一种病毒感染阻断剂、其药物组合物及其应用的制作方法

专利名称：一种病毒感染阻断剂、其药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本申请涉及一种病毒感染阻断剂及其应用，具体而言，本申请涉及N末端和C末端均修饰的可阻断HBV感染的多肽。
背景技术：
1. HBV的流行病学HBV感染是全球最为严重的公共卫生问题之一，是仅次于性病和水痘的第三常见疾病。全球约有20亿人感染过HBV，75 %的世界人口生活在乙型肝炎高发区，慢性HBV感染者超过3. 5亿。每年与HBV感染相关的死亡人数高达100万，每年新增感染估计是HIV新增感染的2. 5 4倍。世界上75%的HBV慢性感染者集中在亚洲(约为2. 87亿)，中国是乙型肝炎的高流行区，70年代末、90年代初和最近的三次全国肝炎流行病学调查的数据显示，我国感染过HBV者6. 9亿，感染率为57. 6%，全国长期携带HBV者0. 87亿，现有的慢性乙型肝炎患者2000余万。2. HBV感染的预防与治疗现状HBV的重要性早已在世界范围内得到广泛公认，其预防和治疗也被置于优先地位。 但迄今尚缺乏可清除体内HBV的药物，疗效相对确切的抗病毒药物主要是α干扰素和核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和特必夫定等)。α干扰素主要通过免疫调节和诱生靶细胞内抗病毒蛋白而发挥抗病毒作用；核苷类似物则作用于HBV逆转录酶，抑制病毒 DNA链的合成，从而抑制HBV DNA的复制。经过1年的标准疗程治疗，约33%的α干扰素治疗患者和约16%的拉米夫定治疗患者可获得彻底或部分血清学应答(HBsiVg转阴、HBeAg 均转阴、出现或不出现抗-HBe抗体)、完全的病毒学应答(HBV DNA转阴)和生化应答(丙氨酸氨基转移酶间隔1个月连续2次检测均正常，肝功能复常)。自从1970年Krugman获得最早的乙型肝炎疫苗后，各国相继利用无症状HBsAg携带者的血浆提取血源性HBsAg制备HBV疫苗。血源性HBV疫苗经过长期使用被证明安全有效，但由于其来源有限，制备成本高昂，已被基因重组HBV疫苗取代。目前主要的重组疫苗包括酵母和中国仓鼠卵巢细胞表达的重组乙肝疫苗。这些疫苗免疫原性强，3针全程免疫后抗HBsAg抗体阳转率不低于85%。但其主要缺点是抗体应答较迟，HBV感染产妇的新生儿初次免疫若超过7天以上，则失去HBV疫苗对新生儿阻断垂直传播的作用。而且10% 15%接种者不产生应答或低应答，该人群仍可被HBV感染。乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)系用经乙型肝炎疫苗免疫健康人后，采集的高效价血浆或血清分离提取制备的免疫球蛋白制剂，其抗体效价在100IU/ml以上。适用于突发意外感染人群、免疫功能低下者以及HBV感染产妇新生儿的被动免疫预防。我国的慢性HBV 感染者约有30% -50%通过母婴传播，为阻断HBV母婴围产期传播，普遍将HBIG与乙肝疫苗联合应用，虽然保护率可达80%以上，但HBIG提供的阻断贡献并不明显，联合应用仅较乙肝疫苗单用提高5% 10%的阻断率，而且联合应用后HBV感染产妇新生儿HBV感染率仍较健康产妇新生儿高4倍。近年发现，宫内感染可能是母婴传播的重要途径，HBV感染孕妇引产胎儿肝脏或血液的HBV感染标志检出率可达40%，HBsAg阳性母亲的婴儿的宫内感染率约16%。因此国内有些医院在妊娠的最后3 4个月中对HBV感染孕妇每月一次注射大于200IU的HBIG，以期预防胎儿HBV宫内感染。但该方法宫内传播阻断效果并不理想，且可能导致HBV S区变异株的出现和免疫复合物病理免疫反应的发生。HBIG还广泛应用于乙型肝炎相关肝移植术后HBV感染复发的预防。在没有预防措施的情况下，乙型肝炎相关肝移植术后6个月内HBV再感染率高达约40%，2年内再感染率高达约60%。多数再感染病例历经急性、慢性肝炎而发展为肝硬化、肝功能衰竭，远期预后不佳，需再次肝移植。单独采用拉米夫定预防肝移植术后乙型肝炎复发，其长期HBV-DNA、 HBeAg及HBsAg转阴率约60 70%，且易发生HBV基因突变，YMDD耐药变异率高达21 %。 加之患者移植前多长期使用抗病毒药物，多数出现抗病毒药物抵抗现象，增加了移植后病毒感染复发率和预防的难度。因此国外加用大剂量HBIG以预防乙型肝炎相关肝移植术后乙肝复发。肝移植术后没有接受HBIG治疗的受者中，术后早期体内出现不同滴度的HBsAb， 随后血清HBsAb逐渐消失，而使用HBIG的患者血清HBsAb能长期维持较高滴度。高剂量无限制性HBIG单一治疗能阻止65% 80%患者复发，但HBIG价格昂贵，费用每年高达约130 万元人民币。国内采用拉米夫定与小剂量HBIG联合应用阻止移植后HBV感染复发的疗效虽然显示良好，但未经大样本临床试验证实。且长期应用HBIG带来的免疫压力会造成HBV 基因变异而出现免疫逃逸现象，使HBIG用于乙型肝炎相关肝移植术后HBV再感染的预防受到很大限制。综上所述，目前用于防治HBV感染的手段主要限于核苷酸类似抑制物、抗病毒细胞因子和中和性抗体的主动被动免疫，缺少对HBV病毒其他感染环节的抑制手段。本发明所涉及的多肽可与肝细胞结合，直接阻断病毒对肝细胞的感染，为HBV感染的治疗和预防提供新的手段。3.关于本发明公开的可阻断HBV感染的多肽HBV病毒包膜含有大(L)、中(M)、小(S)三种表面抗原蛋白，这些蛋白由具有3个不同翻译起始位点的S区基因单一开放阅读框编码，即LO^re-Sl+PreSZ+S)、M(Pre S2+S) 和。HBV的L蛋白区存在与肝细胞特异性受体结合的关键氨基酸序列，本发明合成关键序列多肽，并对其两端进行修饰改造，提高了多肽对HBV感染阻断的效能，增强了多肽的稳定性。目前治疗HBV慢性感染的药物均作用于HBV细胞内复制环节，而本发明涉及的多肽可高效直接抑制HBV对细胞的感染，且十分稳定，为HBV感染的防治提供了优良的药用化合物。

发明内容
本发明涉及一种可阻断HBV感染的多肽，该多肽自N端至C端具有氨基酸序列SEQ ID NO :1，其N端被疏水集团修饰，其C端被稳定化修饰。在一个实施例中，所述多肽的N端被豆蔻酰化修饰、硬脂酸修饰、棕榈酸修饰、胆固醇修饰，其C端被酰胺化(Amidation，氨基化)修饰、或异戊二醇化修饰。其中N端的疏水基团修饰可增强所述多肽阻断HBV感染的效能，而C端的稳定性修饰可增强所述多肽的稳定性。本发明还涉及一种药物组合物，它含有本发明公开的多肽和药学上可接受的载体。本发明还涉及所述多肽在制备预防和/或治疗乙型肝炎的药剂中的用途。
具体而言，本申请提供一种多肽，该多肽选自(I)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(2)在SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列基础上具有1_3个氨基酸取代、缺失或插入、并保持SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的阻断HBV感染的活性的氨基酸序列；其中，该多肽N端带有疏水基团修饰且C端被稳定化修饰。在一具体实施例中，所述的N端疏水性修饰为豆蔻酰化修饰、或硬脂酸修饰、或棕榈酸修饰、或胆固醇修饰。在一具体实施例中，所述的C端稳定化修饰为酰胺化修饰或异戊二醇化修饰。在一具体实施例中，所述的N端疏水性修饰为豆蔻酰化修饰，所述的C端稳定化修饰为酰胺化修饰。在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、3或4所示。在一具体实施例中，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、3或4所示，所述多肽的N 端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其 N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。本申请提供一种药物组合物，该药物组合物含有本申请所述的多肽和药学上可接受的载体。在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1_4中任一条序列所述。在一具体实施例中，所述药物组合物含有至少一条SEQ ID NO 1-4所示的氨基酸序列。在一具体实施例中，所述药物组合物中的多肽为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列， 其N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其 N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。在一具体实施例中，药物组合物中多肽的浓度为大于等于20ng/ml，优选为大于等于 100ng/ml。本申请还涉及所述的多肽在制备治疗HBV感染用的药剂中的用途。在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其 N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。在一具体实施例中，所述对象为已感染HBV或可能感染HBV的人。


图1显示具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，C端酰胺化修饰，N端疏水基团修饰的多肽对HBV感染的阻断。图2显示具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻酰化修饰，C端稳定化修饰的多肽的稳定性。图3显示具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻酰化修饰，C端稳定化修饰的多肽对HBV感染的阻断。图4显示氨基酸突变对SEQ ID NO 1-4氨基酸序列多肽阻断HBV感染的影响和稳定性。
具体实施例方式如上所述，本发明提供了一种可抑制HBV感染的多肽。该多肽自N端至C端具有 SEQ ID NO :1所示氨基酸序列，其N端带有疏水基团修饰，其C端被稳定化修饰。以上所述的 N端疏水基团修饰，这些疏水基团优选地是豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、胆固醇、 花生四烯酸及其类似基团。进一步优选地为豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或胆固醇，更优选地为豆蔻酸。以上所述的C端稳定化修饰，这些稳定化修饰包括酰胺化修饰(即氨基化修饰)、 异戊二醇化修饰及其他多肽C端稳定化修饰。优选地为酰胺化修饰(即氨基化修饰)。在本发明的一个优选方案中，序列为SEQ ID NO=I的多肽的C末端经酰胺化修饰， 而其N末端分别进行了豆蔻酰化、硬脂酸、棕榈酸和胆固醇修饰，其中优选地N端豆蔻酰化修饰的多肽具有更高的病毒感染抑制活性。在另外一个优选方案中，序列为SEQ ID NO 1 的多肽的N末端经豆蔻酰化修饰，而其C末端分别进行了酰胺化修饰和异戊二醇化修饰，其中优选地C端酰胺化修饰的多肽具有更高的病毒感染抑制活性和优良的稳定性。因此在本发明的进一步优选方案中，序列为SEQ ID NO :1的多肽的C末端经酰胺化修饰，而且N末端进行了豆蔻酰化修饰。本申请所涉及多肽的任何同系物均为本申请的一部分，包括经过一个或多个氨基酸突变，如包括1-10个氨基酸、较佳1-8个氨基酸、更佳1-5个氨基酸、更佳1-3个氨基酸的删除、保守/非保守氨基酸替换、或插入而获得的多肽序列。这里的“同系物”还包括与本申请涉及多肽具有大于30% (如40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更大) 同源性的多肽。在本发明的一个优选方案中，对序列为SEQ ID NO :1的多肽进行1-3个氨基酸的突变获得的多肽序列(SEQ ID NO 2-4)。具体而言，氨基酸一般被分成四类(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的替代将不会对生物活性有重要影响。本申请还包括将提供的多肽用作阻断或防止HBV感染的药物以及与适当药学上可接受的载体组成的药物制剂。本申请还包括含有所述多肽的药物组合物。 本发明的药物制剂或药物组合物含有有效量的本发明多肽。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。例如，对于液体制剂或组合物而言，所述多肽的浓度可以为20ng/ml以上，例如50ng/ml以上、80ng/ ml以上、100ng/ml以上或更高。 所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。可采用本领域各种常规的合适方式给予对象本发明的药物组合物或药物制剂，所述方式包括但不限于口服、皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等。本申请也包括以所提供的多肽作为治疗或预防HBV感染的措施，以及涉及本申请多肽在内的患者所需要的任何预防、治疗措施。本申请特别包含本申请多肽体内抑制HBV 感染的预防和治疗措施，其中包括阻止HBV传播到生物体未受感染的细胞中。这里的预防措施是指降低或避免患者感染HBV的可能性，治疗措施是指改善或稳定患者状况的所有措施。所指的患者是任何被HBV感染、可能被HBV感染和可能即将被HBV感染的人。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，C端酰胺化修饰，N端疏水基团修饰的多肽对HBV感染的阻断1、多肽的制备和修饰以AB 431A型多肽合成仪按标准Fmoc方案，以0. 25mM树脂起始，按照SEQ ID NO 1序列自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成，最后添加疏水集团修饰。肽合成结束后，经切割液切割，G6玻砂漏斗滤除树脂，滤液真空抽干，多肽的C末端进一步酰胺化。无离子水溶解多肽产物，AKTA explorer 100型中压液相色谱仪C18柱纯化，分步收集主峰。目标峰收集样以Delta 600型反相高压液相色谱Symmetry C18分析柱纯度鉴定，API 2000LC/MS/ MS型质谱仪分子量鉴定。中压液相色谱纯化所得的收集液冻干，溶于PBS形成多肽储存液， 0. 20 μ M过滤除菌，-80°C冻存。2、树駒原代肝细胞的培养树駒麻醉后经门静脉插管，按照BD公司肝细胞培养基使用手册提供的经典两步灌注法消化肝脏组织，分离原代肝细胞，经洗涤后铺板于肝细胞培养板(BD公司产品 BD354408)，采用肝细胞培养基培养(BD公司产品BD355056)，每3天更换培养基，37度、5% 二氧化碳环境培养。3、HBV病毒对肝细胞的感染。将我国临床收集的混合的HBV感染患者的病毒血清2ml加入培养3天的树駒原代肝细胞，37°C孵育感染12小时。感染完成后移除感染血清，洗涤细胞3次，补充新鲜培养基连续培养12天。4、HBV感染后肝细胞培养上清HBsAg的检测培养上清中的HBsAg通过三明治夹心法(in-house sandwich)酶联免疫分析 (ELISA)检测。lug/ml抗HBsAg单克隆抗体37°C包被96孔板2小时。充分洗涤后(0. 1% Tween 20PBS洗涤3次、PBS洗涤2次)，10%胎牛血清37°C封闭1小时。去除封闭液，加入 HBV感染的肝细胞培养上清100 μ 1 4°C孵育12小时。去除培养上清，充分洗涤，加入过氧化物酶偶联的抗HBsiVg抗体37°C孵育1小时。去除多余抗体，加入苯二胺-H2O2反应底物室温反应15分钟，2N H2SO4中止反应，测定反应产物的0D492，计算感染上清中HBsAg含量。5、具有SEQ ID NO 1氨基酸序列、C端酰胺化修饰、N端疏水基团修饰的多肽对HBV
7感染的阻断树駒原代肝细胞于M孔培养板中培养3天，在HBV病毒感染的同时，在感染上清中加入不同N端修饰的多肽各20ng/ml，共同孵育12小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。 继续培养12天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图IA所示，以未受多肽处理肝细胞的HBV感染为对照，带有N端不同疏水基团修饰的多肽对HBV感染肝细胞具有不同程度的阻断效应，其中N末端为豆蔻酸修饰、硬脂酸修饰、棕榈酸修饰、胆固醇修饰和N末端无修饰的多肽分别可抑制HBV对肝细胞感染的57. 4%、49. 2%、46. 8% 43. 2%和9. 7%。可见， N末端为豆蔻酸修饰的多肽具有较高的HBV感染抑制效应，且FITC荧光标记的N、C末端为豆蔻酸和酰胺化修饰的SEQ ID NO 1多肽可与原代肝细胞结合(图1B)。实施例二 具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻酰化修饰，C端稳定化修饰的多肽的稳定性1、多肽的制备和修饰以AB 431A型多肽合成仪按标准Fmoc方案，以0. 25mM树脂起始，按照SEQ ID NO 1序列自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成，最后豆蔻酸修饰。肽合成结束后，经切割液切割，G6玻砂漏斗滤除树脂，滤液真空抽干，多肽的C末端进一步酰胺化、或异戊二醇化修饰、 或C端不修饰。无离子水溶解多肽产物，Akta explorer 100型中压液相色谱仪C18柱纯化，分步收集主峰。目标峰收集样以Delta 600型反相高压液相色谱Symmetry C18分析柱纯度鉴定，API 2000LC/MS/MS型质谱仪分子量鉴定。中压液相色谱纯化所得的收集液冻干，溶于PBS形成多肽储存液，0. 20 μ M过滤除菌，_80°C冻存。2、多肽的稳定性多肽溶于0.02M PBS，形成0. 25mg/ml浓度溶液，置于37度放置3天。采用Luna C18，150X4. 6mm, 5 μ , 100Α色谱柱，采用Delta 600型反相高压液相色谱仪分别进行HPLC 纯度分析。如图2所示，N端均经豆蔻酰化修饰，而C末端分别酰胺化修饰、异戊二醇化修饰和C末端未修饰的多肽37度放置前纯度分别为98. 2%、98. 7%和98. 3% (图2A) ；37度放置12小时后纯度分别为95. 4%、95. 6%和95. 5% (图2B) ；37度放置3天后纯度分别降低至83. 9%、87. 7%和43. 9% (图2C)。可见C端未修饰的多肽缺乏稳定性，而经C端酰胺化修饰和异戊二醇化修饰后多肽稳定性明显增加。实施例三具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，N端豆蔻酰化修饰，C端稳定化修饰的多肽对HBV感染的阻断1、多肽的制备和修饰(同实例二 )。2、树駒原代肝细胞的培养和HBV病毒的感染(同实施例一)3、HBV感染后肝细胞培养上清HBsAg的检测(同实施例一)4、具有SEQ ID NO :1氨基酸序列，N端豆蔻酰化修饰，C端稳定化修饰的多肽对HBV 感染的阻断1)多肽低浓度下对HBV感染的阻断效应树駒原代肝细胞于M孔培养板中培养 3天，在HBV病毒感染的同时，在感染上清中加入不同C端修饰的多肽各20ng/ml，共同孵育 12小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。继续培养12天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图3A所示，以未受多肽处理肝细胞的HBV感染为对照，N末端均被豆蔻酰化修饰而C 端带有不同稳定化修饰和C端未修饰的多肽对HBV感染肝细胞具有不同程度的阻断效应，其中C末端为酰胺化修饰、异戊二醇化修饰和C端未修饰的多肽分别可抑制HBV对肝细胞感染的55. 9%、42. 4%和57. 3%。可见，在低浓度条件下C末端酰胺修饰多肽与C端未修饰多肽对HBV感染的阻断效应相当，而C末端异戊二醇化修饰则影响多肽对病毒感染的阻断效应。2)多肽高浓度下对HBV感染的阻断效应树駒原代肝细胞于M孔培养板中培养3 天，在HBV病毒感染的同时，在感染上清中加入不同C端修饰的多肽各lOOng/ml，共同孵育 12小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。继续培养12天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图:3B所示，以未受多肽处理肝细胞的HBV感染为对照，N末端均被豆蔻酰化修饰而C 端为酰胺化修饰、异戊二醇化修饰和C端未修饰的多肽对HBV感染肝细胞具有不同程度的阻断效应，其中C末端为酰胺化修饰、异戊二醇化修饰和C端未修饰的多肽分别可抑制HBV 对肝细胞感染的95. 1%、60. 9%和81. 5%。可见，C末端异戊二醇化修饰阻断HBV效应仍不及C端未修饰的多肽。而出乎意料地，C末端酰胺化修饰的多肽在高浓度时较C端未修饰的多肽阻断HBV效应明显提高。这种增强效应可能存在两方面原因1)多肽经酰胺化修饰后，半衰期延长，使试验阻断时间(12小时)内的多肽有效浓度增加。但实施例二中稳定性的研究却显示，12小时末C端未修饰与C端酰胺化修饰的多肽相比，降解无差别。因此不能用半衰期优势解释高浓度条件下C端酰胺化修饰对多肽病毒阻断能力的增强作用。2) C端酰胺化修饰增强了多肽的某些生物学性状(如分子空间结构、亲疏水性、高浓度条件下的多聚体等)，更适合与HBV竞争，进而增强了多肽阻断感染的效应。但由于目前该多肽的生物学性状尚不了解，因此无法预料和解释高浓度条件下C端酰胺化修饰对多肽病毒阻断能力的增强作用。实施例四氨基酸突变对SEQ ID NO=I氨基酸序列多肽阻断HBV感染的影响1、多肽的制备和修饰以AB 431A型多肽合成仪按标准Fmoc方案，以0. 25mM树脂起始，按照SEQ ID NO 2-4序列(分别带有1个突变F13L，2个突变F13L、H39Q和3个突变F13L、H39Q、N44D)自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成，最后豆蔻酸修饰。肽合成结束后，经切割液切割，G6玻砂漏斗滤除树脂，滤液真空抽干，多肽的C末端进一步酰胺化修饰。无离子水溶解多肽产物，AKTA explorer 100型中压液相色谱仪C18柱纯化，分步收集主峰。目标峰收集样以 Delta 600型反相高压液相色谱Symmetry C18分析柱纯度鉴定，API 2000LC/MS/MS型质谱仪分子量鉴定。中压液相色谱纯化所得的收集液冻干，溶于PBS形成多肽储存液，0. 20 μ M 过滤除菌，_80°C冻存。2、树駒原代肝细胞的培养和HBV病毒的感染(同实施例一)。3、HBV感染后肝细胞培养上清HBsAg的检测(同实施例一)。4、具有SEQ ID NO :1_4氨基酸序列，N端豆蔻酰胺化修饰，C端酰胺化修饰的多肽对HBV感染的阻断1)树駒原代肝细胞于M孔培养板中培养3天，在HBV病毒感染的同时，在感染上清中加入SEQ ID NO :1-4序列的多肽各20ng/ml，共同孵育12小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。继续培养12天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图4A所示，以未受多肽处理肝细胞的HBV感染为对照，SEQID NO :1_4序列的多肽分别可抑制HBV对肝细胞感染的56. 7%、55. 9%、59. 3%和52. 6%。可见，1-3个氨基酸序列的突变不影响SEQ ID NO 1序列的多肽阻断HBV感染的效应。2)树駒原代肝细胞于M孔培养板中培养3天，在HBV病毒感染的同时，在感染上清中加入SEQ ID NO :1-4序列的多肽各lOOng/ml，共同孵育12小时。移除感染上清，洗涤细胞3次。继续培养12天后检测肝细胞培养上清中HBsAg含量。如图4B所示，以未受多肽处理肝细胞的HBV感染为对照，SEQID NO :1_4序列的多肽分别可抑制HBV对肝细胞感染的94. 7%、96. 2%、95. 7%和93. 9%。可见，1-3个氨基酸序列的突变不影响SEQ ID NO 1 序列的多肽阻断HBV感染的效应。5、突变多肽的稳定性多肽溶于0.02M PBS，形成0. 25mg/ml浓度溶液，置于37度放置3天。采用Luna C18，150X4. 6mm, 5 μ , IOOA色谱柱，采用Delta 600型反相高压液相色谱仪分别进行HPLC 纯度分析。SEQ ID NO :1-4多肽37度放置前纯度分别为98. 2%、98. 9%、98. 6%和98.8%， 如图4C所示，37度放置3天后纯度分别降低至83. 9%、84. 1%、82. 7%和83. 2%。可见， 1-3个氨基酸序列的突变不影响SEQ ID NO :1序列的多肽稳定性。上述具体实施例仅仅是阐述性的，而非限制性的。本申请的保护范围将由权利要求来限定。本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的技术方案作出各种修改和变动，这些修改和变动依然包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种多肽，选自(1)SEQID NO 1所示的氨基酸序列；或(2)在SEQID NO :1所示的氨基酸序列基础上具有1-3个氨基酸取代、缺失或插入、并保持SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的阻断HBV感染的活性的氨基酸序列；其中，该多肽N端带有疏水基团修饰且C端被稳定化修饰。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的N端疏水性修饰为豆蔻酰化修饰、或硬脂酸修饰、或棕榈酸修饰、或胆固醇修饰。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的C端稳定化修饰为酰胺化修饰、或异戊二醇化修饰。
4.权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的N端疏水性修饰为豆蔻酰化修饰、所述的C端稳定化修饰为酰胺化修饰。
5.权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDN0:2、3或4 所示。
6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述多肽的N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。
7.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，其N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。
8.—种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1-7中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。
9.权利要求1-7中任一项所述的多肽在制备治疗HBV感染用的药剂中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，其N端为豆蔻酰化修饰、C端为酰胺化修饰。
全文摘要
本发明涉及用于预防、治疗病毒感染的阻断剂。改变该阻断剂的N末端和C末端的修饰，可明显影响该阻断剂的稳定性和阻断病毒感染的有效性。本发明还涉及该阻断剂用于预防、治疗病毒感染的应用。
文档编号A61K38/16GK102241744SQ201010174788
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者刘宏利 申请人:上海贺普生物科技有限公司