专利名称：眼镜蛇毒神经毒在屈光不正治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种眼镜蛇毒神经毒在制药中的新应用，尤其是在治疗屈光不正的药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：
目前，近视已经成为影响我国人民健康的重要问题。2004年，教育部作了一个 《2004年全国学生体质健康监测报告》。在此报告中，我国7至12岁小学生视力不良检出率为32. 5%，初中生视力不良检出率为59. 4%，高中生视力不良检出率为77. 3%，大学生视力不良检出率为80.0%，学生视力不良发生率呈逐年增加的趋势。而近视高发群体——青少年近视发病率则高达50%至60%，我国是世界上近视发病率最高的国家之一，近视眼人数世界第一。近年来，随着电视及电脑的普及，青少年近视发病率呈逐年上升趋势。目前，已有的声称能够治疗近视的眼药水，从现在医学进角度来说，是没有科学依据的。称能治近视的眼药水，往往在用途上都写了解痉、活血，实际上主要成分却为睫状肌麻痹剂。目前用于扩瞳的药物，如多阿托品，托吡卡胺等可以解除睫状肌的收缩，使眼睛暂时得到放松，通过麻痹肌肉抑制了近视进展，而对近视本身没有治疗作用。阿托品类药物长期使用有副作用和耐受性，因此还不能做为常规的治疗近视的药物。长期使用睫状肌麻痹剂，会使瞳孔正常回缩出现障碍，影响其根据光线自动调节大小的能力。这样一来，眼睛就容易受到强光的照射，从而影响正常的视物功能。而手术治疗近视存在适用人群和后遗症问题的争论。手术不可逆，即使不满意也不可能再恢复到没做之前。尤其是接受这种手术的基本都是年轻人，不慎将会影响一生的发展。同时手术并不适应青少年假性近视的治疗。为了适应环境，很多动物在长期的进化过程中演化出了丰富的毒素及相关分泌物。这些物质中包含了高活性，作用专一的蛋白和多肽。由于其作用的特异性和专一性，它们成为蛋白质多肽结构与功能研究的良好模型，也成为了研究人类自身生理病理机制的工具和线索，同时也是开发临床诊断试剂和治疗药物的天然宝库。动物毒素的毒理作用非常广泛。以人体为例，它们的作用几乎涵盖了人体的各个生理系统。其中，与血液系统、免疫系统、神经系统的关键部位联系较为紧密。动物毒素中的很多成分可以分别作用于血液系统的各个因子，多种细胞膜受体和离子通道、补体系统等。因此，从动物毒素中寻找和开发安全有效的近视治疗药物成为国内外的热点。有着巨大的社会和经济意义。申请人检索了相关专利和科技期刊库，未见有将蛇毒神经毒或其类似物用于屈光不正治疗药物的研究和运用报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种眼镜蛇毒神经毒在屈光不正治疗药物中的应用。本发明的另一目的是提供一种眼镜蛇毒神经毒的水解片段在屈光不正治疗药物中的应用。本发明涉及眼镜蛇毒神经毒在制备治疗屈光不正的药物中的应用。
本发明涉及眼镜蛇毒神经毒的水解片段在制备治疗屈光不正的药物中的应用， 所述的眼镜蛇毒神经毒水解片段由以下方法制成用眼镜蛇毒神经毒，经蛋白酶水解水解成为水解片段，所述的蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或者V8蛋白酶，所述的蛋白酶眼镜蛇神经毒按照1 30-100的比例在20-40°C，以PH 7-9的25mM-100mM的 Tris-HCl或者PH4-5的25mM-100mM磷酸缓冲液的对此眼镜蛇神经毒进行水解H4小时， 用高压液相C4或者C8柱层析纯化得到眼镜蛇毒神经毒水解片段。上述的眼镜蛇毒神经毒商品名为科博肽，英文名是cobrotoxin。所述的眼镜蛇毒神经毒或其水解片段可以是作为制备治疗屈光不正的药物中的唯一活性成分，也可以与抗生素共同作为活性成分。制备的治疗屈光不正的药物主要为滴眼液，眼镜蛇毒神经毒或其水解片段的含量的低限为0. lug/ml，高限为lmg/ml。在本发明中，眼镜蛇毒神经毒或其水解片段更为通常的含量是30-120ug/ml。除了活性成分，其余为滴眼液辅料。所述的眼镜蛇蛇毒经离子交换柱层析纯化得到眼镜蛇毒神经毒，可以用已有技术实现。滴眼液辅料为常规的滴眼液药用辅料，包括添加维生素E、牛黄酸、透明质酸、胶原蛋白等其中的一种或几种辅助成分的滴眼液药用辅料。从各种蛇毒，如孟加拉眼镜蛇(Naja koauthia)蛇毒和中华眼镜蛇(Naja atra) 中分离得到cobrotoxin的方法，已经有文献报道，见Lu Q M，Meng QX, Li DS, Zhu Sff, Jia WH, Xiong YL, Wang WY. 2002. Comparative study of three short-chain neurotoxins from the venom of Naja kaouthia(Yunnan, China)[J]. J Nat Toxins,11(3) 221-229. Cheng Y, Meng Q, Wang W, Wang J.2002.Structure-function relationship of three neurotoxins from the venom of Naja kaouthia :a comparison between the NMR-derived structure of NT2 with its homologues, NTl and NT3[J]. Biochim Biophys Acta,1594(2) :353-363. Meng QX，Wang WY, Lu QM, Jin Y，Wei JF, Zhu Sff, Xiong YL. 2002. A novel short neurotoxin, cobrotoxin c, from monocel late cobra(Naja kaouthia)venom :isolation and purification, primary and secondary structure determination, and tertiary structure mode ling[J]. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol,132(1) :113_121。经研究发现，蛇毒神经毒及其类似物是从眼镜蛇科、海蛇科蛇毒中分离纯化出的一类毒素。它们通常是由60-72个氨基酸组成的多肽。其三级结构特征是由三个loop组成的三指型结构。虽然它们的结构类似，但是重要结构部位氨基酸的突变对其生物活性大小有很大影响。例如从孟加拉眼镜蛇(Najakoauthia)蛇毒和中华眼镜蛇(Naja atra)中都分离得到cobrotoxin，而和它类似的神经毒氨基酸序列只有几个氨基酸差别，但是生物活性却相差数倍。眼睛具有调整晶状体曲率的能力，当看远目标时，睫状肌处于松弛状态，睫状肌使晶状体悬韧带保持一定的张力，晶状体在悬韧带的牵引下，其形状相对扁平；当看近目标是，环形睫状肌收缩，睫状环形成的环缩小，晶状体悬韧带松弛，晶状体由于弹性而边凸，使眼的屈光力增强。长时间近距离视物，可导致睫状肌长期紧张，晶状体曲率过大，屈光率超出正常范围，发生屈光性近视。睫状肌由外侧的纵行、中间的放射状和内测的环形三组肌肉纤维构成是平滑肌，受副交感神经支配。眼镜蛇毒神经毒对平滑肌的收缩有可逆的抑制作
眼镜蛇毒神经毒可以和神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，阻断神经信号的传递，从而达到松弛肌肉的作用。低剂量的眼镜蛇神经毒除了可以阻断神经肌肉接头的信号传导外，在多次给药可以对其受体起到调节作用。这种阻断-调节作用机制与目前用于扩瞳孔的药物有着明显的区别。本发明将蛇毒中纯化得到的神经毒运用于屈光不正的治疗， 使神经——肌肉功能恢复平衡状态从而达到真正治疗近视的作用。另外对影响近视的一些因素，例如生长因子，神经递质和内分泌激素等也有改善作用。在正确使用的剂量下，无明显毒副作用。对近视等屈光不正的防治具有重要意义。本发明是采用低剂量的眼镜蛇毒神经毒或其水解片段作为活性成分治疗屈光不正，除了可以阻断神经肌肉接头的信号传导外，多次给药可以对其受体起到调节作用，使神经一肌肉功能恢复平衡状态从而达到治疗屈光不正的作用。蛇毒神经毒对豚鼠近视模型的治疗作用应用530nm单色光光照建立一种豚鼠近视眼动物模型。光照12周后，光照组屈光度发生-3. 225 士0. 78D的变化，眼轴和玻璃体腔分别增长0. 99 士0. 14mm与0. 34士0. 15mm。 用20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml眼镜蛇神经毒滴眼，一日三次，结果表明，经过4周的治疗， 具有较好治疗作用(表1)。表1眼镜蛇毒神经毒对豚鼠近视模型屈光度、眼轴和玻璃体腔的作用(N = 10)
权利要求
1.眼镜蛇毒神经毒在制备治疗屈光不正的药物中的应用。
2.眼镜蛇毒神经毒的水解片段在制备治疗屈光不正的药物中的应用，所述的眼镜蛇毒神经毒水解片段由以下方法制成用眼镜蛇毒神经毒，经蛋白酶水解水解成为水解片段，所述的蛋白酶为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或者V8蛋白酶，所述的蛋白酶眼镜蛇神经毒按照 1 30-100 的比例在 20-40°C，以 PH 7-9 的 25mM-100mM 的 Tris-HCl 或者 PH4-5 的 25mM-100mM磷酸缓冲液的对此眼镜蛇神经毒进行水解1- 小时，用高压液相C4或者C8柱层析纯化得到眼镜蛇毒神经毒水解片段。
3.如权利要求1所述的眼镜蛇毒神经毒在制备治疗屈光不正的药物中的应用，其特征在于眼镜蛇毒神经毒在滴眼液中的含量为30-120ug/ml。
4.如权利要求2所述的眼镜蛇毒神经毒的水解片段在制备治疗屈光不正的药物中的应用，其特征在于眼镜蛇毒神经毒水解片段在滴眼液中的含量为30-120ug/ml。
全文摘要
本发明涉及一种眼镜蛇毒神经毒在制药中的新应用，尤其是在治疗屈光不正的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明涉及眼镜蛇毒神经毒或其水解片段在制备治疗屈光不正的药物中的应用。所述的眼镜蛇毒神经毒或其水解片段可以是作为制备治疗屈光不正的药物中的唯一活性成分，也可以与抗菌素共同作为活性成分。本发明是采用低剂量的眼镜蛇毒神经毒作为活性成分治疗屈光不正，除了可以阻断神经肌肉接头的信号传导外，多次给药可以对其受体起到调节作用，使神经——肌肉功能恢复平衡状态从而达到治疗屈光不正的作用。
文档编号A61K35/58GK102178928SQ20111009265
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者钟树荣 申请人:昆明茂博生物科技有限公司