专利名称：无抗原猪真皮胶原纤维的制作方法
技术领域：
本发明涉及无抗原猪真皮胶原纤维及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术：
迄今为止，就世界范围而言，无论是器官移植还是组织缺损的修复，都存在同种异 体器官或组织供体的严重不足、由同种异体器官或组织移植而产生的排斥作用等负面影 响。组织工程的兴起和迅猛发展，给器官移植和软、硬组织的修复和重建带来了希望的曙 光。组织工程材料，尤其是组织工程支架材料的研究与开发，已经成为而且必将继续成为国 际生物材料学的研究热点和重点之一。胶原具有良好的生物相容性、较弱的抗原性、优秀的亲水性以及独特的多孔结构， 是一种不可多得的理想生物材料。动物皮(尤其是猪皮)胶原在医用材料方面的应用和发 展，展现出皮胶原在医学应用的十分广阔的发展前景。利用猪皮胶原制备性能优良的组织工程支架材料，是国内外科技工作者研究 的热点。Livesey S. A等人进行了脱细胞真皮基质材料的研究，认为通过酶消化、高 渗盐水浸泡等处理后的脱细胞真皮基质，一方面保留了其独特的三维组织构造，另一方 面也最大限度地降低了其免疫原性(Livesey S A, Herndon D N, Hollyoak M A et al. Transplanted acelluar allograft dermal matrix. Potential as a template for the reconstruction viable dermis. Transplantation. 1995, 60 (1) : 1-9 )。但卫华以 猪皮为原料，采用一系列物理、化学和生化的方法，制备出脱细胞猪真皮基质材料，并进行 了体内降解、体外降解、生物相容性、体外细胞培养、新西兰兔损伤皮肤的修复实验等一系 列实验研究，发明了 “脱细胞猪真皮基质材料”(但卫华，廖隆理，李志强，等.[P]中国专 利.ZL 200410022506. 9)。为了进一步提高脱细胞猪真皮基质材料的综合性能，但年华等人 先后尝试了用环氧化合物、碳化二亚胺对脱细胞猪真皮基质材料改性，并取得重要成果(但 年华，但卫华，曾睿，等.碳化二亚胺改性脱细胞基质的性能研究，功能材料.2007，38 (8) 1389-1392 ；但年华，但卫华，关林波，等.环氧化合物和碳化二亚胺交联pADM的性能比较. 功能材料.2009,40 (8) :1352-1354,1358).从实际应用效果看，采用这种猪皮整体利用 的方法，可以制备得到生物相容性好、力学性能好、具有适当的降解性能。但其孔结构尚不 大适合细胞的三维生长，有待进一步改善。利用动物皮胶原的水解产物与天然/合成高分 子复合制备膜材料已有许多报道。高长有等人以胶原、壳聚糖为主要原料，通过冷冻、干燥 和改性，获得了适用与真皮再生的多孔支架(高长有，马列.医用高分子材料.北京化学 工业出版社.2006 :22-26).叶易春等人采用DHT-EDC改性技术制得了胶原-壳聚糖二元 膜和胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜，并用含有碱性成纤维细胞生长因子微球的三元膜 成纤维细胞进行体外培养试验，证明该材料无毒性，且可促进细胞增殖，细胞与膜材料黏附 良好。王碧、王坤余、但卫华等人也进行了葡甘聚糖-胶原蛋白-壳聚糖共混膜的研究，并 取得一定进展(叶易春.胶原基体表创伤修复膜的研制和性能表征[D].四川大学硕士学位 论文；王碧，王坤余，但卫华，等.葡甘聚糖-胶原蛋白-壳聚糖共混膜.生物医学工程学杂志.2006,23 (1):102-106)。基于胶原的医用生物膜材料的研究开发，仍然未能突破孔 结构和力学性能等方面所存在的问题。为了提高胶原基复合材料的力学性能，并同时兼顾 其孔结构的改善，人们尝试了胶原基复合医用纤维的制备，取得了进展(但卫华，周文常，曾 睿，等.胶原-壳聚糖共混纺丝液的制备.中国皮革.2006,35 (7):35-38 ；叶易春，胶原与 壳聚糖分子间的作用力.高分子材料科学与工程.2007，23 (5):112-115)。但由于所制得 的纤维的力学性能稍差以及生物相容性不稳定等原因，尚不能正常应用。综上所述，已有技术存在以下不足
1.利用脱细胞猪真皮基质材料制备组织工程支架材料，尚存在孔结构不适合细胞的 三维生长的问题；
2.利用猪皮的水解产物与其他天然/合成高分子材料复合，制备成生物医用膜材料， 力学性能差，且孔结构不适合细胞的三维生长的问题；
3.基于猪皮胶原的复合医用纤维存在力学性能稍差以及生物相容性不稳定等问题。
发明内容
本发明的目的是针对目前缺乏适当的组织工程支架材料而提供的一种无抗原猪 真皮胶原纤维及其制备方法，其特点是以纯化猪皮为原料，通过一系列生物、化学以及机械 加工等方法，制备具有医学利用价值的无抗原猪真皮胶原纤维。该方法包括以下步骤
(1)称重准确称重纯化猪皮，作为以下各工序的计料依据。(2)清洗①·技术规定水400 600%;内温:18^24°C ；渗透剂JFC 0. Γθ. 5%。 ②.操作方法调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动6(T90min，控水。(3)浸酸①·技术规定水30 80%;内温:10^240C ；甲酸1. 2 3. 0，NaCl 6 10%。 ②.操作方法调好水量和内温后，加入NaCl，转动15min，然后在转动中从转鼓轴孔加入事 先用8 15倍常温水稀释过的甲酸，转动6(T90min。检查浸酸终点pH=2. 2 2. 5。(4)酶处理①.技术规定在浸酸浴中进行。复合酶皮胶原处理剂F 0. 10 0.80%。②.操作方法浸酸达到要求后，加入复合酶皮胶原处理剂F，转动3(T90 min, 停l(T60min，转动l(T60min，检查处理程度，要求手感柔软、蓬松。处理程度达到要求后，控 水。(5)中和①·技术规定水50 200%，内温28 ;35°C，小苏打0. 8 2. 0%。②.操作方法调好水量和内温后，转动中分3次加入事先配制好的浓度为5 10% 的小苏打溶液，转动30 120 min，加完后转动4(T60min，开鼓检查，终点pH=7. 0 7. 5。(6)清洗①·技术规定水400 600%;内温:30^34°C ；渗透剂JFC 0. Γθ. 3%。 ②.操作方法调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动6(T90min，控水。(7)出鼓水洗达到要求后，将纯化猪皮出鼓，进行解纤操作。(8)解纤、挤水在解纤机上进行解纤，解纤后直接挤水。要求纯化猪皮被彻底解 构，无残留皮块。挤水后所得的纤维饼水分含量为6(Γ70%。(9)微波干燥利用微波干燥机干燥纤维饼，要求纤维饼的水分为14 20%。(10)称重将纤维饼准确称重，作为以下各工序的计料依据。(11)回湿①.技术规定水5 20%，内温18l4°C，柔软剂2. 0 8· 0%。②·操作 方法先调好水量和内温，加入水和柔软剂，加入纤维饼到转鼓中，转动l(T60min即可。
(12)出鼓回湿达到要求后，将蓬松的粗纤维出鼓，进入下道工序。(13)开松在开松机上进行。要求把压紧的、互相纠缠的猪真皮胶原纤维松解，并 清除杂质。(14)分纤在分纤机上进行。要求进一步分离和松散真皮胶原纤维，无缠结现象。(15)粗梳在粗梳机上进行。根据真皮胶原纤维的分离松散情况，粗梳广3次。要 求真皮胶原纤维松散开，无缠结现象。(16)精梳在精梳机上进行。根据猪皮胶原纤维的分离松散情况，精梳广3次，即 得到无抗原猪皮胶原纤维。本发明所得到的无抗原猪真皮胶原纤维的主要技术性能指标 外观白色纤维状物，无肉眼所见之杂质；
水分(％) ^ 18 ； 线密度(dtex) :1. 2 2.0; 纤维长度(mm) :2(Γ30; 断裂强度(cN/tex)彡3. 5; 断裂伸长率(％) :10 30; 回潮率(%) :6^10 ； 重金属总含量彡5ppm； 无菌试验应无菌； 溶血试验
体外细胞毒性细胞毒性反应应不大于0级；
致敏试验应无迟发型超敏反应；
皮内反应试验原发性刺激指数PII应< 0. 4 ；
本发明的方法所制得的无抗原猪真皮胶原纤维具有良好的生物相容性、优良的力学性 能和适当的降解性能，可广泛地应用于组织工程支架材料、止血材料、医疗手术缝线等医用 生物材料的制备。本发明具有以下优点
1.原料资源广泛，取材方便；
2.由纯化猪皮直接制备无抗原猪真皮胶原纤维，技术可靠，工艺简便易行；
3.工艺规范，条件可控，易于工业化生产；
4.生产过程为生态制造过程，无污染，生态效益和环境效益显著。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实施例只用 于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对发明的保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员可以根据本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。实施例1
(1)称重准确称重纯化猪皮，作为以下各工序的计料依据。(2)清洗①.技术规定冰400%;内温18°C;渗透剂JFC 0. 1%。②.操作方法 调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动60min，控水。
(3)浸酸①.技术规定水30%;内温10°C ；甲酸1. 2%，NaCl 6%。②.操作方 法调好水量和内温后，加入NaCl，转动15min，然后在转动中从转鼓轴孔加入事先用8 15 倍常温水稀释过的甲酸，转动60min。检查浸酸终点pH=2. 2^2. 5。(4)酶处理①.技术规定在浸酸浴中进行。复合酶皮胶原处理剂F 0. 10%。 ②.操作方法浸酸达到要求后，加入复合酶皮胶原处理剂F，转动30min，停lOmin，转动 lOmin，检查处理程度，要求手感柔软、蓬松。处理程度达到要求后，控水。(5)中和①.技术规定水100%，内温，小苏打0. 8%。②.操作方
法调好水量和内温后，转动中分3次加入事先配制好的浓度为8%的小苏打溶液，转动 60min，加完后转动40min，开鼓检查，终点ρΗ=7. (Γ7. 5。(6)清洗①.技术规定水400%;内温30°C;渗透剂JFC 0. 1%。②.操作方法 调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动60min，控水。(7)出鼓水洗达到要求后，将纯化猪皮出鼓，进行解纤操作。(8)解纤、挤水在解纤机上进行解纤，解纤后直接挤水。要求纯化猪皮被彻底解 构，无残留皮块。挤水后所得的纤维饼水分含量为6(Γ70%。(9)微波干燥利用微波干燥机干燥纤维饼，要求纤维饼的水分为14 20%。(10)称重将纤维饼准确称重，作为以下各工序的计料依据。(11)回湿①.技术规定水10%，内温18°C，柔软剂3. 0%。②.操作方法先调 好水量和内温，加入水和柔软剂，加入纤维饼到转鼓中，转动30min即可。(12)出鼓回湿达到要求后，将蓬松的粗纤维出鼓，进入下道工序。(13)开松在开松机上进行。要求把压紧的、互相纠缠的猪真皮胶原纤维松解，并 清除杂质。(14)分纤在分纤机上进行。要求进一步分离和松散真皮胶原纤维，无缠结现象。(15)粗梳在粗梳机上进行。根据真皮胶原纤维的分离松散情况，粗梳1次。要 求真皮胶原纤维松散开，无缠结现象。(16)精梳在精梳机上进行。根据猪皮胶原纤维的分离松散情况，精梳1次，即得 到无抗原猪皮胶原纤维。实施例2
(1)称重准确称重纯化猪皮，作为以下各工序的计料依据。(2)清洗①.技术规定冰500%;内温20°C;渗透剂JFC 0. 3%。②.操作方法 调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动75min，控水。(3)浸酸①.技术规定水30%;内温20°C;甲酸1. 5%,NaCl 7. 0%。②.操作方 法调好水量和内温后，加入NaCl，转动45min，然后在转动中从转鼓轴孔加入事先用8 15 倍常温水稀释过的甲酸，转动80min。检查浸酸终点pH=2. 2^2. 5。(4)酶处理①.技术规定在浸酸浴中进行。复合酶皮胶原处理剂F 0.6%。 ②.操作方法浸酸达到要求后，加入复合酶皮胶原处理剂F，转动60min，停60min，转动 60min,检查处理程度，要求手感柔软、蓬松。处理程度达到要求后，控水。(5)中和①.技术规定水150%，内温32°C，小苏打1. 5%。②.操作方
法调好水量和内温后，转动中分3次加入事先配制好的浓度为9%的小苏打溶液，转动 90min，加完后转动50min，开鼓检查，终点pH=7. 0 7. 5。
(6)清洗①.技术规定水600%;内温32°C ；渗透剂JFC 0. m。②.操作方法 调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动90min，控水。(7)出鼓水洗达到要求后，将纯化猪皮出鼓，进行解纤操作。(8)解纤、挤水在解纤机上进行解纤，解纤后直接挤水。要求纯化猪皮被彻底解 构，无残留皮块。挤水后所得的纤维饼水分含量为6(Γ70%。(9)微波干燥利用微波干燥机干燥纤维饼，要求纤维饼的水分为14 20%。(10)称重将纤维饼准确称重，作为以下各工序的计料依据。(11)回湿①.技术规定水20%，内温20°C，柔软剂5. 0%。②.操作方法先调 好水量和内温，加入水和柔软剂，加入纤维饼到转鼓中，转动40min即可。(12)出鼓回湿达到要求后，将蓬松的粗纤维出鼓，进入下道工序。(13)开松在开松机上进行。要求把压紧的、互相纠缠的猪真皮胶原纤维松解，并 清除杂质。(14)分纤在分纤机上进行。要求进一步分离和松散真皮胶原纤维，无缠结现象。(15)粗梳在粗梳机上进行。根据真皮胶原纤维的分离松散情况，粗梳2次。要 求真皮胶原纤维松散开，无缠结现象。(16)精梳在精梳机上进行。根据猪皮胶原纤维的分离松散情况，精梳2次，即得 到无抗原猪皮胶原纤维。实施例3
(1)称重准确称重纯化猪皮，作为以下各工序的计料依据。(2)清洗①.技术规定水600%;内温渗透剂JFC 0. 5%。②.操作方法 调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动90min，控水。(3)浸酸①.技术规定水80%;内温』4°C;甲酸3. 0%，NaCl 10%。②.操作方 法调好水量和内温后，加入NaCl，转动15min，然后在转动中从转鼓轴孔加入事先用8 15 倍常温水稀释过的甲酸，转动90min。检查浸酸终点pH=2. 2 2. 5。(4)酶处理①.技术规定在浸酸浴中进行。复合酶皮胶原处理剂F 0. 80%。 ②.操作方法浸酸达到要求后，加入复合酶皮胶原处理剂F，转动90 min，停60min，转动 60min,检查处理程度，要求手感柔软、蓬松。处理程度达到要求后，控水。(5)中和①.技术规定水200%，内温35°C，小苏打2. 0%。②.操作方
法调好水量和内温后，转动中分3次加入事先配制好的浓度为10%的小苏打溶液，转 动120 min，加完后转动60min，开鼓检查，终点ρΗ=7. 0 7· 5。(6)清洗①.技术规定水600%;内温34°C ；渗透剂JFC 0. 3%。②.操作方法 调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动90min，控水。(7)出鼓水洗达到要求后，将纯化猪皮出鼓，进行解纤操作。(8)解纤、挤水在解纤机上进行解纤，解纤后直接挤水。要求纯化猪皮被彻底解 构，无残留皮块。挤水后所得的纤维饼水分含量为6(Γ70%。(9)微波干燥利用微波干燥机干燥纤维饼，要求纤维饼的水分为14 20%。(10)称重将纤维饼准确称重，作为以下各工序的计料依据。(11)回湿①.技术规定水30%，内温M°C，柔软剂8. 0%。②.操作方法先调 好水量和内温，加入水和柔软剂，加入纤维饼到转鼓中，转动60min即可。
(12)出鼓回湿达到要求后，将蓬松的粗纤维出鼓，进入下道工序。(13)开松在开松机上进行。要求把压紧的、互相纠缠的猪真皮胶原纤维松解，并 清除杂质。(14)分纤在分纤机上进行。要求进一步分离和松散真皮胶原纤维，无缠结现象。(15)粗梳在粗梳机上进行。根据真皮胶原纤维的分离松散情况，粗梳3次。要 求真皮胶原纤维松散开，无缠结现象。(16)精梳在精梳机上进行。根据猪皮胶原纤维的分离松散情况，精梳3次，即得 到无抗原猪皮胶原纤维。注本发明所用的转鼓为不锈钢转鼓，纯化猪皮系由江阴奔翔生物科技有限公司 生产，解纤机由成都佰乐金生物科技有限公司生产，微波干燥机为济南鑫弘微波设备有限 公司制造。复合酶皮胶原处理剂F和柔软剂均由成都佰乐金生物科技有限公司生产，其余 的化学试剂均为市场购买。开松机、分纤机、粗梳机、精梳机等，均为纺织行业通用机械。
权利要求
1.无抗原猪真皮胶原纤维，该纤维的主要含有I型胶原和III型胶原，不含任何抗原物 质，其主要技术性能指标如下外观白色纤维状物，无肉眼所见之杂质；水分(％) ^ 18 ；线密度(dtex) :1.22.0;纤维长度(mm) :20-30;断裂强度(cN/tex)彡3. 5;断裂伸长率(％) :10 30;回潮率(%) :6^10 ；重金属总含量彡5ppm；无菌试验应无菌；体外细胞毒性细胞毒性反应应不大于0级；致敏试验应无迟发型超敏反应；皮内反应试验原发性刺激指数PII应< 0. 4。
2.按照权利要求1所述的无抗原猪真皮胶原纤维，特征在于其制备方法包括以下步骤(1)称重准确称重纯化猪皮，作为以下各工序的计料依据；(2)清洗①.技术规定水400 600%;内温:18^24°C；渗透剂JFC 0. Γθ. 5% ；②·操 作方法调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动6(T90min，控水；(3)浸酸①·技术规定水30 80%;内温1(T24°C;甲酸1.2 3. O,NaCl 6 10% ；②·操 作方法调好水量和内温后，加入NaCl，转动15min，然后在转动中从转鼓轴孔加入事先用 8 15倍常温水稀释过的甲酸，转动6(T90min ；检查浸酸终点pH=2. 2 2. 5 ；(4)酶处理①.技术规定在浸酸浴中进行；复合酶皮胶原处理剂F0. 1(Γ0. 80% ； ②.操作方法浸酸达到要求后，加入复合酶皮胶原处理剂F，转动30 90 min，停l(T60min， 转动l(T60min，检查处理程度，要求手感柔软、蓬松；处理程度达到要求后，控水；(5)中和①.技术规定水50 200%，内温28 ;35°C，小苏打0.8 2. 0% ；②.操作方法调好水量和内温后，转动中分3次加入事先配制好的浓度为5 10%的小 苏打溶液，转动3(Tl20 min，加完后转动4(T60min，开鼓检查，终点ρΗ=7. (Γ7. 5 ；(6)清洗①·技术规定水400 600%;内温3(T34°C;渗透剂JFC 0. Γθ. 3% ；②·操 作方法调好水量和内温后，加入渗透剂JFC，转动6(T90min，控水；(7)出鼓水洗达到要求后，将纯化猪皮出鼓，进行解纤操作；(8)解纤、挤水在解纤机上进行解纤，解纤后直接挤水；要求纯化猪皮被彻底解构，无 残留皮块；挤水后所得的纤维饼水分含量为6(Γ70% ；(9)微波干燥利用微波干燥机干燥纤维饼，要求纤维饼的水分为14 20%；(10)称重将纤维饼准确称重，作为以下各工序的计料依据；(11)回湿①.技术规定水5 20%，内温18 24°C，柔软剂2.0 8.0%;②.操作方法 先调好水量和内温，加入水和柔软剂，加入纤维饼到转鼓中，转动l(T60min即可；(12)出鼓回湿达到要求后，将蓬松的粗纤维出鼓，进入下道工序；(13)开松在开松机上进行；要求把压紧的、互相纠缠的猪真皮胶原纤维松解，并清除杂质；(14)分纤在分纤机上进行；要求进一步分离和松散真皮胶原纤维，无缠结现象；(15)粗梳在粗梳机上进行；根据真皮胶原纤维的分离松散情况，粗梳广3次；要求真 皮胶原纤维松散开，无缠结现象；(16)精梳在精梳机上进行；根据猪皮胶原纤维的分离松散情况，精梳广3次，即得到 无抗原猪皮胶原纤维。
3.按照权利要求1所述的无抗原猪皮胶原纤维，其制备过程的特征在于(1)转鼓为不锈钢转鼓；(2)解纤机为成都佰乐金生物科技有限公司制造；(3)开松机、分纤机、粗梳机、精梳机等，均为纺织行业通用机械；(4)微波干燥机为济南鑫弘微波设备有限公司制造；(5)纯化猪皮为江阴奔翔生物科技有限公司生产，复合酶皮胶原处理剂、柔软剂均为成 都佰乐金生物科技有限公司生产。
全文摘要
本发明公开了无抗原猪真皮胶原纤维及其制备方法。无抗原猪真皮胶原纤维是以纯化猪皮为原料,在保证纯化猪皮的良好的力学性能不变的前提下，采用物理、化学和生化相结合的方法,对纯化猪皮进行蓬松、解纤、分纤及梳理等一系列处理，制备得到的一种性能优良、用途广泛的猪真皮胶原纤维。无抗原猪真皮胶原纤维具有良好的生物相容性、优良的力学性能和适当的降解性能，可广泛地应用于组织工程支架材料、止血材料、医疗手术缝线等医用生物材料的制备。
文档编号A61L15/40GK102121133SQ20111008246
公开日2011年7月13日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者但卫华, 但年华, 吴霞, 曾睿, 林海, 肖世维, 胡杨 申请人:四川大学