一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物及其制备方法

专利名称：一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于美容保健和皮肤抗衰老及医药生物技术领域，涉及一种用于皮肤中胚 层营养的自体血清复合物及其制备方法。
背景技术：
自体血清的主要成分及基本生物学特性自体血清是抽取健康者或患者本人的血液经自然析出或离心分离后获得的。血清 是离体血液在血液中各种凝血因子及其机制启动凝固和血凝块聚缩释出的淡黄色透明液 体。自体血清能为细胞生长提供全营养成分(糖、脂、蛋白质、氨基酸、维生素、无机盐、微量 元素、核酸)和生物活性物质(多种激素、生物酶、细胞生长因子、抗体及糖脂、糖蛋白、粘蛋 白、粘多糖等)，这些物质能有效改善皮肤组织细胞活力，同时促使皮肤原代细胞的分裂和 增殖。尤其是近年来，生长因子与皮肤老化的关系越来越受到重视。例如胰岛素样生长因 子具有促有丝分裂和促成纤维细胞繁殖的作用；血管内皮细胞生长因子在体内外均可促进 血管内皮细胞的分裂增殖，刺激新生血管形成；表皮细胞生长因子可促进角质形成细胞的 体外增殖。这些生长因子不仅可促进细胞等的生长、增殖，并且它们之间还有着良好的协同 作用。同时，自体血清具有提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤和提供结合蛋 白参与细胞代谢的特点，还含有作为某些重要酶的辅基的微量元素和离子，如ai、Se、Mn、Ge 等，它们能在抗氧化等方面起重要作用，而且血液组份中含有大量的生物酶，例如SOD(清 除0_2) ；CAT(清除活性H2O2),这些物质可以对抗自由基的损伤。自体血清因其能为细胞生长 和皮肤组织提供所需要的丰富营养成分，被逐渐应用于医学美容、整形外科中。除此之外， 它在基础医学、临床医学治疗中的应用也越来越广泛。自体血清在皮肤医学美容中的应用随着年龄的增长，加上长期遭受紫外线、有害物质的侵蚀，皮肤是机体衰老过程中 最为明显的器官之一，同人体的其他器官一样它会发生表皮变薄，退行性变，含水量减少、 弹性消退、萎缩、起皱，灰暗无光泽，浅表微小血管扩张、老年色斑，功能减弱或丧失等逐渐 老化的问题。皮肤衰老的组织学改变主要为弹性纤维增加和胶原蛋白减少，当皮肤逐渐衰 老时，两者间的排列也渐趋紊乱，皮肤出现皱纹、色斑等衰老现象是正是由于真皮中胶原纤 维含量减少造成真皮层弹性与保水度降低，从而导致皮肤变薄，分子学改变主要是因为基 质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)表达增加，表皮增生和分化性标志表达 异常，而MMPs的主要作用是降解胶原及弹性蛋白等真皮组织。同时，老年人皮肤的血管数 目至少减少30%，随着皮肤老化的加重，血管减少的数目更加普遍。而皮肤表象的衰老反映 在细胞水平即为细胞衰老，成纤维细胞来源于中胚层，是改变最明显并且最为敏感的细胞 之一，它能够合成和分泌胶原蛋白和弹性蛋白，进而逐步形成胶原纤维，网状纤维，弹性纤 维，Martin DE等证明皮肤皱纹的改善有赖于真皮胶原的重塑。然而真皮胶原的重塑关键 其中之一在于促进成纤维细胞的生长。而自体血清丰富、多样的生物学特性可以促进中胚层细胞(包括成纤维细胞、血管内皮细胞等)分裂、增殖，促进新生细胞和有活力细胞的数量不断增多，不断产生胶原 蛋白，弹性蛋白，透明质酸，皮肤素等成分，同时能促进皮肤新生血管再生，从而重塑皮肤 结构，皮肤呈现弹性，光嫩，红润，皱纹抚平等绝佳美容效果，使皮肤老化症状得以改善。 Crowston等发现，用人体血清培养的人肌腱成纤维细胞，凋亡数量减少，增殖旺盛，生长状 态好，且人体血清中的细胞因子能够抑制丝裂毒素C的细胞毒性作用。自体血清具有为细胞生长提供丰富的营养物质和多种生长因子等生物学特点，从 而能够促进细胞的增殖、组织的修复，并为其提供最佳的生长环境，使其在医学美容，整形 外科(皮肤修复治疗，外科整形)中展现出其独特的优势，并得到了良好的效果。另外由 于来其源于自体，无免疫排斥，并发症少，安全性高的特点。于此同时，自体血清制作简单， 来源方便，对患者损伤少，能有效降低医疗成本，在一定程度上减轻了患者的经济负担。自 体血清在临床上所表现出的特点，为其进一步在整形美容外科的治疗提供了更为广阔的前景。

目前，在皮肤医学美容整形方面有许多方法，例如药物疗法，化学剥脱，光子嫩肤 术，肉毒杆菌毒素，自体活细胞移植，注射填充的软组织的材料等。历史上曾出现过使用蜂 蜡，凡士林等材料填充皮肤，来达到皮肤美容效果，这些材料存在排异反应等致命缺点；现 代相继出现了聚合物水凝胶，胶原，脱细胞真皮基质等非生物，生物材料，同时自体组织方 面主要采用自体脂肪，自体成纤维细胞溶浆等，但这两种自体取材方式仍存在制备成本高， 感染率高，增加患者痛苦等多种缺点；而注射透明质酸及其衍生物已发现出现临床了不良 反应，注射肉毒素在美容中的使用已经出现中毒事件且其只能维持4-6个月，在4-6个月后 被抑制的神经传导功能逐渐恢复，肌肉收缩，小皱纹又可出现，故间隔4 6个月后需再次 注射，其成本高，价格昂贵，来源有限，推广使用受限；自体活细胞移植美容注射的细胞是活 的，有生命的，细胞分泌胶原蛋白需要一个生理性的过程，它会渐进的显效。一般情况下是 在最后一次注射后的1 2个月开始见效，最佳效果在五六个月后开始呈现。相比之下，自体血清是一种来源方便，安全无毒、无菌，并可重复使用，经济的自体 组织，不存在异体或异种组织相容性差、血种类型的免疫排斥反应现象且自体血清不含防 腐剂，是其它试剂不具备的。于此同时，供区及受区无切口，减少了感染机会，可减少病人痛 苦。加上自体血清由于其生物学特性的独特性、多样性及安全性高、稳定性好等，自体血清 在皮肤美容，伤口修复，外科整形等方面逐渐展现出其独特的优势，同时，它还具备易制备， 廉价的特点。因此，它可以作为新兴产品填补自体组织填充的空白。然而，应用自体血清于整形美容中，我们仍不明确自体血清最佳给药浓度，给药途 径，最佳剂量，以及它的代谢方式，是否需要多次反复重复注射，也不能确定自体血清是否 具有优良的远期疗效以及治疗后的观察时间。而且，传统方法常采用高浓度纯自体血清注 射可能引起的直接细胞毒性及生长和增殖抑制、甚至直接导致细胞损伤、破坏及无法生长， 所以，应充分研究并关注其添加浓度、给药时间、增效协同剂复配、不同介质等对其有效生 物学作用的影响及其干预，并高度重视有效机制的放大效应，以提高或完善自体血清在美 容方面的学术技术水平。

发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术所存在的问题而提供一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物。本发明的另一目的是提供该用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物的制备方法。1、为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案本发明所述的一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其特征在于它是由下 述重量配比的原料组成
新鲜无菌自体血清65 80
0.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH72)注射液 15 30 无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.05 0.15
药用甘油0.05 0.20
药用甘露醇0.1 0.3
药用甘氨酸0.1 0.3本发明所述的一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其特征在于它是由下 述优选重量配比的原料组成
新鲜无菌自体血清70
0.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH72)注射液29.49
无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.06
药用甘油0.15
药用甘露醇0.15
药用甘氨酸0.15本发明所述的一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其特征在于所述的一 种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物的制备方法包括以下步骤(1)严格按照人体抽血的规范化要求，迅速采集受术者的肘中静脉血、并同时收集 到不含抗凝剂的无菌干燥采血管中；于室温自然静置1小时左右，以4000rpm ^irf1的转速 离心IOmin ；此时，肉眼可见离心后的采血管中的血液已分为三层上层淡黄色透明液体为 血清；中间薄薄一层灰白色为白细胞和血小板；最下面一层红色为红细胞；(2)严格按照无菌要求和上述优选重量配比，将已离心分离好的最上层清亮透明 的淡黄色液体用匹配的专用无菌注射器吸取配方量的自体血清、并小心转移至特制专用密 封无菌血清收集管中(内含配方量的药用甘油、药用甘氨酸、药用甘露醇、重组人碱性成纤 维细胞生长因子以及PH7. 2无菌磷酸盐缓冲生理盐水注射液)，轻轻混合均勻后，即为一种
5用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，立即置于4°C冰箱中保存和备用。2、本发明的优点本发明的优点在于与以往所用的皮肤去皱注射液相比，本发明的用于皮肤中胚层 营养的自体血清能停留在皮肤中胚层，达到在体培养组织的效果，能填补皮肤中较大的凹 陷，如修补皱纹，皮肤凹陷，填补皮肤，效果十分理想。且自体血清，无排斥反应和毒副作用， 治疗效果显著，治疗后皮肤自然，保持时间长久。其特点如下(1)本技术的核心，就是在人体皮肤中胚层培养皮肤缺失的各种细胞，促使问题皮 肤部位的胶原蛋白，弹力纤维进行修复再生，皮肤呈现弹性，光嫩，红润，皱纹抚平等青春靓 丽重新在患者身上再现，美容效果是一般手术或软组织填充无法比拟的。而且自体血清中 含有抗体，能起到抑菌作用。(2)本发明用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物中组方最大限度地发挥共济协 同、联合增效的效果，使之更加有效和快速的达到预期面部美容养颜和皮肤抗衰老作用。(3)本发明采用最佳的中胚层细胞激活滋养和分裂增殖的血清比例，并提供中胚 层细胞最匹配、最需要和最佳的天然全营养成分、最适PH条件、离子浓度、渗透压、O2和(X)2 合适比例及细胞生长、生存、生活的最佳微环境，理论上更加科学和合理，实际上也会获得 更加有效的面部美容养颜和皮肤抗衰老作用。(4)本发明采用最佳的自体血清与其它几种添加剂进行复合配制，不仅提供和营 造了最佳的中胚层细胞生存、生长和生活的微环境条件，更加有利于中胚层细胞的分裂和 增殖及生命活动，而且，还有效克服和解决了传统自体血清注射法采用高浓度纯自体血清 注射可能引起的直接细胞毒性及生长和增殖抑制、甚至直接导致细胞损伤、破坏及无法生 长，这也是本发明重要的创新点之一。(5)本发明按照自体血清与其它添加剂进行必要的稀释，不仅打破和改良了传统 自体血清注射法应用高浓度纯自体血清注射的局限性和弊端，提高了治疗的科学性和有效 性及合理性，而且，在得到同样体积的治疗液体，本疗法需要自体血清的实际用量仅为传统 方法使用血清量的3/4，通过实验证明，这个浓度，最适合皮肤中胚层细胞的生长，因此，本 发明的技术进步，不仅大大降低或减少了治疗成本，而且，实际抽血量的减少，可以大大减 轻或消除受试者的诸多顾虑和不良心理反应影响。(6)本发明制备方法简单、操作方便、简单易学、易于推广，适合有合法医疗美容资 格的基层单位以上使用。3、本发明自体血清复合物的作用机制由于人体面部的皮肤始终暴露在外界环境之中，不仅遭受自然界大气层中各种有 害污染物质的侵蚀，也遭受阳光中紫外线过久照射导致的损伤；而且，还有很多人、特别是 女性还存在因使用一些剥脱性美容化妆品等所致的面部皮肤表皮屏障结构和功能的破坏， 加上人体随着增龄的变化，皮肤所表现出来的自然衰老或生理性衰老等，因此，科学、合理、 适时进行面部美容养颜是非常重要和必要的。本发明主要通过实施稀释自体血清制备成一种用于皮肤中胚层营养的自体血清 复合物，其疗效作用机制可能与如下因素有关皮肤组织和细胞需要合适的环境和必需的 条件才能更好的生存、生长和生活(生命活动)，而血液组分(红细胞、白细胞、血小板、血清 及纤维蛋白血凝物等)中含有细胞所需要的最基本的营养物质及细胞生长因子等，特别是自体血清中所含有的皮肤组织和细胞所需要的各种营养成分，主要包括体液、碳水化合物、 脂类、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、激素、酶、核酸、抗氧化剂、细胞生长因 子及其它成分和能量等。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞最基本的营养素，维生 素是维持细胞生长的生物活性物质，碳水化合物可提供细胞的能源，无机盐是细胞组成所 必需并参与细胞的代谢和细胞微环境中离子浓度的调控，促细胞生长因子能促进和加快细 胞生长发育及分裂增殖；除此之外，自体血清还具备细胞生存和增殖的生理学和生物化学 限度内最佳的离子浓度、气相含量(氧气和二氧化碳含量)、渗透压和PH条件等，是外胚层 和中胚层细胞生存和生长的最佳环境条件，也是皮肤组织中新生细胞分裂和增殖的良好培 养基，使得自体血清十分有利于细胞在生命活动过程中的新陈代谢。添加了增效剂(药用甘油、药用甘氨酸、药用甘露醇、重组人碱性成纤维细胞生长 因子以及PH7. 2无菌磷酸盐缓冲生理盐水注射液)的自体血清复合物更利于中胚层细胞 (包括成纤维细胞、血管内皮细胞等)分裂和增殖，并使新生细胞或有活力的细胞数量不断 增多；同时，通过这种细胞分裂增殖和年轻细胞数量增多，不断促进合成新皮肤组织和细胞 间质所需要的结构组织和生物活性成分及胶原蛋白、弹性蛋白、酸性粘多糖、糖蛋白、透明 质酸、皮肤素等成分，且促进皮肤新生血管再生，使原来遭受生理性、病理性、环境条件等因 素影响和损伤的真皮层结构及其组分得以修复或再生，从而，在皮肤组织中胚层内实现面 部美容养颜和皮肤抗衰老作用和效果。4、本发明制备注意事项(1)本发明自体血清的采血部位通常来源于肘中静脉或其他肘静脉，如肘静脉不 明显或采集不便、加上血液用量不是太大时，也可采集手背静脉和外踝静脉等，但采集的最 好是空腹静脉血，以减少脂血等。(2)采集血液前，应认真检查血液收集管内是否干燥和消毒，还应仔细检查采血针 与血液收集器是否正确合理连接；另外，血液收集管是否放好(严防打碎)。在采血过程中， 尤应将血液沿血液收集管的管壁自然而缓慢流入，严禁剧烈振摇，严防血液产生气泡，以免 出现溶血和弓I起血浆纤维蛋白原变性。(3)采血过程中，如遇个别受术者“晕针”或出现抽血眩晕时不要慌张，可立即让 其平卧休息片刻即可恢复。必要时，可让其嗅吸芳香氨汀。如仍未恢复，则可针刺(或拇指 掐)人中及合谷等穴位，直至苏醒。(4)为了防止抽血时发生低血糖反应及紧张性休克，应首先做好受术者的思想工 作，消除其紧张心理。抽血完成后，也可嘱受术者适当饮食一些饮料、稀饭之类的流质食物； 尤其应注意了解和观察受术者全身反应状况，严密防止高血压及心血管病等意外。(5)应严防红细胞破坏所出现的溶血现象。通常溶血主要是由于注射器和容器不 干燥、不清洁；或者穿刺不顺利、抽血时压脉管或止血带造成的瘀血时间太长等引起。为了 避免此现象，止血带压迫时间一般不要超过5分钟，最好在0. 5 1. 0分钟顺利完成穿刺及 血液采集。如果静脉采血穿刺不顺利、组织损伤过多、或者采血速度太快、血液进入血液收 集管容器时产生大量气泡、或者在将血液收集管过度震荡或有力过大等均会造成红细胞破 坏、引起溶血。如果有溶血，该血清最好不要使用。(6)对于可能遇到患有高脂血症的患者，为了防止出现脂血或乳糜血，建议治疗头 几天坚持清淡饮食、同时采集空腹12小时以上的静脉血。通常情况下，脂血或乳糜血、溶血、黄疸血等情况，不适合用于本发明。(7)特别应该注意的是，在抽血时，严禁将采血器的气泡或空气误入至静脉之中， 而且，在抽血时注射器只能向外抽、绝对不能向静脉内推，以免注射空气进去，形成气栓造 成严重后果、甚至生命危险。(8)要特别防止血液收集管在离心过程中出现破损。为了避免出现此种情况，一方 面收集血液的离心试管可采用符合注射要求的塑料制品，另一方面，离心前务必保持离心 机罐重量的对称平衡和相等。(9)要注意保存好所采集的血液，并及时离心和分离。离心分离后的血清，应立即 分装于自体血清收集管中。自体血清最好是现采现用、当天或一次用完，以保持血液新鲜和 治疗效果。如实在用不完的血清，可密封保存于低温冰箱之中，但时间不要超过3天，且在 再次使用或治疗时，应置于37°C恒温水浴中稍加复温及强化。
具体实施例方式下面结合具体实施例子来进一步说明本发明的产品和制备方法实施例1 :自体血清复合物中增效剂的制备方法用于配制自体血清复合物中的增效剂是由下述优选重量配比的原料组成
0.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.2)注射液98.3
无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.2
药用甘油0.5
药用甘露醇0.5
药用甘氨酸0.5用于配制自体血清复合物中的增效剂的具体制备方法(以配制IOOg为例):(1)在消毒过的配制容器中，加入配方量80%的0. lmol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐 水(pH7. 2)注射液78. 64g ；将药用甘油0. 5g、药用甘氨酸0. 5g、药用甘露醇0. 5g溶于其中， 搅拌均勻后放置15分钟，装入容器中，密封，于100°C灭菌30min ；(2)取上面灭菌后的液体，加无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0. 2g， 再加入配方量剩余的0. lmol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH7. 2)注射液19. 66g，用超滤膜 过滤，即为用于配制自体血清复合物中的增效剂，然后分装到专用密封无菌血清收集管中 (每管3ml)。实施例2 —种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物的制备方法一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物是由下述优选重量配比的原料组 成
8新鲜无菌自体血清70
0.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.2)注射液29.49
无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.06
药用甘油0.15
药用甘露醇0.15
药用甘氨酸0.15一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物的具体制备方法(以配制IOml为 例)(1)严格按照人体抽血的规范化要求，迅速采集受术者的肘中静脉血约20毫升、 并同时收集到不含抗凝剂的无菌干燥采血管中。(2)将已收集好的20毫升血液于室温静置1小时左右后，将两支血液收集管对称 性放入离心机中离心，调整好需要离心的转速和时间GOOOrpm ^mirT1,离心10分钟)进行 离心。有条件的单位，最好采用低温离心机，离心室内温度最好控制在5-15°C之间即可。(3)离心完毕后立即关闭离心机，小心取出血液收集管(离心管)，此时，肉眼可见 离心试管中的血液已分为三层上层淡黄色透明液体为血清；中间薄薄一层灰白色为白细 胞和血小板；最下面一层红色为红细胞。同时，注意观察上清液的外观有无溶血、黄疸血和 脂血。(4)将离心分离好的最上层清亮透明的淡黄色液体-自体血清，采用自体血清转 移专用的注射器分别吸取7毫升、小心转移至特制专用密封无菌血清收集管中(内含配方 量的药用甘油、药用甘氨酸、药用甘露醇、重组人碱性成纤维细胞生长因子以及PH7. 2无菌 磷酸盐缓冲生理盐水注射液3毫升)，轻轻混合均勻后，即为一种用于皮肤中胚层营养的自 体血清复合物，立即置于4°C冰箱中保存和备用。
权利要求
1. 一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料组成新鲜无菌自体血清65 800.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.2)注射液15 30无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.05 0.15药用甘油0.05 0.20药用甘露醇0.1 0.3药用甘氨酸0.1 0.3。
2.根据权利要求1所述的一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其特征在于它 是由下述优选重量配比的原料组成新鲜无菌自体血清700.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH72)注射液29.49无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.06药用甘油0.15药用甘露醇0.15药用甘氨酸0.15。
3.根据权利要求1或权利要求2所述一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其 特征在于所述的一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物的制备方法包括以下步骤(1)严格按照人体抽血的规范化要求，迅速采集受术者的肘中静脉血、并同时收集到不 含抗凝剂的无菌干燥采血管中；于室温自然静置1小时左右，以4000rpm · mirT1的转速离 心IOmin ；此时，肉眼可见离心后的采血管中的血液已分为三层上层淡黄色透明液体为血 清；中间薄薄一层灰白色为白细胞和血小板；最下面一层红色为红细胞；(2)严格按照无菌要求和上述优选重量配比，将已离心分离好的最上层清亮透明的淡 黄色液体用匹配的专用无菌注射器吸取配方量的自体血清、并小心转移至特制专用密封无 菌血清收集管中(内含配方量的药用甘油、药用甘氨酸、药用甘露醇、重组人碱性成纤维细 胞生长因子以及PH7. 2无菌磷酸盐缓冲生理盐水注射液)，轻轻混合均勻后，即为一种用于 皮肤中胚层营养的自体血清复合物，立即置于4°C冰箱中保存和备用。
全文摘要
本发明公开了一种用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物及其制备方法。该用于皮肤中胚层营养的自体血清复合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料组成新鲜无菌自体血清65～80，0.1mol/L无菌磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.2)注射液15～30，无菌重组人碱性成纤维细胞生长因子冻干粉0.05～0.15，药用甘油0.05～0.20，药用甘露醇0.1～0.3，药用甘氨酸0.1～0.3。本发明的优点在于与以往所用的自体血清相比，在同等效果下，本自体血清复合物的实际用量更少，且能更好地培养在体组织，填充皮肤凹陷区，改善皱纹，效果十分理想。本发明公开的自体血清复合物，制备工艺简单，实际操作容易，不需特殊仪器设备，便于应用。
文档编号A61K38/18GK102133391SQ201110046409
公开日2011年7月27日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者丁克祥, 丁宇, 左夏林, 杨永鹏, 罗迎霞, 董萍 申请人:丁克祥, 董萍