药物制剂和其用于治疗花生过敏的用途

药物制剂和其用于治疗花生过敏的用途
【专利摘要】本发明涉及可以用于免疫治疗的组合物，且特别涉及可用于经受花生过敏的哺乳类，例如人类哺乳类的免疫治疗的组合物。本发明还涉及本组合物用于通过免疫治疗使经受过敏的哺乳类的免疫系统脱敏的治疗性治疗的用途，和本组合物用于在对发展某种过敏有高度倾向的哺乳类中的预防性治疗的用途。特别地，本发明涉及包括改性的完整全花生提取物和药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂的药物组合物，其中所述改性的全花生提取物是还原且随后烷基化的全花生提取物，优选包括可溶性花生仁蛋白质如Ara?h1、Ara?h2和Ara?h6的脱脂全花生提取物。
【专利说明】药物制剂和其用于治疗花生过敏的用途
[0001] 本发明涉及药物制剂、或组合物，其可以在免疫治疗中使用，并特别涉及可用于对 经受花生过敏的哺乳类，例如人类哺乳类的免疫治疗的制剂或组合物。本发明还涉及本制 剂或组合物用于通过免疫治疗使经受过敏的哺乳类的免疫系统脱敏的治疗性治疗的用途， 和本制剂或组合物用于在对发展某种过敏有高度倾向的哺乳类的预防性治疗的用途。
[0002] 过敏原免疫治疗，也称为低敏治疗、免疫脱敏、低敏（hyposensibilization)、或过 敏原特异性免疫治疗，是用于过敏疾患的一种免疫治疗形式，其中患者被接种越来越大剂 量的过敏原，即他们对其过敏的物质或多种物质，旨在诱导免疫耐受性。
[0003] 过敏原特异性免疫治疗是治疗过敏疾患的根本原因的唯一治疗策略。这是极具成 本效益的治疗策略，并导致改善的生活质量。
[0004] 免疫治疗已被证明产生过敏症状的长期缓解、减少相关的过敏应答的严重程度、 以及减少对过敏原的新的致敏的发展机会。免疫治疗旨在调节免疫系统对过敏原的应答。
[0005] 免疫治疗通常涵盖经由例如舌下或皮下途径重复暴露于特定过敏原，从而提供过 敏患者对过敏原的脱敏，并因此减少过敏症状和用于基于症状的治疗。
[0006] 免疫治疗潜在的确切机制不完全清楚，但被接受的是免疫治疗导致对过敏原的免 疫应答的改变。改变至少包括IgE合成的变化，和减少免疫系统对特定过敏原的过敏应答 的IgE阻断抗体的产生。还观察到Th2向Thl/T调节细胞转化的增加。在分子水平上，部分 潜在机制依赖于过敏原特异性IgG的优先诱导以中和过敏原及过敏原特异性IgE的减少。
[0007] 免疫治疗通常涉及使过敏患者暴露至低剂量的过敏原。剂量定期例如每周逐渐增 力口，直到达到"维持"剂量。这相当于在约4个月中每周一次注射以达到维持剂量。一旦达 到维持剂量，施用注射较少，例如每月一次持续几年。通常，治疗越长和剂量越高，治疗收益 越大。
[0008] 成功完成免疫治疗后，可以预期3至5年或更长时间段的长期保护。如果症状开 始复发，或如果个体发生暴露于未包括在先前治疗方案中的新的过敏原，治疗可重复进行。
[0009] 花生是造成食物诱导的过敏的最常见的食物之一。花生过敏的根治性治疗尚未获 得。使用花生水提取物（aqueous peanut extract)的特异性免疫治疗（SIT)显示对经口摄 入的花生的增加的耐受性。然而，如由Nelson等人（J. Allergy Clin. Immunol. 1997June ; 99 (6Ptl) :744-51)报道的，花生水提取物导致不可接受的全身反应，甚至在维持注射期。因 此，Nelson等人得出结论："对于这种治疗方法的临床应用，需要改性的花生提取物。"
[0010] 花生过敏的主要过敏原是花生种子C藏蛋白Ara hi (豌豆球蛋白）和Ara h2 (羽扇 豆球蛋白）。在最近的研究（Mov6rare 等人，Int Arch Allergy Immunol ;2011 ;第 282-290 页）中，患有疑似花生过敏的大部分年轻的成年人具有针对Ara hi和Ara h2的IgE抗体。 除了这些主要过敏原，还报道了 IgE针对其它花生仁蛋白质例如Arah6的反应性。
[0011] 已经描述花生过敏原Ara h2和Ara h6通过还原和烷基化的方法的改性提供这些 致敏蛋白质的低致敏形式。低致敏性可通过固相免疫测定中减少的IgE结合，或通过激活 效应细胞，如嗜碱性粒细胞显示。然而，过敏原Ara h2和Ara h6不包括在花生中发现的所 有的过敏原，且仅基于Ara h2和Ara h6,因此没有其它花生过敏原的免疫治疗或免疫接种， 很可能不足以（预防地）治疗花生过敏的个体或使其脱敏。
[0012] 还原和烷基化不可逆地裂解蛋白质中的二硫键。Ara h2具有4个二硫键且Ara h6 具有6个二硫键。已表明，还原和烷基化引起Ara h2和Ara h6的二级结构的重大变化，导 致IgE结合损失和效应细胞的激活。然而，考虑到Ara h2以及在较小程度上的Ara h6仅形 成花生过敏致病因素的一部分，仅有Ara h2和Ara h6可能不足以治疗花生过敏的个体。
[0013] 除了其它目标以外，本发明的一个目标是提供药物组合物或制剂，用于花生过敏 的治疗性或预防性治疗。换言之，除了其它目标以外，本发明的一个目标是提供药物组合物 或制剂，用于使患者对花生，或更具体地花生过敏原的脱敏。
[0014] 除了其它目标以外，这些目标通过如所附权利要求中限定的药物组合物实现。
[0015] 具体地，根据第一方面，除了其它目标以外，这些目标，通过包括改性的全花生提 取物（modified whole peanut extract)和药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂的药物组合 物实现，其中所述改性的全花生提取物是还原且随后烷基化的全花生提取物。
[0016] 在本发明的上下文中，过敏原被定义为能够通过免疫球蛋白E(IgE)的应答刺激 特应性哺乳类中的超敏反应的抗原。大多数哺乳类仅作为针对寄生虫感染的防御发动显著 免疫球蛋白E应答。然而，一些哺乳类可以对许多普通的环境抗原响应。此遗传倾向也被命 名为特应性。在特应性哺乳类中，非寄生虫抗原刺激不希望的IgE产生，导致超敏或过敏。
[0017] 在本发明的上下文中，全花生提取物是指包括花生中发现的基本上所有的种仁蛋 白质的花生提取物。换句话说，根据本发明的全花生提取物代表花生中发现的蛋白质，并从 而代表花生过敏的致病因素（过敏原）。因此，除了 Ara h2和Ara h6,根据本发明的全花生 提取物还包括其它花生过敏原，其中主要的花生过敏原是Ara h 1。
[0018] 根据本发明，本全花生提取物通过还原与烷基化来改性，因此存在于全花生提取 物的蛋白质中的二硫键断裂，随后为烷基化，导致包括二硫键的蛋白质的二级结构中的不 可逆变化，并从而破坏这些蛋白质中引起IgE过敏反应的表位。
[0019] 还原二硫键的合适的剂（agent)是已知的且可以是，例如，2-巯基乙醇（β -ME)、 二硫苏糖醇（DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、高半胱氨酸、三丁基膦、亚硫酸盐、三（2-羧乙 基）膦（TCEP)、（氰基）硼氢化钠、碱液、谷胱甘肽、E-巯基乙胺、巯基乙酸、甲硫醚或乙硫 醚。
[0020] 烷基化还原的半胱氨酸残基的合适的剂是已知的且可以是，例如，是N-乙基马来 酰亚胺、胱胺、碘乙酰胺、碘乙酸、烷基卤化物、烷基硫酸盐（alkylsulfate)、烯烃、或酶。
[0021] 考虑到相比Ara h2和Ara h6，Ara hi不包括二硫键，只有单一 Cys残基，使包括主 要过敏蛋白质Ara hi的全花生提取物经受还原和甲基化从而减少其致敏性是令人惊讶的。 因此，Ara hi的还原和烷基化预期不会导致二级结构的变化和伴随全花生提取物的IgE结 合损失和效应细胞的激活。尽管这样，特别是考虑到Ara hi是主要的花生过敏原，本发明人 惊奇地发现，还原和烷基化对Ara hi有作用，且从而对改性的花生提取物的致敏性有作用。
[0022] 根据本发明该第一方面的优选的实施方案，本全花生提取物在使花生提取物经受 还原和烷基化之前被脱脂。除去脂类和其它脂肪物质增加了提取物中的蛋白质含量，并从 而增加了免疫原性IgE表位的相对数量，且从而增加了提取物的致敏性。
[0023] 根据本发明该第一方面的又另一个优选的实施方案，本全花生提取物包括可溶性 花生仁蛋白质，更优选包括至少Ara hi、Ara h2和Ara h6。可溶性花生仁蛋白质代表花生蛋 白质Ara hl、Ara h2和Ara h6的大多数，即便不是全部过敏原原因表位（allergen causing epitope)〇
[0024] 根据本发明该第一方面的特别优选的实施方案，本全花生提取物是通过以下可获 得的：
[0025] a)研磨花生以提供花生粉；
[0026] b)使用每50ml丙酮5克花生粉在丙酮中孵育所述花生30分钟，以提供脱脂的花 生粉；
[0027] c)干燥所述脱脂的花生粉；
[0028] d)在具有在7和9之间的pH的缓冲液中悬浮所述干燥的花生粉；及
[0029] e)分离步骤（d)得到的上清液，从而提供全花生提取物。
[0030] 上述方法提供了可溶性花生过敏原蛋白质的纯化提取物，即富集可溶性花生仁蛋 白质的提取物，其可以容易地经受随后的还原和烷基化。
[0031] 根据本发明该第一方面的另一个特别优选的实施方案，本药物组合物还包括铝。 出人意料的是，发现添加铝至本组合物进一步减少本改性的全花生提取物的致敏性。
[0032] 因为显著减少的IgE结合，或IgE表位，本药物组合物特别适合被用于对患者进行 花生过敏脱敏的治疗性治疗中，优选地，通过免疫治疗或免疫接种。
[0033] 根据本发明，免疫治疗包括以足够的量且持续足够的时间向经受过敏的哺乳类， 优选人类哺乳类施用本组合物，以减少、或消除所述哺乳类对所述过敏原的过敏应答。
[0034] 典型的足够的量将是以本组合物相对于其施用的个体体重计从约0. lng/kg至 10mg/kg、10ng/kg至约100μ g/kg、或0· 1 μ g/kg至1 μ g/kg。通常，治疗将包括以在这些范 围的下端的剂量的施用起始，并随着治疗的进展增加剂量。
[0035] 对于脱敏治疗，它通常需要患者接受频繁的施用，例如，最初地每一、两或三天，逐 渐减少到每两或三周一次。其它合适的脱敏方案包括皮下注射，每2-4周一次，注射的剂量 可在3-6个月的时期逐渐增加，且然后以每2-4周一次继续注射，持续长达约5年的时期。 给予每日施用也是可能的，特别是用于舌下施用。
[0036] 脱敏的方案还可以包括在各种等价替代形式中常规地被称为快速脱敏、快速过敏 原免疫治疗、快速过敏原接种、及快速或急速免疫治疗的治疗形式。从广义上讲，这个过程 旨在通过以频繁（例如每小时）间隔，施用增加剂量的过敏原的一系列注射（或经由另一 种合适的载体），以使过敏患者提前达到提取物（即，过敏原）的免疫或维持剂量。如果成 功的话，患者将会表现出对过敏原改善的抵抗，甚至可能呈现出对任何随后的过敏原暴露 的完全无反应性。
[0037] 各种脱敏方案是本领域已知的，并且可例如包括治疗对过敏原具有速发型超敏反 应的患者的方法，使用加速的快速免疫治疗安排，与在接受加速的免疫治疗之前用泼尼松 和组胺拮抗剂预治疗这些患者的方法组合。
[0038] 本发明将在本发明的优选实施方案的下述实施例中进一步详细说明。在实施例 中，参考了附图，其中：
[0039] 图1 :显示了个体花生过敏原和西班牙（Spanish)品种的提取物的rp-HPLC图谱。 图A (个体花生过敏原）：在7. 3ml处的峰：Ara h2 ;在9-9. 5ml处的峰：Ara h6 ;在11ml处 的峰：Ara hi。图B(西班牙品种的提取物）：空白（MQ水）；在7. 3ml处的峰：Ara h2 ;在 9-9. 5ml 处的峰：Ara h6 ;在 11ml 处的峰：Ara hi ;
[0040] 图2 :显示了个体花生过敏原改性之前和之后的rp-HPLC图谱。上图：Ara hl，箭 头指示改性之前（天然）和之后（RA)。中图：Ara h2,箭头指示改性之前（天然）和之后 (RA)。下图：Arah6,箭头指示改性之前（天然）和之后（RA);
[0041] 图3 :显示了个体花生过敏原改性之前和之后的远UV⑶光谱。上图：Ara hl，箭 头指示改性之前（天然）和之后（RA)。中图：Ara h2,箭头指示改性之前（天然）和之后 (RA)。下图：Arah6,箭头指示改性之前（天然）和之后（RA);
[0042] 图4 :显示了花生过敏小鼠激发后的体温。上图：以天然花生提取物（0. 1、0. 6、和 3mg/小鼠）激发。下图：以改性的花生提取物（0. 1、0. 6、和3mg/小鼠）激发；
[0043] 图5 :显示了实施例6(A)中使用的致敏、脱敏和激发方案的时间线，和实施例7(B) 中使用的致敏、脱敏和激发方案的时间线；
[0044] 图6:显示了在第91天激发的小鼠的温度（A)，与在第85天的肥大细胞激活（B; mMCP-1)；
[0045] 图7 :显示了在第112天激发的小鼠的温度；
[0046] 图8 :显示了在第99天测试的所有组的血清中mMCP-1的水平；
[0047] 图9 :显示了在第99天测试的所有组的血清中IgE㈧、IgGl (B)
[0048] 和 IgG2a(C)的水平。 实施例
[0049] 实施例1.样品采集和提取物的制备
[0050] I2 种花生样品由 Maleki 博士（US Department of Agriculture, New Orleans, USA) 慷慨地提供，包括四种不同的品种（兰纳（Runner)、西班牙（Spanish)、巴伦西亚 (Valencia)和弗吉尼亚（Virginia))。这些品种通常在西欧和美国消费。部分花生被烘烤 (在预热的循环热空气烘箱中140°C持续15分钟）。
[0051] 手工研磨花生并用丙酮脱脂（5克花生使用50mL丙酮脱脂30分钟），并留在室 温（RT)干燥过夜。以10mL50mM Tris HC1 pH8. 0(10% w/v)悬浮lg脱脂的花生粉，并在 RT搅拌1小时。随后将样品离心，并将上清液通过0. 2 μ m的纤维素膜过滤器（Whatman FP30/0, 2CA-S, Whatman GmbH, Dassel, Germany)过滤并用于进一步的研究。
[0052] 提取物以等分试样储存在_20°C用于单次使用。蛋白质浓度使用Bradford分 析测定。以牛血清白蛋白（BSA2mg/mL来自Pierce,IL,USA)制备标准曲线，并稀释至 50-500 μ g/mL的范围。将粗花生提取物（CPE)以50mM Tris HC1 pH8. 0稀释40x。将来自 Bio-Rad, USA的蛋白测定试剂以水稀释5x。将20 μ L标准品和样品与lmL5x稀释的试剂 混合，且将250 μ L的每个样品和标准品置于有平面的平底平板（F型）（flat bottom plate withflat(F-type))的孔中。50mMTrisHClpH8.0被用作空白。结果总结于表1中。
[0053] 表1 :花生样品和其提取物中的蛋白质浓度。
[0054]
【权利要求】
1. 药物组合物，所述药物组合物包括改性的全花生提取物和药学上可接受的稀释剂和 /或赋形剂，其中所述改性的全花生提取物是还原且随后烷基化的全花生提取物。
2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述全花生提取物是脱脂的。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的药物组合物，其中所述全花生提取物包括可溶 性花生仁蛋白质。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述全花生提取物包括Ara h 1、Ara h2 和 Ara h6。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述全花生提取物是通过以 下可获得的： a) 研磨花生以提供花生粉； b) 使用每50ml丙酮5克花生粉在丙酮中孵育所述花生30分钟，以提供脱脂的花生粉； c) 干燥所述脱脂的花生粉； d) 在具有在7和9之间的pH的缓冲液中悬浮所述干燥的花生粉；及 e) 分离步骤（d)得到的上清液，从而提供全花生提取物。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包括铝。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，用于通过免疫治疗来治疗经受过敏的 哺乳类。
8. 根据权利要求7所述的用途，其中所述哺乳类是人类哺乳类。
9. 根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，用于针对所述过敏原使哺乳类的免疫 系统脱敏的治疗性治疗，或用于在与所述过敏原接触后有发展过敏的高度倾向的哺乳类的 预防性治疗。
10. 根据权利要求9所述的用途，其中所述哺乳类是人类哺乳类。
11. 根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，用于药物。
12. 用于免疫治疗的方法，所述方法包括以足够的量且持续足够的时间向经受过敏的 哺乳类、或处于发展过敏的风险的哺乳类施用根据权利要求1至6中任一项所述的组合物， 以减少、或消除所述哺乳类对所述过敏原的过敏应答。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳类是人类哺乳类。
【文档编号】A61K36/48GK104066433SQ201280061902
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月16日
【发明者】斯特凡·约翰·科佩尔曼, 乔安娜·宝琳娜·玛丽亚·范德克雷杰 申请人:哈尔过敏控股有限公司