基酸序列。图17显示来自NRG_2i3的表皮生长因子样(EGFL) α片段的核酸及氨基酸序列。图18显示各EGF-样肽的氨基酸序列比对。EGF-样结构域可定义为NRG的亚结构域，序列比对显示，其与人EGF分子(序列Ρ01133|971 1023，在图中比对底部)相比，在氨基酸序列上具有至少 25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43， 44或45%同源性。同源氨基酸具有相同的，保守的或半-保守的物理-化学及结构性质， 如分别通过符号‘*’，‘ ，及‘.，标识。发明详述如所示本文中，缺血性中风的非-减轻性治疗迄今限于在中风后急性期施用治疗剂。急性期期间观察到至少部分由于氧剥夺的立即细胞死亡。此外，如图1中所示，血流阻塞导致细胞内贮存的自由基，谷氨酸盐，及钙及钠释放，这被理解为毁坏脑组织及扩展损伤区。神经损伤后大致6小时 2天(或通过一些定义是3天)的半-急性期的特征在于持续的自由基释放，谷氨酸盐清除，钙及钠释放，阻塞的区的氧剥夺，及立即局限的细胞死亡。至今，无已知的用于人中风后半-急性期期间的临床上获得批准的试剂。如图1中所示，药学神经损伤后治疗的有限的窗至少部分被病理生理学及暂时的损伤进展解释。例如阻塞的数分钟内，在梗塞核心的神经元毁坏。阻塞后数小时时，自由基， 兴奋毒性及炎症试剂释放/产生，及这些分子持续毁坏脑组织及扩展损伤区。如上所述，损伤的程度可有限，通过恢复血流(使用临床上获得批准的溶栓剂，即，tPA)从而达到疫区的再-氧合作用。如通过科学文献所示，各化合物似乎在急性及半-急性时期呈现功效。但是，CNS 神经损伤后M，36或48小时标记后，潜在治疗进行性丧失治疗损伤的能力。实际上，在急性时期具有效应的一些治疗剂模式，例如tPA，随着损伤后时间经过开始具有严重的，威胁生命的禁忌症。缺血性事件后数天，数周或数个月，在中风后慢性期期间，治疗必需旨在促进神经恢复。创伤性事件(例如中枢神经系统中的中风)后神经恢复的促进相比前-慢性窗中所采用的涉及明显不同的生理学现象及治疗性策略。前-慢性治疗通常涉及旨在恢复血流及减少急性细胞死亡的试剂。相反，可在损伤后48小时或更久，或72小时或更久时有效施用的治疗剂通过其不改变缺血性损伤大小而恢复功能的能力从急性期治疗剂分化出。在一实施方式中，本发明的治疗在缺血性CNS损伤的基本上完全损伤后死亡后开始；“缺血性CNS 损伤的基本上完全损伤后死亡”是指直接导致缺血性事件的CNS细胞死亡将发生，其他由于年龄或治疗(无关治疗是否设计用于解决缺血)的细胞死亡不在此定义的范围内。如所示本文中，本发明人展示，神经调节蛋白对在神经创伤性损伤的慢性期期间恢复神经性功能有效。在一实施方式中，神经创伤性损伤是缺血性中风。如本文所述，本发明人作出惊人的发现，神经调节蛋白在缺血性事件后慢性期期间起始施剂时有效。甚至更惊人的是发现神经调节蛋白甚至当晚至在缺血性事件后7天时起始施剂时有效。本数据显示，达到的有利的结果不通过与发现在立即缺血后治疗中有效的机理相同的机理发生。中风后慢性期期间的神经调节蛋白处理不改变缺血性损伤的大小(见表 1)。此明显显示，病理生理学的急性及半-急性期完全在这些期，及慢性期期间施用的神经调节蛋白促进神经恢复，而非建立再灌注及保护神经元。表1 梗塞体积(％ )
bFGF21. 3±3. 3NRG 1. 0μ g/kg26. 8±3. 0GGF26. 5 μ g/kg27. 1±3. 7GGF2100u g/kg26. 3±3. 5媒质25. 0±3. 本发明的组合物如上所述，神经调节蛋白是由NRG-1，NRG-2, NRG-3或NRG-4基因编码的多肽及具有使它们结合及活化ErbB受体的EGF-样结构域。Holmes等人(Science 256 :1205 1210， 1992)显示，EGF-样结构域单独足以结合及活化pi邪erbB2受体。因此，由NRG-1，NRG-2, NRG-3或NRG-4基因编码的任何多肽产物，或任何神经调节蛋白_样多肽，例如，具有由神经调节蛋白基因或cDNA编码的EGF-样结构域(例如，含NRG-I肽亚结构域C-C/D或C-C/ D'的 EGF-样结构域，如 USPN 5，530，109，USPN 5，716，930，及 USPN 7，037，888 中所述；或如公开于wO 97/09425的EGF-样结构域)的多肽可用于本发明的方法。本发明的组合物可为单元剂型。包括本发明的组合物和/或根据本发明的使用说明的试剂盒也在本发明的范围内。可将本发明的组合物与药学-可接受的稀释剂，载质，或赋形剂一同施用于的患者。采用常规药学实践提供制剂或组合物以将所述组合物施用给患者或实验动物。尽管静脉内施用是优选的，可采用任何适当的施用途径，例如，肠胃外，皮下，肌内，颅内，眶内，眼， 心室内，囊内，脊柱内，脑池内，腹膜内，鼻内，气雾剂，口服，或经皮(例如，通过施加带制剂的粘合贴剂能交叉真皮及进入血流)或局部施用。治疗性制剂可取液体溶液或悬浮液形式；对于口服施用，制剂可取片剂或胶囊形式；及对于鼻内制剂，以粉末，鼻滴液，或气雾剂的形式。本领域中熟知的用于制备制剂的方法见于，例如，“Remington' sPharmaceutical Sciences",,用于肠胃外施用的制剂可， 例如，含赋形剂，无菌水，或盐水，聚烯基甘醇(例如聚乙二醇)，蔬菜来源的油，或氢化萘。 用于施用本发明的分子的其他潜在地有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子，渗透泵，可植入的输注系统，及脂质体。用于吸入的制剂可含赋形剂，例如，乳糖，或可为含，例如，聚氧乙烯-9-月桂醚，甘胆酸盐及脱氧胆酸盐的水溶液，或可为用于以鼻滴液的形式施用的油性溶液，或作为凝胶。本发明的其他方面提供了将本化合物用作尤其是治疗或预防前述病情及疾病的药物。本文也提供本化合物在制备用于治疗或预防前述病情及疾病之一的药物中的用途。关于静脉内注射，剂量水平通常在从以下列表中的一个值到列表中的更高值的范围内约 0. 001mg/kg，约 0. 01mg/kg,约 0. lmg/kg,约 lmg/kg,及约 10mg/kgo 施剂周期性通常在从约每对，48，72，或96小时的规则的时间间隔内。在替代性实施方式中，施剂周期性通常在从约每1，2，3，4，5，6，7，数天的规则的时间间隔内。在替代性实施方式中，施剂周期性通常在从约每1，2，3，4，或5周的规则的时间间隔内。所述施剂时期后，可采用欠频繁的施剂，例如每月，每3个月，每4个月，或每年。选择经皮剂量来提供相比使用注射剂量实现的基本上相同的，类似或更低生理学水平(血浆，组织，CSF)。可将本发明的化合物作为单独的活性剂施用，或它们可与其他试剂(包括可发现展示相同的或类似治疗性活性及测定为对于所述组合的施用安全的及有效的其他化合物) 组合施用。含盖的用于治疗急性或半-急性神经损伤的其他所述化合物包括造血因子(例如，G-CSF和/或GM-CSF)；具有溶血栓活性的物质，例如，tPA，链激酶，尿激酶，和/或安克洛酶；抗血小板剂，例如乙酰水杨酸(阿司匹林)，氯吡格雷(Plavix)，与缓释双嘧达莫 (Aggrenox)组合的阿司匹林；抗凝剂，例如杀鼠灵(Coumadin)或肝素；和/或干扰凋亡性信号转导的物质(例如胱天蛋白酶抑制剂)或孕酮。但是，已知以预防中风发展的目的(例如，用于抗血小板剂或抗凝剂)，或在中风后急性期期间(tPA)施用以上化合物。为了评估根据本发明有效治疗的运动，感觉或认知缺乏，本领域中可用几种工具。熟知的监控治疗功效的标志包括细微精神状态检查(MMSE)，改良的细微精神状态检查(3MS)，功能损伤测量(FIM，Barthel测试，Fugl-Meyer运动分值，Wolf运动功能测试，Jebsen-Taylor手功能测试，Nottingham健康特征部分1及运动评定标尺(MAS)， S0dring运动评估标尺(SMES)，Berg平衡标尺(BBS)及日常生活Barthel活性(ADL)，及
其他临床测试，例如影响，语言，吞咽，认知，运动协调，强度，感觉及自主功能测量，以及存活率及住院率可用于评定疾病进展。损伤后，疾病，感染或其他神经系统分裂，脑，脊髓或外周神经由于任何的组合总破坏，凋亡，分裂的通路及突触，发炎，改变的化学环境，细胞代谢变化及细胞转录及翻译变化而不恰当地起作用。本文中的术语“神经恢复”用于指神经系统向正常状态恢复其功能的过程。此过程可通过修正，防止，反转或消除以上提及的任何原因来发生。此外，目前已知显著的神经恢复可通过称为‘可塑性’的处理发生，其中神经系统形成新联系以补偿或适应于其他变化。CNS损伤导致造成分裂的功能及残疾的局部及长-范围联系的分裂。可塑性是既有的神经元之间形成新联系的事件。可塑性已显示是包括视觉系统(Pizzorusso 等人)及脊髓(Fawcett Jff (2009) Brain 132:1417-1418)的 CNS系统中的神经恢复机理。在可塑性中，新突触形成或既有的突触加强，减弱或去除，以使既有的结构及系统补偿已在损伤中毁坏或分裂的那些。其他形式的可塑性可包括改变既有的细胞的神经化学，以变化直接突触信号转导及旁分泌信号转导。可塑性也可取改变受体水平的形式，以使神经元及其他细胞更或欠敏感于直接的突触或旁分泌信号转导。这些过程良好被接受为学习及记忆的机理。文献，行为，材料，装置，物品等的讨论包括在此说明书中仅旨在提供本发明的背景。不推荐或代表，任何或全部这些东西形成部分现有技术基础或是本申请的各权利要求的优先权日之前本发明领域相关中的公知常识。本发明已联系其特定实施方式描述，需知，能进一步改良及本申请，一般而言，旨在覆盖遵循本发明的原理的本发明的任何变化，使用，或适应，及包括在本发明所属领域中已知的或习惯的实践内从本公开内容脱离，及可将应用于前述必要的特征，及落入随附的权利要求的范围。以下实施例将辅助本领域技术人员更佳了解本发明及其原理及优点。期望这些实施例为阐明本发明及不限制其范围。
实施例实施例1材料及方法动物准备将50只，成年，雄性Sprague-Dawley用于研究(定购10只额外的动物)。全部大鼠笼养及进行用于以适应环境目的在手术之前7天行为评定的操作。操作时期末，大鼠随机化及分配到不同的组。大鼠通过尾标记给予唯一的识别号。10只额外的大鼠也操作。手术准备中脑动脉阻塞(MCAO)，Tamura模型此大鼠手术损伤模型是本领域中良好接受的中风模型(Tamura etal,1981, J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1) :53-60 ；Tamura et al,1981, JCereb Blood Flow Metab. 1 (1) :61-9)。通过使用Tamura等人方法的改良方法的近端右中脑动脉(MCA)永久的阻塞来制备病灶脑梗塞。用在N2O O2 (2 1)的混合物中的2 3%氟烷麻醉雄性 Sprague-Dawley大鼠(在手术时300 400g)，及用在N2O O2 (2 1)的混合物中的1 1.5%氟烷维持。两断颞肌，及通过在眼及耳道之间中位切开来呈现。通过颞下颅骨切除术不去除髋弓及不横断面神经地暴露近端MCA。然后通过从刚好接近嗅觉通路到大脑下静脉的显微双极性凝固阻塞动脉，及横断。贯穿整个过程于37.5°C 士0.5°C体温维持。在MCAO 前一天及 MCAO 刚后腹膜内(i. p.)给予头孢唑林(40mg/kg ；Baxter, Lot 06014. 1，Exp。1 月2009年)，以阻止感染。在MCAO手术之前作为镇痛剂皮下(0. 05 0. lmg/kg)给予丁丙诺啡(NDC12496-0757-1, Lot#700Y02, exp :1 月 1 日 2010 年)。化合物制备及施剂[GGF2 及 NRG-I (NRG-EGF)在Acorda Therapeutics制备浓储物溶液及保存于0 5°C。如下述制成剂量NRG_l[NRGlb2EGF结构域(156Q)]的克隆，表达及纯化DNA 从人脑cDNA克隆NRGlb2 egf结构域及使用Ndel及BamHl限制性位点克隆进pet 15b 载体(Novagen cat#69661 3)。得到的蛋白是 6. 92kda+ 3kDa His 标签(= 9. 35kDa)。NRGlb2egf pet 15 克隆的 DNA 序列有下划线的序列是克隆位点(Ndel及BamHl)CATATGAGCCA TCTTGTAAAA TGTGCGGAGA AGGAGAAAAC TTTCTGTGTGAATGGAGGGG AGTGCTTCAT GGTGAAAGAC CTTTCAAACC CCTCGAGATACTTGTGCAAG TGCCCAAATG AGTTTACTGG TGATCGCTGC CAAAACTACGTAATGGCCAG CTTCTACAAG GCGGAGGAGC TGTACCAGTA AGGATCC从petMb载体最终翻译的蛋白示于下。egf结构域加了下划线。1020304050MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSHLVKCAEK EKTFCVNGGE CFMVKDLSNP607080SRYLCKCPNE FTGDRCQNYV MASFYKAEEL YQ理论pI/Mw 7. 69/9349. 58蛋白表达使用过夜表达自动诱导系统(Novagen)在LB培养基中于25°C将克隆转化进用于蛋白表达的B121细胞M小时。表达主要在不溶性包含体中。蛋白再折叠从Novagen蛋白再折叠试剂盒改造，70123-3。蛋白纯化将蛋白以2. 5ml/分钟装在阴离子交换柱DEAE。NRG_1片段仍在流通中， 然而混入物结合及以更高盐洗脱。装载及洗涤缓冲液是50mM Tris pH7. 9，及洗脱缓冲液是含IM NaCl的50mM TrispH7. 9。将流通液合并，及用来自Millipore的Centripr印YM-3 浓缩。蛋白印迹通过蛋白印迹评定蛋白表达。得到的条带以约IOkD运行。将4 20%标准凝胶(Biorad)用于蛋白解析，然后转移到Protran硝酸纤维素纸 (来自khliecher&khull的0. Iym孔径)。印迹在TBS-T(0. 1 % )中的5%乳中封闭。 在TBS-T中的5%乳中的1 1000稀释的第一抗体(来自R&D系统的抗EGF人NRGl-α/ HRGl-α亲和力纯化的多克隆抗体Cat#AF-296-NA)_于室温1小时(也于4°C工作过夜)。 以TBS-T中的5%乳中的1 10，000稀释液使用兔抗山羊HRP第二抗体，于室温1小时。 全部在TBS-T中进行洗涤。NRG-1的纯化流程将培养物于25°C在来自Novagen的过夜表达自动诱导系统1 (cat#71300-4)中生长。有非常少的可溶性NRG-I存在。将培养物离心沉降及将沉淀提取，溶解及在纯化可发生之前再折叠以获取NRG-I。用于提取，增溶及再折叠的物质IOX 洗涤缓冲液:200mM Tris-HCl, pH 7. 5，IOOmM EDTA, 10% Triton X-10010X 增溶缓冲液500mM CAPS, pH 11. 050 X 透析缓冲液:1M Tris-HCl, pH 8. 530% N-月桂基肌氨酸-作为粉末添加(Sigma 61739-5G)IM DTT
还原的谷胱甘肽(Novagen 3541)氧化的谷胱甘肽(Novagen 3542)IL细胞裂解及包含体的制备-解冻及在30ml1 X洗涤缓冲液中重悬浮细胞沉淀。根据需要，为完全重悬浮而混合。-将蛋白酶抑制剂(25μ 1 的 10 X /50ml)，DNA 酶 QOO μ 1 的 lmg/ml/50ml)及 MgC12(500y 1的lM/50ml)添加到悬浮液。-通过超声处理裂解细胞。a.贯穿此步骤在冰上冷却细胞。b.使用方形端，以6，10次水平超声处理30秒钟，直到悬浮液粘性减小。各超声处理之间使悬浮液在冰上冷却60秒钟。当超声处理时，保持50ml圆锥形管内的体积不高于 40ml。-当完成时，将各悬浮液转移到用于以F-16/^250转子使用的250ml曲颈离心瓶。-通过以IOOOOXg离心12分钟来收集包含体。-去除上清(留下用于可溶性蛋白分析的样品)及在30ml的IX洗涤缓冲液中充分重悬浮沉淀。-如在步骤4中重复离心及留下沉淀。-再次，在30ml的1X洗涤缓冲液中充分重悬浮沉淀。-通过以IOOOOXg离心10分钟来收集包含体。倒出上清及通过在纸巾上敲打颠倒的管来去除最后痕量的液体。B.增溶及再折叠-从待处理的包含体湿重，计算对于以10 15mg/ml浓度重悬浮包含体必需的 IX增溶缓冲液的量。如果计算的体积大于250ml，使用250ml。-于室温，制备计算的体积的补充了0. 3% N-月桂基肌氨酸(可使用达2%，如果进一步优化中需要)(300mg/100mL缓冲液)及ImMDTT的IX增溶缓冲液。-将计算的量的IX增溶缓冲液来自步骤2的添加到包含体及轻轻混合。可将大的碎片通过重复的移液打碎。-在冰箱摇床中于25°C，以50 IOOrpm温育4 5小时。-通过于室温以10000Xg离心10分钟来澄清。C.蛋白再折叠的透析流程-制备所需的体积的用于溶解的蛋白透析的缓冲液。透析应以至少2次大于样品体积50倍的缓冲液变更进行。-将50X透析缓冲液稀释到期望的体积的IX，及补充0. ImM DTT。-于4°C透析至少4小时。更换缓冲液及持续。透析额外的4或更多小时。-制备额外的如在步骤1中测定的透析缓冲液，但省略DTT。-通过2次额外的变更(分钟。各4hr)，用缺少DTT的透析缓冲液持续透析。D.促进二硫键形成的氧化还原再折叠缓冲液-制备在IX透析缓冲液中含ImM还原的谷胱甘肽(1.2g/4L)及0.2mM氧化的谷胱甘肽(0. 48g/4L)的透析缓冲液。体积应25倍大于溶解的蛋白样品体积。冷却至4°C。
-透析来自步骤1的再折叠的蛋白于4°C过夜。纯化全部过程于4°C进行。化学品氨基丁三醇盐酸盐(SigmaT5941-500G)氯化钠5M 溶液(Sigma S6546-4L)氢氧化钠10N(JT Baker 5674-02)E.在DEAE HiPrep 16/10 阴离子柱 _20ml (GE Healthcare)上的纯化缓冲液A :50mM Tris-HCL ρΗ8· 0缓冲液B 含 IM NaCl pH 8. 0 的 50mM Tris-HCL柱平衡缓冲液A-5CV，缓冲液B-5CV，缓冲液A-10CV-每次运行以2.Oml/分钟负荷50ml的样品到20ml柱(NRG-1在流通中)。-用5CV的缓冲液A洗涤20ml柱20ml柱用至100% B的梯度用5CV。这是为洗脱下混入物。-用IOCV的100%缓冲液B清洁。-用15CV的缓冲液A平衡-用SDS-PAGE银染色分析级分-用NRG-I (IOkDa)合并级分F. NRG-I的浓度-用Millipore Centripr印 3000 MWCO 15ml 浓缩机(UltracelYM-3，4320)浓缩-使用改良的Lowry蛋白测定来测定浓度。G.His-标签去除用来自Novagen (Cat#69022-;3)的A凝血酶切割捕获试剂盒进行His-标签去除。 基于之前测试，最佳条件对于每10 μ g的NRG-I蛋白是于室温以0. 005U的酶/ μ 1的凝血酶4小时。温育4小时后，添加16 μ 1的链霉亲和素琼脂糖浆/单元的凝血酶。于室温摇动样品30分钟。通过自旋-过滤或无菌过滤(取决于体积)回收NRG-1。用EGF及抗-His 蛋白印迹确定完全切割。H.最终缓冲液中的储存于4°C储存在含 0. 2% BSA 的 IXPBS 中。GGF2的表达及纯化对于GGF2的克隆及背景信息，见USPN 5，530，109。细胞系描述于USPN 6，051，401。将各USPN 5，530，109及USPN 6，051，401的整个内容均通过引用整体并入本文。CH0-(Alpha2HSG)-GGF细胞系此细胞系设计来产生足够的量的胎球蛋白(人 alpha2HSG)，以支持在无血清条件下rhGGF2的高产生速度。用如下显示的表达载体(pSV-AHSG)转染Cho (dhfr_)细胞。在氨苄西林压力下稳定的细胞生长。细胞系标识为(dhfr7a2HSGP)。然后将dhfr7a2HSGP细胞使用阳离子脂质DMRIE-C试剂(LifeTechnologies#10459-014)用如下显示的含人GGF2的编码序列的 PCMGGF2载体转染。
根据标准流程使用甲氨喋呤(100ηΜ，200ηΜ，400ηΜ，1μΜ)以4 6周间隔衍生稳定的及高产的细胞系。使细胞逐渐从含血清的培养基脱离。克隆通过标准限制稀释方法分离。培养基要求之细节见于上述报道。为增强转录，将GGF2编码序列放置在EBV BMLF-I干扰序列(MIS)后。见以下图。
MIS [229 bpi
miixri mi 丨丨丨 niiiiim 丨 mnrnwnffl nin
Lniron (177 bpjMIS 序列CGAT「AACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG(GTAAGAAGCTACACCGGCCAGTGGCCGGGGCCCGATAACTAGCAGCATTTCCTCCAACGAGGATCCCGCAG(GTAAGAAGCTACACCGGCCAGTGGCCGGGGCCGTGGAGCCGGGGGCATCCGGTGCCTGAGACAGAGGTGCTCAAGGCAGTCTCCACCTTTTGTCTCCCCTCTGCAG)AGAGCCACATTCTGGAA]GTTGGF2编码序列atgagatgg cgacgcgccc cgcgccgctc cgggcgtccc
0190]301ggcccccgggcccagcgccccggctccgccgcccgctcgtcgccgccgctgccgctgctg0191]361ccactactgctgctgctggggaccgcggccctggcgccgggggcggcggccggcaacgag0192]421gcggctcccgcgggggcctcggtgtgctactcgtccccgcccagcgtgggatcggtgcag0193]481gagctagctcagcgcgccgcggtggtgatcgagggaaaggtgcacccgcagcggcggcag0194]541cagggggcactcgacaggaaggcggcggcggcggcgggcgaggcaggggcgtggggcggc0195]601gatcgcgagccgccagccgcgggcccacgggcgctggggccgcccgccgaggagccgctg0196]661ctcgccgccaacgggaccgtgccctcttggcccaccgccccggtgcccagcgccggcgag0197]721cccggggaggaggcgccctatctggtgaaggtgcaccaggtgtgggcggtgaaagccggg0198]781ggcttgaagaaggactcgctgctcaccgtgcgcctggggacctggggccaccccgccttc0199]841ccctcctgcgggaggctcaaggaggacagcaggtacatcttcttcatggagcccgacgcc
901aacagcaccagccgcgcgccggccgccttccgagcctctttcccccctctggagacgggc
961cggaacctcaagaaggaggtcagccgggtgctgtgcaagcggtgcgccttgcctccccaa
1021ttgaaagagatgaaaagccaggaatcggctgcaggttccaaactagtccttcggtgtgaa
1081accagttctgaatactcctctctcagattcaagtggttcaagaatgggaatgaattgaat
1141cgaaaaaaca3.3. C C 3. C 3.3.3.3.tatcaagatacaaaaaaagccagggaagtcagaacttcgc
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1321accactgggacaagccatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaat
1381ggaggggagtgcttcatggtgaaagacctttcaaacccctcgagatacttgtgcaagtgc
1441ccaaatgagtttactggtgatcgctgccaaaactacgtaatggccagcttctacagtacg
1501tccactccctttctgtctctgcctgaatagGGF2蛋白序列MRWRRAPRRSGRPGPRAQRPGSAARSSPPLPLLPLLLLLGTAALAPGAAAGNEAAPAGA SVCYSSPPSVGSVQELAQRAAVVIEGKVHPQRRQQGALDRKAAAAAGEAGAWG⑶REPPAAGPRALGPPAEEPLLAA NGTVPSWPTAPVPSAGEPGEEAPYLVKVHQVWAVKAGGLKKDSLLTVRLGTWGHPAFPSCGRLKEDSRYIFFMEPDA NSTSRAPAAFRASFPPLETGRNLKKEVSRVLCKRCALPPQLKEMKSQESAAGSKLVLRCETSSEYSSLRFKWFKNGN ELNRKNKPQNIKIQKKPGKSELRINKASLADSGEYMCKVISKLGNDSASANITIVESNATSTSTTGTSHLVKCAEKE KTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPEGGF2产生将一瓶2. 2 X IO6细胞/mL的GGF2解冻到IOOml的Acorda培养基1 (见表2)，及扩展直到达到足够数，以接种产生容器。将细胞在21通气的滚瓶中以1. 0 X IO5细胞/mL接种于生产培养基Acorda培养基2 (见表幻。将滚瓶维持于37°C 5天，然后降低到 27°C^6天。监控滚瓶的细胞计数及总体外观，但它们不进料。一旦活力到10%以下，将细胞旋转出，及收获条件培养基及无菌过滤。表2:培养基1
物品供应商货号终浓度CD-CHOInvitrogen10743-029-移出50ml，然后添加以下成分FeSO4-EDTASigmaF-0518Ix ( 10ml/L)L-谷氨酰胺Cellgro25-005-CI4mM ( 20ml/L )重组人胰岛素Sigma1-9278290 V/L ( lml/L)非-必要的氨基酸Cellgro25-025-CIIx ( 10ml/L)胨 4 型大豆 -HySoySigmaP0521粉末-制备20 χ在CD-CHO ( 50ml/L )中庆大霉素Invitrogen15750-078IOOpg ( 2ml/L )表3:培养基权利要求
1.给哺乳动物施用包括表皮生长因子-样(EGF-样)结构域的多肽的方法，所述方法包括在所述哺乳动物神经损伤后施用包括表皮生长因子-样(EGF-样)结构域的多肽；及， 在神经损伤后至少2天时起始所述施用。
2.权利要求1的方法，其中所述起始步骤在神经损伤后至少3天时开始。
3.权利要求1的方法，其中所述起始步骤在神经损伤后至少7天时开始。
4.权利要求1的方法，其中所述EGF-样结构域由神经调节蛋白(NRG)-I基因，(NRG)-2 基因，(NRG)-3基因，(NRG)-4基因编码。
5.权利要求1的方法，其中所述多肽是GGF2。
6.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
7.给哺乳动物施用包括表皮生长因子-样(EGF-样)结构域的多肽的方法，所述方法包括在所述哺乳动物神经损伤后施用包括表皮生长因子-样(EGF-样)结构域的多肽； 在神经损伤后6小时内起始所述施用；及， 持续所述施用步骤至多于损伤后6小时的时期。
8.权利要求7的方法，其中所述持续步骤包括持续施用步骤至多于损伤后48小时的时期。
9.权利要求7的方法，其中所述持续步骤包括持续施用步骤至多于损伤后72小时的时期。
10.权利要求7的方法，其中所述EGF-样结构域由神经调节蛋白(NRG)-I基因， (NRG)-2基因，(NRG)-3基因，(NRG)_4基因编码。
11.权利要求7的方法，其中所述多肽是GGF2。
12.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.在哺乳动物缺血性中枢神经系统神经损伤后施用包括表皮生长因子-样 (EGF-样)结构域的多肽的方法，所述方法包括在所述哺乳动物神经损伤后施用所述肽；及，在哺乳动物达到完全损伤后缺血性损伤细胞死亡体积后起始所述施用。
14.权利要求13的方法，其中所述EGF-样结构域由神经调节蛋白(NRG)-I基因， (NRG)-2基因，(NRG)-3基因，(NRG)_4基因编码。
15.权利要求13的方法，其中所述多肽是GGF2。
全文摘要
本发明涉及在神经损伤后在急性窗后或在慢性时期治疗神经损伤。
文档编号A61P25/28GK102159237SQ200980136712
公开日2011年8月17日 申请日期2009年8月17日 优先权日2008年8月15日
发明者A·卡加诺, J·艾希 申请人:阿索尔达治疗公司