专利名称：具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用。
背景技术：
端粒是细胞染色体末端标志，由端粒DNA和端粒蛋白组成。端粒蛋白包括Potl、TPPl、Tin2、TRFl、TRF2和RAPl。这六种蛋白在端粒DNA上相互作用，形成多种形式端粒蛋白复合体，对保护端粒DNA不被细胞错误识别为染色体损伤断端和引发染色体末端DNA损伤反应有重要作用。端粒蛋白复合体的功能性结构受端粒DNA序列长度调控。人体正常细胞由于缺乏端粒酶活性，端粒DNA长度随细胞分裂次数增多而发生逐渐缩短，最终导致端粒蛋白复合体功能性结构丧失，引发细胞染色体末端DNA损伤反应,诱导细胞衰老或凋亡。因此人体正常细胞只具备有限次数的分裂倍增能力，不能无限繁殖。相反，阻断端粒DNA随细胞分裂而缩短的趋势，获得永久性端粒蛋白染色体末端保护能力，是所有人类细胞癌变 的一个重要步骤，是肿瘤细胞形成永生化恶性生长能力的共同基础。大量研究已经证明诱导端粒蛋白复合体功能障碍具有广谱、完全的肿瘤抑制效应，是治疗人类肿瘤性疾病的一条潜在途径。但关键问题是寻找出能够特异性攻击肿瘤细胞的端粒蛋白复合体而不影响正常细胞端粒蛋白复合体的结构和功能的治疗靶标和药物。在已经鉴定出的六种端粒组成型结构蛋白中，Potl是主要用于抑制ATR在端粒上介导的单链DNA损伤反应活化的专业化端粒保护性蛋白(Drik H, et al. Telomereprotection by mammalian Potl requires interaction with TppLNat struct. Mol.Biol. 14(2007) :754-761.以及 Zimmerman S，UM Martens. Telomeres and telomerase astargets for cancer therapy. Cell Mol Life Sci 2007 (64) :906-21. ) 全长 Potl 蛋白由634个氨基酸组成，分为两个主要功能结构域，一是N-端OB fold结构域与端粒单链DNA的特异高亲和力结合；另一个是C-端与另一种端粒结构蛋白TPPl结合结构域。Potl与TPPl相互作用是介导Potl端粒定位的主要机制。但有关Potl在端粒上如何抑制ATR的作用机制并不清楚。以往研究发现去除Potl N端的OB fold结构域并不影响剩余的Potl片段(Potlaal21-634)在细胞中的端粒定位，同时在肿瘤细胞中表达Potlaal21_634片段能促进端粒酶延长端粒DNA和稳定肿瘤细胞端粒的效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有广谱特异肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用。本发明所提供的多肽，名称为PotlClOO，由Potl蛋白C-末端的114个氨基酸残基组成,具体来说，PotlClOO是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤细胞杀伤活性相关的由序列I衍生的多肽。
由所述多肽PotlClOO衍生的蛋白质也属于本发明的保护范围。在本发明中，所述蛋白质具体为由序列表中序列4所示氨基酸序列组成的蛋白质。该蛋白质，是在所述多肽PoticiOO的N端连接上绿色荧光蛋白(EGFP)后所形成的融合蛋白(命名为EGFP-Pot 1C100 )。其中，序列I由114个氨基酸组成；序列4由355个氨基酸组成，其中第242-355位对应序列I。编码所述多肽PotlClOO或所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述多肽的基因(命名为·PotlClOO)或编码所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的基因(命名为EGFP-PotlClOO);所述基因是如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)编码序列为序列表中序列2的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)编码序列为序列表中序列5所示的DNA分子；4)序列表中序列5所示的DNA分子。其中，序列2由345个核苷酸组成，编码序列表中序列I所示的多肽；序列5由1068个核苷酸组成，编码序列表中序列4所示的蛋白质。序列5的第1-717位为EGFP蛋白的编码基因(不含终止密码子)，对应序列表中序列3，第718-723位为Bgl II的识别序列，第724-1068位为PotlClOO基因(不含起始密码子)，对应序列表中序列2。含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本发明中，所述重组表达载体中启动所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因转录的启动子具体为MCMV启动子。更为具体的，所述重组表达载体可为在pDC316载体或pDC315载体的多克隆位点处插入所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因得到的重组质粒。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pDC316载体的多克隆位点处插入所述PotlClOO基因以及EGFP蛋白的编码基因得到的同时表达所述PotlClOO多肽和所述EGFP蛋白的重组质粒(命名为pDC316-EGFP-Pot 1C100)。其中，插入所述PotlClOO基因(不含起始密码子)的多克隆位点具体为BlII和Sal I ;插入所述EGFP蛋白的编码基因的多克隆位点具体为EcoR I和Bgl II。即所述重组表达载体具体为在PDC316载体的多克隆位点EcoR I和Sal I之间插入所述EGFP-PotlClOO基因(序列5)。所述表达盒由能够启动所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因表达的启动子，所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因，以及转录终止序列组成。在本发明的一个实施例中，所述重组病毒具体为携带并表达所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因的重组腺病毒。在本发明中，所述重组腺病毒是基于Ad-MAX包装系统构建得到的，具体可按照包括如下步骤将所述重组表达载体(在PDC316载体或pDC315载体(与pDC316载体相比，仅多克隆位点存在差异)的多克隆位点处插入所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因得到的重组质粒)与骨架质粒PBH Glox ΔΕ1, 3Cre共转染腺病毒包装细胞得到重组细胞甲；培养所述重组细胞甲，获得所述重组腺病毒。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为所述重组表达载体pDC316-EGFP-PotlC100 ;所述腺病毒包装细胞具体为HEK293 细胞。当然，基于其他腺病毒包装系统构建得到的表达所述PotlClOO多肽的重组腺病毒也属于本发明的保护范围。上述多肽，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒在制备下述任一产品中的应用也属于本发明的保护范围(I)诱导肿瘤细胞凋亡的产品；(2)抑制肿瘤细胞生长的产品；(3)抗肿瘤产品；活性成分为上述多肽，或核酸分子，或重组载体，或表达盒，或重组细胞，或重组菌，或重组病毒的如下产品也属于本发明的保护范围(I)诱导肿瘤细胞凋亡的产品；(2)抑制肿瘤细胞生长的产品；(3)抗肿瘤产品；上述所有的所述肿瘤细胞均为端粒酶阳性的肿瘤细胞，如肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞等；所述肿瘤均为端粒酶阳性的肿瘤，如肝癌、宫颈癌、肺癌、肾癌等。实验证明，表达本发明所提供多肽的重组腺病毒能够抑制端粒酶阳性的肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤体内外生长。这表明本发明的多肽具有广谱、特异性端粒酶阳性肿瘤细胞杀伤活性，同时该多肽对正常人体细胞的生长和生存没有影响。这将对新型广谱特异性抗肿瘤药物的研发具有重要意义。
图I为Adv-Pot 1C100/EGFP感染(MOI :200)端粒酶阳性的肿瘤细胞后对细胞生长的抑制作用的分析。其中，Adv-PotlClOO即表示Adv-Pot 1C100/EGFP。图2为Adv-Pot 1C100/EGFP感染(MOI :500)端粒酶阴性的肿瘤细胞和正常的的二倍体细胞株后对细胞生长的抑制作用的分析。其中，Adv-PotlClOO即表示Adv-PotlClOO/EGFP0图3为Adv-PotlClOO感染肿瘤细胞后引起细胞凋亡情况的分析。其中，GFP即表示 Adv-EGFP ；PotlC100 即表示 Adv-Pot 1C100/EGFP。图4为重组腺病毒载体Adv-Pot 1C100/EGFP的抗肿瘤小鼠实验结果。其中，A为SMMC7721组；B为BEL-7402组；C为HeLa组；D为!fepG2组。A-D中，每只小鼠为一个重复；每只小鼠左侧肿瘤为Adv-Pot 1C100/EGFP注射组；右侧肿瘤为Adv-EGFP注射组。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。端粒酶阳性的肿瘤细胞株=HeLa (人子宫颈癌细胞株)、HepG2 (人肝癌细胞株)、、SMMC7721 (人肝癌细胞株，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心购，资源号3111c0001ccc000087)、BEL-7402 (人肝癌细胞株，中国典型培养物保藏中心细胞库购，资源号3142c0001000000035)、A549 (人肺癌细胞株，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心购，资源号3111c0001ccc000002)和A498 (人肾癌细胞株，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心购，资源号3111c0001ccc000171)端粒酶阴性的肿瘤细胞株U2os (骨肉瘤细胞株，中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心购，资源号3111c0001ccc000028)正常的人二倍体细胞株WI-38 (中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心购，资源号3111c0001ccc000210)、2BS (中国药品生物制品检定所购，资源号 3111c0002000000003)和 BJ (购自 ATCC, CRL-2522)SPF级无胸腺裸鼠购自军事医学科学院动物中心，所有裸鼠均为雌性，4-6周龄。实施例I、重组腺病毒载体Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP的制备重组腺病毒载体Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP是基于Ad-MAX包装系统构建的，由五加合公司制备，具体过程如下一、用于包装重组腺病毒的穿梭质粒的构建为了研究的方便，实现可视化标记，将EGFP蛋白的编码基因引入到穿梭质粒中，具体如下以EGFP蛋白的编码基因(序列表中序列3)为模板，用引物EGFP-up和EGFP-down进行PCR扩增，获得两端含有限制性内切酶识别位点EcoR I和Bgl II的DNA片段，用EcoRI和Bgl II进行双酶切后，与经过同样双酶切的PDC316载体(本元正阳公司，PD-01-28)大片段相连，对得到的重组质粒进行测序，经测序鉴定在EcoRI和Bgl II位点之间插入了序列表中序列3 (无终止密码子)所示EGFP蛋白编码基因的重组质粒为阳性，将其命名为PDC316-EGFP。EGFP-up :5，_CGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’(下划线部分为 EcoRI是识别序列，粗体部分为kozak序列，其后的序列为序列3的第1-19位)EGFP-down :5’ -TCGCA AGATCT CTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(下划线部分为 BlII 是识别序列，其后的序列为序列3的第699-717位的反向互补序列)以端粒保护蛋白(Potl) C端114个氨基酸片段为研究对象，将其对应的编码基因(命名为PotlClOO基因，核苷酸序列如序列表中序列2所示)为模板，用引物PotlClOO-UP和PotlClOO-down进行PCR扩增，获得两端含有限制性内切酶识别位点Bgl II和Sal I的DNA片段，用Bgl II和Sal I进行双酶切后，与经过同样双酶切的pDC316_EGFP载体大片段相连，对得到的重组质粒进行测序，经测序鉴定在Bgl II和Sal I位点之间插入了序列表中序列2 (无起始密码子)所示PotlClOO基因的重组质粒为阳性，将其命名为pDC316-EGFP-Pot1C100。PotlClOO-up :5’_TCGAG AGA TCT AAAACATCGTGGATTCCTTCT-3’(下划线部分为 BglII是识别序列，其后的序列为序列2的第1-21位)PotlClOO-down :5’_TCGA GTCGAC TTAGATTACATCTTCTGCAAC-3’(下划线部分为 SalI是识别序列，其后的序列为序列2的第325-345位的反向互补序列)
综上所述，重组表达载体pDC316-EGFP-Pot 1C100，即为在pDC316载体的酶切位点EcoR I和Sal I之间插入了序列表中序列5所示的EGFP蛋白编码基因和PotlClOO基因的融合基因(命名为EGFP-Pot 1C100)。序列5所示的融合基因EGFP-PotlClOO编码序列表中序列4所示的蛋白质(命名为EGFP-PotlClOO)。重组表达载体pDC316-EGFP_Pot 1C100中启动所述融合基因EGFP-PotlClOO转录的启动子为MCMV启动子。二、制备重组腺病毒将步骤一制备得到的穿梭质粒pDC316-EGFP-PotlC100(或pDC316-EGFP)与骨架质粒pBH Glox Δ El, 3Cre(加拿大Microbix Biosystems公司(多伦多)产品，另记载于“陈振海，杨汉春，郭鑫等.表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果.农业生物技术学报，2007，15 (2) :192-197” 一文中)，借助转染试剂PEI (Sigma，408727)，大批量共转染腺病毒包装细胞HEK293细胞。约一周后，除去细胞培养液，收获细胞。采用反复冻融法获得原代病毒液。用原代病毒液继续感染新的HEK293细胞(ATCC，CRL-1573)，在发生细胞病变效应(CPE)时收获病毒，经过几次重复感染，扩大病毒量和提高病毒滴度，得到粗制的重组腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP。 三、重组腺病毒的鉴定取5 μ I上述步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP (或Adv-EGFP)上清，加上 ο μ I蛋白酶K (NEB, P8102)，55°C消化I小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2 μ I进行PCR反应，在基因水平完成重组腺病毒的鉴定。其中对于PotlClOO基因的检测采用引物PotlClOO-up和PotlClOO-down，对于EGFP蛋白的编码基因的检测采用引物EGFP-up 和 EGFP-down。结果显示，步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP (或Adv-EGFP)在基因水平上扩增出了大小约为340bp (PotlClOO基因)和720bp (EGFP蛋白的编码基因)的两个目的条带，粗制重组腺病毒Adv-EGFP在基因水平上扩增出了大小约为720bp (EGFP蛋白的编码基因)的一个目的条带。以上结果证实步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-PotlClOO/EGFP和Adv-EGFP在基因水平上鉴定正确。另外,采用Western blot对步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-PotlClOO/EGFP(或Adv-EGFP)进行蛋白水平的鉴定，针对EGFP蛋白进行鉴定。结果表明步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP在蛋白水平上成功表达EGFP蛋白，粗制重组腺病毒Adv-EGFP在蛋白水平上成功表达EGFP蛋白。四、重组腺病毒的纯化采用氯化铯密度梯度离心法对步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-PotlC100/EGFP和Adv-EGFP分别进行纯化。具体如下(I)将 15% (15g/100ml)CsCl 和 40% (40g/100ml)CsCl (CsCl 溶于 IOmM HEPES,pH7. 4)加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；(2)将步骤二得到的粗制重组腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP (或Adv-EGFP)的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；(3)超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；(4)离心后，有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有需要收集的活病毒颗粒。用16号针头将这一条带收集;(5)在TBS中透析一小时，随后在含有10% (v/v)甘油的TBS中透析两次，每次一小时；(6)将透析后所得的纯化后重组腺病毒分装于EP管中，备用。实施例2、Adv-PotlClOO感染肿瘤细胞后对细胞生长和细胞凋亡的影响本实施例用实施例I制备所得的重组腺病毒载体Adv-Pot 1C100/EGFP分别感染端粒酶阳性的肿瘤细胞株(HeLa、H印G2、SMMC7721、BEL-7402、A549和A498)、端粒酶阴性的肿瘤细胞株(U2os)和正常的人二倍体细胞株(WI-38、2BS和BJ)，检测Adv-PotlClOO/EGFP感染肿瘤细胞后对细胞生长和细胞凋亡的影响。实验共分三组，其一为未感染腺病毒Adv-Pot 1C100/EGFP的空白对照组；其二为感染Adv-EGFP的病毒对照组；其三为感染Adv-Pot 1C100/EGFP的实验组。实验重复三次。具体操作如下 I、生长曲线测定(I)用胰酶消化细胞，用含体积百分含量10%血清的DMEM培养基中和后，以每孔1000个细胞接种在96孔板中；(2)每种细胞都设置3大组，即空白对照组，病毒对照组，实验组。其中，病毒对照组和实验组又各分为2小组感染复数(MOI)为200，以及感染复数(MOI)为500。每组均有2个复孔。(3)待病毒表达后，每12小时按照CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所，货号CK04)说明书每孔加入10μ I反应液(CCK-8试剂盒自带)，37°C孵育2_4小时，测0D450值，按照比值做细胞生长曲线。结果显示用感染复数(MOI)为200的Adv-Pot 1C100/EGFP或Adv-EGFP感染端粒酶阳性的肿瘤细胞株后，细胞的生长情况如图I所示。这一结果显示，与空白对照组和病毒对照组(Adv-EGFP)相比，Adv-Pot 1C100/EGFP感染端粒酶阳性的肿瘤细胞株后细胞的生长会受到抑制。用感染复数(MOI)为500的Adv-Pot 1C100/EGFP或Adv-EGFP感染端粒酶阴性的肿瘤细胞株和正常的人二倍体细胞株后，细胞的生长情况如图2所示。这一结果显示，与空白对照组和病毒对照组(Adv-EGFP)相比，Adv-Pot 1C100/EGFP感染端粒酶阴性的肿瘤细胞株和正常的人二倍体细胞株并不影响细胞的生长。2、凋亡检测采用DNA染料Hoechst染色，计数细胞凋亡情况，具体如下(I)细胞胰酶消化，用体积百分含量10%血清的DMEM培养基中和后，接种到12孔板中，将分别梯度稀释好的重组腺病毒(Adv-Po11C100/EGFP或Adv-EGFP )加入培养皿中(对应3个Μ0Ι，即100、200和300)，设多个时间点，用4%(4g/100ml)的多聚甲醛固定10-15分钟；(2)固定后用IXPBS轻轻洗2遍后(动作要轻柔，避免洗去死细胞)，加入IOyg/ml 的 Hoechst 33258 (Invitrogen, H21491)避光染核 30 分钟；(3)荧光显微镜下观察细胞核表现为核碎片、核浓缩的可认为是凋亡细胞，通过计数每组及复孔中的三个随机区域做柱状图来确定细胞凋亡指数，实验结果由三次独立的重复实验获得。
结果显示，用不同感染复数的Adv-PotlClOO/EGFP或Adv-EGFP感染细胞后，细胞凋亡的发生情况如图3所示。这一结果显示，与Adv-EGFP相比，Adv-Pot 1C100/EGFP感染端粒酶阳性肿瘤细胞明显可使细胞发生凋亡，但Adv-PotlClOO/EGFP感染端粒酶阴性的肿瘤细胞及正常细胞不能形成细胞凋亡。实施例3、重组腺病毒载体Adv-Pot 1C100/EGFP的抗肿瘤效果检测本实施例首先采用端粒酶阳性的肿瘤细胞株(HeLa、HepG2、SMMC7721和BEL-7402)构建小鼠肿瘤模型；进而通过瘤体局部注射实施例2制备所得的重组腺病毒载体Adv-PotlClOO/EGFP或Adv-EGFP，观察瘤体大小变化，从而检测Adv-Pot 1C100/EGFP的抗肿瘤效果。具体操作如下一、裸鼠成瘤实验将5X IO6-I X IO7 个肿瘤细胞(HeLa、H印G2、SMMC7721 或 BEL-7402)，皮下注射到4-6周龄雌性SPF级无胸腺裸鼠两侧腋下，进行裸鼠成瘤模型。每种细胞注射6只小鼠结果显示，SMMC7721组小鼠自注射肿瘤细胞后10天成瘤；BEL_7402组小鼠自注射肿瘤细胞后7天成瘤；HeLa组小鼠自注射肿瘤细胞后7天成瘤；HepG2组小鼠自注射肿瘤细胞后10天成瘤。所述成瘤指的是瘤体直径约为O. 5-1厘米。二、重组腺病毒免疫及抗肿瘤效果测定在小鼠成瘤(瘤体直径约为O. 5-1厘米)后，对步骤一获得的四种小鼠肿瘤模型分别进行瘤体局部注射Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP，采用瘤体内及周围多点注射的方式，其中Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP的用量均为IX IO8VP/次，每周注射一次，共注射三次。Adv-Pot 1C100/EGFP和Adv-EGFP各注射于每只小鼠一侧的瘤体处。自第3次注射日后第7天，测量肿瘤的体积，根据如下公式计算得到肿瘤体积肿瘤体积V (Him3)=L2XDX 1/2。其中，L为瘤体的短径，D为瘤体的长径，单位均为mm。结果如图4和表I所示。这一结果表明，通过瘤体局部注射表达PotlClOO的重组腺病毒 Adv-PotlC 100/EGFP 能够造成包括 BEL-7402、SMMC7721、HeLa、HepG2 等多种不同肿瘤细胞在裸鼠体内移植生长出的肿瘤实体的体积显著性缩小。表I重组腺病毒载体Adv-Pot 1C100/EGFP的抗肿瘤效果
权利要求
1.多肽，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤细胞杀伤活性相关的由序列I衍生的多肽。
2.权利要求I所述多肽衍生的蛋白质，是由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.编码权利要求I所述多肽或权利要求2所述蛋白质的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子为编码权利要求I所述多肽或权利要求2所述蛋白质的基因；所述基因是如下I) -4)中任一所述的DNA分子 1)编码序列为序列表中序列2的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)编码序列为序列表中序列5所示的DNA分子； 4)序列表中序列5所示的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；在所述重组表达载体中，启动所述基因转录的启动子为MCMV启动子。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述重组表达载体为在PDC316载体或pDC315载体的多克隆位点处插入权利要求3或4所述核酸分子的重组质粒。
8.根据权利要求5所述的重组病毒，其特征在于所述重组病毒为重组腺病毒；所述重组腺病毒按照包括如下步骤的方法制备得到将权利要求6或7中所述的重组表达载体与骨架质粒pBH Glox AEl，3Cre共转染腺病毒包装细胞得到重组细胞甲；培养所述重组细胞甲，获得所述重组腺病毒。
9.权利要求I所述多肽，或权利要求2所述蛋白质，或权利要求3或4所述核酸分子，或权利要求5-8中任一所述的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒在制备下述任一产品中的应用 (1)诱导肿瘤细胞凋亡的产品； (2)抑制肿瘤细胞生长的产品； (3)抗肿瘤产品； 所述肿瘤细胞为端粒酶阳性的肿瘤细胞；所述肿瘤为端粒酶阳性的肿瘤。
10.活性成分为权利要求I所述多肽，或权利要求2所述蛋白质，或权利要求3或4所述核酸分子，或权利要求5-8中任一所述的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒的如下产品 (1)诱导肿瘤细胞凋亡的产品； (2)抑制肿瘤细胞生长的产品； (3)抗肿瘤产品； 所述肿瘤细胞为端粒酶阳性的肿瘤细胞；所述肿瘤为端粒酶阳性的肿瘤。
全文摘要
本发明公开了具有肿瘤细胞杀伤活性的端粒蛋白多肽片段及其应用。本发明所提供的多肽是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与肿瘤细胞杀伤活性相关的由序列1衍生的多肽。实验证明，表达本发明所提供多肽的重组腺病毒能够抑制端粒酶阳性的肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤体内外生长。这表明本发明的多肽具有广谱、特异性端粒酶阳性肿瘤细胞杀伤活性，同时该多肽对正常人体细胞的生长和生存没有影响。这将对新型广谱特异性抗肿瘤药物的研发具有重要意义。
文档编号A61K38/16GK102942618SQ201210459010
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者黄君健, 金蕊, 白云秀, 马航航, 徐晓玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所