一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，该方法是在基础培养基中添加刺激药物凝血酶，刺激间充质干细胞自身分泌内源性纤连蛋白。本发明是一种简便、成本低且安全性高的方法，有效解决了无血清培养间充质干细胞贴壁的问题，同时还能明显的促进间充质干细胞在无血清培养基中增殖。适用于临床研究级的间充质干细胞在无血清中培养扩增。
【专利说明】—种适用于间充质干细胞无血清培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(MSC)是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。因其具有免疫调控、分泌细胞因子、取材方便等优点而倍受关注，成为细胞治疗的理想种子细胞。间充质干细胞研究日益受到广泛关注并显示出越来越广阔的应用前景，在细胞治疗、组织工程等领域具有极为重要的应用价值。是继造血干细胞之后临床应用研究最多，也是最成熟的一种成体干细胞。从1995年首次报道MSC应用于临床试验，现在培养的MSC已被广泛地用于临床试验研究，如移植物抗宿主病(GVHD)、充血性心衰、急性心梗、2型糖尿病、脊髓损伤、软骨和骨损伤、克罗恩病等，而且在肾脏、肌肉和肺的损伤修复中也有初步进展。
[0003]不管是来源于骨髓还是其他组织的间充质干细胞原始数量都是很有限的，要达到临床应用的细胞数量级，就必须经过体外的扩增培养。培养基是MSC培养效率和安全的关键。选择使用的培养基要求能够维持MSC在经过数次传代培养后的表型，基因稳定和功能。因此必须采用优化的培养条件。常用DMEM或a MEM添加动物血清(胎牛血清FBS)或人血清或血浆和生长因子。但在培养过程中，血清蛋白能细胞内化而残留在细胞的胞浆中，由此可能会导致患者过敏反应，以及可能引起如疯牛病(BSE)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)等疾病。因此临床研究用MSC需要在无血清的条件下培养扩增。
[0004]现有的无血清培养基主要通过添加大量的生长因子来维持细胞的生长繁殖。但是因为MSC是贴壁生长的细胞，无血清培养基缺乏各种粘附贴壁因子如纤连蛋白(FN)等而不能很好贴壁。目前国际上几家大生物公司研究的几款无血清培养基如(加拿大STEMCELL公司的 MESENCULT，德国 LONZA 公司的 MSCGM-CDT，美国 GIBICO 公司的 STEMPRO MSC SFM CTS蛋，德国PAN公司的POWERSTEM MSCl等)，以及现有专利(201110420539.9)都是通过添加预先用纤连蛋白或其他专用试剂预先包被培养皿，或在培养基中添加大量的纤连蛋白来保证间充质干细胞的贴壁生长。现有方案的缺点是:1)需预先包被培养皿工作量大，不适用大规模培养。2)需用特殊蛋白如纤连蛋白FN，价格昂贵，Ig约100万人民币。3)重组的FN只是片段，不完全具有全部FN的功能。4)重组的FN还需要保证其生物安全，未被其它基因污染等。所以基于此的无血清培养基价格昂贵，使用不方便，使得其普及性十分低。 [0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的提供一种简便、成本低且安全性高的方法，有效地解决间充质干细胞在无血清培养基中的贴壁问题。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于:在基础培养基中添加刺激药物凝血酶,刺激间充质干细胞自身分泌内源性纤连蛋白。[0008]其中，所述的基础培养基包括a MEM, DMEM,或其他无血清培养基。
[0009]所述的刺激药物凝血酶浓度为0.1~20 IU/mL，使用的凝血酶为临床药品级。
[0010]所述的刺激药物凝血酶浓度优选为0.25~10 IU/mL。
[0011]所述的间充质干细胞的组织来源包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪、羊水、羊膜、血管。
[0012]本发明主要是通过用在基础培养基中添加凝血酶，通过凝血酶与间充质干细胞上的蛋白激酶受体结合，激活NF K B和ERK信号通路，促进间充质干细胞合成和分泌纤连蛋白，增强间充质干细胞贴壁能力，同时不改变间充质干细胞的生物学特性。
[0013]本发明的显著优点:
I)本发明的培养基中不含动物源血清，不含人源血清。
[0014]2)本发明利用MSC自身分泌大量的纤连蛋白，实现MSC在无血清培养基中的贴壁生长。
[0015]3)本发明还可以促进MSC在无血清培养基中的增殖。
[0016]4)本发明使得内源性FN分泌增多，内源性FN生物学功能优于重组的FN片段。有利于间充质干细 胞更好的维持自我更新的干性。
[0017]5)本发明添加的刺激物来自临床药品，适用于临床研究级的间充质干细胞在无血清中培养扩增，及临床治疗应用。
[0018]6)通过本发明的方法培养的间充质干细胞维持其生物学特性，具有多向分化能力。
[0019]7)本发明经济，简便。
[0020]
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为对照组(Control)与凝血酶组(Thrombin)分泌纤连蛋白(FN)量的比较。
[0022]图2为对照组(Control)与凝血酶组(Thrombin)间充质干细胞mRNA水平表达纤连蛋白(FN)量的比较。
[0023]图3为对照组(Control)与凝血酶组(Thrombin)间充质干细胞Ih细胞贴壁情况。
[0024]图4为不同浓度的凝血酶在无血清培养基促进间充质干细胞增殖结果，其中Tl~T7代表不同浓度凝血酶。
[0025]图5为凝血酶组培养的间充质干细胞流式检测细胞标志物结果。
[0026]图6为凝血酶组培养的间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞(油红O染色成红色)。
[0027]图7为凝血酶组培养的间充质干细胞诱导分化成骨细胞(ALP染色成蓝黑色)。
【具体实施方式】
[0028]为了充分公开本发明一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，以下结合实施例加以说明，但本发明不仅限于此。
[0029]实施例1:刺激无血清培养骨髓间充质干细胞分泌内源纤连蛋白 操作步骤:
I)将骨髓间充质干细胞分别以5X IO4个细胞数种植到6孔板中。[0030]2)分别加2ml的培养基I (对照组，无血清基础培养基a MEM)和培养基2 (凝血酶组，在无血清基础培养基中添加凝血酶4 IU/ml)。37°C,CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养24h。
[0031]3)收集培养上清进行ELISA方法测定间充质干细胞分泌纤连蛋白FN量。
[0032]4)收集细胞提取细胞总RNA，实时定量PCR方法检测间充质干细胞纤连蛋白mRNA的表达。
[0033]结果:凝血酶刺激后，间充质干细胞纤连蛋白mRNA表达和内源性纤连蛋白分泌量增加6倍以上。见图1、图2，图中对照组为不含凝血酶无血清基础培养基，凝血酶组为含凝血酶的无血清基础培养基。
[0034]实施例2:无血清培养间充质干细胞的贴壁效果 操作步骤:
I)将间充质干细胞分别培养于培养基I和(对照组，无血清基础培养基a MEM)培养基2 (凝血酶组，在无血清基础培养基中添加凝血酶4 IU/ml)中，分别以2 X IO4个细胞数种植于96孔板中，自然贴壁lh。
[0035]2)吸弃培养基和未贴壁细胞。
[0036]3) PBS洗涤3次，将未贴壁细胞充分洗净。
[0037]4)加入 MTT 孵育 3_4h，弃去 MTT。
[0038]5)显微镜下观察细胞贴壁数。
[0039]6)加DMSO溶解贴壁细胞。
[0040]7) 490nm波长测定细胞吸光度值，判定细胞贴壁情况。
[0041]结果:凝血酶组刺激的间充质干细胞在无血清培养中的Ih贴壁数明显增加。如图3所示，图中对照组为不含凝血酶无血清基础培养基，凝血酶组为含凝血酶的无血清基础培养基。说明本发明方法可以提高无血清培养基的细胞贴壁率。
[0042]实施例3:凝血酶组对间充质干细胞在无血清培养基中的增殖效果 操作步骤:
I)将间充质干细胞充分重悬混匀，按每孔2X IO3细胞数种植到96孔板中，分别加入培养基I (对照组，无血清基础培养基α MEM)和培养基2 (凝血酶组，在无血清基础培养基中添加凝血酶浓度分为0.25, 0.5，I, 2，4,8, 10 IU/mL，7个浓度)。
[0043]2) 37°C、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养3天。
[0044]3)加入CCK-8孵育汕。
[0045]4) 450nm波长测定细胞吸光度值，判定细胞增殖情况。
[0046]结果:本方法可明显刺激间充质干细胞在无血清培养基中增殖，且具有浓度依赖效应，见图4。
[0047]实施例4:凝血酶组培养的间充质干细胞的生物学特性
1.细胞培养
I)将间充质干细胞培养于培养基2 (凝血酶添加浓度为4 IU/mL)中3-7天。
[0048]2)胰蛋白酶消化细胞。
[0049]3)磷酸盐缓冲液PBS洗涤细胞2次。
[0050]4)加间充质干细胞鉴定表面标志物抗体CD34，CD45，CD31，CD44，CD73，CD90，CDlO5，HLA-DR孵育30分钟。
[0051]5)加 PBS 洗涤 2 次。
[0052]6)流式细胞仪器检测。
[0053]2.诱导分化
O培养的间充质干细胞，以每IX IO4细胞数分别种于24孔板中。
[0054]2)分别加成骨、成脂肪诱导液。
[0055]3)每3-4天换液一次。
[0056]4)诱导2周后，进行染色鉴定。成脂肪细胞(油红O染色)，成骨细胞(碱性磷酸酶ALP染色)。
[0057]3.结果
流式结果显示，培养的间充质干细胞表面标志表达不改变，高表达⑶44，⑶73，⑶90，⑶105等间充质干细胞标的标志物，不表达造血系统的标志物⑶34，⑶45，⑶31，HLA-DR等，见图5。培养的间充质干细胞保持多向分化的能力，能够诱导分化成骨细胞，脂肪细胞等，见图6、图 7。
【权利要求】
1.一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于:在基础培养基中添加刺激药物凝血酶，刺激间充质干细胞自身分泌内源性纤连蛋白。
2.如权利要求1所述的一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于:所述的基础培养基包括a MEM, DMEM，或其他无血清培养基。
3.如权利要求1所述的一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于:所述的刺激药物凝血酶浓度为0.1~20 IU/mL，使用的凝血酶为临床药品级。
4.如权利要求1所述的一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于:所述的间充质干细胞的组织来源包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪、羊水、羊膜、血管。
5.如权利要求3所述的一种适用于间充质干细胞无血清培养的方法，其特征在于:所述的刺激药物凝血酶浓度优选 为0.25~10 IU/mL。
【文档编号】C12N5/0775GK103881972SQ201310379426
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】陈津, 马予洁, 郭子宽, 谭建明 申请人:中国人民解放军南京军区福州总医院