专利名称：一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法
技术领域：
本发明属于卷烟毒理学评价及相关技术检测领域，具体涉及一种用灵长目动物构建卷烟减害功效的评价方法。
背景技术：
现有技术中，为了减少吸烟给人类带来的危害，世界卫生组织(WHO)已将“反吸烟”列为二十一世纪卫生领域的三大主要行动目标(抗疟疾、反吸烟和助贫困)之一。在评价吸烟对机体损害时，有必要建立一个合适的吸烟动物模型来研究烟雾所含毒物的损伤机制。目前，用于吸烟染毒试验的动物主要有啮齿目(如小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等)和灵 长目动物如猴子等。肺癌动物模型也多选择小鼠、大鼠、地鼠、羊和狗等动物，还没有关于猿猴等灵长类的报道。从与人类的相似性考虑，采用猴子、猩猩等作为动物模型最好，但是猴子和猩猩等大型灵长类动物数量少、价格昂贵、遗传和饲养管理困难。中国树鼠句(Tupaia Belangeri Chinensis)是中国特有的小型灵长目实验动物,为低等灵长目动物。中国树駒其脑重与体重之比为I : 45，与人的I : 40和猕猴的I : 45极为相似。既往研究表明中国树駒的视上核主部出现OT(催产素，Oxytoc in)能神经元的部位在终板血管器头侧，距第三脑室最前壁约90 y m处，相对于大鼠的视上核终板血管器更前；中国树斷!的室旁核尾侧部OT能及VP (加压素,Vasopressin)能神经元的分布也比大鼠的要复杂。同时，中国树駒视上核和室旁核OT能神经元胞体数目比大鼠的要多得多，说明其OT能神经元所接触的神经调控表面积要比大鼠的精细，并复杂得多。而VP能神经元胞体比OT能神经元的大，与人类的相似，这也是中国树駒属于灵长目的一个可能的佐证。因此，这种小型、廉价的灵长目动物已经广泛用于医学研究，包括病毒、神经、消化、泌尿、生殖、免疫和社会生物学方面。现有技术中，动物染毒试验的吸入接触途径有两种，一种是静式吸入，一种是动式吸入。静式吸入是将实验动物置于一个称为染毒箱的密闭容器内，加入一定量的易挥发的液态化合物或一定体积的气态化合物，在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境，对动物进行试验。动式吸入是将实验动物置于空气流动的染毒箱中，染毒箱装备有新鲜空气补入与含受试化合物空气排出的动力系统和随时补充受试化合物的配气系统，在动态环境下对动物进行试验。卷烟行业也需要对烟草的毒性进行动物试验，但现有技术的动式吸入系统不适用于烟草的动物试验。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，本方法选用中国树駒作为试验动物，采用一种特殊设计的主动吸烟装置，使受试动物处于模拟抽烟的状态，进而观察动物在该状态下的情况，测得真实的试验数据，对卷烟有害程度进行合理的评价。
本发明的技术方案是ー种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，含有用于动物实验的主动吸烟装置，这种装置是本申请人的另ー实用新型专利，专利号为2008201907603，实用新型名称为“用于动物实验的主动吸烟装置”。本发明的方法按以下步骤依次进行[I]将ー或数只小型灵长目实验动物中国树駒，每日定时置于用于动物实验的主动吸烟装置的染毒箱内；[2]开启所述主动吸烟装置的模拟抽烟系统的真空泵，设置压カ为0. 03MPa,自控断电重启间隔时间10s，用样品卷烟和对照卷烟分别对中国树駒进行烟气暴露试验，每天每只中国树駒在烟气中的暴露剂量为5支烟，中国树駒在染毒箱内主动吸入烟雾时间为15分钟/只/天，连续暴露时间为12周；[3]对连续暴露12周的中国树駒及暴露前的中国树駒，或以不同的卷烟样品分别对两组不同的中国树駒连续暴露12周后，进行以下测试 (I)生物学行为测试对中国树駒的饲料摄入率，体重，口腔粘液分泌中的ー种或数种进行测试；(2)血液、生化、抗氧化指标的测试对中国树駒的血液学常规指标红细胞，白细胞，血小板，血清生物化学指标天门冬氨酸转换酶，丙氨酸氨基转换酶，碱性磷酸酶，总蛋白，白蛋白，总胆固醇，总胆红素，血糖，尿素氮，肌酐，及球蛋白中的ー种或数种进行测试；(3)生物学标志物表达的测试包括采用以GAPDH为内參照，对中国树駒的相关细胞因子mRNA表达相对量进行检测，以中国树駒GAPDH/CRCX4/MHC-l/TNF-a /MCP mRNA序列设计引物，分别检测外周血，肺组织，心肌组织，支气管组织的相应产物的表达；(4)组织病理学指标测试对中国树駒组织病理组织学变化，及发病例数，肺间质细胞增生的程度，膀胱和前列腺病理组织学检查和测试；[4]将上述测试数据用统计方法进行计算，将计算结果与对照样的数据进行差异对比，由此对样品卷烟有害程度进行评价。所述小型灵长目实验动物中国树斷!为中国树斷Iz 南漠西亚种。所述的血液、生化、抗氧化指标的测试还包括研究分析烟草暴露对于中国树駒的造血系统的评价。所述的测试采用全自动血气分析仪和全自动生物化学分析仪进行。所述生物学标志物表达按以下方法进行自中国树駒股静脉采集血液I. 2ml置于经肝素抗凝的EP管中；取0. 3ml外周血，用红细胞裂解液分离有核细胞，用Trizol溶液处理，提取总RNA ;以总RNA为模板，逆转录合成cDNA ；PCR反应加入2 u I cDNA, 50 U I反应体系包含 lOmMTris-HCl，I. 5mM MgCl2, 50mM KCl,pH 8. 3, 200 u M each dNTP, 2 u I SYBR GreenI 突光染料 and IU TaqDNA polymerase (promega)和 0. 4 U M 引物；反应条件预变性 94°C,5min，变性 94°C，30s，退火 57°C，30s，延伸 72°C，30s，共 45 循环；最后 72°C，延伸 IOmin ;在退火的过程中搜集荧光信号；用GAPDH作内參照；反应条件预变性94°C，5min，变性94°C，30s，退火50°C，lmin,延伸72°C，2min,共45个循环；最后72°C，延伸IOmin ;在退火的过程中搜集荧光信号，于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照；反应结束后做PCR产物熔解曲线验证PCR产物的特异性；用2_A ACt法计算mRNA的表达量；经颈椎脱臼法处死股动脉放血致死中国树斷!后，取中国树斷!的左肺叶、支气管、心脏组织IOOmg,加入Trizol Iml溶液处理，于匀浆器研磨成混悬液，提取总RNA，以总RNA为模板，逆转录合成cDNA ;其他步骤同N / .刖。所述组织病理学指标测试按以下方法进行采用HE染色、图像采集系统来进行；对连续暴露12周的中国树駒用颈椎脱白法处死股动脉放血致死后，将其心脏、肺脏、脾脏、肺脏(左叶)、肾脏、脑、胰腺、睾丸、子宫、前列腺组织，置10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片，用HE染色，图像采集系统来进行光镜下观察各器官组织病理学变化。本发明的统计方法试验数据用X±5D表示。采用spssll. 5软件，进行方差分析。根据方差分析结果，分别采取组间比较T检验或wilcoxon秩和检验。本发明的优点是采用特有的生物学分类较高的中国树駒进行烟草毒理及减毒机制的评价研究，由于其不仅对于卷烟烟气产生的毒理作用具有反应敏感、操作方便、饲养经济的特点，同时本方法所采用的评价体系较为完善，评价费用较为低廉，评价结果相对于其他实验动物更具有比较医学价值，适用于卷烟减害功效的评价。
附图I是中国树駒在动物主动吸烟装置中吸入浓烟的现象示意；附图2是动物主动吸烟装置结构示意图；附图3是被试中国树駒在吸烟后的流涎现象示意；附图4是被试中国树駒在吸烟后的咳嗽现象示意；附图5是被试中国树駒在吸烟后的咳痰现象示意。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式
及有关技术问题作进一步详细的描述。实施例I本实施例是对烟草暴露的中国树駒，以未进行烟草暴露的中国树駒为对照组，进行本发明方法中的各项测试，结果如下与未进行暴露的中国树駒比较，烟草暴露后的中国树駒呼吸频率明显低于对照组，每分钟咳嗽次数41次到69次之间，其饲料利用率呈出现一过性减少现象；烟雾暴露时，暴露组中国树駒表现出抑制到兴奋的明显反应，8W后出现对烟雾一定程度的成瘾性；同时发现暴露12W后，暴露组中国树駒有一例出现明显的神经症状，其运动姿态发生明显改变；烟草暴露12W中国树駒血清SOD含量明显下降、血清CREA含量明显升高，血清MDA的含量未见明显升高；暴露对于中国树駒外周血CXCR4及TNF-a mRNA的表达有明显的影响；同时，其支气管CXCR4表达量亦有显著变化；肺脏组织病理组织学变化较对照组严重，从发病例数、肺间质细胞增生的程度都较对照组有明显的区别；膀胱和前列腺暴露组膀胱内均出现颗粒状凝胶分泌物，前列腺病理组织学检查证实该分泌物来自前列腺，对照组均未见明显的颗粒状凝胶分泌物存在，可见，受试物的刺激作用可能导致前列腺分泌增加，造成膀胱堵塞，进一步导致排尿困难其一系列临床表现。如果试验时间延长，可能刺激前列腺增生等情况发生。出现上述结果可以判定该高等级烟草毒理及减毒研究模型构建成功。本发明的特点是采用特有的生物学分类较高的中国树駒进行烟草毒理及减毒机制的评价研究，由于其不仅具有对于香烟烟雾产生的毒理作用具有反应敏感、操作方便、饲养经济的特点，同时本模型所采用的评级体系较为完善，评价费用较为低廉，评价结果相对于其他实验动物更为具有比较医学价值，适用于烟草减毒作用的评价以及可望作为替代猴子等濒危灵长目实验动物的新型药理、毒理学模型。下表为几种烟草毒理评价方法的比较。表I、几种烟草毒理评价方法的比较
特点大鼠小鼠猴树駒
烟雾暴露所需时间75days75 days未见报道84days
物种分类嗤齿目嗤齿目灵长目灵长目
与人类的亲缘性远远近近 _ 烟雾暴露方式动式染毒，集中动式染毒，集中未见，极其困难动式染毒，单只 行为学指标评价不敏感不敏感未见报道敏感，很接近人的_
表现
基因表达评价不敏感不敏感未见报道敏感 组织病理评价____敏感__未见报道___实施例2本实施例研究日期为2010年2月到2010年8月。本实施例以灵长目实验动物中国树駒为研究对象，对比分析中国树駒置于动物实验的主动吸烟装置的染毒箱内，分别以卷烟样品10号、11号进行烟雾暴露后，对于实验动物中国树駒的减害作用及其机制。试验方法本研究采用由SHZ-D(III)循环水多用真空泵(中国巩义予华仪器有限责任公司生产)、电磁流量计、自动合闭装置组成的动物主动吸烟装置以0. 05Mpa的真空压、按照燃烧5支样品烟/只/天的烟气量作为暴露剂量，将中国树駒于密闭主动吸烟装置内，其净吸入烟雾时间为15mins/d/只。暴露周期为12W。试验结果实验结果表明与10号样品比较，11号样品在暴露过程中的中国树駒的生物学反应具有明显的变化。其特征表现如下(I)相对于10号样品，11号样品暴露期中国树駒的咳嗽次数明显少于10号样品组。暴露4W后，10号样品中国树駒的咳嗽次数为53±8次，而11号样品中国树駒的咳嗽次数为15±13次/min ；暴露8W后，10号样品中国树駒的咳嗽次数为53 ± 9次/min，而11号样品中国树駒的咳嗽次数为18±10次/min ;暴露12W后，10号样品中国树駒的咳嗽次数为59±9次/min，而11号样品中国树駒的咳嗽次数为21±10次/min。可见11号样品中添加的天然植物提取成分对于中国树駒具有较明显的镇咳作用。(2)相对于10号样品，11号样品暴露期中国树駒的兴奋性持续时间明显长，兴奋性起始时间明显快。⑶结果表明烟雾暴露12W的10号样品组和11号样品组中国树駒血常规指标仅EOS和EOS%有明显差异(p < 0. 05)。(4)烟雾暴露4W，10号样暴露组和11号样暴露组BUN指标出现显著区别(P < 0. 05)，10号样暴露组指标明显高于11号样暴露组，反映出10号样暴露组动物肾脏功能障碍较突出；烟雾暴露8W，10号样暴露组和11号样暴露组生化指标无明显差异；烟雾暴露12WS，10号样暴露组和11号样暴露组生化指标无明显差异。(5)烟雾暴露12WS，10号暴露组和11号暴露组动物在气管的CXCR4和TNF-a表达量上有差异，其中第11号样品组中国树駒的上述两项因子表达量明显高于第10号样品组；与此同时，第11号样品组中国树駒心脏MCP表达量亦明显高于第10号样品组的表达。(6) 11号样品和10号样品暴露12WS后中国树斷!均出现不同程度支气管肺炎，并可见支气管周围肺泡坏死灶，从坏死波及的范围、坏死灶的大小来看，10号样品的病变程度明显比11号样品要高。结论试验结果表明相对于无添加天然植物有效成分的10号卷烟样品，第11号卷烟样品中添加天然植物有效成分能降低对于灵长目实验动物中国树駒因卷烟烟雾暴露所产生的咳嗽频率，能降低因烟雾暴露所产生的流涎持续时间，表明有效成分具有显著的保护作用，同时，第11号样品中天然植物有效成分能加速烟雾成分引起中国树駒的起始性兴奋性时间，能有效延长中国树駒的兴奋性维持时间；第11号样品中天然植物有效成分能显著性地刺激炎性因子CXCR4以及抗肿瘤因子如TNF- a在外周血以及靶向组织中的表达。天然植物有效成分对于延缓和减轻卷烟有害物质 对于肺组织的病理性损害具有一定的保护作用。
权利要求
1.一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，含有用于动物实验的主动吸烟装置，其特征在于所述的方法按以下步骤依次进行 [1]将一或数只小型灵长目实验动物中国树駒，每日定时置于用于动物实验的主动吸烟装置的染毒箱内； [2]开启所述主动吸烟装置的模拟抽烟系统的真空泵，设置压力为0.03MPa，自控断电重启间隔时间10s，用样品卷烟和对照卷烟分别对中国树駒进行烟气暴露试验，每天每只中国树駒在烟气中的暴露剂量为5支烟，中国树駒在染毒箱内主动吸入烟雾时间为15分钟/只/天，连续暴露时间为12周； [3]对连续暴露12周的中国树駒及暴露前的中国树駒，或对不同的卷烟样品分别对两组不同的中国树駒连续暴露12周后，进行以下测试 (1)生物学行为测试对中国树駒的饲料摄入率，体重，口腔粘液分泌中的一种或数种进行测试； (2)血液、生化、抗氧化指标的测试对中国树駒的血液学常规指标红细胞，白细胞，血小板，血清生物化学指标天门冬氨酸转换酶，丙氨酸氨基转换酶，碱性磷酸酶，总蛋白，白蛋白，总胆固醇，总胆红素，血糖，尿素氮，肌酐，及球蛋白中的一种或数种进行测试； (3)生物学标志物表达的测试包括采用以GAPDH为内参照，对中国树駒的相关细胞因子mRNA表达相对量进行检测，以中国树駒GAPDH/CRCX4/MHC-l/TNF-a /MCP mRNA序列设计引物，分别检测外周血，肺组织，心肌组织，支气管组织的相应产物的表达； (4)组织病理学指标测试对中国树駒组织病理组织学变化，及发病例数，肺间质细胞增生的程度，膀胱和前列腺病理组织学检查和测试； [4]将上述测试数据用统计方法进行计算，将计算结果与对照样的数据进行差异对比，由此对样品卷烟有害程度进行评价。
2.根据权利要求I所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，其特征在于所述小型灵长目实验动物中国树斷!为中国树斷Iz 南漠西亚种。
3.根据权利要求I所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，其特征在于所述的血液、生化、抗氧化指标的测试还包括研究分析烟草暴露对于中国树駒的造血系统的评价。
4.根据权利要求3所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，其特征在于所述的测试采用全自动血气分析仪和全自动生物化学分析仪进行。
5.根据权利要求I所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，其特征在于所述生物学标志物表达按以下方法进行自中国树駒股静脉采集血液I. 2ml置于经肝素抗凝的EP管中；取0. 3ml外周血，用红细胞裂解液分离有核细胞，用Trizol溶液处理，提取总RNA ;以总RNA为模板，逆转录合成cDNA ；PCR反应加入2 u I cDNA, 50 U I反应体系包含IOmMTris-HCl, I. 5mMMgCl2, 50mM KCl，pH 8. 3, 200 u M each dNTP,2u I SYBR Green I 荧光染料 andlU Taq DNApolymerase (promega)和 0. 4 U M 引物；反应条件预变性 94°C,5min，变性94°C，30s，退火57。。，30s，延伸72°C，30s，共45循环；最后72。。，延伸IOmin ;在退火的过程中搜集荧光信号；用GAPDH作内参照；反应条件预变性94°C，5min,变性94°C，30s,退火50°C，lmin,延伸72°C，2min,共45个循环；最后72°C，延伸IOmin ;在退火的过程中搜集荧光信号，于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照；反应结束后做PCR产物熔解曲线验证PCR产物的特异性；用2_A ACt法计算mRNA的表达量；经颈椎脱臼法处死股动脉放血致死中国树g句后，取中国树g句的左肺叶、支气管、心脏组织IOOmg,加入Trizol Iml溶液处理，于匀浆器研磨成混悬液，提取总RNA，以总RNA为模板，逆转录合成cDNA ;其他步骤同前。
6.根据权利要求I所述的用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，其特征在于所述组织病理学指标测试按以下方法进行采用HE染色、图像采集系统来进行；对连续暴露12周的中国树駒致死后，将其心脏、肺脏、脾脏、肺脏(左叶)、肾脏、脑、胰腺、睾丸、子宮、前列腺组织，置10%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋切片，用HE染色，图像采集系统，进行光镜下观察各器官组织病理学变化。
全文摘要
本发明公开了一种用灵长目动物模型评价卷烟有害程度的方法，属于卷烟毒理学评价及相关技术检测领域。本方法选用中国树鼩作为试验动物，采用一种特殊设计的主动吸烟装置，使受试动物处于模拟抽烟的状态，进而观察动物在该状态下的情况，测得真实的试验数据，对卷烟有害程度进行合理的评价。本发明的优点是采用特有的生物学分类较高的中国树鼩进行烟草毒理及减毒机制的评价研究，由于其不仅对于卷烟烟气产生的毒理作用具有反应敏感、操作方便、饲养经济的特点，同时本方法所采用的评价体系较为完善，评价费用较为低廉，评价结果相对于其他实验动物更具有比较医学价值，适用于卷烟减害功效的评价。
文档编号A61K49/00GK102788874SQ20111012526
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者吴健鸿, 周顺长, 宋旭艳, 曾繁典, 魏敏 申请人:武汉市黄鹤楼科技园有限公司, 湖北中烟工业有限责任公司