一种抗体口含制品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗体口含制品及其制备方法，所述的抗体口含制品含有安全、有效的可食用的抗体。所述抗体对下述至少一种病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用：流感病毒包括禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒，腺病毒，肠病毒，呼吸道合胞病毒或A组链球菌。本发明所述的抗体口含制品具有成本低、特异性强、活性高、安全可食用等优点，可用于口腔或呼吸道的清洁或感染性疾病的预防或辅助治疗。
【专利说明】ー种抗体ロ含制品及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及ー种抗体ロ含制品及其制备方法。
【背景技术】
[0002]抗体药物是对目标抗原(如病毒、细菌、癌细胞等)具有非常特异的识别与抑制能力的ー种蛋白类药物，由于其对目标特异性强对身体副作用小成为目前世界上最具发展潜力的新型药物，也是最昂贵的药物(价格是同样治疗目的化学药的几十倍)。抗体药物虽然价格高昂但市场巨大利润丰富，因此，近年来抗体药物成了世界各大制药巨头追逐的研发方向。
[0003]目前市面上有预防疾病功能的ロ含制品有中药型、果蔬型、维生素型尚未见有抗体ロ含制品。有报导ー种可用于预防非典型肺炎等传染性疫症防疫ロ含片(专利申请号:CN03108028.6)，它是ー种以甘草、香白芷、细辛、冰片、朱砂等原料为基本组方加工制成的ロ含制品。另有报导ー种抗病毒ロ含片(专利申请号:CN200610055156.5)，它是ー种以中成药抗病毒ロ服液的处方及制备エ艺提取获得粗提物为主料再加入辅料后压制成片口含制品。
[0004]近来，黑龙江省农业科学院畜牧研究所公开了ー种提取禽流感卵黄抗体的方法(专利申请号:CN201110447572.0)。另有报导(专利申请号:CN02103760.4)公开了ー种通过接种人类预防传染病的疫苗给母鸡的方法，使母鸡生产含有特异性免疫抗体的鸡蛋。直接食用该免疫鸡蛋有望消除体内炎症和提高防疫能力。然而，上述报导并未涉及如何，包括以什么样形式，将抗体生产成真正有效的能预防疾病的合适产品。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供含有一种或多种能对不利于身体的有害物质尤其是对口腔或呼吸道病毒和细菌有特异性中和或抑制作用的抗体，可用于口腔或呼吸道的清洁或感染性疾病的预防或辅助治疗。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:ー种抗体ロ含制品，包括赋形剂，其特征是，还含有至少ー种对病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用的抗体。
[0007]所述抗体对下述ー种或多种病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用。所述病毒和/或细菌包括但不限于:流感病毒包括禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒，腺病毒，肠病毒，呼吸道合胞病毒或A组链球菌。
[0008]所述抗体ロ含制品中最终抗体效价为100-100000滴度，最好在1000-10000滴度范围。
[0009]所述抗体是从免疫过哺乳母动物(如:奶牛和奶山羊)，下的乳中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
[0010]所述抗体是从免疫过的母禽(如:母鸡)，下的蛋中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
[0011]所述抗体是从免疫过动物的血液中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
[0012]所述抗体是从细胞培养液动物腹水中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性单克隆抗体。
[0013]所述抗体是由对应的抗原经免疫动物后获得。所述抗原可以是ー个单ー的病毒或多个病毒株的组合裂解液或减毒的活株；也可以是商业上使用的疫苗，如甲型HlNl流感疫苗；流感病毒的选择可以采用世界卫生组织(WHO)推荐的季节性流感病毒；可以是任何病毒或细菌的蛋白质，尤其是病毒或细菌中分离出来的表面或膜蛋白；抗原蛋白可以是通过基因工程技术制备的或人工合成的与所述呼吸道感染有关的病毒或细菌蛋白整体或根据其氨基酸序列制备的片段或多肽；所述抗原也可以是ー种基于DNA的疫苗，它可以在免疫动物体内产生抗原。
[0014]ー种抗体ロ含制品的制备方法，包括下述几个步骤:1)抗原选择及制备；2)动物免疫；3)抗体提取；4) ロ含制品制备。
[0015]所述步骤I)中的抗原是选用下述的ー种或多种病毒和/或细菌的裂解液或减毒的活株，或纯化的病毒或细菌相关蛋白，在免疫动物之前与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合、乳化制得；所述 的病毒或细菌包括但不限于:流感病毒，禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒，腺病毒，肠病毒，呼吸道合胞病毒或A组链球菌。
[0016]所述步骤4)中的ロ含制品制备过程中，抗体或掺合了抗体的原料、半成品、成品采用65°C以下低温流程。所述抗体在最终ロ含制品中的效价需调至100-100000滴度，最好在1000-10000滴度范围。
[0017]所述步骤4)的エ艺流程包括:1)将ロ含制品基料破碎、干燥、过筛备用；2)取部分过筛后的基料充分混匀，然后和纯化水及已备好的抗体溶液调和单独制粒、低温干燥、破碎、过筛备用；3)将剩余的过筛后的基料与其它辅料及矫味剂充分混匀制空白粒、干燥、破碎、过筛备用；4)将两种颗粒充分混匀、加入助流剂、混合均匀后压片，制得抗体ロ含片。
[0018]所述步骤4)的エ艺流程还包括:1)将胶基与糖浆在高温溶化、混和；2)加入糖粉及香料辅料，混和制成胶团；3)将胶团温度调降至在45-50°C，加入抗体活性成分，充分混；
4)压延、切片成型，制成抗体ロ香糖。
[0019]本发明的有益效果是:本发明所述的抗体ロ含制品所含抗体是安全的有效的可食用的。由本发明所述的疾病预防型抗体ロ含制品具有成本低、特异性强、活性高、安全可食用等优点，可用于口腔或呼吸道的清洁或感染性疾病的预防或辅助治疗。
【具体实施方式】
[0020]下面结合【具体实施方式】对本发明作进ー步详细说明:
[0021]本发明的抗体ロ含制品，包括赋形剂，还含有至少ー种对病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用的抗体。
[0022]所述抗体对下述ー种或多种病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用:流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒，腺病毒，肠病毒，呼吸道合胞病毒或A组链球菌。
[0023]所述抗体ロ含制品中最终抗体效价为100-100000滴度，最好在1000-10000滴度范围。
[0024]所述抗体是从免疫过哺乳母动物下的乳中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
[0025]所述抗体是从免疫过的母禽，下的蛋中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
[0026]所述抗体是从免疫过动物的血液中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
[0027]所述抗体是从细胞培养液动物腹水中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性单克隆抗体。
[0028]抗体ロ含制品的制备方法，包括下述几个步骤:1)抗原选择及制备；2)动物免疫；
3)抗体提取；4) ロ含制品制备。
[0029]所述步骤I)中的抗原是选用下述的ー种或多种病毒和/或细菌的裂解液或减毒的活株，或纯化的病毒或细菌相 关蛋白，在免疫动物之前与弗氏完全佐剂(初次免疫用)或弗氏不完全佐剂(后续免疫用)混合、乳化制得；所述的病毒或细菌包括:流感病毒，禽流感病毒(influenza virus),呼吸道合胞病毒(RSV) (respiratory syncytialvirus),人类副流感病毒 3, HPIV-3 (human parainfluenza virus3),肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia e ),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae),如:こ型流感嗜血杆菌(Hib),鼻病毒，冠状病毒(rhinovirus),轮状病毒(coronavirus),腺病毒(adenovirus；, 1--? (enterovirus；, BsF(respiratory syncytial virus；,A 组链球菌(group A streptococcus)等。
[0030]所述步骤4)中的ロ含制品制备过程中，抗体或掺合了抗体的原料、半成品、成品采用65°C以下，最好是45°C以下低温流程。所述步骤4)的エ艺流程包括:1)将ロ含制品基料，如:可溶性淀粉、蔗糖等，破碎、干燥、过筛备用；2)取部分过筛后的基料充分混匀，然后和纯化水及已备好的抗体溶液调和单独制粒、低温干燥、破碎、过筛备用；3)将剩余的分过筛后的基料与其它辅料，如:甘露醇，及矫味剂，如:薄荷、柠檬酸，充分混匀制空白粒、干燥、破碎、过筛备用；4)将两种颗粒充分混匀、加入助流剂，如:硬脂酸镁、混合均匀后压片，制成抗体ロ含片。
[0031]所述的ロ含制品也可以制成ロ香糖形式，其制备方法基本上是:先将胶基与糖浆在高温溶化、混和，然后加入糖粉及香料等辅料，混和后将胶团温度调降至在45-50°C，此时加入抗体等活性成分经充分混和后压延、切片成型。ロ香糖的基本组分比是:胶基18-20%，糖60%左右，葡萄糖浆20%左右，甘油0.3-0.5%，抗体适量，调香料和调味料适量。
[0032]实施例1.流感病毒抗原制备:
[0033]将甲型H1N1、H3N2流感病毒和こ型布里斯班病毒分别裂解然后按1:1:1比例混合，制的三种流感病毒裂解混合液，备 用。免疫时，再将此混合液与弗氏完全佐剂(第一次免疫用)或与弗氏不完全佐剂(后续免疫用)按1:1比例混合、乳化制得含总抗原约0.6mg/ml的抗原混合液。
[0034]实施例2.奶抗体制 备:[0035]选怀孕奶牛(荷斯坦奶牛)，在产仔日前九个星期，皮下注射50毫克的实施例1中所述的用弗氏完全佐剂乳化的抗原混合液，进行首次免疫，三周和七周后，用30毫克实施例I中所述的用弗氏不完全佐剂乳化的抗原混合液再分别免疫各一次。分娩后，再重新免疫两次注射在胸腺附近的淋巴结。动物分娩后连续收集初乳和常乳五个月。以12，000g离心15分钟除去乳脂肪，得脱脂抗体乳，经60°C 30分钟巴氏灭菌(注:巴氏灭菌会使抗体活性下降20%左右)后分装、冷冻保存备用。取少量样品，检测牛奶中的每种免疫球蛋白类的浓度:分别使用HRP偶联的兔抗牛IgG，IgA和IgM特定的第二抗体及ELISA測定法来定量IgG, IgA和IgM浓度。本实验检测结果:免疫奶中的IgG、IgA和IgM的平均浓度分别达到
0.3g/L、0.02g/L和0.01g/L ;合并使用HRP偶联的兔抗牛IgG，IgA和IgM特定的第二抗体经间接ELISA法(该检测法为公知的方法，可參照实施例4中所述抗体活性检测)检测，该抗体乳对HlNl、H3N2和こ型布里斯班病毒三种抗原均呈特异性阳性，滴度分别达600倍，450倍和400倍。将此抗体乳冷冻干燥成冻干粉，分装、冷冻保存备用。
[0036]实施例3卵黄抗体制备:
[0037]将甲型HlNl流感病毒和こ型流感嗜血杆菌(Hib)分别裂解然后按1:1比例混合，制得含总抗原约0.4mg/ml的抗原混合液，备用。选好初产或丰产期的健康罗马母鸡，对每只母鸡通过皮下多点注射含0.2毫克抗原的按1:1比例与弗氏完全佐剂混合、乳化的抗原混合液，进行首次免疫。两周后通过再注射含0.1毫克抗原的按1:1比例与弗氏不完全佐剂混合、乳化的抗原混合液，进行二次免疫。再过两周后通过再注射再注射含0.1毫克抗原的按1:1比例与弗氏不完全佐剂混合、乳化的抗原混合液，进行三次免疫。收集自第一次免疫起6周后的鸡蛋。每隔ー个月再注射一次含0.1毫克抗原的按1:1比例与弗氏不完全佐剂混合、乳化的抗原混合液。
[0038]从鸡蛋中分离出蛋黄，然后加5倍体积的去离子水并调pH至5.5，静置过夜，离心取上清，然后加PEG-6000至12%，室温放置30分钟，2000rpm离心15分钟，所得沉淀以3倍体积的0.01mol/L的Tris-HCl (pH8.0)缓冲液溶解，获得抗HlNl流感病毒和抗Hib流感嗜血杆菌的特异蛋黄抗体液。然后，取蛋黄抗体液0.1毫升用间接ELISA法(该检测法为公知的方法，可參照实施例4中所述抗体活性检测)检测抗体滴度，根据检测结果，低温浓缩或用0.01mol/L的Tris-HCl (pH8.0)缓冲液稀释调所得抗体液至滴度至10000以上，然后无菌过滤、分装、冷冻保存备用。
[0039]实施例4.抗体ロ含片制备
[0040]I?抗体ロ含片生产工艺:
[0041]A:将1000克可溶性淀粉真空低温干燥，过筛备用；将100克蔗糖粉碎，80目过筛备用;
[0042]B:分别取部分过筛的可溶性淀粉200克和蔗糖粉20克充分混匀，混匀后和辅料甘露醇10克、已备好的效价等于或大于100000滴度的抗体溶缩液15ml (或抗体冻干粉加适量纯净水调和成IOml)制粒，45°C以下低温真空干燥，破碎，30目过筛，备用；
[0043]C:将剩余的过筛的可溶性淀粉蔗和糖粉加上甘露醇50克及柠檬酸I克充分混匀，制空白粒，干燥，破碎，30目过筛，备用；
[0044]D:将两种颗粒充分混匀，加入助流剂硬脂酸镁10克，总混，混合均匀后压片，每片I克；[0045]E:质量检测；
[0046]F:铝塑包装。
[0047]注:为保护抗体的活性，上述ロ含制品制备エ艺中必须避免高温(65°C以下，最好45°C以下)。
[0048]2.抗体活性检测:
[0049]取一片由牛奶抗体制备的抗体ロ含制品(I克)将其浸泡于5ml的PBS缓冲液，室温I小吋，然后经6000RPM转速10分钟离心，取得上清液。
[0050]抗体特异性測定:采用间接酶联免疫检测法測定，将HlNl病毒抗原标准品(来自英国国家生物标准及控制研究所的由鸡蛋培育的抗原California/7/2009(NYMC X-179A)，(NIBSC代码:09/146))用PBS缓冲液稀释至4ug/ml，按每槽IOOul的量添加到酶标盘的反应槽中，室温静置3小时后弃去该液体，并用PBS缓冲液洗盘3次，然后于每个槽中加入200ml封闭液(溶于PBS缓冲液的1%人血清蛋白HAS)室温静置3小时后弃去该液体，再用PBS缓冲液洗盘3次，凉干备用。将待测样品上清液用PBS缓冲液按1:3梯度稀释，制备8份不同的稀释液，其中一份不含任何待测样品，每份0.2ml;每份取IOOul添加到上述抗原包被过的酶标盘上不同的槽中，每份样品测两次，室温静置孵育2小时后弃去该液体，用洗涤液(0.l%Tween20溶于PBS缓冲液)洗盘3次；取IOOul HRP标记的兔抗牛二抗(当ロ含制品中抗体提取自牛奶时)或兔抗鸡IgY 二抗(当ロ含制品中抗体提取自鸡蛋时)的稀释液(0.05%溶于含1%人血清蛋白的HBS缓冲液)添加到酶标盘的各个槽中，室温静置孵育I小时后弃去该液体，用洗涤液(0.l%Tween20溶于PBS缓冲液)洗盘3次；取IOOul含H202的TMB显色液添加到酶标盘的各个槽中，室温静置至蓝色梯度出现，然后添加lOOullM的H2S04終止液到酶标盘的各个槽中终止显色；用酶标仪在450nm下检测各槽的吸光度。
[0051]检测结果(如下表)显示所测ロ含制品特异抗体活性较强，特异性抗体滴度超1200。
[0052]表1，间接酶联免疫法检测ロ含制品特异性抗体滴度结果
【权利要求】
1.ー种抗体ロ含制品，包括赋形剂，其特征是，还含有至少ー种对病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体ロ含制品，其特征是，所述抗体对下述至少ー种病毒和/或细菌有特异性中和或抑制作用:流感病毒，禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒，腺病毒，肠病毒，呼吸道合胞病毒或A组链球菌。
3.根据权利要求1或2所述的抗体ロ含制品，其特征是，所述抗体是从免疫过哺乳母动物下的乳中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗体ロ含制品，其特征是，所述抗体是从免疫过的母禽下的蛋中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
5.根据权利要求1或2所述的抗体ロ含制品，其特征是，所述抗体是从免疫过动物的血液中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性抗体。
6.根据权利要求1或2所述的抗体ロ含制品，其特征是，所述抗体是从细胞培养液动物腹水中提取的并且对至少ー种病毒和/或细菌具有特异性中和或抑制作用的活性单克隆抗体。
7.ー种抗体ロ含制品的制备方法，其特征是，包括下述几个步骤:1)抗原选择及制备；2)动物免疫；3)抗体提取；4) ロ含制品制备。
8.根据权利要求7所述的抗体ロ含制品的制备方法，其特征是，所述步骤I)中的抗原是选用下述的至少ー种病毒和/或细菌的裂解液或减毒的活株，或纯化的病毒或细菌相关蛋白，在免疫动物之前与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合、乳化制得；所述的病毒或细菌包括:流感病毒，禽流感病毒，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒3，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒，腺病毒，肠病毒，呼吸道合胞病毒或A组链球菌。
9.根据权利要求7所述的抗体ロ含制品的制备方法，其特征是，所述步骤4)中的ロ含制品制备过程中，抗体或掺合了抗体的原料、半成品、成品采用65°C以下低温流程。
10.根据权利要求7所述的抗体ロ含制品的制备方法，其特征是，所述步骤4)的エ艺流程包括:①将ロ含制品基料破碎、干燥、过筛备用取部分过筛后的基料充分混匀，然后和纯化水及已备好的抗体溶液调和单独制粒、低温干燥、破碎、过筛备用；③将剩余的分过筛后的基料与其它辅料及矫味剂充分混匀制空白粒，干燥、破碎、过筛备用；④将两种颗粒充分混匀、加入助流剂、混合均匀后压片，制成抗体ロ含片。
11.根据权利要求7所述的抗体ロ含制品的制备方法，其特征是，所述步骤4)的エ艺流程包括:①将胶基与糖浆在高温溶化、混和加入糖粉及香料辅料，混和制得胶团；③将胶团温度调降至在45-50°C，加入抗体活性成分、充分混；④压延、切片成型，制成抗体ロ香糖。
【文档编号】A61P31/12GK103520719SQ201310508746
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】邹潮 申请人:哈德逊（天津）生物技术有限责任公司