一种葡萄柚皮黄酮类提取物及制备与应用的制作方法

专利名称：一种葡萄柚皮黄酮类提取物及制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组黄酮类化合物及提取纯化方法和应用，特别涉及一种葡萄柚皮黄酮类提取物及制备与应用。
背景技术：
白血病属造血系统常见的恶性肿瘤，为国内十大高发恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，居35岁以下人群肿瘤发病的首位，并呈逐年上升趋势。其特征是造血干/祖细胞恶性克隆性增生并广泛浸润骨髓、肝、脾和淋巴结，最终破坏全身器官组织，导致贫血、出血、 感染等症状。迄今化疗和造血干细胞移植仍是白血病的主要手段。在杀灭癌症细胞的同时，化疗药物因其毒副作用很大而使患者难以承受，同时易产生耐药性而导致治疗失败和复发，均是迫切需要解决的难题。当前国内外肿瘤学专家特别强调研制抗癌药的新策略是减毒增效，及提高患者生活质量，而不同于传统化疗药，即抑制恶性细胞增殖、诱导分化、促进凋亡、增强化疗药敏，及阻断癌细胞的恶性信号传递，但对正常细胞毒性低。中药是开发天然药物与前导化合物的重要资源，由于某些中药具有抗白血病作用，而对正常细胞损伤小的优点，很多国内外研究者致力于研制抗白血病有效且低毒的中药新药。目前，“参一胶囊”(Rg3单体)与化疗药合用，有助于原发性肺癌、肝癌的疗效，但该药体内抗肿瘤作用较弱；冬虫夏草、苦参、白花蛇舌草、冬凌草、葛根、白藜芦、大黄、雷公藤、天花粉等，均被报道具有抗白血病的作用，但大多停留在实验室阶段，并且作用机制及途径均未明确。因此，提取和分离出中药中起治疗作用的有效部位或有效成分，用现代医学的方法研究其作用和机制，并推向国际医学界是当前迫切需要解决的难题。葡萄柚(Citrusparadisi Macf.),系芸香科柑橘属植物柚(C. grandis (L.)Osbeck)与甜橙(C. sinensis (L. ) Osbeck)的自然杂交品种。本世纪20年代末至30年代期间，从美国引进邓肯、马叙、汤普森三个品种到四川，至今已有多个品种在我国多个地区大规模种植。葡萄柚果实柔软多汁，酸甜中略带苦味，风味独特、口感好，已成为风味独特、广受欢迎的水果畅销市场。目前，主要用以鲜食、制汁、罐头和色拉原料，而其果皮常常被丢弃，已经成为不可忽视的污染源，既不经济更不环保。据报道，葡萄柚含丰富的黄酮类化合物，其果皮中黄酮类成分含量最高，主要包括柚皮苷、新橙皮苷、柚皮芸香苷等。这些黄酮类物质具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、辅助降血脂、降血糖、预防动脉粥样硬化等功效。采用现代科技高效提取葡萄柚果皮中的黄酮类化合物，既能解决废弃葡萄柚皮对环境的污染，且对提高农副产品附加值、增加农民收入有非常重要的现实意义。目前，对葡萄柚皮中黄酮类物质的提取有少量报道，其主要采用溶剂提取、超声波、微波提取和超临界CO2流体萃取等，所需时间8-15小时，且需多次过滤，对工业化生产有一定影响。除了超声波辅助提取技术越来越多的应用于天然产物提取领域外，生物方法的应用以其条件温和、效率高等优点逐渐得到关注。而采用生物方法与超声波辅助提取技术相结合对葡萄柚皮中活性成分进行提取，仍未见相关报道。此外研究表明，柚皮素对人慢性髓系白血病K562细胞有明显诱导凋亡作用，而提高FAS的表达，降低FASL的表达，诱导caspase-3和caspase-8活化,可能是其作用机制。但关于葡萄柚皮黄酮(Pure TotalFlavonoids from Citrus paradisi Macf. ,PTFC)对白血病细胞株的增殖抑制及作用机制，至今未见文献报道。

发明内容
本发明主要 解决两个技术问题一是采用生物酶法与超声波辅助提取技术结合的方法，建立一种提取纯化葡萄柚皮黄酮类提取物(PTFC)的方法；二是通过PTFC对白血病Kasumi-I细胞株或K562细胞株的增殖抑制、细胞凋亡及与As2O3协同作用等试验，评价PTFC抗白血病细胞的作用及可能的分子机制，为临床上寻找高效低毒，通过多靶点、多途径发挥疗效；与As2O3联用具增效减毒作用的抗白血病中药新药提供实验依据，本发明的目的是提供一种葡萄柚皮黄酮类提取物及制备与应用，该制备方法操作简便、生产成本低、缩短提取时间，减少能耗，降低污染，提高葡萄柚皮黄酮提取率，且纯化操作简单，所得产品纯度较闻。本发明采用的技术方案是本发明提供一种葡萄柚皮黄酮类提取物，所述葡萄柚皮黄酮类提取物按如下方法制备(I)取葡萄柚皮粉，加入pH为4. 6 6. O的缓冲液，并加入纤维素酶，搅拌状态下于30°C 50°C水浴I 2小时，然后在200 300W(优选200W)条件下超声处理20 30min，获得混合料液；所述纤维素酶的酶活力为1000 1500U/g，所述葡萄柚皮粉与纤维素酶的投料质量比为20 I 2;所述缓冲液的体积用量以葡萄柚皮粉质量计为8 10L/Kg; (2)在步骤(I)的混合料液中加入无水乙醇，在150 250W(优选200W)频率下超声处理30 40min，过滤，获得滤液和滤饼；所述无水乙醇在混合料液中的体积终浓度为50 70%;(3)将步骤(2)获得的滤液浓缩、干燥，再用水溶解后加入乙酸乙酯萃取，取上层萃取液真空干燥，获得所述葡萄柚皮黄酮类提取物。进一步，所述葡萄柚皮黄酮类提取物中柚皮芸香苷与柚皮苷和新橙皮苷的质量比为I : O. I 3 O. I 4;优选为I : 2 3 : 3 4;最优选为I : 2. 82 2. 86 3. 75
3.81。通常所述葡萄柚皮黄酮提取物中三个化合物含量范围柚皮苷(3. 3% 35% )、新橙皮苷(4. 4% 45% )、柚皮芸香苷(I. 2% 20% )。进一步，步骤⑴所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。进一步，步骤(I)所述纤维素酶为酶活力1000 1500U/g的酸性食品级纤维素酶或酶活力1000 1500U/g的中性食品级纤维素酶。进一步，步骤(3)所述方法为将步骤(2)获得的滤液浓缩、干燥，再用水溶解后加入与水等体积的乙酸乙酯进行一次萃取，获得一次上层萃取液和一次下层萃余液，取一次下层萃余液加入与水等体积乙酸乙酯进行二次萃取，获得二次上层萃取液和二次下层萃余液，合并一次上层萃取液和二次上层萃取液，真空干燥，获得所述葡萄柚皮黄酮类提取物。此外，本发明提供一种所述葡萄柚皮黄酮类提取物在治疗或预防白血病药物中的应用。进一步，所述葡萄柚皮黄酮类提取物在治疗或预防白血病药物中的应用，优选所述的应用为葡萄柚皮黄酮类提取物在抗白血病Kasumi-I细胞或白血病K562细胞中的应用。更进一步，所述葡萄柚皮黄酮类提取物抗白血病Kasumi-I细胞的有效剂量为O. 125 2mg/ml细胞悬液，所述每毫升细胞悬液含I X IO5个细胞。更进一步，所述葡萄柚皮黄酮类提取物抗白血病K562细胞的有效剂量为O. 125 2mg/ml细胞悬液，所述每毫升细胞悬液含5 X IO4个细胞。
本发明的方法中，葡萄柚皮可以选用干燥处理后(例如自然干燥)的葡萄柚皮粉，将新鲜葡萄柚皮用自来水洗净，切丝，自然晒干，粉碎，过20目筛，获得葡萄柚皮粉，也可以选用新鲜的葡萄柚皮，葡萄柚皮粉的质量用量是新鲜的葡萄柚皮的20%。本发明的方法中，葡萄柚皮也可用柚(Citrus grandis (L. ) Osbeck)、胡柚(Citruschangshan-huyou Y. B chang)、舌甘澄(Citrus sinensis (L.)Osbeck)、沙田柚(Citrusmaxima cv. Shatian Yu)等的果皮替代。本发明所述葡萄柚皮黄酮提取物制备方法中，pH为4. 6 6. O的缓冲液的加入是为了调节PH和提取溶媒。本发明采用了将纤维素酶的酶解技术与超声波辅助提取技术相结合的方法，该方法充分利用了纤维素酶对植物细胞壁的降解及超声技术促进活性成分释放的优点，结合超声波辅助提取技术对黄酮类物质释放的促进作用，达到葡萄柚皮中黄酮类物质快速释放和浸出的目的。如采用已有的葡萄柚皮黄酮类物质的提取方法，就必须使用较高的温度回流，所需时间较长，对黄酮类化合物的破坏作用严重，且多次过滤，操作耗时、繁琐，能耗大，产业化成本高。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明所述葡萄柚皮黄酮类提取物制备方法，大大缩短酶解时间，减少能耗，降低污染，减少对黄酮类化合物的破坏，保证其生物活性；采用超声波协同醇处理，可以简化去除提取物中果胶类杂质的纯化过程，大幅度缩短纯化时间，减少能耗；本发明方法操作简单、成本低、后续处理简便，而且能确保所得黄酮类化合物纯度达85%以上。


图I实施例I制备得到葡萄柚皮黄酮类提取物(PTFC)HPLC色谱图，a为柚皮芸香苷(Narirutin) ；b 为新橙皮苷(Neohesperidin) ；c 为柚皮苷(Naringin)；图2实施例2制备得到PTFC的HPLC色谱图，a为柚皮芸香苷(Narirutin) ；b为新橙皮苷(Neohesperidin) ；c 为柚皮苷(Naringin)；图3实施例3制备得到PTFC的HPLC色谱图，a为柚皮芸香苷(Narirutin) ；b为新橙皮苷(Neohesperidin) ；c 为柚皮苷(Naringin)；图4PTFC作用24、48小时后Kasumi-I细胞株的存活率；图5PTFC作用24、48小时后K562细胞株的存活率；图6流式细胞术检测PTFC诱导Kasumi-I细胞株凋亡情况，A-F分别对应的PTFC作用浓度为 0mg/ml、0. 125mg/ml、0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml ；图7Hoechst 33258染色法检测PTFC诱导Kasumi-1细胞株凋亡情况(100 X，箭头所示为凋亡细胞凋亡小体)；
图8Hoechst 33258染色法检测PTFC诱导K562细胞株凋亡情况(100 X，箭头所示为凋亡细胞凋亡小体)；图9Western_blot法检测不同浓度的PTFC作用Kasumi-1细胞、K562细胞后各蛋白表达情况；图10PTFC、As2O3以及PTFC联合As2O3对Kasumi-Ι细胞株的生长抑制作用，PTFC、As2O3单药分别以及共同作用于Kasumi-I细胞株，从细胞存活率方面反映药物的作用，图中的A E代表药物作用浓度，分别代表PTFC组0,0. 25,0. 5、l、2mg/ml ；As203组0、1、2、
4、8 μ mol/L 和 PTFC 联合 As2O3 组(0mg/ml+0 μ mol/L)、(O. 25mg/ml+l μ mol/L)、(0. 5mg/ml+2μ mol/L)、(lmg/ml+4μ mol/L)、(2mg/ml+8μ mol/L)；图11PTFC、As2O3以及PTFC联合As2O3对Kasumi-1细胞株的生长抑制作用，通过复杂数学计算软件CalcuSyn 2. O运算来反映PTFC与As2O3之间的协同效应，图中的每个叉(“ X ”)号表不一个药物浓度，a 为 0. 25mg/ml+l μ mol/L、b 为 0. 5mg/ml+2 μ mol/L、c 为lmg/ml+4 μ mol/L、d 为 2mg/ml+8 μ mol/L,其中 O. 25mg/ml+l μ mol/L 组在 I. O 线以上，即Cl值大于1，因此不具有协同作用，其余叉号均在I. O线以下，即小于1，具有协同效应；曲线I 3为数学方法计算出来的趋势，不代表实验意义；
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此HPLC色谱条件色谱柱大连依利特公司Hypersil BDS C18柱(250_X4. 6mm,5 μ m);流动相甲醇-O. 5%醋酸(38 62);流速为I. OmL/min ;检测波长为283nm ;柱温25°C。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。实施例I葡萄柚皮黄酮类提取物的制备I)、将新鲜葡萄柚皮用自来水洗净，切丝，自然晒干，粉碎，过20目筛，获得葡萄柚皮粉，称取葡萄柚皮粉50g，加入500mL pH为4. 8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，加入5g纤维素酶(为中性食品级纤维素酶，酶活力为1000 1500U/g，武汉康宝泰精细化工有限公司)，搅拌状态下30°C水浴2h，停止水浴，再在200 下超声处理30min，获得混合料液。2)、在步骤I)所得的混合料液中加入无水乙醇，得混浊液，使乙醇在混浊液中的体积终浓度为50% ;将混浊液在200W频率下超声波处理30min，抽滤，获得滤饼和滤液。3)、将步骤2)所得的滤液用真空旋转蒸发仪(70 80°C)浓缩后干燥，将所得干燥物加200mL水溶解，倒入一只500mL的分液漏斗中，加入200mL的乙酸乙酯进行一次萃取，获得一次上层萃取液和一次下层萃余液，取一次下层萃余液加入200mL的乙酸乙酯进行二次萃取，获得二次上层萃取液和二次下层萃余液，合并一次上层萃取液和二次上层萃取液，真空干燥，获得葡萄柚皮黄酮类提取物，经HPLC色谱检测，黄酮类物质含量为85. 17%，根据HPLC色谱谱图峰面积，可知葡萄柚皮黄酮类提取物包含下列质量配比的物质柚皮苷31. 77%、新橙皮苷42. 27%和柚皮芸香苷11. 12%，结果见图I所示。实施例2I)、将新鲜葡萄柚皮用自来水洗净，切丝，自然晒干，粉碎，过20目筛，获得葡萄柚皮粉，称取葡萄柚皮粉60g，加入480mL pH为5. 2的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入4. Sg纤维素、酶(为中性食品级纤维素酶，酶活力为1000 1500U/g，武汉康宝泰精细化工有限公司)，搅拌状态下40°C水浴I. 5h，再在200W下超声处理25min，获得混合料液。2)、在步骤I)所得混合料液中加入无水乙醇，得混浊液，使无水乙醇在混浊液中的体积终浓度为60% ;将混浊液在200W频率下超声波处理35min，抽滤，得滤饼和滤液。3)、将步骤2)所得的滤液用真空旋转蒸发仪(70 80°C )浓缩后干燥，将所得干燥物加水200mL溶解，倒入一只500mL的分液漏斗中，加入200mL的乙酸乙酯进行一次萃取，重复萃取两次以后(同实施例I)，合并上层萃取液，再真空干燥，得所述葡萄柚皮黄酮类提取物，经HPLC色谱检测，黄酮类物质含量为86. 60%,根据HPLC色谱谱图峰面积，可知葡萄柚皮黄酮类提取物包含下列质量配比的物质柚皮苷32. 29%、新橙皮苷42. 88%和柚皮芸香苷11. 43%，结果见图2所示。实施例3
I)、将新鲜葡萄柚皮用自来水洗净，切丝，自然晒干，粉碎，过20目筛，获得葡萄柚皮粉，称取葡萄柚皮粉50g，加入450mL pH为6. O的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入2. 5g纤维素酶(为酸性食品级纤维素酶，酶活力为1000 1500U/g，北京盛世嘉明科技开发有限公司)，搅拌状态下50°C水浴Ih，再在200W下超声处理20min，获得混合料液。2)、在步骤I)所得混合料液中加入无水乙醇，得混浊液，使乙醇在混浊液中的体积终浓度为70% ;将混浊液在200W频率下超声波处理40min，抽滤，得滤饼和滤液。3)、将步骤2)所得的滤液用真空旋转蒸发仪(70 80°C )浓缩后干燥，将所得干燥物加水200mL溶解，倒入一只500mL的分液漏斗中，加入200mL的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取两次(萃取同实施例I)，合并上层萃取液，再真空干燥，得葡萄柚皮黄酮类提取物，经HPLC色谱检测，黄酮类物质含量为85. 14%，根据HPLC色谱谱图峰面积，可知葡萄柚皮黄酮类提取物包含下列质量配比的物质柚皮苷31. 76%、新橙皮苷42. 25%和柚皮芸香苷
11.13%，结果见图3所示。实施例4葡萄柚皮黄酮类提取物诱导白血病Kasumi-I细胞株和K562细胞株凋亡的实验研究I.材料与方法I. I 材料葡萄柚皮黄酮类提取物(PureTotal Flavonoids from Citrus paradisi Macf.,PTFC)为实施例I所制备。白血病Kasumi-I细胞株和K562细胞株由浙江大学医学院附属第一医院血研所惠赠。ffestern-blot 抗体抗人 PARP、抗人 caspase-3、抗人 caspase-8、抗人caspase-9,(即为一抗)，美国，-20°C保存。Western-blot 抗体Actin,(即为一抗)，Santa Cruz,美国,4°C保存。辣根标记山羊抗兔IgG(H+L)(即为二抗)亲和纯化，杭州联科生物有限公司，-20°C保存。辣根标记山羊抗鼠I gG (H+L)(即为二抗)亲和纯化，杭州联科生物有限公司，-20°C保存。二甲基亚砜为杭州化学试剂有限公司产品，Western blot抗体为美国cell-signaling 公司产品，Western-blotting Iuminol 试剂盒为以色列 BiologicalIndustries公司产品,流式凋亡检测试剂盒为美国Biouniquer公司产品。I. 2实验方法与结果I. 2. I细胞培养采用常规培养，Kasumi-I细胞、K562细胞在体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，Kasumi-I细胞每2_3天换液传代一次，K562细胞每天换液传代一次。取对数生长期细胞为实验对象。I. 2. 2MTT比色法检测细胞增殖1)MTT比色法检测Kasumi-I细胞增殖 MTT工作液称取MTT粉剂150mg，溶于30ml PBS液中，搅拌溶解后，20 μ m孔径滤膜过滤除菌，分装后4°C保存备用。取对数生长期Kasumi-I细胞，以IOOOrpm离心5min,弃上清，重悬于无血清的RPMI1640培养液中配制成细胞悬液，调整Kasumi-I细胞终浓度为IxlO5个/ml进行实验。将上述Kasumi-I细胞的细胞悬液接种于96孔培养板,使每孔Kasumi-I细胞终浓度为IxlO5个/ml，同时分别加入5种不同剂量的PTFC和超纯水，分成2组，每组设6个剂量(剂量I =PTFC终浓度为O. 125mg/ml、剂量2 =PTFC终浓度为O. 25mg/ml、剂量3 =PTFC终浓度为O. 5mg/ml、剂量4 =PTFC终浓度为lmg/ml、剂量5 =PTFC终浓度为2mg/ml、剂量6 :不添加PTFC，用超纯水代替PTFC的空白对照)，使每孔终体积为200 μ I，置于培养箱中，分别在37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中孵育24小时(组I)、48小时(组2)后，每孔加MTT工作液20 μ 1，再置培养箱中37°C孵育4小时，3000rpm/min离心5min，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO) 200 μ I/孔，震荡，使底部蓝紫色结晶物充分溶解后，在酶标仪(BI0-RAD，美国)570nm波长处读取吸光度值(0D值)，实验重复三次，设复孔四个，取平均值为最终结果。细胞存活率(％)=(处理组/对照组)X 100%，结果如图4 (Kasumi-Ι细胞)和图5 (K562细胞)所示。结果表明，PTFC作用于Kasumi-I细胞24小时的IC5tl为I. 8mg/ml,48小时IC5tl为O. 8mg/ml，不同剂量PTFC作用于Kasumi-I细胞24小时后其生存率分别是95. 63% (剂量1),84. 29% (剂量 2)、77. 66% (剂量 3)、65. 66% (剂量 4)、50. 27% (剂量 5);作用 48 小时后其生存率分别是81. 98% (剂量1)、76.5% (剂量2)、64. 93% (剂量3)、45. 39% (剂量 4)、31.34% (剂量 5)。2) MTT比色法检测K562细胞增殖取对数生长期K562细胞，以IOOOrpm离心5min,弃上清，重悬于无血清的RPMI1640培养液中配制成细胞悬液，调整K562细胞终浓度为5 X IO4个/ml进行实验，其他操作同步骤I)。PTFC作用于K562细胞48小时的IC5tl为O. 72mg/ml，不同剂量PTFC作用于K562细胞24小时后其生存率分别是103. 39% (剂量I)、106. 9% (剂量2)、92. 41% (剂量3)、49. 39% (剂量4)、30.99% (剂量5)。PTFC作用于K562细胞48小时后其生存率分别是94. 63% (剂量 1)、86. 75% (剂量 2)、62. 71% (剂量 3)、31.42% (剂量 4)、18.3% (剂量5)，实验重复三次，结果如图3所示。IC50是指细胞被抑制半数时抑制剂的浓度，即Kasumi-1、K562细胞株在PTFC的作用下抑制率为50%时所对应的PTFC的药物浓度。IC5tl本身即是一个浓度值。[抑制率=100%-细胞存活率(％)];细胞存活率(％)=(处理组抑制率/对照组抑制率)X100%。图4和图5表明PTFC能够明显的抑制Kasumi-I细胞和K562细胞的生长，且具有剂量依赖性和时间依赖性。 I. 2. 3Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞早期凋亡Kasumi-I取对数生长期的Kasumi-I细胞接种于6孔培养板,每孔Kasumi-I细胞终浓度为IxlO5个/ml，分别加入细胞培养级超纯水配制的不同浓度PTFC溶液(PTFC终浓度分别为0. 125mg/ml、0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml),同时设空白对照组(以细胞培养级超纯水替代PTFC)，在37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时后收获细胞，pH为7. 2±0. I的冷PBS缓冲液洗涤2次，1000rpm/min离心，4°C，5min，弃上清。将细胞重悬于500μ1 Annexin V Binding buffer,转移至流式细胞仪专用试管中，加5 μ I AnnexinV-FITC混匀后，加入5 μ IPropidium Iodide，轻轻混匀，室温避光反应lOmin，立刻用流式细胞仪(Becton Dickinson,美国)检测，Cellquest I. 2分析软件分析结果，如图6所示。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜磷脂双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中PS由脂膜的内侧翻向外层，Annexin V是一种分子量35 36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可以通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。利用这一原理，Annexin V可检测细胞早期凋亡。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红，故能检测晚期凋亡细胞。流式细胞术检测结果中PI阴性Annexin V阳性的细胞为早期凋亡细胞，而PI阳性Annexin V阳性为晚期凋亡细胞，结果表明:早期凋亡率分别是 3. 19% (PTFC O. 125mg/ml)、3. 19% (PTFC O. 25mg/ml),3. 49%(PTFC O. 5mg/ml) ,7. 25% (PTFC lmg/ml) ,16. 87% (PTFC 2mg/ml)，这表明 PTFC 能够诱导Kasumi-I细胞早期凋亡。I. 2. 4Hoechst荧光染色检测细胞凋亡(I) Kasumi-I 细胞取对数生长期Kasumi-I细胞，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中配制细胞悬液，将细胞悬液分别接种于6孔板，使每孔kasumi-Ι细胞终浓度为IxlO5个/ml，使每孔终体积为5ml，分别加入用细胞培养级超纯水配制的PTFC溶液，使PTFC终浓度分别达到O. 125mg/ml、0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml,设置空白对照组(用细胞培养级超纯水替代PTFC)，在37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中作用于Kasumi-I细胞24h后，收集空白对照组细胞及处理组细胞，离心，PBS缓冲液(pH为7. 2)洗涤2次，弃上清，各加入4%多聚甲醛固定液(博士德生物工程有限公司)200 μ I分别移至EP管，放入培养箱中37°C培养30min。离心弃甲醛(即上清)，用微量移液器(Gilson，法国)在干净玻璃片上涂单层细胞，待涂层干燥后，pH为7. 2±0. IPBS缓冲液摇床洗3次，每次IOmin,用pH为7. 2±0. I、含
0.5% (体积浓度)Triton-20的PBS缓冲液在摇床上透化30分钟，再用pH为7. 2±0. IPBS缓冲液摇床洗3次，每次lOmin，每张玻片用I μ g/ml Hoechst33258染液均匀滴涂于细胞涂层，避光反应20min。弃Hoechst染液，pH为7. 2±0· IPBS缓冲液摇床洗3次，每次IOmin0实验重复2次。每张片子随机选取3个视野，分别用低倍(IOx)、高倍(40x)、油镜(IOOx)观察并拍照，结果如图7所示。
(2)K562 细胞取对数生长期Κ562细胞，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中配制细胞悬液，调整每孔Κ562细胞终浓度为5χ104个/ml进行实验，其他操作同步骤(I)，结果见图8所示。结果表明，经过PTFC处理后，Kasumi-I细胞核内可见明显的凋亡小体(箭头所示)，并且随着PTFC浓度的增加凋亡小体逐渐增多。而K562细胞在观察视野下凋亡小体较少(箭头所示)，并且随着PTFC浓度增加凋亡小 体增多不明显。I. 2. 5Western-blotI. 2. 5. I细胞蛋白质提取(I)PTFC作用于Kasumi-I细胞后蛋白质提取将对数生长期的Kasumi-I细胞以每瓶I. 5 X IO5个接种于培养瓶中，使终体积为每瓶10ml，加入PTFC (细胞培养级超纯水配制)，使 PTFC 终浓度为 Omg/ml、O. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，37 °C 作用 24 小时。24 小时后收集细胞，离心，弃上清，用预冷的PH为7. 2±0. I的PBS缓冲液洗涤二次，加细胞裂解液(IOx Cell Lysis, cell signal公司，用时稀释为lx) 50 100 μ I,反复吹打,置冰上,用超声波细胞粉碎机处理(160w，持续3s，间隔5s，共3次)以剪切DNA，至溶液不再粘稠，4°C、12000g/min离心5min，取上清液，分别获得不同浓度PTFC作用后的蛋白质溶液，计量体积，BCA法测蛋白质浓度后，-70 V冻存备用。(2) PTFC作用于K562细胞后蛋白质提取将对数生长期的K562细胞以每瓶
I.OX IO5个接种于培养瓶中，使终体积为每瓶10ml，加入PTFC(细胞培养级超纯水配制)，使PTFC终浓度为0mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，37°C作用24小时。其他操作同步骤⑴。I. 2. 5. 2蛋白质浓度测定将BCA工作液(上海生工)中溶液A和溶液B按照50 I的比例混合制成工作液，将BSA标准蛋白(5mg/ml)用 IxPBS溶液分别稀释为 O μ g/ml、25 μ g/ml>50 μ g/ml、100 μ g/ml、200y g/ml、300y g/ml、400y g/ml、500y g/ml，在 562nm 处测量吸光值，以吸光值为纵坐标，以BSA标准蛋白浓度为横坐标(CurveExpert I. 3计算),制作标准曲线。取待测蛋白(I. 2. 5. I提取的蛋白质溶液)在酶标板中分别加入浓度相同的20 μ IPBS稀释液(1μ I待测蛋白+19μ I PBS)，各孔加入200 μ I BCA工作液，混匀后置于60°C恒温箱中保温30min，冷却后在酶标仪上测各孔的A562值，在标准曲线上确定出经过稀释后的蛋白浓度，再根据下式计算样品的蛋白质浓度样品蛋白质浓度(μ g/ml)=该样品经过稀释后的蛋白质浓度X样品稀释倍数。I. 2. 5. 3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳I. 2. 5. 3. I制胶按Bio-Rad公司说明书安装玻璃板，分别灌制10% 15%分离胶和5%积层胶，具体配制见表I。加完TEMED后聚合反应就立即开始，因此迅速旋动混合物进行下述步骤将分离胶混合液灌至两块玻璃板中间的间隙中，给积层胶预留出足够空间(梳齿长度再加Icm)。小心在分离胶混合液上方覆盖一层水，将凝胶垂直放置于室温(25°C )下。待聚合反应完成后，倒掉上方覆盖的水，再用吸水纸小心吸净残留的水。在积层胶混合液中加入TEMED并混匀后，将溶液灌至分离胶上方，小心不产生气泡，并立即插入一块干净的梳子(BIO-RAD配套产品)，再放置于室温下，待积层胶聚合反应完成后，小心拔下梳子，取出玻璃板，按BIO-RAD公司说明书安装好垂直电泳装置，并加入事先配制的电泳缓冲液(Tris碱3. 03g，甘氨酸18. 8g，SDSlg，加双蒸水充分溶解并定容至1L)，排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡。表I各浓度分离胶、积层胶配方
权利要求
1.一种葡萄柚皮黄酮类提取物，其特征在于所述葡萄柚皮黄酮类提取物按如下方法制备(I)取葡萄柚皮粉，加入pH为4. 6 6. O的缓冲液，并加入纤维素酶，搅拌状态下于.30°C 50°C水浴I 2小时，然后在200 300W条件下超声处理20 30min，获得混合料液；所述纤维素酶的酶活力为1000 1500U/g，所述葡萄柚皮粉与纤维素酶的投料质量比为20 I 2 ;所述缓冲液的体积用量以葡萄柚皮粉质量计为8 10L/Kg ； (2)在步骤(I)的混合料液中加入无水乙醇，在150 250W频率下超声处理30 40min，过滤，获得滤液和滤饼；所述无水乙醇在混合料液中的体积终浓度为50 70% ； (3)将步骤(2)获得的滤液浓缩、干燥，再用水溶解后加入乙酸乙酯萃取，取上层萃取液真空干燥，获得所述葡萄柚皮黄酮类提取物。
2.如权利要求I所述的葡萄柚皮黄酮类提取物，其特征在于所述葡萄柚皮黄酮类提取物中柚皮芸香苷与柚皮苷和新橙皮苷的质量比为I : O. I 3 O. I 4。
3.如权利要求I所述的葡萄柚皮黄酮类提取物，其特征在于所述葡萄柚皮黄酮类提取 物中柚皮芸香苷与柚皮苷和新橙皮苷的质量比为I : 2 3 3 4。
4.如权利要求I所述的葡萄柚皮黄酮类提取物，其特征在于步骤(I)所述纤维素酶为酶活力1000 1500U/g的酸性食品级纤维素酶或酶活力1000 1500U/g的中性食品级纤维素酶。
5.如权利要求I所述的葡萄柚皮黄酮类提取物，其特征在于步骤(I)所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。
6.如权利要求I所述的葡萄柚皮黄酮类提取物，其特征在于步骤(3)所述方法为将步骤(2)获得的滤液浓缩、干燥，再用水溶解后加入与水等体积的乙酸乙酯进行一次萃取，获得一次上层萃取液和一次下层萃余液，取一次下层萃余液加入与水等体积乙酸乙酯进行二次萃取，获得二次上层萃取液和二次下层萃余液，合并一次上层萃取液和二次上层萃取液，真空干燥，获得所述葡萄柚皮黄酮类提取物。
7.—种如权利要求I所述葡萄柚皮黄酮类提取物在治疗或预防白血病药物中的应用。
8.如权利要求7所述葡萄柚皮黄酮类提取物在治疗或预防白血病药物中的应用，其特征在于所述的应用为葡萄柚皮黄酮类提取物在抗白血病Kasumi-I细胞或白血病K562细胞中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄柚皮黄酮类提取物及制备与在治疗或预防白血病药物中的应用，所述葡萄柚皮黄酮类提取物按如下方法制备(1)取葡萄柚皮粉，加入pH为4.6～6.0的缓冲液，并加入纤维素酶，搅拌状态下于30℃～50℃水浴1～2小时，然后在200～300W条件下超声处理20～30min，获得混合料液；(2)在混合料液中加入无水乙醇，在150～250W频率下超声处理30～40min，过滤，获得滤液和滤饼；(3)将滤液浓缩、干燥，再用水溶解后加入乙酸乙酯萃取，取上层萃取液真空干燥，获得所述葡萄柚皮黄酮类提取物；本发明方法操作简单、成本低、后续处理简便，而且能确保所得黄酮类化合物纯度达85％以上。
文档编号A61K131/00GK102631446SQ20121011809
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者林圣云, 熊耀康, 王博, 蒋剑平 申请人:浙江省中医院