专利名称：酒蒸黄连炮制品及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酒蒸黄连，本发明还提供了该酒蒸黄连的制备方法和用途。
背景技术：
据世界卫生组织《2008年世界卫生报告》城市化、老龄化和全球性的生活方式变 化三者结合，使糖尿病等慢性非传染性疾病成为越来越主要的疾病和死亡原因。据中华医 学会糖尿病学分会《中国2型糖尿病防治指南(2007版)》:中国糖尿病患病人群中，以2型 糖尿病为主(占93. 7% )，2025年预计将达到5500万人。糖尿病属于中医“消渴”病范畴， 中医药理论认为“消渴”的病机因恣食肥甘，或情志过极、房事不节、热病之后等，郁热内 蕴，气化失常，津液精微不能正常输布而下泄，阴虚燥热(GB/T 16751. 1-1997中医临床诊 疗术语疾病部分)。“凡积久饮酒，未有不成消渴。”(唐代《千金方》)黄连为常用中药，中医很早就认识到“治消渴”的用途，历代本草及名医验案多有 记载，梁代《名医别录》记载“止消渴”；唐代《新修本草》记载“黄连，疗渴为最”。明代《玉机 微义》记载“酒蒸黄连丸，治消渴，饮水无度至二三升，小便五七十次，发热瘦弱，口干，食已 如饥，此名消瘅。今用味苦无毒，除热正气，消渴厚肠。消渴之人，脾胃恶湿，黄连为对。黄 连净，半斤，酒一升，汤重蒸。伏时晒干用，右末，滴水丸，梧子大，每五十丸食前温水下”；明 代《本草纲目》记载“治消渴，用酒蒸黄连”；朝鲜医籍《东医宝鉴》引明代《医学纲目》“治消 渴要药，酒浸蒸，晒干为末，蜜丸，白汤下五七十丸”；清代《本草备要》记载“单用能治消渴”。中药黄连也为治疗消渴病(糖尿病)的中成药处方中常用药味，2006年国内 医院糖尿病用药分析结果表明，在排名前十位的产品中，糖脉康颗粒(含黄连，市场分额 22. 1 %，约1亿元)、金芪降糖片(含黄连，市场分额11. 6%，约5000万元)，分列第2、4位， 在中医临床中广泛应用。但本草医籍对治消渴宜用的黄连饮片(炮制品)，或语焉不详，或统而概之，现代 研究中也缺少对黄连不同炮制品在“治消渴”用途上的实验证据，导致在中医临床实践中甚 至提出“黄连不是治疗消渴病(糖尿病)的主药”。目前黄连治疗消渴病(糖尿病)的研究主要集中在生品黄连及单一有效成分(小 檗碱)及生品黄连中提取的黄连总碱上，[黄笑夏，欧阳钦.黄连免煎颗粒治疗肝原性糖 尿病临床观察.天津药学.2008，20 (3) 41-42]等报道，在临床单独使用胰岛素及黄连素 免煎颗粒与胰岛素联合应用均能有效降低血糖，但黄连素免煎颗粒与胰岛素联合应用效 果更好，且黄连素免煎颗粒与胰岛素联合应用组血糖值控制得更为稳定。[Li-Qin Tang, Wei Wei，Li—MingChen，et al· Effects of berberine on diabetes induced by alloxan anda high-fat/high-cholesterol diet in rats. Journal ofEthnopharmacology. 2006, 108 (1) : 109 115]报道，对饮食诱导的糖尿病高脂血症大鼠模型(高脂/高胆固醇/四氧 嘧啶)，小檗碱抑制了糖尿病进程，作用机制可能与降血糖、调节血脂代谢等作用相关。[朱 红卫，唐礼可.黄连总碱对小鼠降糖作用研究.云南中医中药杂志.2008，29 (7) :59 60] 报道，黄连总碱具有显著降血糖作用，对正常小鼠的血糖水平没有影响。
小檗碱对改善2型糖尿病患者胰岛素抵抗方面有明确作用，而黄连各种饮片规格 都含有小檗碱成分，不同的黄连炮制品的功效也有不同，而且含有小檗碱成分的黄柏、三颗 针等中药临床效用也有不同，为中医临床处方用药所困惑，早在清代《修事指南》就指出“炮 制不明，药性不确，则汤方无准而病症不验也”，因此本发明发掘本草经验，系统研究了酒蒸 黄连“治消渴”用途及其安全性，对防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征、糖尿病或并发症 具有一定的意义。
发明内容
本发明的技术方案是提供了 一种酒蒸黄连炮制品。本发明的另一技术方案是提供 了该炮制品的制备方法和用途。本发明提供了一种酒蒸黄连炮制品，它是将黄酒或白酒加入生黄连中蒸制而成， 制备的黄连炮制品的指纹图谱如图1所示，主要指标成分包括药根碱、非洲防己碱、表小檗 碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱及其以上生物碱成分的盐酸盐，其中，药根碱、非洲防己碱、表小 檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为4_7 5-9 11-17 23-35 23-27 100。进一步优选地，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配 比为4· 7-6.8 5.7-8.3 11.5—16.7 23.9—34.5 23.4—26.5 100。 更进一步优选地，所述的药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱 的重量配比为5. 6 7. 1 14. 8 31. 0 24.5 100。本发明酒蒸黄连炮制品是由如下方法制备而成取净黄连，加黄酒或白酒闷润 1-6小时，加热蒸制3 8小时，取出，干燥，即得，其中黄连与黄酒或白酒的用量配比为黄连100份、黄酒或白酒20 120份。进一步优选地，所述的酒蒸黄连的炮制工艺中，每100份黄连，用酒40份拌勻，闷 润6小时，加热蒸制8小时，取出，干燥。本发明还提供了一种制备所述的黄连炮制品的方法，它是由如下方法制备而成 取净黄连，加黄酒闷润1-6小时，加热蒸制3 8小时，取出，干燥，即得，其中黄连与黄酒的 用量配比为黄连100份、黄酒20 120份。进一步优选地，所述的酒蒸黄连的炮制工艺中，每100份黄连，用酒40份拌勻，闷 润6小时，加热蒸制8小时，取出，干燥。本发明还提供了所述的黄连炮制品在制备具有抑制3T3-L1前脂肪细胞分化、提 高葡萄糖利用率或降低血脂功能的药物中的用途。其中，所述的药物是改善胰岛素抵抗，降低糖异生的药物。其中，所述的药物是治疗糖尿病及其并发症的药物。本发明还提供了该黄连炮制品在制备胰岛素增敏剂及PPARY激动剂的药物中的 用途。与生品黄连、小檗碱比较，显著增加PPAR γ表达量，可以显著改善胰岛素抵抗，是具 有开发前景的胰岛素增敏剂。本发明还提供了所述的黄连炮制品在制备α -葡萄糖苷酶抑制剂的药物中用途。本发明还提供了一种具有抑制3T3-L1前脂肪细胞分化、提高3T3-L1前脂肪细胞 葡萄糖利用率或降低血脂功能的药物组合物，它是由下述方法制备而成取权利要求1-4所述的酒蒸黄连，加水煎煮1 3次，每次0. 5 3小时，每次加水量为6 10倍量，滤过，合 并提取液，浓缩，备用，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。进一步优选地，它是由下述方法制备而成取酒蒸黄连，加水煎煮3次，每次3小 时，每次加水量为10倍量，滤过，合并提取液，浓缩，备用。其中，所述的制剂是口服制剂。本发明酒蒸黄连与生品黄连及盐酸小檗碱相比，具有明显的作用，药效明确，为临 床提供了一种新的选择。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
图1酒蒸黄连样品HPLC图谱(其中，1-盐酸药根碱2-非洲防己碱3-表小檗碱 4-黄连碱5-巴马汀6-盐酸小檗碱)图2酒蒸黄连给药后大鼠血清HPLC指纹图谱(其中，a 对照品色谱图b空白血 清色谱图c:酒蒸黄连体内色谱图，1-非洲防己碱2-表小檗碱3-黄连碱4-小檗碱)图3酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1前脂肪细胞模型增殖影响图4显微镜下的3T3-L1前脂肪细胞及3T3-L1脂肪细胞(X200)A :3T3_L1前脂肪 细胞；B :3T3-L1脂肪细胞；C :3T3-L1脂肪细胞(油红0染色)图5酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1前脂肪细胞株分化的影响图6酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1脂肪细胞IR模型葡萄糖利用的影响图7酒蒸黄连对PPAR y表达的影响(Western blot法)
具体实施例方式实施例1本发明酒蒸黄连炮制品的制备取净黄连，加酒拌勻(每1kg净药材，用黄酒或白酒0. 2kg)，置锅内，闷润2小时， 加热蒸制5小时，取出，干燥。实施例2本发明酒蒸黄连炮制品的制备取净黄连，加酒拌勻(每1kg净药材，用黄酒或白酒0. 4kg)，置锅内，闷润4小时， 加热蒸制8小时，取出，干燥。实施例3本发明酒蒸黄连炮制品的制备取净黄连，加酒拌勻(每1kg净药材，用黄酒或白酒0. 6kg)，置锅内，闷润6小时， 加热蒸制4小时，取出，干燥。实施例4本发明酒蒸黄连炮制品的制备取净黄连，加酒拌勻(每1kg净药材，用黄酒或白酒0. 8kg)，置锅内，闷润1小时， 加热蒸制7小时，取出，干燥。实施例5本发明酒蒸黄连炮制品的制备取净黄连，加酒拌勻(每1kg净药材，用黄酒或白酒1kg)，置锅内，闷润3小时，加 热蒸制3小时，取出，干燥。
实施例6本发明酒蒸黄连炮制品的炮制工艺优选 取净黄连，加酒拌勻(每Ikg净药材，用黄酒或白酒1. 2kg)，置锅内，闷润5小时， 加热蒸制6小时，取出，干燥。以上6个试验例制备的酒蒸黄连炮制品，测定总生物碱含量，同时进行薄层色谱 分析。总生物碱测定方法取黄连粉末约0. 8g，精密称定.置索氏提取器中，用盐酸-甲 醇(1 100)适量。加热回流提取，至提取液无色为止，将提取液转移至25mL量瓶中，用盐 酸-甲醇(1 100)少量洗涤容器，洗液并人提取液中，并加至刻度。照柱色谱法(附录VI C)试验，精密量取5mL，加于已处理好的氧化铝柱(内径约9mm，中性氧化铝5g，湿法装柱， 用乙醇约30mL预洗)上，用乙醇35mL分次洗脱，置50mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇勻， 精密吸取2mL，置50mL量瓶中，用硫酸溶液(0. 05mol/L)稀释至刻度，摇勻，照分光光度法以 硫酸溶液(0.05mol/L)为空白，在345nm波长处测定吸收度，按盐酸小檗碱(C2tlH18ClNO4)的
吸收系数(A=)为728计算其含量。表1酒蒸黄连炮制工艺均勻设计试验表与结果 含量综合评分=Σ (表2中各生物碱含量/表3中各生物碱最高值*100)效应综合评分=Σ (表3中各剂量组葡萄糖利用率/表3中各剂量组葡萄糖利用 率最高值*100)表2酒蒸黄连炮制工艺含量测定结果 表3酒蒸黄连炮制工艺样品对3T3-L1细胞模型葡萄糖利用率的影响 (1)采用统计分析软件对含量综合评分结果进行多元逐步回归分析，得到回归方 程Y = 570. 02-0. 41*Xl+4. 18*X2P = 0. 019，回归方程有显著性意义(2)采用统计分析软件对含量综合评分结果进行多元二次逐步回归分析，得到回 归方程2 Y = 574. 45-0. 17*X1_0. 08*X3*X3_0. 04*Xl*X3+0. 71*X2*X3P = 0. 0021,回归方程有显著性意义最高指标时的因素水平组合黄酒用量20%、闷润时间6小时、蒸制时间8小时。(3)采用统计分析软件对特征性成分(非洲防己碱)含量进行多元逐步回归分析， 得到回归方程3:Y = 0. 4864-0. 0109*X3P = 0. 055，回归方程无显著性意义(4)采用统计分析软件对效应综合评分结果进行多元逐步回归分析，得到回归方 程Y = 211. 69-0. 63*X1P = 0. 040，回归方程有显著性意义(5)采用统计分析软件对效应综合评分结果进行多元二次逐步回归分析，得到回 归方程Y = 179. 68+0. 41*X1_0. 01*Xl*Xl+0. 09*X1*X3_0. 57*X2*X3P = 0. 049，回归方程有显著性意义最高指标时的因素水平组合黄酒用量60%、闷润时间1小时、蒸制时间8小时。由方程1、2、3、4、5，结合直观分析及成本效益分析，确定酒蒸黄连的工艺参数为 取净黄连，每100kg用黄酒或白酒40kg,闷润6小时，蒸制8小时，即得。根据方程2的含量综合评分的预测值为584根据方程5的效应综合评分的预测值为182以上预测结果表明，在确定的酒蒸黄连的工艺参数下，含量与效应的结果比较理 想，也与均勻设计试验号2的因素水平设置相近。因此确定酒蒸黄连的工艺参数为取净黄连，每100kg用黄酒或白酒40kg，闷润6 小时，蒸制8小时，即得。实施例7本发明酒蒸黄连的质量控制方法酒蒸黄连的质量控制方法
(1)薄层色谱鉴别取本品粉末0. lg，加甲醇50ml，超声处理30min，滤液作为供试品溶液。取盐酸药 根碱照品、非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱加甲醇制成 每1ml含0. lmg的溶液，作为对照品溶液。精密量取各对照品溶液1. 5ml加入同一 10ml量 瓶中，以甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部 附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10 yl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙
酸乙酯-异丙醇-甲醇-氨水-三乙胺(3 3.5
1.5 0. 5 1)并以氨水预饱和
20min后，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点。(2)含量测定方法采用XtimateTM C18(4. 6mmX 250mm, 5 u m)色谱柱，以 0. 三乙胺(碳酸 氢铵，氨水调PH为10)为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速lmL.min-l，柱温 30 °C，检测波长 270nm。结果盐酸药根碱在 0. 848 u g. ml/1 16. 96 u g. ml/1 (r = 0. 9997)、 非洲防己碱在 1. 248 u g. ml/1 24. 96 u g. ml/1 (r = 0. 9999)、表小檗碱在 2. 048 u g. ml/1 40. 96 u g. mL_1 (r = 0. 9999)、黄连碱在 3. 648 ii g. mL_1 72. 96 u g. mL_1 (r = 0. 9999)、 巴马汀在 2. 88 u g. mL-1 57.6iig. mL-1 (r = 0. 9998)、盐酸小檗碱在 13. 248 u g. mL-1 264. 96 ug. mL—1，(r = 0. 9996)呈现良好的线性关系。加样回收率及其RSD分别为102.4% (RSD 为 1. 17 % )、101. 8 % (RSD 为 1. 30 % )、100. 3 % (RSD 为 1. 76 % )、100. 7 % (RSD 为 1. 75% )U01. 2% (RSD 为 1.53% )和 97.9% (RSD 为 1. 97% ) 样品重复性良好，在 12h 内稳定。结论方法操作简便、准确性高、稳定性好，可用于酒蒸黄连中6种生物碱的含量测 定。
对以上含量测定数据采用SPSS统计软件进行进行两样本均数的比较分析 (Independent-Samples T Test)，统计分析结果表明酒蒸黄连中非洲防己碱的含量与生品饮片比较有显著性变化(P = 0. 017)(指纹图谱见图1)，同时在血清化学指纹图谱发现的入 血成分中非洲防己碱的色谱峰明显，非洲防己碱的可能是酒蒸黄连中与药效生物效应相关 的重要成分之一，见图2。由实施 例6中酒蒸黄连工艺各实验号测定结果(表2)，结合实施例7中各批次酒 蒸黄连测定结果(表4)，合并各结果构成表5表5酒蒸黄连含量测定结果(mg/g) 表6酒蒸黄连含量测定结果(比例含量，以盐酸小檗碱含量为100计算) 按统计学意义的99%置信区间(下限值，上限值)，Ua/2 二 2·56(α = 0· 01)下 限值=平均值-υα/2 X标准偏差，上限值=平均值+Ua/2Χ标准偏差综上所述，酒蒸黄连中，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为4. 74-6. 84 5.67-8.32 11. 54-16. 66 23. 89-34. 49 23. 38-26. 46 10 0 或4-7 5-9 11-17 23-35 23-27 100(3)化学指纹图谱酒蒸黄连化学指纹图谱的主要特征峰包括药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连 碱、巴马汀、小檗碱，还包括以上生物碱成分的盐酸盐(图1)。酒蒸黄连HPLC指纹图谱的最佳色谱条件为XtimateTMC18(4.6X250mm，5iim)；柱 温30°C ；流速1. Oml/min ；检测波长270nm ；流动相0. 三乙胺的水溶液(碳酸氢铵，氨 水调节PH到10)-乙腈(二元梯度洗脱)；进样量10ul ；采样时间45min，洗脱程序如下流动相A泵0. 三乙胺的水溶液(碳酸氢铵，氨水调节PH到10) ；B泵乙腈。时间程序0 15min，A 泵90% — 75% ;B 泵— 25%15 25min，A 泵75%— 70% ;B 泵25%— 30%25 40min，A 泵70%— 55% ;B 泵30%— 45%40 50min，A 泵55%— 90% ;B 泵45%— 10%酒蒸黄连供试品溶液制备方法取酒蒸黄连粉末0. lg，精密称定，置锥形瓶中，加 入盐酸-甲醇(1 100)501111，超声处理301^11，滤过，过0.4511111微孔滤膜，取续滤液，即得。酒蒸黄连水提取浸膏供试品溶液制备方法取酒蒸黄连25g，精密称定，置烧杯 中，加水150ml，煎煮3h，煎煮3次，合并水煎液，浓缩至lg/g浓缩液。取0. lg浓缩液，精密 称定，置锥形瓶中，加入盐酸-甲醇(1 100)501111，超声处理301^11，滤过，过0.4511111微孔 滤膜，取续滤液，即得。(4)血清化学指纹图谱酒蒸黄连血清化学指纹图谱中的主要特征峰包括非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、 小檗碱，还包括以上生物碱成分的盐酸盐(图2)。整体动物模型灌胃样品的制备取酒蒸黄连100g，加水600ml，煎煮2h，煎煮3次， 合并水煎液，浓缩至lg/ml，即得灌胃样品。试验方法取SD大鼠5只。禁食12h(自由饮水)，称体重，按照5g/kg灌胃给予酒 蒸黄连浓缩液(lg/ml)，给药后180min，股动脉取血，37°C水浴15min，3600rpm离心15min， 分离血清，即为含药血清。取各时间点含药血清1ml分别置于5ml带盖离心管中，分别加入 乙腈3ml涡旋3min，3600r/min离心lOmin，取上清液，于37°C氮吹仪吹干，加入50%甲醇 75 u 1，涡旋 3min, 120000r/min 离心 lOmin,即得。色谱分析条件同“化学指纹图谱”项下。(5)其控制指标 实验例7本发明酒蒸黄连炮制品提取浸膏的制备工艺优选根据均勻设计试验和水煎提取工艺特点，考察加水量、提取时间、提取次数等三个 因素，选择混合水平的均勻设计表U6 (6 X32)。称取黄连10g，加水至规定量，水煎提取规定时间，提取规定次数，提取液浓缩至10mL。
表7酒蒸:黄连水煎提取工艺的影响因素与水平设置 表8酒蒸黄t连水煎提取工艺的均勻设计试验表和结果
(1)采用DPS统计软件对总生物碱含量结果进行多元逐步回归分析，得到回归方 程1 Y = 1. 6680+0. 3209*Xl+0. 5200*X3P = 0. 0121 ；回归方程有显著性意义(2)采用DPS统计软件对总生物碱含量结果进行多元二次逐步回归分析，得到回 归方程2 Y = 2. 1836+0. 1235*Xl*X3+0. 0044*X2*X3P = 0. 0164 ；回归方程有显著性意义最高指标时的因素水平组合加水量为100ml，提取时间为3小时、提取次数为3 次由方程1、2可知，对黄连水煎提取工艺影响的显著因素是提取时间、提取次数，其 次是加水量，从确定了酒蒸黄连水煎提取工艺的优化参数为取净黄连，加水煎煮3次，每 次3小时，每次加水量为10倍量，滤过，合并提取液。2. 3. 3验证方法与结果按2. 3. 2项下确定的优化水煎提取工艺参数，进行验证试验，由表9可知，酒蒸黄 连的水煎提取工艺稳定可行。表9酒蒸黄连水煎提取工艺的验证试验表和结果 实验例8本发明酒蒸黄连提取浸膏的制备根据实验例6、7提供的优化工艺，提取制备了酒蒸黄连提取浸膏供药理实验，在 总生物碱测定的基础上还测定了总多糖的含量。根据实验例7提供的优化工艺，还提取制 备了生品黄连的提取浸膏供药理实验，在总生物碱测定的基础上还测定了总多糖的含量。总生物碱的测定方法精密称取浸膏0.4g，至25mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇 勻，照柱色谱法试验。精密量取5mL，置已处理好的氧化铝柱(内径约0. 9cm,中性氧化铝5g， 湿法装柱，用乙醇30mL预洗)上，用乙醇35mL洗脱，收集洗脱液置50mL量瓶中，用乙醇稀 释至刻度，摇勻。精密量取2mL转置50mL量瓶中，用0.05mol/l H2S04溶液，稀释至刻度， 摇勻。按照紫外分光光度法，在345nm波长处，测定吸收度，按盐酸小檗碱的吸收系数为728 计算，即得。总多糖的测定方法精密称取已经提取好的黄炮制品品提取浸膏，置离心管中，加 无水乙醇至80%，混勻，离心10min(3000r/min)，弃去上清液，用80 %乙醇多次洗涤沉淀， 至离心上清液无色，沉淀用沸水分次使溶解，离心，上清液转移置100mL量瓶中，精密吸取 5mL转移置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品。分别吸取供试品溶液、葡萄糖对照 品溶液(0. 06mg/mL) 2mL至具塞试管中，加入蒽酮试剂8mL，涡旋30s，沸水lOmin，冷却至室 温，在620nm处测定其吸光度，计算以葡萄糖计算的黄连总多糖的含量。表10酒蒸黄连提取浸膏总生物碱/总多糖测定结果 由上数据可知，酒蒸黄连提取浸膏中总生物碱含量明显低于生品黄连。以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。试验例1酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1前脂肪细胞增值的影响3T3-L1前脂肪细胞株是小鼠胚胎来源、具有纤维母细胞形态的细胞株，在经典的 激素鸡尾酒，即胰岛素、地塞米松和1-甲基-3-异丁基黄嘌呤的刺激下，具有分化为成熟脂 肪细胞的能力，是目前国际上研究肥胖及体外脂肪细胞增殖和分化的细胞模型。通过干预 小鼠前脂肪细胞观察其对该细胞增殖和分化的影响，为肥胖的2型糖尿病的治疗提供可能 的途径。方法将3T3-L1前脂肪细胞悬液按5X 105/ml的密度接种到48孔培养板，于含 10%小牛血清的DMEM高糖培养基中，在37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，2d换液1次。待3T3-L1前脂肪细胞贴壁后，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预，空白对照组 培养液中加入等体积药物溶剂PBS，每浓度组均设6个复孔。在37°C、体积分数5% C02中 培养2d。48h后，PBS漂洗，加入DMEM高糖培养液400 yl及5mg/ml MTT 40 u 1，孵育4h。 吸去培养液，并加入溶媒DMSO 300ia，490nm测定各组的0D值。计算3T3-L1前脂肪细胞
增殖变化率。相对变化率(％ )=(实验组平均0D值/空白对照组平均0D值-1) X 100%表11酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响 增殖率1 各剂量组相对空白组的增殖变化率；增殖率2 酒蒸组相对于同剂量组生品的增殖变化率。注与空白对照组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；由表11、图3可知，酒蒸黄连促进3T3-L1前脂肪细胞增殖作用优于黄连生品。试验例2酒蒸黄连提取浸膏对对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响方法将3T3-L1前脂肪细胞悬液按5X 105/ml的密度接种到48孔培养板，于含 10%小牛血清的DMEM高糖培养基中，在37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养，2d换液1次。 待3T3-L1前脂肪细胞达到接触抑制后，用含1 P mol/L的Dex、0. 5mmol/L IBMX及5mg/L胰 岛素的DMEM完全培养液诱导分化，48h后撤去Dex和IBMX，用10mg/L胰岛素再继续作用 48h，换正常完全培养液培养8 12天，隔天换液，直至3T3-L1细胞90 %多呈脂肪细胞表型 时。在诱导分化的同时，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预，空白对照组培养液 中加入等体积药物溶剂PBS，每浓度组均设6个复孔。药物与分化培养液同步更换至分化结 束。诱导分化结束后，吸去培养液，细胞经PBS清洗3次后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞 lOmin，吸去固定液，PBS漂洗，加入油红0染液室温染色15min。弃去油红0染液，PBS漂洗 3次除去多余染液；置显微镜下观察，拍片；加入异丙醇，抽提脂肪细胞中油红0，510nm测定 0D值，计算细胞分化相对变化率。分化相对变化率(％ )=(实验组平均0D值/空白对照组平均0D值-1) X 100%未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈梭形，胞浆中无脂滴存在，形态与成纤维细胞相似 (图4-A)。3T3-L1前脂肪细胞在地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和胰岛素的共同作用 下，逐渐诱导分化成为成熟的脂肪细胞，胞浆内出现脂滴，并随着分化程度的加深而积聚增 多(图4-B)。油红0为脂肪特征性染色剂，染色后胞浆中的脂滴呈红色(图4-C)。 注与空白对照组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；由表12，图5可知，酒蒸黄连有2个剂量组明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化(P <0.01)，这与阳性药马来酸罗格列酮作用恰好相反；同时，与黄连生品相比较，酒蒸黄连 抑制分化率均明显高于黄连生品。上述实验结果表明，酒蒸黄连在一定剂量下抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，提示 酒蒸黄连炮制品可能不会引起脂肪的聚集而造成体重增加，这对防治与胰岛素抵抗相关的 代谢综合征或并发症具有一定的意义，而且其作用优于黄连生品。试验例3酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1前脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型葡萄糖利 用的影响方法细胞分化完全后，除空白组加入正常培养基，其余各组均加入lymol/L的 地塞米松、lymol/L的胰岛素进行脂肪细胞的胰岛素抵抗，作用3d。待脂肪细胞胰岛素抵 抗成立后，换用无酚红DMEM高糖培养基，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预 3d，空白对照组培养液中加入等体积药物溶剂PBS，每浓度组均设6个复孔，观察药物对胰 岛素抵抗的改善作用。72h后取细胞培养上清液505nm比色测定葡萄糖的含量，计算细胞葡 萄糖利用相对变化率。
葡萄糖利用相对变化率(％) 二 r聽且平丨髓-实爾<^ _跳xl00%
mmmmmmim表13酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1脂肪细胞IR模型葡萄糖利用的影响
(> $，n=6) 注与模型对照组比较，*P < 0. 05，**P < 0.01 ；由表13，图6可知，与空白组比较，3T3-L1脂肪细胞在地塞米松和胰岛素作用下， 模型组对胰岛素的敏感性明显降低，培养液中葡萄糖的摄取明显减少，表明脂肪细胞胰岛 素抵抗模型造模成功(P <0.01)。与模型组比较，酒蒸黄连能明显或部分降低培养液中葡 萄糖的含量(P < 0. 05 0. 01)，提高脂肪细胞葡萄糖的利用率，改善胰岛素抵抗，作用与阳 性药马来酸罗格列酮相似，同时，酒蒸黄连有3个剂量组的葡萄糖利用相对变化率高于黄 连生品。试验例4酒蒸黄连提取浸膏对3T3-L1前脂肪细胞PPAR γ的影响ilfi^^Blilli^^^Sf^ (Peroxisome Proliferator ActivatedReceptors, PPARs)，PPARs包括PAR α ,PPAR γ和PPAR δ等三种亚型。PPAR γ则主要在肝脏及脂肪、肌 肉组织表达，促进脂肪组织的分化、脂肪酸合成和储存，是脂肪形成的关键物质。PPARy与 配体或激活物结合后，可进一步激活脂肪细胞分化过程，参与调节脂肪细胞特异基因的表 达、脂质贮存和代谢。目前PPAR γ激动剂中的典型药物是罗格列酮，它是人工合成的PPAR 配体，它有胰岛素增敏及降血糖作用，可通过激活靶组织中的PPARy发挥改善胰岛素抵抗 (IR)、降低血糖、抑制血管平滑肌的增殖和迁移、改善内皮功能等多种生物学效应。对3T3-L1前脂肪细胞模型，按设计剂量分别加入不同浓度的受试药物干预， Western blot检测PPAR γ表达量，结果表明与生品比较，酒蒸黄连使PPAR γ的蛋白表达 量显著上升，见图7。体外培养3T3-L1前脂肪细胞经小檗碱干预，在3T3-L1脂肪细胞分化过程中，小 檗碱组脂肪细胞的PPARYmRNA较对照组低48 %，蛋白质免疫印迹结果也显示小檗碱抑制 PPARy的表达[周丽斌，杨颖，唐金凤，等.小檗碱对脂肪细胞糖代谢的影响.上海第二 医科大学学报.2002，22 (5) :412-414]。而PPAR γ表达的增加，可以促进葡萄糖的利用以 及胰岛素的增敏[成峰，蒋华良，陈凯先，等.PPAR γ激动剂的研究进展.中国药物化学杂 志2003，13(2) 110-118,124]刘毅，娄少颖，何燕铭，等.小檗碱对3T3-L1前脂肪细胞增 殖及分化相关基因PPARy、C/EBPamRNA何蛋白表达的影响.中国中西医结合杂志.2008， 28(11) 10051009，小檗碱使PPAR γ表达量减少82%。按BandScan5. 0，默认值
经内参校正后结果表明，与生品黄连比较，酒蒸黄连使PPARY表达量增加17.02倍。以上文献与试验的结果表明与生品黄连、小檗碱不同，酒蒸黄连明显增加 PPAR y的表达，可以促进葡萄糖的利用以及胰岛素的增敏，有希望成为一类2型糖尿病治 疗药物。该试验说明，本发明萸炙黄连可作为胰岛素增敏剂使用，胰岛素增敏剂是指噻唑 烷二酮(TZDs)衍生物，又称罗格列酮。1982年研究其降脂作用，同时发现还有减肥降低血 糖作用。其主要通过结合和活化过氧化物酶增殖物激活受体PPARy起作用，PPARy受体 被激活后通过诱导脂肪生成酶和与糖代谢调节相关蛋白的表达，促进脂肪细胞和其他细胞 的分化，并提高细胞对胰岛素作用的敏感性，减轻胰岛素抵抗，故被称为胰岛素增敏剂。(张 文，治疗糖尿病药物的发展历史，《中国执业药师》，2008年2期)胰岛素增敏剂除了包含胰 岛素增敏剂激动剂外，还包括维甲酸受体激动剂，3 3受体激动剂等(蔡小花，等，胰岛素增 敏剂类糖尿病药物研究进展，怀化医专学报，2002，1 (2)。上述试验结果表明，酒蒸黄连具有改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗，增强脂肪细 胞对葡萄糖摄取和利用的能力，从体外细胞水平上具有改善胰岛素抵抗的作用；同时，酒蒸 黄连在一定剂量下抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，提示酒蒸黄连在增加细胞对葡萄糖摄 取的同时不会引起脂肪的聚集而造成体重增加，这对防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征 或并发症具有一定的意义。试验例5酒蒸黄连提取浸膏对糖尿病整体动物模型的影响表14整体动物试验的设计剂量
16 1对小鼠正常血糖的影响(1)试验方法取ICR小鼠70只，雌雄各半，体质量18 22g。按体质量分层随机分成7组，每组 12只，即正常对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸黄连高、中、低 剂量组。各组小鼠按表14设计剂量灌胃给药(每只小鼠定量0. 3ml)，每日1次，连续7天。 末次给药后45min (禁食不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min离心lOmin，分离血清，按试 剂盒测定说明书测定小鼠空腹血糖(FBG)。(2)试验结果由表15结果可知，酒蒸黄连各剂量组均对正常小鼠空腹血糖(FBG)无明显影响(P > 0. 05)。
表15对正常小鼠FBG的影响 2对高浓度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影响(1)试验方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，体质量18 22g。按体质量分层随机分成8组，每 组12只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒 蒸黄连高、中、低剂量组。各组小鼠按表14设计剂量灌胃给药(每只小鼠定量0. 3ml)，每日 1次，连续7天。第7天末次给药后lOmin (禁食不禁水8h)，小鼠腹腔注射高浓度葡萄糖注 射液2g/kg(0. lml/只)复制模型，空白组给予等容积的生理盐水。测定造模后120min的 血糖(Glu)。(2)试验结果由表16可知，与空白组相比较，模型组小鼠腹腔注射高浓度葡萄糖后立即引起空腹血糖急性升高。与模型组相比较，酒蒸黄连高、中剂量组均能明显降低高浓葡萄糖引起的小鼠血 糖升高(P<0.01)；同时，与黄连生品相比较，酒蒸黄连的降糖作用明显优于黄连生品，且 作用优于盐酸小檗碱。表16对高浓度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影响 3对正常小鼠a -葡萄糖苷酶的抑制作用(1)试验方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，体质量18 22g。按体质量分层随机分成8组，每组 12只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸 黄连高、中、低剂量组。各组小鼠按表14设计剂量灌胃给药(每只小鼠定量0.3ml)，每日1 次，连续7天。第7天，动物禁食8h，测定小鼠空腹血糖(Omin)，测定后各组小鼠给药1次， 并立即灌服蔗糖溶液5g/kg(50g-100ml，0. 3ml/只)复制模型，空白组给予等容积的生理盐 水。测定灌胃前(Omin)及灌胃后30，60及120min血糖，计算各时间点血糖的变化率，采用 近似梯形的计算公式计算曲线下面积(AUC)。(2)试验结果
表17对正常小鼠a-葡萄糖苷酶的影响 由表17结果可知，酒蒸黄连高剂量组和盐酸小檗碱组能明显抑制灌服蔗糖引起的血糖升高(P < 0. 05-0. 01)，作用与阿卡波糖相似，表明药物对α -葡萄糖苷酶有一定的 抑制作用，可能与抑制淀粉类碳水化合物的吸收，降低餐后血糖相关，其作用可能是酒蒸黄 连治消渴的途径之一。4对四氧嘧啶致糖尿病小鼠糖异生的影响(1)试验方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，体质量18 22g。按体质量分层随机分成8组，每组 10只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒蒸 黄连高、中、低剂量组。试验前小鼠禁食18h(建议前1日下午3点禁食，第2日早晨9点造 模)。第2日早晨小鼠尾静脉注射的四氧嘧啶溶液60mg/kg造模，注射后4h模型小鼠灌胃 50%葡萄糖，0.4ml/只。造模次日，除空白组和模型组外，其余各组按表14剂量灌胃给药 (每只小鼠定量0. 3ml)，每日1次，连续7天。第7天末次给药后45min(禁食不禁水8h)， 腹腔注射L-丙氨酸(2g/kg)，测定注射前(Omin)及注射后60及120min血糖，采用近似梯 形的计算公式计算AUC。(2)试验结果由表18可知，与空白组比较，模型组小鼠尾静脉注射四氧嘧啶72h后，均出现多 食、多饮、多尿等症状，模型组空腹血糖含量明显升高，表明四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型造 模成功，模型组腹腔注射L-丙氨酸后，血糖立即升高，模型组糖异生异常明显(P < 0. 01)。与模型组比较，酒蒸黄连炮制品能明显降低小鼠腹腔注射L-丙氨酸引起的血糖 升高(P < 0. 01)，表明药物能减轻糖异生的异常，可能是酒蒸黄连治消渴的途径之一。5对四氧嘧啶致糖尿病模型小鼠的影响(1)试验方法取ICR小鼠80只，雌雄各半，体质量18 22g。按体质量分层随机分成8组，每 组10只，即正常对照组、模型对照组、二甲双胍对照组、盐酸小檗碱对照组、黄连生品组、酒 蒸黄连高、中、低剂量组。试验前小鼠禁食18h(建议前1日下午3点禁食，第2日早晨9点 造模)。第2日早晨小鼠尾静脉注射的四氧嘧啶溶液60mg/kg造模，注射后4h模型小鼠灌 胃50%葡萄糖，0.4ml/只。造模次日，除空白组和模型组外，其余各组按表14剂量灌胃给 药(每只小鼠定量0. 3ml)，每日1次，连续9天。⑵观察指标1)对小鼠葡萄糖糖耐量(OGTT)的影响第7天，动物禁食8h，末次给药后10分钟，灌胃葡萄糖(3g/kg，10ml/kg)，测定灌 胃前(Omin)及灌胃后30，60及120min血糖，计算各时间点血糖的变化率，采用近似梯形的 计算公式计算曲线下面积(AUC)。2)对小鼠血液生化的影响第9天末次给药后120min(禁食不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min离心 lOmin，分离血清，按试剂盒测定说明书分别测定小鼠糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白 (GSP)、空腹血糖(FBG)、血乳酸(LD)、血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量。3)对小鼠肝组织肝糖原的影响小鼠处死后，迅速取出肝组织，称重，转移致液氮中冻存备用。按肝糖原试剂盒说明书制备肝组织勻浆，测定小鼠肝糖原的含量。(3)试验结果1)对小鼠葡萄糖糖耐量(0GTT)的影响由表19可知，与空白组比较，模型组小鼠尾静脉注射四氧嘧啶72h后，均出现多 食、多饮、多尿等症状，模型组小鼠糖化血红蛋白含量和空腹血糖含量明显升高，表明四氧 嘧啶致小鼠糖尿病模型造模成功(P < 0. 01)。与模型组比较，酒蒸黄连炮制品能明显降低小鼠糖耐量的异常(P < 0.01)，且随 给药时间的延长表现出一定的时效性。2)对小鼠血液生化的影响由表20可知，与空白组相比较，模型组小鼠糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白 (GSP)、空腹血糖(FBG)、血乳酸(LD)、血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量明显升 高。与模型组相比较，酒蒸黄连能明显或部分降低6恥、65 、？86、0)、1^和16的含量(P < 0. 05-0. 01)，改善糖尿病小鼠血液生化的异常。尤其酒蒸黄连能明显降低模型小鼠血清 乳酸的异常，与阳性药二甲双胍增加血乳酸的作用相反，提示酒蒸黄连在降糖的同时不会 引起酮中毒的副作用。综上所述，酒蒸黄连能通过减弱四氧嘧啶对胰岛0细胞的损伤或改善受损伤的 3细胞的功能来发挥降血糖作用。小结酒蒸黄连具有明显的改善糖尿病的作用，但对正常血糖无明显影响，其作用 与改善胰岛素抵抗，降低糖异生，抑制a “葡萄糖苷酶作用相关。试验例6酒蒸黄连提取浸膏对急性毒性试验表21药物的分组及剂量设计 ICR小鼠180只，雌雄各半，按体质量分层随机分为18组，分组及给药剂量按表21 设计，每只小鼠均按20ml/kg给药(禁食不禁水8h)，分别观察小鼠给药后14天内出现的中 毒症状，死亡情况及死亡时间、体重变化及进食情况，对死亡小鼠立即解剖，肉眼观察记录 主要损害的器官及病理变化情况，并将主要脏器保存于10%甲醛溶液中。最后清点各组动 物的死亡数，计算出各药物的LD5(i。(3)试验结果急性毒性试验结果表明，生品黄连的LD5Q为4. 4679g/kg，依据《中国药典2005版》
黄连人体临床使用推荐最大量5g/天(人体质量按60kg)计算，即0. 0833g/kg d，相当于
人体用药剂量的53. 6倍；酒蒸黄连的LD50为7. 5475g/kg，相当于人体用药剂量的90. 6倍，
接近于临床安全剂量(相当于人体的100倍)，黄连酒蒸炮制后毒性明显降低。
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权利要求
一种酒蒸黄连炮制品，其特征在于它是将黄酒或白酒加入生黄连中蒸制而成，制备的黄连炮制品的指纹图谱如图1所示，主要指标成分包括药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱及其以上生物碱成分的盐酸盐，其中，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为4-7∶5-9∶11-17∶23-35∶23-27∶100。
2.根据权利要求1所述的酒蒸黄连炮制品，其特征在于药根碱、非洲防己碱、表小檗 碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为4. 7-6. 8 5.7-8.3 11.5-16.7 23.9-34.5 2 3.4-26.5 100。
3.根据权利要求2所述的黄连炮制品，其特征在于所述的药根碱、非洲防己碱、表小 檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的重量配比为5. 6 7. 1 14. 8 31.0 24.5 100。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的黄连炮制品，其特征在于它是由如下方法制备 而成取净黄连，加黄酒或白酒闷润1-6小时，加热蒸制3 8小时，取出，干燥，即得，其中 黄连与黄酒或白酒的用量配比为黄连100份、黄酒或白酒20 120份。
5.根据权利要求4所述的黄连炮制品，其特征在于所述的酒蒸黄连的炮制工艺中，每 100份黄连，用黄酒或白酒40份拌勻，闷润6小时，加热蒸制8小时，取出，干燥。
6.一种制备权利要求1-5任意一项所述的黄连炮制品的方法，它是由如下方法制备而 成取净黄连，加黄酒或白酒闷润1-6小时，加热蒸制3 8小时，取出，干燥，即得，其中黄 连与黄酒或白酒的用量配比为黄连100份、黄酒或白酒20 120份。
7.根据权利要求6所述的黄连炮制品的制备方法，其特征在于所述的酒蒸黄连的炮 制工艺中，每100份黄连，用酒40份拌勻，闷润6小时，加热蒸制8小时，取出，干燥。
8.权利要求1-5任意一项所述的酒蒸黄连炮制品在制备PPARY激动剂的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的药物是抑制3T3-L1前脂肪细胞分 化、提高3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖利用率的药物或胰岛素增敏剂。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于所述的药物是降低血脂功能、改善 胰岛素抵抗，降低糖异生的药物。
11.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于所述的药物是治疗糖尿病及其并发 症的药物。
12.权利要求1-5任意一项所述的酒蒸黄连炮制品在制备a-葡萄糖苷酶抑制剂的药 物中用途。
13.一种具有抑制3T3-L1前脂肪细胞分化、提高3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖利用率的药 物组合物，其特征在于它是由下述方法制备而成取权利要求1-4所述的酒蒸黄连，加水 煎煮1 3次，每次0. 5 3小时，每次加水量为6 10倍量，滤过，合并提取液，浓缩，备 用，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于它是由下述方法制备而成取酒 蒸黄连，加水煎煮3次，每次3小时，每次加水量为10倍量，滤过，合并提取液，浓缩，备用。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂是口服制剂。
全文摘要
本发明提供了一种酒蒸黄连，本发明还提供了该酒蒸黄连的制备方法和用途。本发明酒蒸黄连作为胰岛素增敏剂及PPARγ激动剂，具有抑制3T3-L1前脂肪细胞分化、提高3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖利用率及降低血脂，改善胰岛素抵抗和糖尿病药物。本发明涉及的酒蒸黄连及其提取浸膏，制备，具有抑制3T3-L1前脂肪细胞分化、提高3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖利用率或降低血脂功能及在改善胰岛素抵抗或糖尿病药物中的用途，具有明确的药效，药效优于盐酸小檗碱和生品黄连及其提取浸膏，安全性明显优于生品黄连。
文档编号A61P3/10GK101874832SQ20101017485
公开日2010年11月3日 申请日期2010年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者孟宪丽, 张艺, 李佳川, 赖先荣, 郑海杰 申请人:成都中医药大学