专利名称：青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1及其编码基因和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl及其编码基因和在制药中的应用。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF-a，又称TNF)是一种主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞分泌的细胞因子。对于不同的细胞类型，TNF能够引起多样化的生物学效应，这暗示了其在多种生理和药理条件下都具有重要的调控作用。此外，TNF-a还是凋亡过程(程序性细胞死亡)中的关键性调控因子之一。TNF-a作为一种多效的细胞因子，在细胞再生、迁移、炎症和凋亡等生物学过程中都具有作用。随着研究的深入，TNF-a在风湿性关节炎、哮喘、败血症、结肠炎乃至糖尿病、冠心病等多种复杂炎症疾病或免疫性疾病中所起的关键性作用逐渐为人们所知并日益受到重视。作为一种多效的细胞因子，TNF-a介导的生物学响应都是通过TNF-a与其两种受体的结合而触发的。这两种受体分别为TNFRl (又称TNFRSF1A、CD120a、p55)和TNFR2 (TNFRSF1B, CD 120b, p75)。其中，胞内域中含有死亡结构域(death domain, DD)的TNFRl属于TNF受体超家族中的死亡受体亚群；而TNFR2的胞内域不含该结构。在机体内，TNF-a引起的炎症或免疫反应，主要是通过TNFRl信号通路发挥作用。虽然有研究表明TNFR2能够增强TNFRl信号通路的生物学效应，甚至能够独自激活TNFRl弓丨发的大部分信号通路，但其更重要的功能是调控机体的增殖与再生。近年来，以抗TNF-a抗体治疗自身免疫性炎症疾病如类风湿性关节炎等已取得了重大进展，进一步证明TNF`在该类疾病中的重要作用。作为一种多效的细胞因子，TNF在机体内的功能还涉及了细胞增殖、修复及迁移等生物学功能，因此TNF-a抗体在使用过程中往往表现出一定的毒副作用，如对英国风湿病学会生物制剂注册数据库的数据进行分析，发现使用TNF拮抗剂治疗风湿性关节炎的患者比正常人和使用常规药物的患者感染结核病的概率要高，其中使用infliximab和adalimumab的患者患病的概率比使用etanercept的患者高三到四倍(参见文献Dixon WG, Hyrich KL, Watson KD etal.Drug-specific risk of tuberculosis in patients with rheumatoid arthritistreated with ant1-TNF therapy:results from the British Society for RheumatologyBiologies Register(BSRBR) [J]. Ann Rheum Dis, 2010;69: 522 - 528)。因此，结合前述内容研究开发一种以TNFRl为靶点的药物已愈发重要。据统计，全世界蛇类有2700多种，其中毒蛇有600多种.我国的蛇类资源丰富，约有200多种，其中毒蛇约为48种。作为一种成分复杂功能、多样的天然药物宝库，蛇类毒素中有效成分的分离及功能研究一直备受关注。研究表明，蛇毒中的活性成分主要为蛋白质和多肽，按照功能可分为酶、神经毒性多肽、神经生长因子、膜活性多肽及其他生物活性肽(参见文献王艳妮，鲍毅新。蛇毒的研究进展及其在医药领域的应用[J]，浙江师范大学学报(自然科学版)，2012，35 (2) :189-194)。随着病理学、药理学、生物化学及分子生物学的发展，蛇毒中的许多活性组分得到了分离纯化，而它们在抗炎、镇痛及抗肿瘤等方面的功效也日益受到关注。青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)属于爬行纲海蛇科,分布于我国辽宁、江苏、浙江、福建、广东、广西和台湾近海。作为一种药用动物，于唐朝陈藏器的《本草拾遗》中就有对其作为祛风燥湿，通络活血，攻毒和滋补强壮等功效良药的记载。目前有关青环海蛇活性成分的文献介绍的都是复方提取物，如复方海蛇酊、海蛇药酒，海蛇提取物等。目前尚无文献报道有关青环海蛇的生物活性肽的报道，更没有有关青环海蛇的生物活性肽与TNF-a相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl及其编码基因，本发明的另一目的在于提供该青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl在制药中的应用。本发明人以TNFRl为靶点淘选青环海蛇毒腺噬菌体展示文库筛选获得得到一种蛇毒活性小肽Hydrostatin-SNl。对其进行深入研究，发现该活性小肽能够有效阻遏肿瘤坏死因子I型受体介导的生物活性，具有极大的药用前景。本发明的主要技术方案是，以TNFRl为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库筛选获得蛇毒抗炎活性小肽，并对其抗炎能力进行研究。本发明的第一方面 ,提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl,所述的青环海蛇抗炎活性肽，具有如下(a)或(b)或(C)的蛋白质(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO: 2的氨基酸序列经过1-17个氨基酸残基的取代或缺失且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质；(c)将SEQ ID NO: 2中的氨基酸序列在N端或C端加上1_10个氨基酸残序列，且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质。本发明还提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl的编码基因，为如下(i )或(ii )的DNA分子( i )如 SEQ ID NO:1 所示的 DNA 分子；( ii )在严格条件下与(i )限定的DNA序列杂交且编码所述青环海蛇抗炎活性肽的DNA分子。所述的一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl,具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，是一种直链多肽，分子量为2483. 68道尔顿，等电点4. 39。本发明的第二方面，提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl的筛选方法，该方法包括如下步骤(I)生物淘选以TNFRl作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库用PH9. 6的碳酸盐包被缓冲液将TNFRl稀释至浓度为I U g/ml,以lOOyl/well包被96孔ELISA板，并以封闭剂封闭各孔；包被好的ELISA板，每孔加入IOOyl噬菌体，37°C孵育I小时；以TBST溶液洗板4次，加洗脱液于37°C孵育20分钟，从ELISA板上将结合的噬菌体洗脱下来，并以宿主菌BLT5403扩增洗脱下的噬菌体，完成第一轮淘选。按上述方法以第一轮淘选所得噬菌体为基础，再进行两次淘选，获得强亲和力的含目的基因的噬菌体群。从第三轮淘选所得噬菌体中分离单克隆噬菌体，以up和down引物扩增，测序鉴定后获得 Hydrostatin-SNl 的基因序列5’ -GACGAACAAC ACCTAGAGAC CGAACTACACACTCTCACCA GCGTGCTGAC AGCCAATGGA TTCCAA-3’ (如 SEQ ID NO:1 所示)；其氨基酸序列一级结构为Asp-Glu-Gln_His-Leu-Glu-Thr-Glu-Leu-Hi s-Thr-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Thr-Ala-Asn-Gly-Phe-Gln (如 SEQ ID N0:2 所不)。(2)合成以固相多肽合成技术合成Hydrostatin-SNl，并以HPLC及MS分析其纯度和分子量，其分子量为2489. 69,等电点为4. 39。青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库是用以下方法制备得到的1、青环海蛇蛇毒毒腺mRNA的获得及cDNA的获得；2、T7载体的构建及体外包装；·3、噬菌体文库的滴度鉴定及保存。本发明的第三方面，提供了青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl及其编码基因在制药中的应用，所述应用为制备治疗与TNF-a相关的疾病的药物中的应用。所述的与TNF-a相关的疾病，包括类风湿性关节炎、糖尿病、冠心病、败血症、结肠炎等多种复杂炎症疾病或免疫性疾病。本发明采用噬菌体展示技术筛选得到蛇毒活性肽Hydrostatin-SNl，BIACORE (基于表面等尚子共振技术的生物大分子相互作用分析技术)分析Hydrostatin-SNl与偶联于芯片上的人重组TNFRl之间的相互作用，证明Hydrostatin-SNl可直接与结合于芯片上的TNFRl结合，并能与肿瘤坏死因子II型受体(TNFR2)及TNF-a以相对较弱的能力结合；Hydrostatin-SNl可以抑制TNF-a与偶联于芯片上的TNFRl和TNFR2的结合。并进一步采用TNF- a敏感细胞L929细胞，检测Hydrostatin-SNl对TNF- a生物活性的作用；并采用293A细胞检测Hydrostatin-SNl对TNF- a激活的NF- k B、MAPK信号通路的影响；同时建立小鼠内毒素(LPS)急性休克动物模型和葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎动物模型，证明Hydrostatin-SNl能够抑制TNF- a的生物活性，能够直接与TNF- a ,TNFRl及TNFR2结合，并在细胞和动物水平上抑制TNF-a的的生物活性，是一种良好的抗炎活性肽。因此，可作为活性成分用于TNF-a相关的抗炎药物。本发明的青环海蛇活性肽Hydrostatin-SNl具有结构简单、人工合成方便、抗炎活性强的特点。该青环海蛇活性肽作为药物，可治疗TNF-a相关的疾病如败血症、结肠炎等多种复杂炎症疾病或免疫性疾病的新用途，为治疗这些疾病提供了新的途径，因此具有较大的临床应用价值。
图1 是 Hydrostatin-SNl 的 HPLC 分析结果。图2 是 Hydrostatin-SNl 的 MS 分析结果。图3是TNF-a与芯片的偶联(最终偶联3000RU)。图4是TNFRl与芯片的偶联(最终偶联8000RU)。
图5是TNFR2与芯片的偶联(最终偶联200RU)。图6是Hydrostatin-SNl直接与偶联在芯片上的TNF-a的结合反应曲线。图7是Hydrostatin-SNl直接与偶联在芯片上的TNFRl的结合反应曲线。图8是Hydrostatin-SNl直接与偶联在芯片上的TNFR2的结合反应曲线。图9是TNFRl偶联于芯片上，三条从上到下依次为TNF-a单独、TNF_a Hydrostatin-SNl 为 2 :1 (n:n)、TNF-a Hydrostatin-SNl 为1:5(n:n)。图10是TNFR2偶联与芯片上，三条从上到下依次为TNF_ a单独、TNF- a Hydrostatin-SNl 为 2 :1 (n:n)、TNF-a Hydrostatin-SNl 为1:l(n:n)。图11是TNF- a单独或与Hydrostatin-SNl混合后加入L929细胞，作用20h后对细胞的杀伤作用。图12 是 Hydrostatin-SNl (32pM_20nM)对 TNF-a 杀伤 L929 细胞的活性具有剂量依赖性的抑制作用光镜图，其中A为空白组、B为TNF-a组(10ng/ml)、C为TNF- a +Hydrostatin-SNl (4nM)、D 为 TNF-a+Hydrostatin-SNl (32pM)。图13Hydrostatin_SNl单独加入L929细胞作用20h后，对细胞的影响。图14Hydrostatin_SNl 对 TNF- a 激活的 NF- k B、MAPK 信号通路的作用。图15Hydrostatin_SNl对小鼠内毒素(LPS)急性休克动物模型的作用。图16Hydrostatin _SNl对小鼠结肠炎动物模型小鼠体重变化的影响。图17Hydrostatin_SNl对小鼠结肠炎动物模型脾脏质量比的影响。图18Hydrostatin_SNl对小鼠结肠炎动物模型小鼠结肠末端组织病变的影响，组织切片染色光镜图，其中A为normal组、B为control组(2. 5%DSS)、C为DSS+Hydrostatin-SNl (200 u g/kg/d)、D 为 DSS+Hydrostatin-SNl (20 u g/kg/d)。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。用实施例1制得的Hydrostatin-SNl进行实施例2_6的实验。实施例1 :青环海蛇蛇毒活性肽Hydrostatin-SNl的来源及合成。以TNFRl作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库用pH9. 6的碳酸盐包被缓冲液将TNFRl稀释至浓度为I U g/ml,以100 u 1/well包被96孔ELISA板，并以封闭剂封闭各孔；包被好的ELISA板，每孔加入100 ill噬菌体，37°C孵育I小时；以TBST溶液洗板4次，加洗脱液于37°C孵育20分钟，从ELISA板上将结合的噬菌体洗脱下来，并以宿主菌BLT5403 (购自Novagen公司，是novagen公司T7Select Cloning Kit试剂盒里提供的，改造过的特定的宿主菌)扩增洗脱下的噬菌体，完成第一轮淘选。青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库是用以下方法制备得到的1、青环海蛇蛇毒毒腺mRNA的获得及cDNA的获得取新鲜分离获得的青环海蛇蛇毒毒腺，剥离肌肉组织后称取约0. 18-0. 2mg,以trizol法提取总RNA,随后以Straight A’ s mRNA Isolation system试剂盒(市售,购自Novagen 公司)分离获得mRNA,再以 Orient Express Oligo (dT) and Orient Express RandomPrimer cDNA Synthesis Kits试剂盒(市售,购自Novagen公司)进行反转录,从而获得所需 cDNA。2、T7载体的构建及体外包装使用ITSelect Cloning Kit试剂盒(市售，购自Novagen公司)将上述所得cDNA接入17载体中，随后以ITSelect Packing Extract试剂盒(市售,购自Novagen公司)对其进行包装，最终获得青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库。3、噬菌体文库的滴度鉴定及保存根据ITSelect Cloning Kit试剂盒说明书，以平板计数法测定文库滴度并扩增文库，所得扩增文库加入0. 1%的80%甘油，混匀后于_80°C保存。按上述方法以第一轮淘选所得噬菌体为基础，再进行两次淘选，获得强亲和力的含目的基因的噬菌体群。从第三轮淘选所得噬菌体中分离单克隆噬菌体，以up和down引物扩增，Up GGAGCTGTCGTATTCCAGT (如 SEQ ID NO:3 所示)Down TTGGGGAGTTCTGGGCAAAT (如 SEQ ID NO:4 所示)
测序鉴定后获得SNl 基因序列5’ -GACGAACAAC ACCTAGAGAC CGAACTACACACTCTCACCA GCGTGCTGAC AGCCAATGGA TTCCAA-3’(如 SEQ ID NO:1 所示)。其氨基酸序列一级结构为Asp-Glu-Gln_His-Leu-Glu-Thr-Glu-Leu-Hi s-Thr-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Thr-Ala-Asn-Gly-Phe-Gln (如 SEQ ID N0:2 所不)。以固相多肽合成技术合成Hydrostatin-SNl，并以HPLC (图1)和MS (图2)分析其纯度及分子量，结果可知其纯度> 95%，分子量为2486. 69g/mol，等电点为4. 39。实施例2 biacore (基于表面等离子共振技术的生物大分子相互作用分析技术)分析Hydrostatin-SNl与TNF- a、TNFRl及TNFR2之间的相互作用。为了进一步验证Hydrostatin-SNl与TNF- a、TNFRl及TNFR2之间的相互作用，采用基于表面等离子共振技术(SPR)的生物大分子相互作用分析仪BIAC0RE T100分析了SNl与偶联于芯片上的重组TNFRl之间的相互作用。实验流程为将人重组TNFRl、TNF-a及TNFR2 (购自美国P印roTech，纯度彡98%)用BIAC0RE T100控制软件中的氨基偶联方法共价偶联在传感器芯片表面，TNF- a、TNFRl及TNFR2的偶联量分别约为8000 (图3) ,3000(图 4)及 200 (图 5)反应单位(Response Unit, RU)；Hydrostatin-SNl 溶解于 PBS,并稀释为24iiM、60iiM、121iiM、242iiM、0. 6mM、l. 2mM及2. 4mM的浓度梯度，离心后进样，检测不同浓度药物和TNF-a、TNFR1及TNFR2间的结合能力。结果证明Hydrostatin-SNl可直接与偶联在芯片上的 TNF-a (图 6),TNFRl (图 7)及 TNFR2 (图 8)结合；Hydrostatin-SNl 与 TNF-a、TNFRl 及 TNFR2 的亲和力分别为 2. 02mM、32. 4 y M 和 0. 22mM。进一步将 Hydrostatin-SNl与TNF-a混合后进样，检测Hydrostatin-SNl能否抑制TNF-a与其受体的结合，结果表明Hydrostatin-SNl (Hydrostatin-SNl :TNF_a 为 5:1 和 0. 5:1, n n)能够抑制 TNF- a 与偶联于芯片上的 TNFRl (图 8)的结合；且 Hydrostatin-SNl (Hydrostatin-SNl TNF-a 为1:1和0.5:1，n:n)能够抑制TNF-a与偶联于芯片上的TNFR2 (图10)的结合。实施例3 =Hydrostatin-SNl对TNF- a杀伤其敏感靶细胞活性的抑制作用。biacore证明Hydrostatin-SNl与TNFRl的相互作用后，进一步采用TNF-a敏感靶细胞L929细胞，检测Hydrostatin-SNl对TNF- a杀伤其敏感靶细胞的活性是否具有抑制作用。具体实验步骤为传代培养的小鼠成纤维细胞L929细胞(购自中科院细胞库)用胰酶消化后重悬于含10%胎牛血清(市售，购自Thermo公司)的RPM1-1640培养基(市售，购自Thermo公司)，调整细胞密度为2X105/ml，接种100 于96孔细胞培养板，C02孵箱培养过夜。TNF-a与放线菌素D及系列浓度的Hydrostatin-SNl混合后加入L929细胞96孔细胞培养板中，TNF- a与放线菌素D的终浓度分别为10ng/ml与0. 2 y g/ml。细胞于C02孵箱继续培养20h，镜下观察L929细胞的状态并拍照；各孔加入20 ill的5mg/ml的MTT，C02孵箱继续培养4h，弃上清，各孔加入150 u I DMSO,振荡使结晶充分溶解后，于波长490nm处测吸光度值，计算细胞存活率，数据为mean土SD。结果表明Hydrostatin_SNl (32pM_20nM)对TNF-a杀伤敏感靶细胞的活性具有剂量依赖性的抑制作用(图11、12)，而在同样剂量范围内Hydrostatin-SNl单独作用对L929细胞无明显的细胞毒性(图13)。上述结果表明Hydrostatin-SNl对TNF- a的生物活性具有抑制作用。实施例4 =Hydrostatin-SNl对TNF激活的NF- k B和MAPK信号通路的作用。具体实验步骤为传代培养的人胚肾细胞系HEK293A细胞用胰酶消化后重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞密度至5X105/ml，接种Iml于12孔细胞培养板，C02孵箱培养过夜。终浓度为20ng/ml的TNF- a与终浓度为4nM的Hydrostatin-SNl混匀后加入12孔细胞培养板中，分别作用O、5、15、30及60min后，弃上清，以PBS洗涤一次后提取细胞总蛋白，并以BCA法对各样品蛋白浓度进行测定。设立对照组(单独加入TNF-a )。western blot检测NF-k B和MAPK信号通路的变化(图14)。结果表明Hydrostatin_SNl能够有效抑制TNF- a对NF- k B和MAPK信号通路的激活。上述结果表明Hydrostatin-SNl对TNF- a的生物活性具有抑制作用。实施例5 =Hydrostatin-SNl对小鼠LPS急性休克动物模型的作用。具体实验步骤为选 取6-8周的C57雄鼠(每组7只)，腹腔注射LPS (15mg/kg)、20 yg/kg和200 yg/kg的Hydrostatin-SNl，计算幸存率并绘制生存曲线(图15)。结果表明Hydrostatin-SNl能够有效防治LPS诱发的败血症。实施例6 Hydrostatin-SNl对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发的小鼠结肠炎动物模型的作用。具体实验步骤为选取6周龄的BALB/c小鼠随机分为4组，每组包含6只小鼠。组I (normal)不做任何处理,组2 (control)饮水中加入2. 5%(w/v)的DSS (市售,购自MP公司，MW为36，000-50, 000)造模七天以诱发结肠炎；组3和组4造模的同时腹腔注射Hydrostatin-SNl (20 u g/kg/d和200 u g/kg/d)。每日记录各组小鼠体重变化(图16).可知Hydrostatin-SNl能够有效抑制结肠炎导致的体重下降；并于造模七日后，颈椎脱臼处死小鼠，取结肠末端及脾脏，测定脾重并计算相应脏器比(图17)，发现Hydrostatin-SNl能够有效抑制结肠炎导致的脾脏变化；取结肠末端组织以10%福尔马林固定，组织切片，HE染色后观察结肠变化(图18)，观察发现Hydrostatin-SNl能够有效抑制DSS导致的结肠病变。上述结果表明，Hydrostatin-SNl能够有效的防治DSS诱导的结肠炎动物模型。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定 。
序列表SEQUENCE LISTING
<iio>中国人民解放军第二军医大学
<120>青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl及其编码基因和在制药中的应用 <130〉说明书，权利要求书
<160〉4
<170>PatentIn version 3.3
<210> I<211〉 68<212〉 DNA<213〉人工序列<400> I
gacgaacaac acctagagac cgaactacac actctcacca gcgtgctgac agccaatgga 60ttccaa86
<210> 2<211〉 22<212> PRT<213>人工序列`<400> 2
Asp Glu Gln His Leu Glu Thr Glu Leu His Thr Leu Thr Ser Va] Leu151015
Thr Ala Asn Gly Phe Gln20
<210〉 3<211〉 19<212〉 DNA<213〉人工序列<400〉 3
ggagctgtcg tattccagt丄y
<210> 4<211〉 20<212〉 DNA〈213〉人工序列<400> 4
ttggggagtt ctgggcaaatZO
权利要求
1.一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽具有如下(a)或(b)或(C)的蛋白质 (a)由SEQID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQID NO:2的氨基酸序列经过1-17个氨基酸残基的取代或缺失且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质； (c)将SEQID NO: 2中的氨基酸序列在N端或C端加上1_10个氨基酸残序列，且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，是一种直链多肽，分子量为2483. 68道尔顿，等电点4. 39。
3.—种如权利要求1所述的青环海蛇抗炎活性肽的编码基因，其特征在于，该编码基因为如下(i )或(ii )的DNA分子 (i )如SEQ ID NO:1所示的DNA分子； ( )在严格条件下与(i )限定的DNA序列杂交且编码所述青环海蛇抗炎活性肽的DNA分子。
4.一种如权利要求2所述的青环海蛇抗炎活性肽的筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (A)生物淘选以TNFRl作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将TNFRl稀释至浓度为I μ g/ml，以100 μ 1/well包被96孔ELISA板，并以封闭剂封闭各孔；包被好的ELISA板，每孔加入100 μ I噬菌体，37°C孵育I小时；以TBST溶液洗板4次，加洗脱液于37°C孵育20分钟，从ELISA板上将结合的噬菌体洗脱下来，并以宿主菌BLT5403扩增洗脱下的噬菌体，完成第一轮淘选； 按上述方法以第一轮淘选所得噬菌体为基础，再进行两次淘选，获得强亲和力的含目的基因的噬菌体群； 从第三轮淘选所得噬菌体中分离单克隆噬菌体，以SEQ ID NO:3所示的up引物和SEQID N0:4所示down引物扩增，测序鉴定后获得Hydrostatin-SNl的基因序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列一级结构如SEQ ID NO:2所示； (B)合成以固相多肽合成技术合成Hydrostatin-SNl，并以HPLC及MS分析其纯度和分子量，其分子量为2489. 69,等电点为4. 39。
5.根据权利要求4所述的青环海蛇抗炎活性肽的筛选方法，其特征在于，该方法中青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库是用以下方法制备得到的 a)青环海蛇蛇毒毒腺mRNA的获得及cDNA的获得； b)T7载体的构建及体外包装； c)噬菌体文库的滴度鉴定及保存。
6.一种如权利要求1或2所述的青环海蛇抗炎活性肽在制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的青环海蛇抗炎活性肽在制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的与TNF-α相关的疾病是类风湿性关节炎、糖尿病、冠心病、败血症或结肠炎。
8.—种如权利要求3所述的青环海蛇抗炎活性肽的编码基因在制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的青环海蛇抗炎活性肽的编码基因在制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的与TNF-α相关的疾病是类风湿性关节炎、糖尿病、冠心病、败血症或结肠炎。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，目前尚无文献报道有关青环海蛇的生物活性肽的报道。本发明提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1，所述的青环海蛇抗炎活性肽，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还提供了Hydrostatin-SN1的编码基因，以及青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1及其编码基因在制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用，与TNF-α相关的疾病，包括类风湿性关节炎、糖尿病、冠心病、败血症、结肠炎等多种复杂炎症疾病或免疫性疾病。本发明具有较大的临床应用价值。
文档编号A61P9/10GK103030687SQ20131000840
公开日2013年4月10日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者陆一鸣, 郑增节, 王俊杰, 胡振林, 厉建中, 张俊平 申请人:中国人民解放军第二军医大学