向个体的肿瘤引流淋巴结递送cd40激动剂的制作方法

专利名称：向个体的肿瘤引流淋巴结递送cd40激动剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及CD40激动剂用于治疗癌症、癌变前病症或感染性疾病的用途，其中将 CD40激动剂局部给予并靶向个体的肿瘤引流淋巴结。
背景技术：
许多肿瘤避开我们免疫系统的监视。在癌症患者中，除去肿瘤细胞的免疫系统的特异性机制明显存在定量和/或定性缺陷。这些机制之一是由细胞毒性T细胞(CTL)提供的，所述细胞毒性T细胞可以识别并杀死被病毒感染或转化成癌细胞的细胞。已知T辅助细胞不直接向CTL提供辅助信号(通过分泌IL2)，相反地，T辅助细胞向仅诱导部分特征化的细胞表面和/或可溶分子的树突细胞(DC)提供信号，所述部分特征化的细胞表面和/ 或可溶分子可以在缺少T辅助细胞的情况下激活CTL。T辅助细胞向DC所提供的信号受 CD40L-CD40相互作用介导。该新发现已为癌症免疫疗法提供了独特的机会。据利用CD40激动剂的研究报道，刺激CD40受体引发与抗肿瘤活性有关的作用的级联。例如，已经证明刺激抗原呈递细胞上的CD40受体增强它们的成熟、抗原呈递功能、共刺激潜能以及它们释放免疫调节细胞因子(Lee et al. , PNAS USA，1999，96 (4) :1421_6 ； Cella et al.，J. Exp. Med.，1996，184 (2) :747_52)。这些免疫刺激作用和直接抗肿瘤作用的意义在动物模型中已有说明，其中已经证明CD40激动剂抗体阻止肿瘤生长并逆转肿瘤
(Diehl et al. ， Nature Med. , 1999,5(7) 774-9 ；Francisco et al. ， CancerRes.， 2000,60(12) :32225-31)。此外，全身给予或肿瘤内注射抗CD40激动剂单克隆抗体激活肿瘤引流淋巴结内的DC。这些激活的DC触发无一例外地驻留在肿瘤引流淋巴结内的、一群惰性的所谓“平衡”肿瘤特异性T细胞，作为DC介导的激活的直接结果，其迁出肿瘤引流淋巴结而成为全身循环的杀肿瘤效应细胞，从而介导肿瘤根除(van Mierlo et al. 2002 ；van Mierlo et al. ，2004)。因此，⑶40激动剂的用途在理论上非常有前途。然而，其在人临床研究中的使用涉及毒性，即非常重要的细胞因子释放综合征，其特征是可以威胁生命且剂量限制性的发烧、发冷以及血管作用(Vonderheide et al, Journal ofClinical Oncology, 2007, 25 876-883)。因此，仍然需要利用⑶40激动剂治疗癌症，其中所述治疗比用⑶40激动剂的已知治疗毒性更低。发明描述本发明人证明将CD40激动剂选择性靶向肿瘤引流淋巴结是一种局部给药形式， 与典型的全身给药相比具有几种优势。尽管这是例如通过在肿瘤附近皮下或皮内注射CD40 激动剂而实现的局部给药，但是其仍然诱导全身抗肿瘤应答。不期望受限于任何理论，我们期望通过向肿瘤引流淋巴结选择性递送CD40激动剂会激活存在于肿瘤引流淋巴结内的 “平衡” T细胞，从而使局部T细胞应答变成全身杀肿瘤T细胞应答(参阅上文)。另外，作为本发明的关键部分，毒性较低的作用与这种特异性给药模式有关，因为与全身给药相比， 剂量会大幅度降低。实际上，如下文所述，可以使用非常低量的CD40激动剂来诱导期望的抗肿瘤作用。
因此，本发明第一方面提供了 CD40的激动剂在制备用于治疗个体的癌症、癌变前病症或感染性疾病的药物中的用途，其中将所述药物局部给予并靶向所述个体的肿瘤引流淋巴结。CD40 激动剂在本发明中，CD40激动剂是这样的分子，其与个体的CD40分子特异性结合，并且在下文所述的任何测定中，当其与所述个体的表达CD40的细胞、组织或器官(organism)接触时，增加或增强或诱导一种或多种CD40活性达至少约5%。在一些实施方案中，激动剂激活一种 CD40 活性达至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 85% 或更多。在一些实施方案中，激活在⑶40L(⑶40配体)的存在下发生。在一些实施方案中，使用全血白细胞表面分子上调测定来测量激动剂的活性。在另一实施方案中，利用测量IL-12释放的树突细胞测定来测量激动剂的活性。在另一实施方案中，通过评价激动剂激活CTL的能力来测量其活性。通过使用荧光标记的单克隆抗体和流式细胞术评价诸如CD62L、CD25、CD69 的细胞表面标记，在体外氚掺入测试中测定对它们的特异性抗原的增殖能力以及用细胞内细胞因子染色或ELISA分析细胞因子的产生，可以分析CTL激活。在另一实施方案中，利用体内肿瘤模型来测量激动剂的活性。在该实施方案中，激动剂的活性通过如下方式测量通过PBMC或淋巴组织切片的四聚体染色来评价⑶8细胞毒性T细胞活性；或通过⑶4+和⑶8+ 细胞的细胞内细胞因子染色，同时染色⑶4、⑶8和包括干扰素Y、IL-4、IL-5和TNF α在内的不同细胞因子；或通过利用静脉内注射的脾靶细胞的体内细胞毒性测定，所述脾靶细胞用不同浓度的彩色CFSE染色并装载有特异性靶肽或不相关肽。⑶40的激动剂的活性可通过对树突细胞或T细胞的酶联免疫吸附测定(ELISA)、 蛋白免疫印迹或诸如免疫化学或RNA表达测定的其他技术检测。在优选的实施方案中，⑶40激动剂是激动剂⑶40抗体。本发明的⑶40激动剂可以通过常规生产和筛选技术制备。大鼠和仓鼠抗小鼠⑶40单克隆抗体(“Mabs")各自描述于 Nature 393 :474_77 (1998)，并且可以商购获得(Pharmingen，Inc.，CA)。抗小鼠 CD40 抗体称为FGK45，用于下文所述的实验中，由Rolink. A. et al. , Immunity 5，319-330 (1996) 做了描述。在优选的实施方案中，为了治疗人个体，使用抗人CD40抗体或人CD40抗体。采用本领域熟知并且由 G. Khler and C. Milstein (Nature, 1975 256 495-497)描述的技术， 可以制备此类人抗体。本文所用的“人抗体”意指可变和恒定结构域序列来自人序列的抗体。人CD40抗体详细描述于W003/040170。因为预期降低人患者中与非人抗体的使用相关的免疫原性应答和变应性应答，所以人抗体在本发明的用途中提供了实质性优势。通过用在细胞上表达或由人血浆或尿纯化的天然CD40或者在真核或原核系统中表达的重组CD40或其片段免疫啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)可以产生抗体。其他动物，如非人灵长类、表达人免疫球蛋白的转基因小鼠和移植有人B淋巴细胞的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠可以用于免疫。如 G.Kohler and C. Milstein，Nature，1975 256 495-497所述，将来自免疫的动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞(如Sp2/0和NS0)融合，通过常规方法可以产生杂交瘤。另外，通过在噬菌体展示系统中从人B淋巴细胞筛选重组单链 Fv或Fab文库可以产生抗⑶40抗体。为了治疗人个体，激动性抗CD40抗体优选为嵌合抗体、去免疫化抗体、人源化抗体或人抗体。这样的抗体可以减少免疫原性并且因此避免人抗小鼠抗体(HAMA)应
4答。优选地，抗体为IgG4、IgG2或不增加抗体依赖性细胞细胞毒性(S. MCanfield and S. L. Morrison, J. Exp. Med. , 1991 173 1483-1491)和补体介导的细胞溶解(Y. Xu et al.，J. Biol. Chem.，1994 269 :3468_3474 ；V. L. Pulito et al.，J. Immunol.，1996 ；156 2840-2850)的其他遗传突变的IgG或IgM。嵌合抗体可以通过本领域熟知的重组方法产生，并且具有动物可变区和人恒定区。人源化抗体通常比嵌合抗体具有更高程度的人肽序列。在人源化抗体中，仅负责抗原结合和特异性的互补性决定区(CDR)是动物来源的，并具有对应于动物抗体的氨基酸序列， 且基本上该分子的所有剩余部分(除了在某些情况下可变区内的构架区的小部分)是人来源的，并且在氨基酸序列上对应于人抗体(参阅L. Riechmann et al.，Nature, 1988 ；332 323-327 ；G. Winter，美国专利号 C. Queen et al.，美国专利 5，530，101 号)。如国际专利申请PCT/GB98/01473所述，去免疫化抗体是已经除去T和B细胞表位的抗体。当体内应用时，它们的免疫原性降低。人抗体可以通过不同的方式制备，包括使用人免疫球蛋白表达文库(Stratagene Corp.，La Jolla, California)产生人抗体 VH、VL、Fv、FcUFab 或(Fab' ) 2 的片段，并利用与产生嵌合抗体相似的技术用这些片段构建全人抗体。可选地，这些片段可对它们自身用作激动剂。人抗体也可以在具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠中产生。这样的小鼠可以从 Abgenix. Inc. , Fremont, California 禾口 Medarex, Inc. , Annandale, New Jersey 获得。还可以产生单肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区相连。单链抗体(“ScFv") 以及它们的构建方法描述于美国专利4，946，778号。可选地，Fab可以通过相似的方式构建和表达(M. J. Evans et al.，J. Immunol. Meth.，1995 ； 184 123-138)。所有的完全和部分人抗体比完全鼠MAb具有较少的免疫原性，并且片段和单链抗体也具有较少的免疫原性。 所有这些类型的抗体因此不太可能引起免疫应答或变应性应答。因此，它们比完全动物抗体更适于人个体体内给药，特别是当需要重复或长期给药时。另外，较小的抗体片段可以有助于改善组织生物利用度，这对于诸如肿瘤治疗的急性疾病指征中更好的剂量累积是关键的。优选的人抗CD40抗体已经广泛描述于WO 2005/063289中。基于抗CD40抗体可变区的分子结构，可以使用分子建模和合理的分子设计来产生和筛选模拟抗体结合区的分子结构并激活CTL的分子。这些小分子可以是肽、拟肽类 (P印tidomimetic)、寡核苷酸或其他有机化合物。模拟分子可以用于治疗癌症。可选地，可以使用本领域常用的大规模筛选方法从化合物文库中分离适宜的分子。在一实施方案中，同时或顺序使用几种⑶40激动剂。 本发明涉及将CD40激动剂给予优选人个体的个体的方法。优选将CD40激动剂局部给予并靶向个体的肿瘤引流淋巴结。关键是进行CD40激动剂的局部给药。换言之，本发明不涉及CD40激动剂的全身给药。优选地，本发明限定向个体局部给予CD40激动剂的具体方式。优选地，CD40激动剂的局部给药靶向个体的肿瘤引流淋巴结。在更优选的实施方案中，靶向肿瘤引流淋巴结的局部给药通过在肿瘤引流淋巴结附近给予CD40激动剂或将 CD40激动剂给予至肿瘤引流淋巴结内实现。在本文中“在附近”优选表示肿瘤引流淋巴结的约几cm或几cm或更少。在本文中，“在附近”优选表示远离肿瘤引流淋巴结的位点几cm或更少。不将CD40激动剂本身直接给予至肿瘤引流淋巴结内。然而，这样给予CD40激动剂，优选将给予的CD40激动剂选择性地递送至肿瘤引流淋巴结内。优选将CD40激动剂间接给予或选择性地给予至肿瘤引流淋巴结内或靶向肿瘤引流淋巴结这表示并不是将其直接给予至肿瘤引流淋巴结内，而是给予的方式会优选导致这样的事实，即至少30%最初给予的⑶40激动剂会到达肿瘤引流淋巴结。优选至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、 98%、99%或100%。肿瘤引流淋巴结内⑶40激动剂的存在优选通过用680-700nm范围内的荧光基团(例如ALEXA-荧光基团)标记的特异性CD40激动剂抗体(优选实施例中所确定的FGK45)的活检或生物成像的免疫染色来评价，将所述抗体注射到个体内，其中在手术过程中可以用照相机检测荧光标记的抗体(照相机指导的手术)。在优选的实施方案中，不以肿瘤内的方式给予CD40激动剂。肿瘤内给药并不总是优选的，因为每个肿瘤都不同(即血管形成、组织分布、渗透压……)，因此化合物的肿瘤内给药不能标准化，并且治疗效果是不可预测的。在优选的实施方案中，经由皮下或皮内注射将CD40的激动剂局部给予并靶向个体的肿瘤引流淋巴结。更优选地，直接向个体的肿瘤引流淋巴结进行皮下或皮内注射。在另一优选的实施方案中，注射位置位于肿瘤和最近的肿瘤引流淋巴结之间的区域，或者直接在肿瘤引流淋巴结内。在另一优选的实施方案中，将CD40激动剂给予至淋巴管内。更优选的淋巴管是足背部的淋巴管。在该更优选的实施方案中，利用进行淋巴管造影术时所用的相似技术(Guermazi et al. , Radiograph. 2003 23 :1541_1560 禾口 Follen et al. , Cancer Supp 1. 2003 98 :2028_2038)，通过在个体的淋巴结进行副主动脉注射，将CD40的激动剂局部给予并靶向所述个体的肿瘤引流淋巴结。通过淋巴管造影术方法，在足的背部给予药物， 在这种情况下是CD40激动剂，然后其沿淋巴通道选择性地迁移到这些淋巴管所引流至的淋巴结内。如果在足的背部给药(Follen et al.，Cancer Supp 1. 2003 98 :2028_2038)，其会选择性地靶向骨盆的淋巴结，之后靶向副主动脉淋巴结。如本文稍后所述，这是用于治疗妇科肿瘤的有利给药方式。本发明因此包括注射入足的背部、注射入骨盆淋巴结(直接或间接作为注射入足背部的结果)、副主动脉注射(直接或间接经由注射入足背部或经由注射入骨盆淋巴结)。在本发明中，皮下注射优选表示肿瘤附近的皮下注射，所述肿瘤优选具有皮下或皮内定位。在本发明中，皮内注射优选表示肿瘤附近的皮内注射，所述肿瘤优选具有皮下或皮内定位。在另一优选的实施方案中，通过淋巴静脉注射，将CD40的激动剂局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结。该技术是技术人员已知的，如淋巴管造影术领域的技术人员。本发明还包括将CD40激动剂顺序或同时，优选皮下局部给予并靶向一个或多个肿瘤引流淋巴结。本发明还包括将⑶40激动剂优选皮下、皮内和/或通过如淋巴管造影术中的若干直接淋巴静脉注射局部给予并靶向一个肿瘤弓I流淋巴结。局部给药并靶向肿瘤引流淋巴结具有几个优势。首先，其将CD40激动剂几乎直接递送至存在于肿瘤引流淋巴结内的DC。这样的激活的DC又激活CTL，这是本领域技术人员已知的。其次，因为这是局部给药，所以我们期望毒性会减少。这在实施例中已经特别得到证明。第三，如本文所证明和广泛解释的，这种局部给药允许使用较低剂量的CD40激动剂。第四，令人惊讶的是，尽管这是局部给药，但是在实施例中已经证明了免疫系统的全身
6激活。本文所确定的CD40的激动剂的使用优选导致疗效。疗效可以是抗肿瘤和/或抗感染性作用。抗肿瘤作用优选按如下确定-激活或诱导全身免疫系统治疗至少一周后，外周血内肿瘤特异性激活的CD4+ 或⑶8+T细胞是可检测的和/或增加，或这些T细胞增加或这些T细胞所产生的细胞因子增加，和/或-抑制肿瘤细胞的增殖，和/或_诱导肿瘤细胞死亡或诱导肿瘤细胞死亡增加，和/或-抑制或阻止或延迟肿瘤重量或生长的增加，和/或-延长患者存活至少1个月、几个月或更长(与未治疗或用同型对照治疗的患者相比)。治疗至少1周后，外周血内肿瘤特异性激活的⑶4+或⑶8+细胞的显著增加可以是至少5%、10%、20%、30%或更多。肿瘤细胞增殖的抑制可以是至少20%、30%、40%、 50%、55%、60%、65%、70%或75%或更多。肿瘤细胞死亡的诱导可以是至少1%、5%、 10%、15%、20%、25%或更多。肿瘤生长可以受到至少5%,10%,20%,30%,40%,50%, 55%、60%、65%、70%或75%或更多的抑制。在某些实施方案中，肿瘤重量增加可以受到至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%或75%或更多的抑制。在某些实施方案中，肿瘤生长可以延迟至少1周、1个月、2个月或更长。本文所确定的CD40的激动剂的使用优选导致抗感染性作用。抗感染性作用优选按如下确定-激活或诱导全身免疫系统治疗至少1周后，外周血内特异性激活的CD4+或 ⑶8+T细胞是可检测的或/和增加，所述T细胞专门抗感染因子(infectious agent)或抗感染的细胞(即在本文中称为感染特异性激活的CD4+或CD8+细胞)，或这些T细胞增加或这些T细胞所产生的细胞因子增加，和/或_抑制感染的细胞或抑制感染因子增殖，和/或-诱导感染的细胞或感染因子的死亡或诱导感染的细胞或感染因子的死亡增加， 和/或-抑制或阻止或延迟感染的细胞或感染因子数量的增加，和/或-延长患者存活至少1个月、几个月或更长(与未治疗或用同型对照治疗的患者相比)。治疗至少一周后，外周血中感染特异性激活的⑶4+或⑶8+细胞的显著增加可以是至少5%、10%、20%、30%或更多。感染的细胞(或感染因子)增殖的抑制可以是至少 20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%或75%或更多。感染的细胞(或感染因子)死亡的诱导可以是至少1%、5%、10%、15%、20%、25%或更多。感染的细胞数量的增加可以受到至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%或 75%或更多的抑制。在定量CD40的激动剂的作用的每个实施方案中，可通过与未治疗个体或与治疗前的同一个体进行比较或与用免疫球蛋白同型对照抗体治疗的个体进行比较来进行测定。 在一些实施方案中，肿瘤是⑶40阳性的。在一些实施方案中，肿瘤是⑶40阴性的。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤，如淋巴瘤。可以使用本发明治疗的一些肿瘤或感染类型稍后在本文做了广泛确定。通过下文所述的体外测试和测定或由动物实验或由人临床试验推断，可以容易地确定本发明的激动剂的剂量。我们证明，靶向肿瘤引流淋巴结的给定CD40的激动剂的局部给药剂量可以诱导与使用全身给药的更高剂量的同一激动剂相同的抗肿瘤作用。因此，本发明允许使用较低剂量的CD40激动剂。“较低”优选表示全身给予的CD40的激动剂的剂量(量)的约2-20%。较低也可以表示约30至60%、40至70%或50%至80%的激动剂。 较低也可以表示约20至40%、15至30%或10%至20%的激动剂。“较低”优选表示全身给予的⑶40的激动剂的剂量(量)的2-20%。较低也可以表示30至60%、40至70%或 50 %至80 %的激动剂。较低也可以表示20至40 %、15至30 %或10 %至20 %的激动剂。 在优选的实施方案中，将至少20μ gCD40激动剂的剂量以单次剂量局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结,优选至少30 μ g、至少40 μ g、至少50 μ g、至少60 μ g、至少70 μ g、至少80 μ g、至少90 μ g、至少100 μ g。在另一优选的实施方案中，将不多于100 μ g的单次剂量局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结，不多于90 μ g、不多于80 μ g、不多于70 μ g、不多于60 μ g、不多于 50 μ g、不多于40 μ g、不多于30 μ g、不多于20 μ g。用30 μ g⑶40激动剂的单次剂量获得非常好的结果。可以用⑶40激动剂治疗的个体包括但不限于已经诊断为患有癌症、癌变前病症或感染性疾病的个体。癌症的实例包括脑癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠直肠癌、结肠癌、妇科癌(如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌或外阴癌、HPV来源的癌)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌(如甲状腺、副甲状腺或肾上腺癌)、软组织肉瘤、白血病、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、霍奇金病、淋巴细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、肝癌、肾癌、肾或输尿管癌(如肾细胞癌、肾盂癌)或中枢神经系统瘤(如原发性CNS淋巴瘤、脊柱瘤(spinal axis tumor)、脑干胶质瘤或垂体腺瘤)、神经胶质瘤或纤维肉瘤。感染性疾病的实例包括可能导致癌症的感染，如HPV、HCV、HBV、HTLV 1、8型疱疹病毒(卡波西肉瘤因子)、EBV或 HIV感染。本文所用术语"个体"优选表示表达交叉反应性CD40的人或非人哺乳动物(如灵长类、猕猴或恒河猴)。优选，被治疗的个体是人。在优选的实施方案中，将CD40的激动剂的一次单次给药局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结。在现有技术中，经常使用几次顺序的全身CD40激动剂给药以获得既定效果(参阅例如WO 2005/063289)。对于个体而言，这是相当不方便且复杂的。另外，毒性经常相当高。令人惊讶的是，本发明人发现，局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结的CD40激动剂单次给药的活性足以诱导免疫系统的全身激活，从而获得特异性抗肿瘤应答或抗感染性应答，这在实施例中得到证明。另外，该CD40激动剂给药伴随较少毒性作用至无毒性作用。在另一优选的实施方案中，将CD40激动剂配制于所谓的缓释制剂或缓释媒介物中。这样的制剂也称为缓释或控释制剂。控释制剂是这样的制剂，其在1天、1周、2周、3 周、1个月或更长的时间内以可控的方式释放至少20 %、至少25 %、至少30 %、至少35 %、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%的其活性成分，即CD40激动剂。释放速率可以通过葡聚糖分子和交联剂之间的比例来调整，并且制剂内的水含量可以根据所需的暴露于治疗化合物的时期来调整。优先的交联剂是丙烯酸甲酯。这种制剂具有几种优势首先，预计不需要重复给予CD40激动剂，因为一旦以这种类型的制剂给药，当从该制剂释放时，会在延长的时间段内递送CD40激动剂。这样的延长的时间段可以在1天、1周、1个月到数月之间变动，这取决于所用的缓释制剂的类型。其次，预计毒性进一步降低，因为预计CD40激动剂的非常低的局部量是可检测的。我们期望，这样的低局部量可以比用相同抗体进行全身治疗所需的剂量低10倍。预计这样的 “低”量不诱导任何毒性，但是预计在诱导本文所限定的抗肿瘤作用或抗感染性作用中发挥作用。本发明并不限于具体类型的缓释制剂。几种类型的缓释制剂是已知的，如矿物油(如 Montanide ISA 51)或基于聚乳酸-共-乙醇酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA)或聚合物的制剂。基于聚合物的制剂的实例是，WO 2005/110377所述的包含带电聚合物的凝胶组合物，或W002/17884或WO 2005/051414或US 3，710, 795所述的包含葡聚糖水凝胶的组合物。在优选的实施方案中，用水含量为30%、40%、50%、60%的葡聚糖水凝胶配制⑶40激动剂。更优选地，水含量的范围为45%至55%，更优选为约50%，或为50%。 优选地，将2、3、4、5、6、7、8、9、10μ g的CD40激动剂配制于此类葡聚糖水凝胶中。据发现， 水含量为50%的葡聚糖水凝胶和5μ gCD40激动剂在实验部分中特别有吸引力其看起来表现为可能最慢的制剂，在血清中检测不到CD40激动剂，而对T细胞应答的影响可以检测到(参阅实验部分)。在另一进一步优选的实施方案中，将CD40激动剂与由DC特异性识别的化合物连接、融合或结合或混合。以此方式，期望进一步改善CD40激动剂对淋巴结内DC的靶向。此类化合物的实例是DC上DC-SIGN C型凝集素的配体，其会结合存在于DC表面的DC-SIGN。 另一实例是 DC 上 DEC-205 分子的配体(Bozzacco, L.，Trumpfheller, C.，Siegal, F. P.， Mehandru, S. , Markowitz, M. , Carrington, Μ. , Nussenzweig, M. C. , Piperno, A. G. , and Steinman, R. Μ. (2007) · DEC_205receptor on dentritic cells mediates presentation of HIV gag protein to CD8+T cells in a spectrum of human MHC I haplotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 104，1289-1294.)其他分子/治疗在一实施方案中，CD40激动剂与另一分子和/或另一治疗一起使用(同时或顺序)。另一治疗的实例包括另一典型癌症治疗，如化疗、放疗。另一分子的实例包括诸如顺钼的DNA复制抑制剂和/或肽，优选CTL激活肽和/或T辅助细胞激活肽和/或另一化合物。在优选的实施方案中，将CD40激动剂与另一化合物或分子联合使用，所述化合物或分子能刺激免疫系统，即免疫刺激化合物，后文称为第二刺激化合物。本文早先已经限定了所述第二刺激化合物对免疫系统优选全身免疫系统的激活或诱导。优选的第二化合物是抗体。优选的抗体包括CTLA4封闭抗体、抗0X40激活抗体和抗41BB激活抗体。可以同时或顺序给予CD40激动剂和第二刺激化合物。更优选将CD40激动剂和第二刺激化合物配制于一种单一组合物中，甚至更优选配制于本文早先所限定的缓释制剂中。这两种或更多种化合物的使用允许协同激活T细胞，这在实施例中已得到证明。可以用于人的优选CTLA4 封闭抗体描述于 Camacho et al，J. Clin. Oncol. (2009)，27 1075-1081 中。与CD40抗体联合使用的CTL激活肽广泛描述于WO 99/61065中。CTL激活肽或T辅助细胞激活肽优选为肿瘤来源或病毒来源的肽。认为CTL激活肽或T辅助细胞激活肽不限于任何长度。然而，优选的是，此类肽的长度为19至45个氨基酸。所述氨基酸序列优选完全或部分来自肿瘤细胞所表达的蛋白。包含于所述肽的来自蛋白的连续氨基酸序列的长度优选为 19-45、22-45、22-40、22-35、24-43、26-41、28-39、30-40、30-37、30-35、32-3533-35、 31-34个氨基酸。在另一优选的实施方案中，肽包含蛋白的22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 或多于 45 个连续氨基酸残基。当癌症为HPV相关癌症和/或感染为HPV感染时，优选的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽来自 HPV蛋白。在另一优选的实施方案中，CTL激活肽或T辅助细胞激活肽的由来自诸如HPV E2、 E6和E7，p53、PRAME、NY-ES0-1的肿瘤相关蛋白或者任何其他肿瘤相关或肿瘤特异性蛋白或者任何感染相关或感染特异性蛋白的氨基酸序列的长度为9-45个氨基酸的任何连续氨基酸序列组成。HPV血清型16E2、E6和E7蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID No. 1、2和3 中。HPV血清型18E2、E6和E7蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID No. 4、5和6中。人p53 的氨基酸序列示于SEQ ID No. 7中。优选的CTL-激活肽或T辅助细胞激活肽来自HPV E2、E6或E7。在实验部分，两种来自不同肿瘤相关蛋白的肽用作本发明所用的适宜肽的实例一种肽确定为长合成CEA肽并且来自癌胚抗原(CEA)，其在多个不同的上皮肿瘤类型中过表达；第二种肽是长合成HPV 肽，其来自HPV E7蛋白。更优选的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽来自HPV E2、E6或E7， 并公开于WO 02/070006中。优选地，包含选自HPV E2、E6或E7蛋白的全长氨基酸序列的连续氨基酸序列或由选自HPV E2、E6或E7蛋白的全长氨基酸序列的连续氨基酸序列组成的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽来自高风险HPV血清型，如血清型16、18、31、33或45，更优选来自HPV E6和E7血清型16、18、31或33的氨基酸序列，最优选来自血清型16或18， 其中16是最优选的。优选的来自E2的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽由以下氨基酸组成或包含以下氨基酸HPV E2蛋白的氨基酸46-75、HPV E2蛋白的氨基酸51-70、HPV E2蛋白的氨基酸 61-76,HPV E2蛋白的氨基酸151_195、HPVE2蛋白的氨基酸316_330、HPV E2蛋白的氨基酸 311-325、HPV E2蛋白的氨基酸326-355、HPV E2蛋白的氨基酸346-355、HPV E2蛋白的氨基酸 351-365。优选的来自E6的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽由以下氨基酸组成或包含以下氨基酸HPV E6蛋白的氨基酸1-32、HPV E6蛋白的氨基酸11-32、HPV E6蛋白的氨基酸 13-22、HPV E6蛋白的氨基酸19-50、HPV E6蛋白的氨基酸29-38、HPV E6蛋白的氨基酸 37-68,HPV E6蛋白的氨基酸41-65、HPV E6蛋白的氨基酸52-61、HPV6蛋白的氨基酸51-72、 HPV E6蛋白的氨基酸55-80、HPV E6蛋白的氨基酸55_86、HPV E6蛋白的氨基酸61_82、HPV E6蛋白的氨基酸71-92、HPV E6蛋白的氨基酸71_95、HPV E6蛋白的氨基酸73_105、HPV E6 蛋白的氨基酸85-109、HPV E6蛋白的氨基酸91-112、HPV E6蛋白的氨基酸91_122、HPV E6 蛋白的氨基酸101-122、HPV E6蛋白的氨基酸109_140、HPV E6蛋白的氨基酸121_142、HPV E6蛋白的氨基酸129-138、HPV蛋白的氨基酸127-140、HPV E6蛋白的氨基酸127-158、HPV E6蛋白的氨基酸129-138、HPV E6蛋白的氨基酸137-146、HPV E6蛋白的氨基酸149-158。优选的来自E7的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽由以下氨基酸组成或包含以下氨基酸HPV E7蛋白的氨基酸1-32、HPV E7蛋白的氨基酸1_35、HPV E7蛋白的氨基酸 11-19、HPV E7蛋白的氨基酸21-42、HPV E7蛋白的氨基酸22-56、HPV E7蛋白的氨基酸 35-77、HPV E7蛋白的氨基酸35-50、HPV E7蛋白的氨基酸50-62、HPV E7蛋白的氨基酸 43-77、HPV E7蛋白的氨基酸51-72、HPV E7蛋白的氨基酸64-98、HPV E7蛋白的氨基酸 76-86。另一优选的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽来自p53蛋白，优选人p53。优选的来自p53的CTL激活肽或T辅助细胞激活肽由以下氨基酸组成或包含以下氨基酸 P53蛋白的氨基酸86-115、p53蛋白的氨基酸102-131、p53蛋白的氨基酸101-110、p53 蛋白的氨基酸112-120、p53蛋白的氨基酸113-120、p53蛋白的氨基酸113-122、p53蛋白的氨基酸117-126、p53蛋白的氨基酸142-171、p53蛋白的氨基酸149-157、p53蛋白的氨基酸154-163、p53蛋白的氨基酸154-164、p53蛋白的氨基酸156-163、p53蛋白的氨基酸156-164、p53蛋白的氨基酸157-186、p53蛋白的氨基酸172-181、p53蛋白的氨基酸190-219、p53蛋白的氨基酸196-205、p53蛋白的氨基酸205-214、p53蛋白的氨基酸224-248、p53蛋白的氨基酸225-254、p53蛋白的氨基酸241-270、p53蛋白的氨基酸257-286、p53蛋白的氨基酸229-236、p53蛋白的氨基酸264-272、p53蛋白的氨基酸264-272、p53蛋白的氨基酸273-302、p53蛋白的氨基酸283-291、p53蛋白的氨基酸305-334、p53蛋白的氨基酸311-319、p53蛋白的氨基酸311-320、p53蛋白的氨基酸312-319、p53蛋白的氨基酸322-330、p53蛋白的氨基酸340-348、p53蛋白的氨基酸353-382、p53蛋白的氨基酸360-370、p53蛋白的氨基酸363-370、p53蛋白的氨基酸363-372、p53蛋白的氨基酸369-393、p53蛋白的氨基酸373-381、p53蛋白的氨基酸 374-382、p53 蛋白的氨基酸 376-386。本发明还包括CTL激活肽或T辅助细胞激活肽，其氨基酸序列与本文所确定的序列之一具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%的同一性，且其中该肽不是HPV E2、E6、E7或p53蛋白。优选地，肽由其与所确定的序列之一的同一性来限定，并且具有本文之前所确定的长度。同一性按如下计算在比对两条序列以确保获得最高数量的相同氨基酸后，限定这两条序列之间的相同氨基酸的数量。本发明所用的这样长度的肽可以容易地合成。本领域目前已知许多产生肽的方式。本发明并不限于所产生的肽的任何形式，只要所产生的肽包含任何给定的序列、由任何给定的序列组成或与任何给定的序列重叠，并具有本文之前限定的所需活性。肽可以以单独的肽存在或并入融合蛋白中。肽还可以通过以下方式进行修饰通过一个或多个氨基酸的缺失或取代，用其他氨基酸或官能团在N和/或C末端延伸，这可以改善生物利用度、靶向T细胞，或者包含或释放提供佐剂或(共)刺激功能的免疫调节物质。N和/或C末端处的任选的其他氨基酸优选不存于在其所源自的蛋白的氨基酸序列中的相应位置。可选地， 肿瘤细胞可以分离自待治疗的个体，并且CTL激活肽可以根据这些肿瘤细胞确定，并随后配制为短或长的合成肽。在另一优选的实施方案中，将CD40激动剂和任选的CTL激活肽和/或T辅助细胞激活肽配制为组合物。优选地，组合物是药物组合物。此类药物组合物优选还包含药用赋形剂和/免疫调节剂。可以将任何已知的惰性药学可接受的载体和/或赋形剂添加到组合物中。药物的配制和药学可接受的赋形剂的使用在本领域内是已知且常用的，并且描述于例
11如 Remington ;The Science and Practice of Pharmacy,2Ind Edition 2005, University of Sciences in Philadelphia。本发明所用的CD40激动剂和任选的CTL激活肽优选可溶于生理可接受的水性溶液(如PBS)，所述水性溶液包含不多于35 %递减至0 %的DMS0，即35 %、20 %、10 %、5 %或 0%的DMS0。在此类溶液中，CD40激动剂优选在浓度为至少0. 5、1、2、4、6、8或IOmg CD40 激动剂/ml时是可溶的。在此类溶液中，CTL激活肽优选在浓度为至少0.5、1、2、4或8mg肽 /ml时是可溶的。可以将任何已知的免疫调节剂添加到本文所限定的组合物中。优选免疫调节剂是佐剂。更优选地，所述组合物包含本文之前限定的肽和至少一种佐剂。佐剂可以是配制于Montanide或PBS中的水包油型乳剂，如弗氏不完全佐剂、Montanide ISA51 (Seppic, France)、Montanide 720 (Seppic，France)或TLR配体。该类型的药物可以以单次给药的方式给予。可选地，本文之前所限定的CD40激动剂和任选的CTL激活肽和/或佐剂的给药若需要可以重复，和/或可以顺序给予不同的CD40激动剂和/或不同的CTL激活肽和/或不同的佐剂。特别优选的佐剂是已知经由Toll样受体(TLR’ s)发挥作用的佐剂(Kawai & S. Akira Signaling to NF- κ B by Toll-like receptors Trends in Molecular medicine Vol. 13,p. 460-469,2007)。能激活先天免疫系统的佐剂可以经由下述途径受到特别好的激活经由Toll样受体(111 ’8)，包括11^’8 1-10 ；和/或经由RIG-I (视黄酸诱导型基因-1) 蛋白；和/或经由内皮素受体。能激活TLR受体的化合物和其修饰物(modification)和衍生物在本领域内有充分的评述。TLRl可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，TLR2可以另外地被革兰氏阳性细菌的糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自细菌或宿主的热休克蛋白以及分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖激活。TLR3可以被dsRNA特别是病毒来源的dsRNA或被化合物poly(I:C)激活。TLR4可以被革兰氏阴性LPS、LTA、宿主或细菌来源的热休克蛋白、 病毒外壳或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含有寡糖的乙酰透明质酸以及纤连蛋白激活。 TLR5可以被细菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝杆菌脂蛋白和B组链球菌(group B Streptococcus)热不稳定可溶因子(GBS-F)或葡萄球菌(Staphylococcus)调控蛋白 (modulin)激活。TLR7可以被咪唑并喹啉和衍生物激活。TLR9可以被未甲基化的CpG DNA 或染色质-IgG复合物激活。特别地，TLR3、TLR4、TLR7以及TLR9在介导抗病毒感染的先天免疫应答中发挥重要作用，并且特别优选能激活这些受体的化合物用于本发明中。特别优选的佐剂包括但不限于合成产生的化合物，包括dSRNA、poly(I:C)、触发TLR3和TLR9受体的未甲基化的CpG 0嫩、扣31、111 9激动剂、通54￥4(、11^4激动剂。在另一优选的实施方案中，佐剂物理连接至本文之前所限定的肽。佐剂和共刺激化合物或官能团与包含肽的I型 HLA和II型HLA表位的物理连接通过同时刺激抗原呈递细胞特别是树突细胞来提供增强的免疫应答，所述抗原呈递细胞内化、代谢并展示抗原。另一优选的免疫修饰化合物是T细胞粘附抑制剂，更优选诸如BQ-788的内皮素受体抑制剂(Buckanovich RJ et al，Ishikawa K，PNAS (1994)91 4892)。BQ-788是N-顺式-2，6- 二甲基哌啶子基羰基-L- γ -甲基亮氨酰-D-I-甲氧基羰基色胺酰-D-正亮氨酸。然而，BQ-788的任何衍生物或修饰的BQ-788化合物也包括于本发明的范围内。此外，W099/61065和W003/084999所述的APC(共)刺激分子与存在于本发明所用药物中的CD40激动剂和任选的CTL激活肽的联合使用是优选的。特别地，优选单独使用 4-1-BB和/或CD40配体或其功能性片段和衍生物以及具有相似的激动性活性的合成化合物，或与存在于药物中的CD40激动剂和任选的CTL激活肽联合使用，给予待治疗的个体以在所述个体中进一步刺激固定最佳免疫应答。在优选的实施方案中，佐剂包括外来体、树突细胞、单磷酰脂质A和/和CpG核酸。因此，在优选的实施方案中，如本文之前所限定的，药物包含CD40激动剂和任选的CTL激活肽自身或者存在组合物中的CD40激动剂和任选的CTL激活肽以及选自以下的佐剂水包油乳剂(Montanide ISA51、Montanide ISA 720)、已知经由Toll样受体发挥作用的佐剂、APC-共刺激分子、外来体、树突细胞、单磷酰脂质A和CpG核酸。在另一优选的实施方案中，为了促进专门的抗原呈递细胞或树突细胞呈递CTL激活肽，包含肽的组合物或药物还包含DC激活剂。给药方式在本领域中是已知且常用的，且描述于例如Remington ;The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition 2005, University of Sciences in Philadelphia。本文已经广泛阐述了⑶40激动剂的给药。本发明所用的CTL激活肽和/ 或任何其他分子的给药可以通过与CD40激动剂相同的方式(同时或顺序)进行。可选地， 可以将CTL激活肽和/或任何其他分子配制为适合静脉内或皮下或肌肉内给药，尽管其他给予途径是可以想象的，如通过注射的粘膜给药或真皮内和/或皮内给药。此外，本发明包括以单次给药的方式给予本发明所用的至少一种CD40激动剂、任选的至少一种CTL激活肽和/或至少一种其他分子或佐剂。可选地，如果需要，可以重复给予本发明所用的至少一种⑶40激动剂、任选的至少一种CTL激活肽和/或至少一种其他分子或佐剂。因此，另一方面提供了治疗癌症、癌变前病症或感染性疾病的方法，其中将CD40 的激动剂局部给予并靶向个体的肿瘤引流淋巴结。本文之前已经广泛限定了该方法的每个特征。优选地，在该方法中，在给予CD40的激动剂之后移除肿瘤引流淋巴结。在本文中，“之后”可以表示7天或者8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天或更长。作为旨在移除原发性肿瘤和可能含有转移的肿瘤细胞的淋巴结的手术方法的一部分，经常移除肿瘤引流淋巴结。该方法是吸引人的，因为其允许存在于肿瘤引流淋巴结中的肿瘤特异性T细胞被CD40激活的DC激活。作为该激活的结果，肿瘤特异性T细胞会在肿瘤引流淋巴结移除之前从该肿瘤引流淋巴结迁移到外周。在该方法中，癌症与本文之前所限定的具有相同涵义。优选地，在此类方法中，肿瘤已经通过手术移除。在本说明书和其权利要求书中，动词“包含”和其变形以其非限制含义使用以表示
包括该词语后的项目，但不排除未特别提到的项目。另外，动词“由......组成”可以由“基
本上由......组成”代替以表示本文所限定的⑶40激动剂或CTL激活肽可以包含特别确
定的组分以外的其他组分，所述其他组分不改变本发明的独特特征。另外，不定冠词“一个 (a)”或“一个(an)”所涉及的元件不排除存在多于一个的所述元件，除非上下文明确要求有1个且仅有1个所述元件。不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”因此通常表示“至少一个”。词语“大约”或“约”当与数值结合使用(约10、约10)时，优选表示该值可以是多于或少于给定值的10%至的值。本说明书所引用的所用专利和参考文献，在此通过引用全文并入。
下面的实施例仅出于说明的目的而提供，并非意图以任何方式限制本发明的范围。


图1 全身给予抗CD40使肿瘤引流淋巴结内部分激活的肿瘤特异性CTL增殖并全身扩散。在全身激动性抗⑶40抗体处理(图la)或无全身激动性抗⑶40抗体处理(图 lb)的情况下，在血液、脾、肿瘤引流和非引流淋巴结中染有四聚体的肿瘤特异性CTL。图2 在用不同方法给予FGK (激动性抗CD40抗体)情况下，右胁具有AR6肿瘤的小鼠的存活曲线。与未处理(nai've)小鼠相比，在肿瘤引流区皮下注射了单剂量30μ gFGK 的小鼠的存活明显增强(Ρ = 0. 002)。当将FGK，即单剂量的30 μ gFGK皮下注射于非引流区中时，没有观察到有益效果(肿瘤引流比非引流区，P = 0.03)。静脉内接受高剂量(3次， IOOyg FGK)的小鼠与肿瘤引流区内s. c.接受低剂量的小鼠存活之间没有观察到显著差已升。图3 不同的方法给药后，血清中所测量的抗CD40抗体(FGK)的毒性。A 在开始抗 ⑶40处理后的第1天和第3天，小鼠血清中所测量的ALAT和ASAT。B和C 在开始抗⑶40 处理后的第1天和第3天的小鼠血清中IL-Ib和IL-6各自的细胞因子浓度。图4 在开始处理后的第3天所分离的不同器官的低温切片的H&E染色。图5 在以下情况中，不用抗体(未处理(naive))或用抗⑶40激动性抗体(FGK45) 处理的具有确定的皮下明显的同源(syngeneiC)AR6(Ad5El诱导的)肿瘤的C57BL/6小鼠的存活曲线，每组8只小鼠1)以100 μ g的剂量连续3天i. ν注射，2)在肿瘤引流区内皮下注射Montanide中的150 μ g，或者3)在对侧胁的非肿瘤引流区中注射150 μ g。图6 带有肿瘤的小鼠外周静脉血中腺El特异性CTL的检测，所述小鼠未进行处理(未处理)或者如图5所述，i. v.注射抗CD40激动剂抗体(FGKIV)或在肿瘤引流区中皮下注射(FGK皮下)进行处理，在开始处理后的第9天进行分析。在开始处理后的第9天收获血液样品。分离PBMC并用⑶8和四聚体染色。证实了四聚体阳性⑶8+T细胞的百分比。图7 如图5所述的不同处理方法后，血清中抗⑶40抗体(FGK)的毒性。测量开始抗CD40处理后第1、3、7和21天的小鼠血清中的ALAT (a)和ASAT (b)。图8 =A 带有肿瘤的小鼠的外周静脉血中腺El特异性CTL的检测，所述小鼠未进行处理(未处理)，或者如图5所述，用抗CD40激动性抗体进行处理(FGK IV)或在同侧肿瘤引流区中(FGK皮下)皮下处理。在开始处理后的第11天收获血液样品。分离PBMC并用⑶8和四聚体染色。证实了四聚体阳性⑶8+T细胞的百分比。图B、C、D和E 分别为未处理的、抗CD40高剂量静脉内、抗CD40低剂量缓释同侧以及抗CD40低剂量缓释对侧的流式细胞术样品的实例。图9 用包含不同剂量的葡聚糖颗粒的不同制剂处理小鼠，所述葡聚糖具有不同的水含量和抗⑶40 (FGK-45)。A 在第2、4、6和8天通过ELISA分析抗⑶40的血清浓度。 B:在第2、4、6、8、10、14和22天，分析外周静脉血中ElA TCR-Tg CTL的检测。在加强后的不同时间收获血液样品。分离PBMC并用CD8和四聚体染色。证实了随时间的四聚体阳性 ⑶8+T细胞的百分比。所用的剂量是Montanide中的30 μ g抗CD40抗体(正方形所示，30montanide)；含有70% H2O的葡聚糖颗粒中的30 μ g抗⑶40抗体(三角形所示，3070% H2O)；含有50% H2O的葡聚糖颗粒中的30yg抗⑶40抗体(星号和浅灰线所示，3050% H2O)；和含有70% H20、60%H20和50% H2O的葡聚糖颗粒的混合物中的30 μ g抗⑶40抗体(星号和黑线所示， 30混合物)；含有70% H2O的葡聚糖颗粒中的5 μ g抗⑶40抗体(圆形所示，570% H2O)；含有50% H2O的葡聚糖颗粒中的5 μ g抗⑶40抗体(黑色实线所示，550% H2O)；和含有70% H20,60% H2O和50% H2O的葡聚糖颗粒的混合物中的5 μ g抗⑶40抗体(单条纹和浅灰线所示，5混合物)。图10 表示在肿瘤引流区中，皮下注射Montanide中的抗⑶40抗体和CTLA-4封闭抗体之间的协同作用的实验。在第4、7、10和18天分析外周静脉血中ElA TCR-Tg CTL的检测。在加强后的不同时间收获血液样品。分离PBMC并用CD8和四聚体染色。证实了随时间的四聚体阳性CD8+T 细胞的百分比。图11 在用照射的肿瘤细胞加强后，血液中肿瘤特异性CTL随时间染有四聚体。将带有肿瘤的小鼠分成5组。在肿瘤和肿瘤引流淋巴结(T+LN)双切除之前，用缓释制剂中的局部抗⑶40抗体(FGK-45)预处理一组小鼠，在肿瘤和肿瘤引流淋巴结切除前，不处理其他组的小鼠。在四个剩余组中，切除了组2和组3小鼠的肿瘤(T)，切除了组4和组5小鼠的肿瘤和肿瘤引流淋巴结(T+LN)。组2和组4的小鼠在手术后立即接受缓释制剂中的局部抗⑶40抗体(FGK-45)，不处理组3和组5的小鼠。手术后12天，用照射的肿瘤细胞加强小鼠。通过四聚体染色分析血液中抗肿瘤细胞的CTL应答。在加强后的不同时间收获血液样品。分离PBMC并用CD8和四聚体染色。证实了随时间的四聚体阳性CD8+T细胞的百分比。图12 皮下或静脉内注射接种了与抗CD40组合的合成长肽后的T细胞应答。用 Montanide中的来自HPV E7或CEA的合成长肽，联合相同montanide贮库(cbpot)中的
抗⑶40，或者静脉内3次IOOyg抗⑶40(第0、1、2天)接种小鼠。14天后，在没有加入抗⑶40抗体的情况下，用Montanide中的相同肽加强小鼠。通过四聚体染色分析脾中的T细胞应答。分离PBMC并用CD8和四聚体染色。证实了四聚体阳性CD8+T细胞的百分比。还进行了细胞内细胞因子染色。在加强接种后10天进行这两个实验。每组处理5只小鼠。A ⑶8+T细胞，其对脾中的HPV E7四聚体是阳性的。B ⑶8+T细胞，其在HPV E7肽体外刺激后，对IFN- γ产生是阳性的。C ⑶8+Τ细胞，其在HPV Ε7肽体外刺激后，对IFN- γ和TNF- α产生是双阳性的。D ⑶8+Τ细胞，其在CEA肽体外刺激后，对IFN- γ产生是阳性的。E ⑶8+Τ细胞，其在CEA肽体外刺激后，对IFN- γ和TNF- α产生是双阳性的。图13 抗⑶40处理后血清中细胞因子的浓度。小鼠未进行处理(未处理)，皮下注射抗⑶40 (Montanide中30 μ g)，或静脉内注射抗⑶40 (第0、1、2天，3次100 μ g)。在开始处理后的第1、3、7和21天收集血清样品，并通过多重测定分析细胞因子的浓度。每组处理4只小鼠。A 血清中IL-2随时间的浓度。B 血清中GM-CSF随时间的浓度。
15实施例在本文的每个实施例中，使用本文所确定的抗CD40激活抗体。实施例1 肿瘤引流区中低剂量抗CD40激活疗法与高剂量全身疗法一样有效地产生抗肿瘤CTL应答，并且毒性降低。在利用腺病毒El诱导的肿瘤细胞的小鼠模型中，产生了弱肿瘤特异性CTL应答。 这些CTL在肿瘤引流淋巴结中维持，并且不能清除肿瘤。肿瘤特异性CD8T细胞受肿瘤引流淋巴结中呈递肿瘤抗原的树突细胞(DC)激发。这些DC未被激活，这是由于缺少危险信号，如递送到 toll 样受体的那些信号(TLR，G. J. van Mierlo, et al. J. Immunol. 173， 6753-6759,2004)。通过全身注射激活性抗⑶40抗体，树突细胞被激活并刺激CTL。肿瘤特异性CTL开始增殖，离开肿瘤引流淋巴结并清除肿瘤(Van Mierlo et al. (2002)Proc Natl Acad Sci USA 99,5561 ；G. J van Mierlo, et al. J. Immunol. 173，6753-6759，2004)。(图 1)。全身注射抗⑶40抗体不但激活肿瘤引流区的DC，还激活整个身体的DC，以及B 细胞、巨噬细胞和几种其他细胞类型。在患者中，这造成细胞因子释放综合征和淋巴细胞计数、血小板、D-二聚体异常(Vonderheide et al. (2007) J Clin Oncol. Mar 1 ；25 (7) 876-83.)。通过在肿瘤引流区局部给予而不是全身给予抗⑶40抗体，我们推测可以降低剂量而不会丧失效力。我们使用缓释系统(Montanide ISA 51，Seppic France)进行皮下注射，以持续刺激肿瘤抗原呈递DC上的CD40信号达数日。我们所用的剂量比小鼠研究中所用的全身剂量低10倍。在肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间的肿瘤引流区，我们皮下注射30 μ g 抗CD40抗体。我们所用的肿瘤模型描述于材料和方法中。如图2所示，接受i. v.注射的高剂量抗CD40抗体的小鼠的存活与在肿瘤引流区内接受s. c.注射的低剂量的小鼠相当，尽管剂量的差异是10倍。与未处理小鼠或在非引流区(相反的胁)接受低剂量FGK的小鼠相比，通过任意给药方法接受CD40抗体的小鼠在肿瘤清除方面表现出显著的增加。在肿瘤引流区以缓释乳剂给予的这种低10倍的浓度允许治疗化合物的剂量在所需位点即肿瘤引流淋巴结处足够高，但保持全身低水平，这显著降低了毒性。为了证明不同给药途径和不同剂量的毒性作用，用3种不同的测定测量全身毒性 (图3和7)。测定了 ALAT (丙氨酸氨基转移酶)和ASAT (天冬氨酸氨基转移酶)水平。这些酶存在于肝细胞中。当肝受到损伤时，这些酶从频临死亡的肝细胞释放到血流内，并充当肝毒性的测量。IL-Ib和IL-6是与称为细胞因子释放综合征(CRS)的不良事件有关的细胞因子，血清中这些细胞因子的升高是全身毒性的迹象。图3a、b、c以及图7a和b清楚地表明皮下、局部给药比静脉内、全身给药导致更低的毒性。我们也研究了开始处理后三天的小鼠的不同器官，以基于组织切片评价毒性水平。在图4中，我们证明FGK的高剂量全身给药导致肝、肺、肾的严重病理。器官表现出严重水肿、组织损伤以及生理器官结构丧失。接受低剂量FGK皮下给药的小鼠的器官，与来自未处理小鼠的器官相比，仅表现出轻微的毒性迹象。重要的是，高剂量全身给药与低剂量皮下给药之间毒性的差异是显著的。材料和方法小鼠
繁殖C57BL/6Kh小鼠，并将其保持在LUMC的动物设施中。肿瘤细胞将用Ad5ElA加EJ-ras转化的小鼠胚胎细胞培养于补充了 8% (v/v)FCS.50 μ M 2-ΜΕ、谷氨酰胺和青霉素的 IMDM(Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD)中。肿瘤实骑在7至13周龄的雄性小鼠的胁处，s. c.注射200μ1 PBS中的⑶40阴性ElA表达肿瘤细胞(1Χ107)。用测径器测量肿瘤的三维大小，每周2次。当存在明显的肿瘤时，处理在肿瘤接种后的8-18天开始。当肿瘤大小超过Icm3时，为避免不必要的痛苦，处死小鼠。^tM产生刺激性抗CD40Ab 的 FGK-45 杂交瘤细胞由 A. Rolink(Basel Institute for Immunology, Basel, Switzerland)提供。小鼠接受i. v.给予(处理的第0、1和2天)的 200 μ 1 PBS 中的 100 μ g 抗 CD40mAb。在肿瘤引流区进行皮下注射(在胁的皮肤下，肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间，200μ 1 montanide乳剂。乳剂通过在涡旋器(vortex)上将PBS中的0. 3 μ g/ml FGK与montanide ISA 51 (Seppic,France)的1 1溶液混合30分钟来制备。最终给予的剂量是30 μ gFGK。四聚体染代用负载APC偶联的E1A234_243的H_2Db四聚体染色肿瘤特异性CTL，与⑶8a染色组合，并通过流式细胞术进行分析。苏木精和曙红(H&E)染饩根据IHC world Life Science Network所述的方法，染色小鼠组织的低温切片， 所述方法可通过 Google 获得。H&E 染色方法是 Roy Ellis, Division of Pathology, Queen Elizabeth Hospital, Woodville Road, ffoodville, South Australia, 5011 的染色方法。ALAT 禾口 ASAT 分析根据IFCC(国际临床化学联盟(International Federation for Clinical Chemistry))建议，测量 ASAT 和 ALAT。试剂来自 Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, FRG) ASAT为编号11876848，ALAT为编号11876805。测试原理基于NADH随ASAT或ALAT浓度升高而降低。以光度计测量NADH。用全自动实验系统在P800Modular (Roche/Hitachi Tokyo, Japan)上测量两种酶。这些测量的CV’ s低于2%。多重测定通过心脏穿刺术，在第1、3、7和21天，收集血清样品。利用来自Bio-rad的 Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex Panel，采用制造商的实验方案，分析血清中IL-1、 IL-6的存在。实施例2 在肿瘤引流区用更高剂量抗CD40抗体的肿瘤实验(图5)。我们确定如下情况是否可能局部增加抗CD40抗体的剂量，同时维持肿瘤清除所测量的功能作用和毒性减少。在肿瘤引流区或在与肿瘤相对的胁处(非引流区)，s. c.给予增加的剂量，即150 μ gFGK-45。将存活与i. v.注射三次100 μ gFGK的小鼠进行比较。令人感兴趣的是，当注射高剂量FGK时，没有在处理的小鼠存活间观察到差异。相比之下(参阅图2)，低剂量FGK (Montanide中的30 μ g)中存活与是否是在肿瘤引流区中注射抗体相关。这证明，即使注射在非引流区的局部(s. c.)，高剂量抗体也确保足量的抗体通过全身分布到达外周。这由以下事实得到解释抗CD40的剂量是如此的高，以至于即使注射不在肿瘤引流淋巴结附近，足够高的浓度也达到肿瘤引流淋巴结以用于激活肿瘤特异性应答。最后，为了防止全身毒性，不但将抗⑶40抗体局部递送至肿瘤引流淋巴结是重要的，而且剂量确保被局部组织吸收而不是全身分布也是重要的。实施例3 具有皮下肿瘤的小鼠血液样品的四聚体染色(图6和图8).在开始抗⑶40处理后的第9天(图6)，或在开始抗⑶40处理后的第11天(图 8)，获得血液样品。比较未处理的或处理的带有肿瘤的小鼠间肿瘤特异性CTL的数量。在肿瘤引流区或在对侧胁(非引流区)，处理的小鼠静脉内接受高剂量抗CD40抗体(FGK-45) (3次IOOyg)，或皮下接受低剂量(Montanide中的30 μ g)。与未处理的小鼠相比，在用 s. c.抗CD40在对侧胁(非引流区)处理的小鼠血液中，未检测到四聚体阳性CD8T细胞的增加。重要的是，在接受全身抗⑶40处理的小鼠或在肿瘤引流区s. c.接受抗⑶40的小鼠中，可以证明明显的四聚体阳性⑶8T细胞群。这证明，即使低剂量抗⑶40皮下处理是局部处理(如果不是在肿瘤引流区给予处理，则该剂量无效)，其也能造成全身免疫应答诱导外周血中可检测的肿瘤特异性CTL。皮下处理组和静脉内处理组之间四聚体阳性⑶8T细胞水平的差异可以由静脉内处理组中抗⑶40毒性的增强来解释。其在处理后的第一周对血液淋巴细胞的数量造成严重的异常，并且回复到正常水平花费了一周的时间。(Vonderheide et al也做了较少程度的描述)。材料和方法四聚体染代用负载有APC-偶联的E1A234_243的H_2Db四聚体染色肿瘤特异性CTL，与CDSa染色组合，并通过流式细胞术进行分析。实施例4 基于葡聚糖的微粒作为用抗CD40抗体进行免疫疗法的缓释系统。基于葡聚糖的微粒形成特别适合诸如抗体的较大蛋白缓释的缓释系统。在使用我们小鼠模型的实验中，我们使用含有激动性抗CD40抗体(FGK-45)的基于葡聚糖的微粒作为缓释系统，这如实施例1的材料和方法所述。我们将IXlO6ElATCRTg⑶8T细胞静脉内注射到带有ElA表达肿瘤的小鼠中，随后注射含有抗CD40的微粒。我们发现，释放最慢的制剂，即水含量为50%的制剂，在给予的低剂量中，即葡聚糖颗粒中的5 μ g抗⑶40抗体(FGK)，于血清中产生浓度不可检测的抗⑶40抗体(图9a)， 但仍然在血液中产生可测量的激活的CTL(图9b)。这些数据表明，使用基于葡聚糖的微粒作为缓释系统允许减少在肿瘤引流区 s. c.注射的抗CD40的剂量，而不影响肿瘤特异性T细胞应答。此外，使用减少的浓度导致血液中抗CD40抗体的浓度减少，这表明全身毒性也会减少。材料和方法向处理加入按以前所述(0. Franssen, L. Vandervennet, P. Roders, and W. Ε. Hennink. Chemically degrading dextran hydogels !controlled release of a model protein from.)，制备含有抗CD40抗体的基于葡聚糖的颗粒。用200μ 1 PBS中的各种浓度的葡聚糖颗粒处理小鼠，在肿瘤引流区(胁的皮肤下，肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间)，进行皮下注射。向小鼠加入繁殖表达对H_2Db限制的E1A234_243腺病毒表位具有特异性的TCR的小鼠 (ElATCR-Tg)，并将其保持在LUMC的动物设施中。转基因CTL分析用BD Imag淋巴细胞富集试剂盒，从ElA TCR Tg小鼠的脾和淋巴结分离⑶8T细胞。将1百万CD8-T细胞静脉内注射到带有肿瘤的小鼠中。血液中CTL应答的动力学通过流式细胞术测量。血清中抗体检测通过ELISA，利用抗大鼠抗体，测定血清中抗⑶40抗体的浓度。实施例5 肿瘤引流区内缓释贮库中免疫激活抗体间的协同作用。在肿瘤引流区以缓释贮库给药适合于除了抗CD40以外的其他免疫激活抗体。不同免疫激活抗体的组合可以导致CTL应答质量和数量的增强。我们用来自肿瘤特异性TCR 转基因小鼠的IXlO6个⑶8T细胞注射带有肿瘤的小鼠。然后，我们在Montanide制剂中将抗⑶40抗体FGK-45与CTLA-4封闭抗体(9H10)组合，并分析血液中外周CTL应答的动力学(图10)。与仅用每种抗体单独处理相比，在用抗CD40和抗CTLA-4抗体组合处理的小鼠中，血液中肿瘤特异性CTL的数量增加了。这表明不同抗体间存在协同作用，并且支持多重免疫刺激抗体在一种缓释制剂中组合。实施例6 在抗⑶40局部处理终止抗肿瘤CTL应答之前，通过手术移除肿瘤和肿瘤引流淋巴结在临床上，通常以手术切除肿瘤和肿瘤引流淋巴结(LN)作为治疗的一部分。我们假定，肿瘤和肿瘤引流LN都是成功的局部免疫激活抗体治疗所需的，因此，治疗应当在肿瘤和肿瘤引流LN切除之前开始。为了证明这一假设，我们用肿瘤细胞接种5组小鼠。当肿瘤明显时，我们用 montanide中的抗⑶40局部处理组1。12天后，所有的小鼠经历手术。切除组1、2和3的小鼠的肿瘤和肿瘤引流LN，在组4和组5中，仅切除小鼠的肿瘤。组2和4的小鼠在切除后立即接受抗CD40。组3和5的小鼠不接受任何抗CD40。手术后12天，所有的小鼠在相反的胁接受照射的肿瘤细胞的加强接种。定期采集血液样品以通过四聚体染色分析抗肿瘤 CTL应答。如图11所示，在肿瘤和肿瘤引流LN切除前接受抗CD40的小鼠中，存在良好的CTL 应答，在任何其他组中不存在。因此，当仍然存在肿瘤引流淋巴结时，进行这种类型的治疗是重要的。材料和方法用赛拉嗪中的氯胺酮(ketamine en xylazine) (PBS中1 1 2，100微升腹膜内)麻醉小鼠。分离肿瘤和肿瘤引流淋巴结，并用缝合夹(mnmdclip)闭合创口。5天后， 移除缝合夹。小鼠接受加强接种。实施例7:以前，我们公开了加入抗CD40激活抗体在接种环境下对针对肽的CTL激发具有积极作用(Diehl et al.Nat Med. 1999Jul ；5 (7) :774_9)。因此，我们测试以一种单一缓释制剂局部给予的抗CD40联合含有CTL表位的长HPV来源的肽(Bijker et al, JJ Immunol. 20070ct 15 ； 179 (8) 5033-40)与以前所用的以单独的缓释制剂全身给予的抗 ⑶40联合CTL肽对T细胞激发是否具有相似的作用。向小鼠s. c.注射Montanide中的 30 μ g抗CD40和HPV长肽，或i. v.注射3次100 μ g抗CD40并同时s. c.注射Montanide 中的HPV长肽。在处理小鼠的脾中进行加强肽接种后10天，测量T细胞应答。我们证实， 作为肽接种的佐剂，使用低剂量的抗CD40抗体(FGK-45)的局部缓释制剂比高剂量静脉内注射更有效。对于长合成HPV肽和长合成CEA肽，与高剂量静脉内注射相比，在用低剂量抗 CD40抗体(FGK-45)的局部缓释制剂处理的小鼠中，应答在CD8+T细胞的数量和质量都获得增强。(图 12a、b、C)。为了确定该观察结果是否可以扩展到含有CTL表位的其他长肽，使用来自CEA的长肽进行同样的实验，该CEA是在一些上皮癌症中过表达的另一种肿瘤相关蛋白。利用该肽证明了相同的观察结果(图12d和e)。总之，对于长合成HPV肽和长合成CEA肽，与高剂量静脉内注射相比，在用低剂量抗CD40抗体的局部缓释制剂处理的小鼠中，应答在CD8+T细胞的数量和质量都获得增强。实施例8:细胞因子可以促进更好的抗病原体或肿瘤的免疫应答，或者改善特异性T细胞的存活。在诸如接种和癌症治疗的治疗环境中，经常向患者给予细胞因子作为佐剂。此类免疫加强细胞因子的实例是IL-2和GM-CSF。在用抗CD40激活抗体(FGK-45)以低剂量缓释制剂在肿瘤引流区中皮下注射或以高剂量静脉内注射(如之前实施例1-3所述)处理后， 我们测定了小鼠血清中这些细胞因子的浓度。我们证实，与高剂量静脉内注射相比，对于 IL-2(图13a)和GM-CSF (图13b)，在用低剂量缓释配制的抗CD40抗体处理后，甚至在延长的时间后，小鼠内的水平获得显著提升。这再次表明，在肿瘤引流区低剂量局部递送抗⑶40 在处理后对于诱导有益细胞因子优于抗⑶40的全身给药。材料和方法肽接种以 PBS 和 Montanide 的 1 1 乳剂，皮下注射 200 μ l、40nmol 每种肽(HPV E7 :GQ AEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR 或 CEA VTRNDARAYVCGIONSVSANRSDPV,(具有粗体所示的CTL表位)。一组小鼠还接受与所述肽相同的Montanide制剂中的30 μ g抗CD40激活抗体。第二组小鼠接受Montanide贮库中的肽，其在第0天s. c.注射，并且同时静脉内注射100 μ g抗⑶40激活抗体。随后在第1和第2天，另外i. v.注射100 μ g抗⑶40。14天后，小鼠接受由40nmol每种肽组成的加强接种，在对侧胁以PBS和Montanide的1 1乳剂皮下注射200 μ 1。这次未给予抗⑶40抗体。细胞内细胞因子染饩分离脾细胞，并用5 μ g/ml合成长肽刺激过夜。将Becton Dickinson Cytofix/ Cytoperm试剂盒用于染色。通过流式细胞术分析样品。所用的流式细胞术抗体是抗CD3、 抗 CD4、抗 CD8、抗 IFN- γ 和抗 TNF- α，都来自 Becton Dickinson。多重测定利用心脏穿刺术在第1、3、7和21天收集血清样品。使用Bio-rad的Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-Plex Panel，根据制造商的实验方案，分析血清中IL_2和GM-CSF的存在。
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权利要求
1.CD40的激动剂在制备用于治疗癌症、癌变前病症或感染性疾病的药物中的用途，其中将所述药物局部给予并靶向个体的肿瘤引流淋巴结。
2.如权利要求1所述的用途，其中不肿瘤内给予所述CD40的激动剂。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中皮下给予所述CD40的激动剂。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中皮内给予所述CD40的激动剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中如在淋巴管造影术的实践中已知的，所述靶向肿瘤引流淋巴结通过淋巴静脉注射给予所述CD40的激动剂来进行。
6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述CD40的激动剂是抗CD40抗体或其片段、肽、寡核苷酸或有机分子。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述CD40的激动剂是抗CD40抗体，所述抗CD40抗体优选是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或去免疫化抗体。
8.如权利要求1至7中任一项所述的用途，其中将25%至50%的全身给予量的所述 CD40的激动剂局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结。
9.如权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述CD40的激动剂作为单剂量给予。
10.如权利要求1至9中任一项所述的用途，其中给予不多于30μ g的⑶40的激动剂。
11.如权利要求1至10中任一项所述的用途，其中将所述CD40的激动剂配制于缓释制剂中。
12.如权利要求1至11中任一项所述的用途，其中CTL激活肽和/或第二刺激化合物。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述第二刺激化合物是CTLA4封闭抗体。
14.治疗癌症、癌变前病症或感染性疾病的方法，其中将CD40的激动剂局部给予并靶向肿瘤引流淋巴结。
15.如权利要求14所述的方法，其中在给予CD40的激动剂后移除肿瘤引流淋巴结。
全文摘要
本发明涉及CD40激动剂用于治疗癌症、癌变前病症或感染性疾病的用途，其中将CD40激动剂局部给予并靶向个体的肿瘤引流淋巴结。任选地，将CD40激动剂配制于缓释制剂中。任选地，还给予CTL激活肽。
文档编号A61P35/00GK102170908SQ200980139185
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月31日 优先权日2008年8月29日
发明者C·J·M·迈利夫, M·F·赫伯特-弗兰森 申请人:莱顿大学医学中心附属莱顿教学医院