专利名称：一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及口腔保健领域，具体涉及一种能预防龋齿、清除牙菌斑、治疗牙龈炎、 牙周炎、口腔溃疡和消除口气的IgY抗体口腔喷雾剂。
背景技术：
龋齿(俗称蛀牙)是指牙齿组织逐渐毁坏崩解形成缺损的一种疾病。龋病是人体 最常见的牙齿疾病。病患率一般为70%左右，有些地方高达90%以上。世界卫生组织把它 与癌症，心血管病一起列为重点防治的三大非传染性疾病。龋齿不仅使牙齿崩溃缺损还能 继发牙髓组织根尖、周围组织的疾病，甚至使髓骨受感染引起骨髓发炎等并发症，以至影响 全身健康。预防龋齿可以从两方面着手一是增强牙齿的硬度和钙化程度，以抵御牙菌斑产 酸对牙齿的腐蚀，如含氟牙膏、含氟漱口水等。由于氟有副作用，而儿童使用漱口水易将其 吞下。因此，许多国家禁止儿童使用含氟漱口水。二是持续有效的抑制牙菌斑的形成，从根 本上预防龋齿。医学研究人员发现引起龋齿的主要致病菌是变异链球菌，这种细菌易粘附 在牙齿表面形成牙菌斑，继而通过代谢活动产生酸，酸使牙矿物质溶解形成齿洞而形成蛀 牙。使用抗菌素可以杀灭变异链球菌，但也会杀灭口腔内部的正常寄生菌群，影响口腔菌群 的生态平衡，经常使用抗菌素还会使细菌产生耐药性。龋齿是由变形链球菌引起。抗变形链球菌IgY是用变形链球菌(Str印tococcus mutans)免疫蛋鸡，从鸡蛋黄中提取的抗体。它对变形链球菌有特异的结合能力，它能强效 抑制变异链球菌，进而抑制牙菌斑的形成，达到有效防龋的目的。它安全，无毒、无副作用， 不会杀灭口腔内其他正常寄宿菌，影响口腔菌群的生态平衡。它形成的蛀牙细菌无法生存 的口腔生态环境，能产生持久特效作用。用抗变形链球菌的鸡蛋黄抗体IgY喷于牙齿上，连 续用两个月，作用效果可达半年。由于儿童手部肌肉发育不完全.不能有效刷牙，再加上儿 童不愿意刷牙，也理解不了刷牙的好处。无论家长、老师怎样劝说，都不愿意刷牙。因而，防 龋齿抗体IgY 口腔喷剂特别适用于儿童防龋齿。我国儿童占人口的20%，若有30%的儿童 使用，每人一只，年均销售可达24亿元。IgY抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过 程中保证其稳定性是非常关键的。如果IgY抗体不稳定，IgY会降解，失活，则IgY的效价 会降低，则IgY的抑菌的活性会降低甚至会消失。所以如何保证产品中IgY抗体的稳定性， 是急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，其预防龋 齿效果好，同时可辅助治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。本发明防龋齿的IgY抗体口腔喷雾 剂制造和使用方便，安全性高，其中，IgY抗体能在常温下稳定保存。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，包括以下组分IgY0. 1-0. 5wt% ；
抑菌剂防腐剂甘油
5-15wt% ； 3-6wt% ； 5-20wt% ； 5-10wt% ； 0. l-lwt% ； 50-75wt%o乙醇食用香精蒸馏水所述抑菌剂为NISIN、三氯生、木糖醇中的一种或多种。所述防腐剂为尼泊金酯钠、山梨醇中的一种或多种。所述尼泊金酯钠为尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠中 的一种或多种。所述食用香精为水溶性水蜜桃香精、水溶性薄荷香精、水溶性留兰香香精中的一 种或多种。下面就本发明所用材料进一步作详细说明1)变异链球菌按其血清型可分为a、b、C、d、e、f、g和h等几类，但是对口腔中变 异链球菌的检测表明，c型菌株约占口腔变异链球菌总量的60-90%，d型菌株约占口腔变 异链球菌总量的10%，其它几种血清型变异链球菌的检出率很低。因此，c型和d型变异链 球菌是引起龋齿的主要血清型，本发明选择c型和d型变异链球菌作为抗原菌体，将c型和 d型变异链球菌免疫产蛋母鸡，然后用聚乙二醇(PEG)法纯化，得到IgY抗体。本发明所述免疫所用的c型和d型变异链球菌通过如下方法培养在37°C温度条 件下，用BHI或TTY培养基，分别培养c型和d型变异链球菌48小时，然后将培养后的c型 和d型变异链球菌分别5，OOOrpm离心5分钟，收集菌体，用pH值为6. 0、浓度为0. 2M的磷 酸缓冲液洗菌3次，然后50°C热处理25分钟，分别制得c型变异链球菌(20亿/ml)和d型 变异链球菌(20亿/ml)液，按体积比c型变异链球菌d型变异链球菌=5 1的比例 混合，制备成免疫原。本发明所述变异链球菌免疫产蛋母鸡的方法为每次取上述抗原1.0ml，对产蛋 母鸡进行皮下注射，免疫三次，每次间隔时间为二周。本发明所述IgY抗体的纯化步骤为用蛋黄筛分离免疫母鸡产蛋的蛋黄，加入等 体积的磷酸缓冲溶液PBS (pH7. 2)，搅拌混勻制备蛋黄液，再加入与蛋黄液等体积的7% (w/ w)PEG(PEG8000)搅拌混勻，室温放置30分钟。8，OOOrpm离心30分钟，弃沉淀，上清即为分 离纯化的IgY抗体。IgY抗体的检测以ELISA(上海市农业科学院)测IgY抗体活性。测抗体浓度 总蛋白含量=(0D280/1. 4) ；IgY含量=总蛋白含量X IgY纯度。2)木糖醇的防龋齿特性在所有的甜味剂中效果最好，首先是木糖醇不能被口腔中 产生龋齿的细菌发酵利用，抑制链球菌生长及酸的产生；其次它能促进唾液分泌，减缓PH 值下降，减少了牙齿的酸蚀，防止龋齿和减少牙斑的产生，可以巩固牙齿。3)乳酸链球菌素(OTSIN)的作用就象一个表面活性剂，它对细菌的营养细胞及孢 子都有作用。NISIN对营养细胞的主要作用点是细胞质膜，抑制细胞壁中肽聚糖的生物合 成，从而使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，并造成细胞膜内容物外泄，严重地引起细胞 裂解，在万分之三到万分之五的浓度既有明显抑菌作用。对芽孢的作用是在孢子出现膨胀的起始阶段抑制其发芽。NISIN主要抑制大部分革兰氏阳性菌，特别是细菌的芽孢。NISIN 还能抑制葡萄球菌属、链球菌属、小球菌属和乳杆菌属的某些菌种，抑制大部分梭菌属和芽 孢杆菌属的芽孢。变异链球菌属于革兰氏阳性菌，从而NISIN能够抑制变异链球菌的生长， 消除牙菌斑，防止龋齿。4)三氯生对引起感染或病原性革兰氏阳性及阴性菌、真菌、酵母及病毒(如甲、乙 肝、狂犬病毒、艾滋病毒HIV)等都有杀灭及抑制作用，另外，三氯生还可以治疗牙龈炎、牙 周炎及口腔溃疡。因此，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂中添加三氯生，从而能杀 灭变异链球菌，消除牙菌斑，防止龋齿，同时能有效预防和治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。5)尼泊金酯钠包含尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠盐 以及复合尼泊金酯钠，由于其具有酚羟基结构，抗细菌性能比苯甲酸钠、山梨酸都强，是一 种高效防腐剂。其作用机制是破坏微生物的细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，并可抑制微 生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性。而且尼泊金酯的添加量只有山梨酸、苯甲酸 钠的1/10 1/5，因此其安全性要高得多。6)本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂还有香精和/或酒精和/或甜味剂。 各种风格的香精的加入，不但可以调节产品的气味，使人用后口气清新，而且可以满足不同 人群的个性化需求。甜味剂可以改善口感。将上述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的各组分按上述配比充分混合，用巴斯德消 毒法进行病毒灭活，用0. 22 μ m的膜过滤除菌，即制得本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂的体外抑菌试验检测方法如下配BHI 培养基，在高压蒸汽灭菌20min ；冷却后分别取700 μ 1培养基放入微量离心管，分别加入本 发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200 μ 1，再加入变异链球菌c型和(!型100 μ 1。共 做2组，对照组不加任何成分。然后，10% H2U0% CO2,80% N2厌氧培养24小时，600nm测
中m估甘 +rh.t 对照组OD值-实验组OD值w 1 AA0/ 定OD值。其中，抑菌率=-对照组OD{a-χ丄υ τ/ο。经上述方法检测，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂对变异链球菌c型的 抑菌率80%以上，对变异链球菌d型的抑菌率85%以上。同时，人群试验表明连续使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂2个月，1 年后复查，结果显示对照组儿童的龋面均比使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂 的试验组明显高，所以，使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂能有效预防儿童乳 牙龋病的发生；牙周炎及牙龈出血、口腔溃疡人群试验表明使用本发明所述防龋齿的IgY 抗体口腔喷雾剂1个月。1个月后复查，观察到实验组病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血 比对照组明显少，表明本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂能有效治疗病人的口腔溃 疡、牙周炎及牙龈出血。IgY抗体在37°C，湿度约75%恒温恒湿环境下放置一个月，如果IgY抗体没变化， 说明IgY抗体在常温下可放置一年。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂在上述条件 下放置三个月，未发现变色、沉淀、分层问题，说明本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾 剂的保质期在常温下可达三年以上。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂作为活性成分，再添加常规辅剂可制备 成口腔清洁剂，其剂型还可以水包油(oil-in-watenO/W)乳剂，以水凝胶(Hydrogel)为载体的凝胶剂和以胶基为载体的制剂。1)水包油乳剂，即将疏水相(如有机相)均勻分散于水中而形成的稳定的乳状 液。分散过程中可以使用乳化剂以利于疏水相的均勻分散，还可以使用勻浆器以使乳液快 速形成。2)水凝胶是水溶性或亲水性的高分子，通过一定的化学交联或物理交联，并以水 为分散介质的凝胶。亲水性高分子包括多糖类，如淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸和壳聚 糖等和多肽类，如胶原、聚L-赖氨酸和聚L-谷胺酸等，以及丙烯酸及其衍生物，如聚丙烯 酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺和聚N-聚代丙烯酰胺等。3)胶基的基本成分包括橡胶，如天然橡胶，枇杷，明胶或苯乙烯-丁二烯橡胶、丁 基橡胶和聚异丁烯等；酯类，如松香甘油酯和松香等；蜡，主要有石蜡或微晶蜡；脂肪，主 要为氢化植物油；乳化剂，主要为卵磷脂；填充物，主要为碳酸钙和滑石粉。本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂和口腔清洁剂可制成各种剂型，如配 置成溶液后装入普通容器中，作为随时使用的含漱水；或装入带压力装置的瓶中作为喷雾 剂，而在需要时随时随地喷入口腔；也可作刷牙液，在吃过食物之后或睡觉醒来之后用牙刷 沾上刷牙；乳剂、膏剂和凝胶剂还可作为刷牙时的牙膏使用，还能杜绝牙膏中的固体粉料 (既通常所说的磨料)对牙齿的磨损伤害作用；以胶基为载体制成口香糖，可含于口中咀 嚼，而起到清洁口腔预防龋齿的作用。本发明相对于现有技术具有如下优势本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂不仅含有抗龋齿IgY抗体，还有NISIN、 三氯生和防腐剂，有效防治龋齿的发生，对变异链球菌c型的抑菌率可达80%以上，对变异 链球菌d型的抑菌率可达85%以上。同时使用本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂1 个月后，病人的口腔溃疡、牙周炎及牙龈出血现象明显减少，表明本发明还能有效预防和治 疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡和消除口气。所述IgY抗体口腔喷雾剂制造和使用方便，安全 性高，能在常温下稳定保存3年以上。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1 IgY抗体的制备与提取用BHI或TTY培养基，在37°C温度条件下，分别培养c型和d型变异链球菌(上 海交通大学口腔研究所)48小时，将培养后的c型和d型变异链球菌分别用5000rpm离心 5分钟，收集菌体，用pH值为6. 0、浓度为0. 2M的磷酸缓冲液洗菌3次。50°C、25分钟热处 理，分别制得c型变异链球菌(20亿/ml)和d型变异链球菌(20亿/ml)液，按5 1的体 积比例混合，制备成免疫原。每次取抗原1.0ml，对产蛋母鸡(来亨鸡)进行皮下注射，免疫三次，间隔二周。第一次免疫母鸡20天后收集鸡蛋，用蛋黄筛分离蛋黄，加入等体积的 PBS (pH7. 2)，搅拌混勻制备蛋黄液，加入与蛋黄液等体积的7% PEG(PEGSOOO)搅拌混勻，室 温放置30分钟。SOOOrpm离心30分钟，弃沉淀。上清为分离纯化的IgY。以ELISA (上海 市农业科学院)测IgY抗体活性。测IgY抗体浓度总蛋白含量=(0D280/1. 4) ；IgY含量=总蛋白含量X IgY纯度。
实施例2 1)配方
组分含量IgY0.15wt%；木糖醇10wt%；NISIN0.02wt%；甘油10wt%；山梨醇5wt%；尼泊金甲酯钠0.2wt%；乙醇(食用酒精)5wt%；水溶性水蜜桃香精0.1wt%；蒸馏水补足至100 Wt %。2)制备将上述组分分别加入容器中，用巴斯德消毒法进行病毒灭活，用0. 22μπι 的膜过滤除菌，即得本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂。然后，将其装入小型携带式 喷雾罐中喷雾使用。3)体外抑菌试验取2)制得的所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μ 1，按照上 文的体外抑菌试验进行测试。经测试对变异链球菌c型的抑菌率为80%，对变异链球菌d 型的抑菌率为85%。
实例3 1)配方
组分含量IgY0.2wt%；木糖醇5wt%；NISIN0.02wt%；甘油20wt%；山梨醇5wt%；尼泊金乙酯钠0.2wt%；乙醇(食用酒精)5wt%；水溶性薄荷香精0.5wt%；蒸馏水补足至100 Wt %。 2)制备同实施例2。
3)体外抑菌试验取2)制得的所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂200μ 1，按照上 文的体外抑菌试验进行测试。经测试对变异链球菌c型的抑菌率为80%，对变异链球菌d 型的抑菌率为85%。实施例41)配方
权利要求
1.一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，包括以下组分 IgY 0. 1-0. 5wt% ；抑菌剂 5-15wt% ；防腐剂 3-6wt% ；甘油 5-20wt% ；乙醇5-10wt% ；食用香精 0. l-lwt% ；蒸馏水 50-75wt%。
2.根据权利要求1所述的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，所述抑菌剂选自NISIN、三氯生、木糖醇。
3.根据权利要求1所述的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，所述防腐剂选自尼泊金 酯钠、山梨醇。
4.根据权利要求1所述的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，所述喷雾剂作为活性成分 制备成口腔清洁剂。
5.根据权利要求4所述的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，所述口腔清洁剂为水包油 乳剂、水凝胶或胶基体剂型。
6.一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，包括以下组分 IgY0. 1-0. 2wt% ；木糖醇5-10wt% ；NISIN0. 01-0. 04wt% ；甘油10-20wt% ；山梨醇3-6wt% ；尼泊金酯钠 0. l-0.4wt%; 乙醇5-10wt% ；食用香精0. 1-0.蒸馏水60-75wt%。
7.一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，具体包括以下组分 IgY0. 1-0. 2wt% ；木糖醇5-10wt% ；NISIN0. 01-0. 04wt% ；三氯生0. 1-0. 5wt%;甘油5-10wt% ；山梨醇3-6wt% ；尼泊金酯钠0. l-0.4wt%;乙醇5-10wt% ；食用香精0. 3-0.蒸馏水63-75wt%。
8.根据权利要求1、6或7所述的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，所述食用香精选 自水溶性水蜜桃香精、水溶性薄荷香精、水溶性留兰香香精。
9.根据权利要求3、6或7所述的IgY抗体口腔喷雾剂，其特征在于，所述尼泊金酯钠选 自尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠、尼泊金丁酯钠。
全文摘要
本发明公开了一种防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂，包括以下组分0.1-0.5wt％IgY、5-15wt％抑菌剂、3-6wt％防腐剂、5-20wt％甘油、5-10wt％乙醇、0.1-1wt％食用香精、50-75wt％蒸馏水。所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂制造和使用方便，安全性高，能有效防治龋齿的发生，对变异链球菌c型的抑菌率可达80％以上，对变异链球菌d型的抑菌率85％以上，同时可有效治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡。另外，本发明所述防龋齿的IgY抗体口腔喷雾剂在常温下可稳定保存至少三年以上。
文档编号A61K39/395GK102000333SQ201010561959
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者赵凯 申请人:赵凯