专利名称：芳香化酶紊乱大鼠抑郁症模型的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种抑郁症动物模型的构建方法。
背景技术：
抑郁症是最常见的精神神经性疾病，世界卫生组织发表的研究结果显示，2000年抑郁症在全球疾病负担中位列第四，而到2020年将排名第二。目前精神神经性疾病也在我国疾病总负担中排名首位，临床上还缺乏对抑郁症的有效治疗措施。抑郁症不仅发病率高，而且疾病负担大、自杀率高。患者病程漫长，伴随沮丧、绝望等情绪，导致工作、生活能力下降，10-15%患者面临自杀危险。因此，抑郁症已成为严重影响社会经济发展、迫切需要解决的公共卫生问题，研究抑郁症的发病机制并找到最合理的治疗方法是神经科学领域的一大 重要任务。抑郁症是多种因素综合的疾病，目前对其发病机制还缺乏深入确切的认识，抑郁症的机制研究和抗抑郁症新药的开发都离不开有效地动物模型，加强抗抑郁药及其药效作用机制的研究，对人类健康生存具有十分重要的意义。目前，抑郁症动物模型最常用的是应激模型，通过给予动物各种剌激，使动物产生应激反应，表现出抑郁的状态。此外，母爱剥夺鼠模型、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)脑室内注射或CRH过表达基因鼠模型等都从不同角度模拟了部分抑郁症临床与神经生物学特征。在进行抗抑郁药理学研究时，现存类别有限的抑郁动物模型，无法满足所有抗抑郁中药的筛选，部分研究中使用的抑郁动物模型往往不一定正确，导致不能准确地反应药物的真正作用机制。近年来，应激假说在抑郁症发病中的地位越来越受到重视。体内下丘脑-垂体-肾上腺(HPA轴)是调节应激反应的关键系统，被认为是产生众多抑郁症的症状和体征产生的共同通路。其中下丘脑室旁核CRH神经元具有整合心理和物理刺激的功能，被公认为是应激反应的中枢驱动力。我们研究组在既往的研究中已经发现，雌、雄性激素分别通过其各自受体介导对于下丘脑室旁核(PVN)内CRH神经元活性的直接刺激、直接抑制调节，这两种调节之间存在着动态平衡，该平衡丧失可以导致抑郁症中HPA轴激活。由于人类细胞色素P-450芳香化酶(P-450arom)是催化雄激素转化为雌激素的雌激素生物合成关键酶，我们推测下丘脑内P-450arom功能紊乱可能是雌、雄激素调节失衡导致HPA轴激活参与抑郁症发病的关键性因素。基于此，我们建立了高度模拟临床与神经生物学特征的芳香化酶紊乱抑郁症动物模型，不但可用于探究芳香化酶对抑郁症的科学内涵，还能对新药的筛选提供能反应疾病本质的动物模型。
发明内容
本发明的目的是构建一种新的抑郁症动物模型。本发明采用的技术方案是一种新的抑郁症动物模型的构建方法，所述方法包括大鼠腹腔注射ATD (ATD: 1，4，6-androstatriene_3，17-dione,是不可逆性芳香化酶抑制剂)21天以上(时间越长越好，一般21天即可造模成功)，获得抑郁症动物模型。所述的大鼠为常规用于动物实验的SD大鼠，所述ATD剂量为40 mg/kg (或更大)，溶于丙二醇中。本发明的有益效果提供了一种简单方便的抗抑郁动物模型构建方法，为抗抑郁药物的筛选提供了研究基础。
图1A为大鼠体重变化示意图。图1B为糖水偏好试验结果示意图。图1C为血浆中CORT水平的变化示意图。图1D为下丘脑中芳香化酶mRNA水平的变化示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。
实施例一、材料与方法1.雄性SD大鼠16只(体重24(T260 g)，由上海生命科学研究院提供。自由饮水进食，正式实验前每天定期抚摸和抓取老鼠，减少实验过程对老鼠造成的应激，适应性饲养一周后进行实验。将动物随机分为两组对照组与实验组，实验组采用腹腔注射ATD，剂量为40 mg/kg (或更大)，媒介为丙二醇，对照组为等量注射丙二醇。两组四只一笼，造模21天后进行行为学测试。2.体重测定及行为观察
在适模第1、7、14、21天注射前称量各大鼠体重，并观察其行为的变化，如精神状态，对抓取的反应，每次观察约20min。 3.旷场实验
在造模之前和之后所有大鼠进行旷场实验。实验装置为100 cm X 100 cm X 50 cm的无盖木制方箱，四周和底面全部涂黑，底面用白线划分成25cm X 25cm的16个方格。实验在隔音房间内进行，对所测大鼠均为新环境。将大鼠置于木箱中心方格内，观察5 min内活动情况。观察指标①动物穿越底面的格数(以4爪均进入方格记数)动物在中央4个格子内的停留时间动物在5min内移动的总距离。4.糖水偏好实验
对照组和ATD组大鼠第一天给予2瓶1%蔗糖水，第二天给予I瓶自来水和I瓶1%蔗糖水进行适应。同时，为了避免大鼠对饮水位置的偏好，第二天在12 h后糖水和自来水的位置互换。第三天禁水禁食一天。第四天给予所有大鼠I瓶自来水和I瓶1%蔗糖水，24 h后称重计算自来水和蔗糖水的消耗量，并计算糖水偏好即蔗糖水消耗量+ (蔗糖水消耗量+自来水消耗量)X 100%ο5.样品准备
所有大鼠均在上午9:0(Γ10:00间快速断头牺牲，收集躯干血，存放于乙二胺四乙酸包被的抗凝管中，在3000 rpm条件下离心20 min，上清液贮存在-80° C冰箱中，标本测定时再取出。在冰上取出大脑，并用解剖剪及镊子分离出下丘脑，下丘脑的分界线如下以视交叉为前端，以乳头体为后缘，以两个下丘脑沟分别为两侧的界限，整个下丘脑解剖深度约3mm。样品于一80° C冰箱内保存，用于RNA的提取和测定。所有动物的实验处理过程，均按浙江大学实验动物操作规则进行。6.皮质酮测定
血浆皮质酮(CORT)采用酶联免疫吸附试验试剂盒严格按照说明书所列步骤进行操作，空白对照和标准品由厂家提供，浓度依次为O、20、50、200、500、2000 ng/ml。吸光度值采用Thermo MK3型酶标仪进行读数，测定波长为450 nm，参考波长为630 nm。CORT的检测限为1. 6 ng/ml，批内与批间变异系数分别为4. 0%和6. 2%。7.弓丨物设计和定量PCR反应
从NCBI网站(http://www. ncb1. nlm. nih. gov)下载目的基因和管家基因的mRNA序列，应用Primer Premier 5.0设计上下游引物，并在NCBI网站进行核苷酸BLAST同源比 对，确保扩增片段的特异性。为了避免对基因组DNA的扩增，尽量跨内含子设计引物对。取大鼠新鲜下丘脑组织用于总RNA提取、逆转录和定量PCR反应，定量PCR反应在ABI PRISM 7500仪器上进行。每一份cDNA样本均在相同反应条件下同时进行目的基因与管家基因β-actin mRNA检测，并测定引物的扩增效率。通过溶解曲线和PCR产物凝胶电泳(8%的聚丙烯酰胺凝胶)鉴定扩增产物的特异性。根据目的基因与管家基因的比值来进行相对定量。8.数据分析
实验数据以均数土标准差表示，结果以Prism 5. O软件作图，SPSS 16. O软件进行统计学分析。组间的比较采用Student T检验法。检验水准为P < 0.05。二、结果1.大鼠体重变化
各组大鼠体重变化见图1A，ATD组大鼠在造模开始时和第I周时体重与对照组相比无明显差异，在造模2周后比对照组明显减轻(P < O. 05)，在造模结束时减轻的更加显著(P< O. OD02.旷场实验
结果见表1，经过21天造模后，与对照组比较，ATD组大鼠5min内穿越底面格数与对照组大鼠相比明显降低，具有显著统计学差异(P < O. 01)，中央停留时间相对缩短，具有统计学差异(P < O. 05)，但移动总距离有减少趋势但不具有统计学差异。表I腹腔注射ATD对大鼠旷场活动的影响(X土 s，η = 8)
组别I穿越格数I中央停留时间 I运动总距离 —
对照组 94. 10±5. 67_15. 88±3. 61_3482±619.1
ATD 组 I 68. 40±5. 50**| 6. 08±0. 74*丨2892±250.1
备注* P〈 O. 05, ** P〈 O. 01。3.糖水偏好实验
在糖水偏好试验中，与对照组相比，ATD大鼠的糖水偏好百分比显著降低(P < 0.001，图 1Β)。4.皮质酮测定
经过21天造模后，与对照组比较，ATD组大鼠血浆中CORT明显升高(P < O. 001，图1C)。5. mRNA水平的改变
经过21天造模后，与对照组比较，ATD组组大鼠下丘脑中芳香化酶mRNA水平降低，具有统计学差异(P < O. 05，图1D)，但CRH-mRNA水平有升高的趋势，但无统计学差异。三、结论 21天造模结束后，通过体重变化、旷场活动和糖水消耗的检测，结果表明腹腔注射ATD模型对造成大鼠抑郁行为有效。在对大鼠血浆皮质酮和下丘脑mRNA水平测定中发现，ATD组脑内芳香化酶mRNA水平也发生了明显的降低，显示了芳香化酶的紊乱，说明按照本发明方法，能够成功获得芳香化酶紊乱抑郁症动物模型。
权利要求
1.芳香化酶紊乱抑郁症动物模型的构建方法，所述方法包括大鼠腹腔注射不可逆性芳香化酶抑制剂1，4，6-androstatriene-3, 17-dione 21天以上,获得抑郁症动物模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述大鼠为雄性SD大鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述1，4，6-androstatriene-3,17-dione剂量为40 mg/kg，溶于丙二醇中。
全文摘要
本发明公开了一种新的抑郁症动物模型的构建方法。在大鼠腹腔注射不可逆性芳香化酶抑制剂ATD(1,4,6-androstatriene-3,17-dione)21天以上(时间越长越好，一般21天即可造模成功)，获得抑郁症动物模型。所述的大鼠为常规用于动物实验的SD大鼠，所述ATD剂量为40mg/kg，溶于丙二醇中。本发明提供了一种简单方便的抗抑郁动物模型构建方法，为抗抑郁药物的筛选提供了研究基础。
文档编号A61K45/00GK103007283SQ201310008389
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者包爱民, 王兆品 申请人:浙江大学